Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

אמצעי בטיחות ונהלי הפעלה בבית (א) BSL-4 מעבדה: 2. שיטות כלליות

Published: October 3, 2016 doi: 10.3791/53600
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Integrated Research Facility at Frederick, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), National Institutes of Health (NIH)

ERRATUM NOTICE

Abstract

עבודה במעבדה הבלימה 4 בטיחות ביולוגית ברמה (BSL-4) דורש זמן ותשומת לב רבה לפרטים. אותה העבודה אשר נעשתה במעבדת BSL-2 עם פתוגנים הלא גבוהת תוצאה תיקח זמן רב יותר באופן משמעותי באווירת BSL-4. דרישת הזמן גדלה זאת בשל מספר רב של גורמים אשר שמטרתם להגן על החוקר מזיהומים-רכש מעבדה, סביבת העבודה מזיהום פוטנציאל ואת הקהילה המקומית מן השחרור אפשרי של פתוגנים גבוהה מכך. בתוך המעבדה, תנועה מוגבלת עקב צינורות אוויר מצורפים חליפות בטיחות גוף מלא חובה. בנוסף, חיטוי של כל פריט יוסר ארונות בטיחות ביולוגיים Class II (BSCs) נדרש. מומחי מעבדה חייבים להיות מאומנים בפרקטיקות של מעבדת BSL-4 ו חייב להראות בקיאות גבוהה המיומנויות הם מבצעים. המוקד של מאמר זה הוא לתאר הליכים נאותים וטכניקות כדי להבטיח ב מעבדהiosafety ודיוק ניסיוני באמצעות assay רובד נגיפי תקן כהליך למשל. בפרט, שיטות נכונות לעבוד בבטחה בסביבה BSL-4 בעת ביצוע ניסוי יודגש חזותי. טכניקות אלו כוללות: הקמת BSC Class II עבור ניסויים, ניקיון נאות של BSC Class II כאשר סיימו לעבוד, ניהול פסולת וסילוק בטוח של פסולת הנוצרת בתוך מעבדת BSL-4, והסרת דגימות מומתות מבתוך BSL- מעבדה 4 למעבדה BSL-2.

Introduction

כמו בטיחות של אנשי מעבדת טיפול פתוגנים גבוהה מכך (לא prophylaxes זיהום ולא אפשרויות טיפול קיימות) היא בעל חשיבות עליונה, משרד החוץ האמריקאי לבריאות ולשירותי אנוש קימת הנחיות לבניית מתקן ושיטות עבודה מומלצת לניהול הבטוח העבודה עם פתוגנים ביו למעבדות קליניות מנקודת מבט בטיחות ביולוגית 1. באמצעות חקיקה ותקינה, רבים של פרקטיקות ונהלים הפכו דרישות החובה שיש אחריו לעבודה עם פתוגנים אלה. בארצות הברית, פתוגנים המועברים בקלות מאדם לאדם, לגרום שיעורי מקרה הרוגים גבוה, ו / או יש פוטנציאל ההשפעה על בריאות הציבור הגדולות טרור ביולוגי, מסווגים כמו המכון הלאומי לבריאות / המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות מחלות (NIH / NIAID) עדיפות א 'פתוגנים או המרכז לבקרת מחלות ומניעתן (CDC) קטגוריה טרור ביולוגי סוכנים 2. בנוסף, hפתוגנים igh-התוצאה מסווגות Tier 1 סוכנים בחרו אם פתוגנים אלה הם סוכני טרור ביולוגיים פוטנציאליים, יש פוטנציאל פגיעה המונית או השפעות הרסניות למשק, תשתיות קריטיות, או אמון ציבור 3.

BSL-4 פעולות, כוללים גישת מכונים עם מעבדות BSL-4, נשלטות מאוד יותר BSL-2/3 פעולות. למשל, הוא משמעותי יותר קשה כדי לקבל גישה למעבדת BSL-4 לעומת מעבדת BSL-2 או BSL-3 עקב דרישות הכשרת חליפה משמעותיות, דרישות חונכות נרחבות, ואת תנאים מוקדמים בטיחות ביולוגית רפואית נוספים. בנוסף, יש בדרך כלל יותר מחסומים אבטחה פיזית במתקן BSL-4 לעומת מתקן BSL-2 או BSL-3 4-6. כפי שמתואר במאמר הראשון שלנו על נהלי כניסת BSL-4 ויציאה, צוות המעבדה לעבור הכשרה מקיפה והקרנה פסיכולוגית להעפיל כניסה למעבדת BSL-4 7. Within במעבדת BSL-4, סיכון לזיהום וטעויות נמנעים או מתן ידי ביצוע נהלים שנקבעו. מחקר חייב להתקדם בזהירות ובכוונה, עם ריבוי משימות או סח דעת מינימאליות. הוא רכן חליפות לחץ חיוביות קשה, ואת מגן הפנים עשוי להגביל הליכים כגון מיקרוסקופיה. כפפות מגושמות לעכב את ביצוע משימות מוטוריקה עדינות, כגון טיפול פריטים קטנים או תיוג צינורות. כדי לצמצם את זמן בילה BSL-4 מעבדות, מומחי מעבדה צריכים לסקור נהלי עבודה לזהות צעדים שניתן לעשות קדימה במעבדת BSL-2 ולאחר מכן להעביר את החומרים הללו לתוך מעבדת BSL-4 עבור השלמת המשימה (ים). כשמוציא חומרים לעיבוד נוסף במעבדת BSL-2, חומרים שתוקנו והוציאו מהמעבדה BSL-4 במכל משני אטומים. דוגמאות של דגימות כי ייתכן שתהיינה הצורך להסירו כוללות: צלחות קבועות או צינורות של חומר נגוע שתנותחנה ידי immunosorbe אנזים צמודNT assay (ELISA), assay immunofluorescence (IFA), או שרשרת פולימראז התגובה (PCR).

בנוסף מגבלות פיסיות יותר שהטילו ציוד מגן אישי הנדרש במעבדות BSL-4 בהשוואה לאלו BSL-2 מעבדות, נהלי איון של פתוגנים גבוהה תוצאת צלחות תרבית תאים וסילוק פסולת מחמירים מאלה הדרושים וירוסים פחות פתוגניים למד במעבדת BSL-2. לכל הפחות, שיטות אלו צריכות לעמוד בדרישת CDC. לדוגמא, צלחות תרבית תאים מזוהמות וחומרים אחרים יכולים להיות מובטלים עם ריאגנטים כימיים, כגון פורמלין ניטראלי שנאגר. מטופלי צלחות או צינורות תרבית תאים יוכנסו לתוך שקיות חותמות חום המכילות פורמלין והוציאו מהמעבדה באמצעות טנק דאנק מלא חיטוי נוזלי. פחי אשפה מלאי פתרונות חיטוי ומרסס חיטוי משמש לקבלת פסולת זמנית שנוצרה במהלך הניסוי ועבור דיסיnfecting כפפות, ניקוי משטחים וכלים ארון בטיחות ביולוגית, בהתאמה. פתרון חיטוי אמוניום הרביעון בריכוז המפורט נחשב את תקן הזהב עבור כל המעבדות בארה"ב BSL-4 (Barr J, תקשורת אישית, 2015). פסולת מוצקה מתוך דלי השפכים autoclaved לחסל פוטנציאל זיהום.

במאמץ חזותי להדגים את זרימת העבודה ואת המגבלות של נהלי BSL-4 בכלל, השתמשנו assay פלאק ויראלי תקן כדוגמא הליך ויראלי נפוץ. בעוד הליך assay ויראלי מתואר באופן כללי, אנו מדגישים את נהלי הבטיחות הביולוגיים בשימוש על מנת להבטיח בטיחות של אנשי מעבדה בפרוטוקול זה. עיין חזותי assay פלאק קלסי קודם עבור רקע נוסף על 8,9 טכניקת assay פלאק.

הנהלים שהוצגו כאן בהתאם למפרטי BMBL שהתוו CDC 1. עם זאת, הפרוטוקולים שהוצגו הםספציפית IRF-פרידריך. יש מתקן BSL-4 כל נהלי עבודה סטנדרטיים שונים (SOPs) ודרכי פעילותן המשפיעים על ביצוע ניסויים בתוך המעבדה BSL-4. הליכים חלופיים לניהול זרם פסולת וביצוע מבחני פלאק עשויים להשתנות בהתאם על הניהול והתפעול של מעבדות אלה. אף על פי כן, הבנה כללית של הקמה של מעבדת חליפה BSL-4 ונהלים לביצוע עבודות עם Class II ארונות בתוך סביבת BSL-4 תסייע למדענים להבין את האילוצים ואת השלכות בטיחות כאשר שוקלים מחקרים של פתוגנים בסיכון גבוהים. מודעות מוגברת של משתפי פעולה מחוץ הקשיים שמסביב עבודה במעבדת BSL-4 יכולה להוביל לציפיות מתואמות וקל יותר בפיתוח אמצעי-נגד רפואי בקהילת המחקר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. כניסת מעבדה

  1. לאסוף את כל אספקה ממעבדה BSL-2 עבור הניסוי (למשל, תאים, התקשורת, וחומרים מתכלים) לפני הכניסה למעבדה BSL-4.
  2. השלם את הליך הכניסה BSL-4 (מתוארים בפירוט התייחסות 7).

2. הכנת Class II בטיחות ביולוגית הקבינט במעבדת BSL-4

  1. פעם בתוך המעבדה BSL-4, להבטיח את רשימת העבודה הפנימית היומית (איור 1) הושלמה. השלימו את רשימת העבודה אם checklist לא כבר מילא בעבר החוצה וציין אילו וירוסים ישמש. אם את רשימת העבודה הושלמה כבר, להוסיף שם ואשר וירוס ישמש לרשימה.
  2. נקו את BSC Class II על ידי ריסוס למטה מבפנים כולו של BSC (כולל אבנט) עם פתרון חיטוי אמוניום הרביעון כפול 5% (למשל, אמוניום כלוריד בנזיל דימתיל n-אלקיל, n-אלקיל אמוניום בנזיל אתיל דימתילכלוריד או מתאים חיטוי אחר עבור הסוכן בשימוש) ולנגב במגבות נייר 10,11. תרסיס פתרון אתנול 70% בתוך ארון ואת האבנט להסיר את פתרון חיטוי מוזנח.
  3. אם יושב, הניח את הכיסא מול BSC Class II בגובה נוח כדי להבטיח שהחלק האחורי של ארון ניתן להגיע וכי פניו של מומחה המעבדה ממוקמת מעל הפתח הקדמי (איור 2) 11.
  4. כן מכל פסולת עבור ארון הבטיחות הביולוגי. ודא את הריכוז הסופי של פתרון חיטוי אמוניום הרביעון כפול מיכל הפסולת הוא לא פחות מ -5%. לתכנן בהתאם ולעשות פתרון 10% שאליו פסולת תתווסף כי תהיה לדלל את החיטוי. בנוסף, במקום בקבוק תרסיס עם 5 פתרון אמוניום הרביעון חיטוי כפול% בתוך Class II BSC לרסס את כל הפריטים לפני הרחקה בידיים עטויות כפפות במהלך ואחרי השלמת assay.
    5. <li> מניח את החומרים המתאימים דרושים לצורך הניסוי כולו Class II BSC עד בחזרה בארון ככל האפשר כדי למנוע היכרויות חומר חזרו לתוך BSC Class II וההפרעה בזרימת האוויר 11.

דוגמה 3.: assay פלאק

  1. תחזור דגימות המכילים וירוס ולשלוט וירוס ממיקום האחסון ביד להפשיר חומרים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. לייבל בארות של 6 צלחות היטב כדי לשמש על פי דילולים וירוס המתוכנן. סמן את העפעפיים וגוף של הצלחות להבטיח התאמה מוצלחת אם המכסים והגוף מופרדים.
  3. תביא חומרי צעדים 3.1-3.2 לתוך BSC Class II. מניחים את כל הפריטים שיש לא או לא לבוא במגע עם הנגיף בצד אחד ( "הצד נקי") ופסולת בצד השני ( "מהצד המלוכלך"). במידת האפשר, לשמור על "פריטים נקי" לפחות מזה 30 ס"מ "פריטים מלוכלכים" במהלך פעילות מניבת אירוסול 11.
  4. לעבוד קרוב למרכז הפנימי של Class II BSC ככל האפשר, כמרכז בתוך נועד להיות המיקום היעיל ביותר כדי להגן על עצמו 11.
  5. הסר 50 μl של מדגם וירוס ובקרה וירוס ומקום לתוך 450 μl של המדיום של הנשר שונה של Dulbecco עם 2% בסרום שור העובר. להמשיך עם ביצוע דילולים סדרתי רחוק ככל הצורך (איור 3 א).
  6. במהלך דילולים, לערבב את דגימות נגיף לפחות 5 פעמים עם קצה פיפטה לאט ובזהירות בעת שניסה למזער הדור בועות אוויר בדגימות. שינוי עצות פיפטה לאחר כל הוספת הדילול הבא כן.
  7. ב הדילול האחרון, לאחר ערבוב המדגם 5 פעמים, להשליך 50 μl של מדגם וירוס לתוך מיכל פסולת כדי להבטיח כרכים של דילולים שווים.
  8. בעת השלכת טיפים, ולשטוף כל קצה עם פתרון חיטוי מדלי פסולת כדי לטהר את צידו הפנימי והחיצוני של קצה לפני לגרשing קצה לתוך דלי פסולת.
  9. לאחר הדילולים נעשים, להגדיר את בארות הדילול בצד ולהתחיל aspirating תקשורת המבארת צלחות תרבית תאים, עוזב 500 μl של תקשורת בכל טוב של צלחת 6 באר.
  10. כאשר סיים עם פיפטה קצה, לשאוב חיטוי פתרון מדלי פסולת לראש פיפטה באמצעות ידני, נפח מתכווננת, בלחיצת כפתור פיפטור, כדי להבטיח טיהור נאותה של החלק הפנימי של פיפטה. השאר את הקצה לתוך הדלי פסולת עד תום הניסוי.
  11. ברגע התקשורת הוסרה מהצלחות, להוסיף 100 μl של המדגם הנכון לתוך הבאר ההנאה הצלחות מראש שכותרתו בשני עותקים, שינוי עצות כל אחד עבור כל דגימה.
  12. עם השלמת חיסונים assay פלאק, לרסס את בידיים עטויות כפפות עם פתרון חיטוי ולהשתמש במגבת נייר ספוגה פתרון חיטוי לנגב את החלק החיצוני של כל הצלחות לפני הצבת לוחות בחזרה לתוך החממה ביד. מִחָדָשׁכבול התהליך הזה עד שכל הצלחות בחזרה לתוך החממה.
  13. רוק הצלחות בתנועת דמות -8 מנת להבטיח פיזור נאות של המדגם על התאים כל 15 דקות במשך שעה 1.
  14. עם השלמת צלחות נדנדה, לחזור צלחות לתוך BSC Class II יחד עם תערובת של המדיום החיוני המינימאלי של 2x Eagle ו -1.6% נכאת, שכבת חצי מוצק כי קלה יותר לתמרן מ agarose משמשת לטיפול הכיסוי של assay פלאק.
  15. הוסף 2 מ"ל של תערובת כיסוי היטב כל צלחת 6-גם וסלע שוב בתנועה דמות -8 לחלוקה שווה של כיסוי לאורך פני השטח של הבאר. חזור על תהליך זה עד שכל המשמש גם הוא מעולף עם תערובת הכיסוי.
  16. ודא קצה פיפטה סרולוגיות לא נוגע כל נוזל בבארות כדי למנוע זיהום לחצות בעת ביצוע הליך הכיסוי.

סילוק פסול 4. והניקוי של מכשירי קבינט הבטיחות ביולוגי

<ol>
  • לחלוטין להטביע את כל חומרי הפסולת בתמיסת חיטוי 5% בתוך הדלי הפסול במשך זמן מגע של 10 דקות לפחות. לחטא טיפים פיפטה, טפטפות סרולוגיות, ופסולת אחרת כמתואר לעיל. בנוסף, לרסס את הדלי פסולת (מבפנים ומבחוץ) עם פתרון חיטוי 5% תנו הפתרון להישאר במגע עם הדלי פסולת במשך זמן מגע של 10 דקות.
  • בזמן ההמתנה בפעם קשר לחלוף על פסולת, לספוג במגבת נייר עם פתרון חיטוי 5%, לנגב מכשירים כגון micropipettes, ולהסיר אותם מן BSC. ספריי בידיים עטויות כפפות עם פתרון חיטוי 5% לפני הבאת בידיים עטויות כפפות מחוץ BSC Class II.
    1. לאחר הסרת micropipettes מן BSC, לנגב אותם עם מגבת נייר נפרדת עם פתרון אתנול 70%, כדי למנוע הצטברות דביקה על המכשירים. ריסוס כל המכשירים כי לא יכול להימחק, הלכה למעשה, עם חומר חיטוי 5% ולהשאיר במגע עם הפתרון של BSC במשך 10 דקות.
  • לאחר זמן מגע מספיק, להסיר את כל הפריטים מן BSC. קח פריטים, כולל דלי פסולת המכילה חומרי פסולת, לכיור. לשטוף פריטים שניתן לעשות בה שימוש חוזר כדי להסיר שאריות חומר חיטוי. להחזיר את כל הפריטים למקומות האחסון שלהם.
  • נקה את משטח העבודה של BSC Class II, הצדדים ארון ובחזרה, פנים של זכוכית, ואת האבנט 1 עם פתרון חיטוי 5% ואחריו פתרון אתנול 70%.
  • משוך החוצה לרוקן את טפטפות סרולוגיות מן טפטפות סרולוגיות דלי והמקום הפסולים-לחטא משטח במגשים פיפטה נפרד עבור מעוקר (טפטפות סרולוגיות יכולות להוות סכנת הדיאזים עלולים להיקרע דרך שקית האשפה. מניח טפטפות אלה במכל קשיח-צדדי לפני מעוקר).
  • שופך את תכולת הדלי פסולת לתוך מסננת הממוקמת בתחתית הכיור.
  • תביא מיכל פסול Biohazard כי הוא ששקית Biohazard אדומה לכיור ושופך את תכולתו של strainer לשקית Biohazard האדום. אל תושיט יד לתוך מסננת כדי להסיר טיפים micropipette שעשויים מקל הפנימי של מסננת. הכה את המסננת לאורך הצד הפנימי של המכל פסולת עד שכל הטיפים מוסרים, או להשתמש פינצטה להסיר טיפים מן המסננת.
  • יש לשטוף את הדלי ומקום פסולת לייבוש על מתלה ליד הכיור.

    • 5. פסולת מעוקרת

    1. מוציא את שקית Biohazard מן מיכל הפסול Biohazard ומניח מגש חיטוי על עגלה.
    2. השאר שקיות Biohazard פתוחות ומניח חתיכת סרט חיטוי על החלק החיצוני של התיק, חיבור צידי מגש החיטוי לשמור על השקית המאובטחת במגש.
    3. מניח שתי חתיכות של נייר חיטוי על מגש קצה פיפטה סרולוגיות ולתייג אותה עם ראשי התיבות של אחד ואת התאריך. מניחים את המגש פיפטה סרולוגיות על העגלה עם מגש החיטוי.
    4. פתח את החיטוי. חבר את טעינת חיטוי בתנאי / ca הפריקהrt אל החיטוי ולהוציא את פלטפורמת החיטוי נשלף לנוח על העגלה.
    5. הסר את מוט מתכת החיטוי ולפתוח העליון. מניח בקבוקון אינדיקטור ביולוגי המכיל נבגים של Geobacillus stearothermophilus לתוך מוט המתכת לבדוק כי מחזור עיקור החיטוי הושלם בהצלחה.
    6. מניח את מוט המתכת למרכז התיק פסולת במגש החיטוי אך להבטיח כי מוט המתכת עדיין נגיש בקלות.
    7. מניח במגש חיטוי מלא בפסולת ומגש פיפטה סרולוגיות אל רציף החיטוי נשלף ולדחוף אותו בחזרה לתוך החיטוי.
    8. לנתק את טוען עגלת החיטוי / פריקה מן החיטוי ולסגור את דלת החיטוי.
    9. הפעל את החיטוי.
    10. אל תשאיר את החיטוי עד המחזור החל. מסך ההפעלה של החיטוי יציין הזמן הנותר כי הריצה.
    11. לאחר ריצת החיטוי תושלם, להסיר את ind הביולוגיicator ולהעריך לצמיחה על ידי חימום חממה שצוינה. אם הצמיחה מזוהית על אינדיקטור הביולוגי, להפעיל מחדש את האשפה ב החיטוי, ולהעריך מחדש מחוון. אם אין צמיחה מזוהית, להסיר את האשפה מהמתקן.

    6. דוגמה: תיקון וצביעת מבחני פלאק

    1. לאחר מספר מתאים של ימים (התלויה על הנגיף בשימוש) עבר, לחזור בחזרה למעבדה ולבצע צעדים ממקטעים 1 ו -2 שוב.
    2. מוציאים בזהירות צלחות assay פלאק מן החממה הושלמה בשלב 3.1.2, ומקום לתוך השנייה BSC מחלקה ביד.
    3. פיפטה את כל החומר מדיה כיסוי ולחלק לתוך מיכל פתרון חיטוי ולהחליף בתערובת של נייטרלי שנאגרו פורמלין 10% וסגול קריסטל 0.8% 12,13. תן לתערובת להישאר על הצלחות במשך 30 דקות כדי להשבית את הנגיף על הצלחות.
    4. לאחר איון, להסיר בזהירות את ניטראליתערובת ומקום סגולים פורמלין / קריסטל שנאגר בתוך מיכל פסולת נפרד להיות מנוטרל לפני הסילוק.
    5. ספריי בידיים עטויות כפפות בחומר חיטוי ולנגב את החלק החיצוני של הצלחות לפני שחילק להם את BSC Class II כפי שתואר לעיל.
    6. המשך לכיור, לשטוף את הצלחות להסיר את כתם עודף, ולאחר מכן למקם את הצלחות על עגלה לייבוש.
    7. לאחר הצלחות הן יבשות לחלוטין, להשתמש בקופסא אור לספור את הפלאק. להקליט את כל הרוזנים לחשב titers וירוס מהמשוואה הסטנדרטית (איור 3 ב).

    7. הסרת דוגמאות ממעבדת BSL-4

    1. להשבית כל דגימות כי יהיה לטפל בתנאי מעבדה BSL-2. בצע אחת משתי שיטות שאושרו על ידי משרד הבטיחות הביולוגי הפנימי בבית 1,14 IRF-פרדריק באמצעות 10% ניטראלי שנאגר פורמלין (NBF) או Trizol LS (פנול, isothiocyanate guanidine, thiocyanate אמוניום, סודיום יצטט, גליצרול). העברת samples לצינור או צלחת נקי חדשים מחוץ BSC לפני האריזה להסרה ממעבדת BSL-4.
    2. מחממים חותמים דגימות מומתות צינורות או צלחות בנרתיק חום חותם המכיל חומר חיטוי מספיק 5% או פתרון מקבע לחטא את החלק הפנימי של התיק החיצוני של דוגמיות עוברת העברה לצאת ממעבדת BSL-4. מניחים שקיק זה לתוך כיס אחר הבא באותו הליך.
    3. חותם את הכיס השני והמקום נרתיק אטום-חום לתוך טנק דאנק המכיל פתרון חיטוי 5% לפחות 10 דקות כדי לחטא את החלק החיצוני של כיס-חום אטום.
    4. מלא את ספר יומן טנק דאנק בתוך המעבדה ידי התוויית המספר והגודל של צינורות, נפח צינורות, הסוכן שיושם, שיטת איון בשימוש, מקום שבו דגימות תועברנה.
    5. לתאם עם עמית בצד החיצוני של מעבדת BSL-4 כדי לאחזר את השקיק מטנק דאנק ולקחת דגימות למעבדת BSL-2.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    בעקבות הליכים נאותים בתוך המעבדה BSL-4 הם חיוניים להבטחת השלמה בטוחה ויעילה של מבחנים. על ידי פניית הרשימה הפנימית היומית הושלמה (איור 1), צוות המעבדה להבטיח הציוד כי הוא מבצעי מלא. מיצוב גוף עצמו בשעה במרכז BSC מבטיח כי הניסוי מתבצע בתנאי זרימת האוויר אופטימליים (איור 2). מדגם הווירוס הוא מדולל סדר להשיג צלחות שיש 30-300 הפלאק לכל צלחת (איור 3 א) ולקבוע כייל נגיף (איור 3B). מספר גורמים משפיעים על היווצרות הפלאק, כולל כמיהות וירוס לקווי תא מארח, טכניקת חיסון, תנאים לצמיחת וירוס, מגוון דילול מתאים, ואת כיסוי מבחר 8. פסולת של BSC במהלך ההליך היא לחטא כראוי לפני ההסרה מן BSC ושוב על ידי מעוקר לפניכיציאה אל מחוץ לסביבה BSL-4. על ידי ביצוע הליכים אלה, אין זיהומים רכשה מעבדה הוקלטו במהלך המחקר BSL-4 על IRF-פרידריך.

    איור 1
    איור 1:. Checklist מערכות פנימיות היומי לדוגמא השלמה יומית של רשימת תיוג זו מבטיחה כי צוות המעבדה בדק ציוד בתוך המעבדה (ובראש והראשון עם BSC) לפני ייזום עבודה. אם BSC יימצא מחוץ לטווח מכויל, BSC זה לא חייב להיות בשימוש, ותחזוקה יש להודיע. כל BSCs חייב להיות מכויל כראוי ומתפקד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 2
    דמות 2:. חזרה ונוף צדדי של דגימות pipetting מומחה מעבדה בתוך ארון בטיחות ביולוגית Class II (א) דלי פסולת המכילה פתרון חיטוי צהוב טפטפות בהם נעשה שימוש הם בצד ימין של צלחות היטב (B), ואת בקבוק חיטוי ספריי היא בצד ימין של הדלי פסולת (א). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    איור 3
    איור 3: חישוב כייל הנגיף של מדגם כייל ויראלי מבוטא יחידות פלאק ויוצרים (pfu) לכל מ"ל.. כדי לחשב את כייל הנגיף, לספור את מספר הפלאק ברורים (pfu) ולחלק תוצר של גורם לדילול (ד) פעמים את היקף וירוס בדילול הוסיף לבאר (V).ד / 53600 / 53600fig3large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    עבודה במעבדת BSL-4 דורשת זמן ניכר ותשומת לב לפרטים. כל סוג של עבודה בסביבה זו מחייבת מאומנת היטב, יסודי, ויחידים מצפוניים. את assay רובד נגיפי התקן קובע מודל מדויק של הליך נפוץ לעבודה עם פתוגנים גבוהה תוצאה במעבדה BSL-4, כמו assay כרוך מושגים מרכזיים בהם עובדי מעבדה חייב להיות מאומן.

    הרעיון הגדול הראשון הוא השימוש הנכון ויישום של שיטות בטוחות Class II BSC, אשר מתפקד בתור בלימה עיקרית פתוגנים גבוהה מכך. הבנה של איך פונקציות BSC Class II יכתיבו שיטות שבגדול להגביל סיכוני החשיפה ליחידים. זרימת עבודה מ באזור נקי ( "הצד נקי") לאזור מזוהם ( "הצד מלוכלך") על פני אזור העבודה Class II BSC גם עוזר למנוע זיהום צולב 11. חומרים נקיים מזוהמים לאספקהies צריך להיות הפרדה כדי להגביל את תנועתם של פריטים מזוהמים על פריטים נקיים.

    הרעיון העיקרי השני הוא ניהול פסול פיזיקליים וביולוגי. אמצעים נאותים סילוק שני סוגי הפסולת חיוניים על מנת להבטיח כי מומחי המעבדה לשמור על בטיחות ועל הסביבה אינה מזוהמת. שלבים במהלך ניסוי נועדו להשבית ולהרוס פתוגנים לפני דגימות מובאות מתוך מעבדת BSL-4. דוגמאות של שלבים קריטיים אלו כוללות: pipetting חיטוי לתוך כל קצה, ומאפשר לפחות זמן מגע 10 דקות של חומרים מזוהמים בחומרי חיטוי, פסולת מעוקרת, והאימות סטריליות במהלך מחזורי חיטוי. צעדים אלה נועדו להיות מיותרים על מנת להבטיח השמדת פתוגנים גבוהה מכך.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Micro-Chem Plus National Chemical Laboratories 255
    Ethanol Fisher BP2818500
    2 ml 96-Deep Well Plates Fisher 278743
    10 ml Serological Pipette Fisher 13-678-11E
    25 ml Serological Pipette Fisher 13-678-11
    6-well plates Fisher 140675
    Crystal Violet Sigma HT90132-1L
    10% Neutral Buffered Formalin Fisher 22-050-105
    Tragacanth Fisher 50-702-2000 
    20 μl Pipette Tips Fisher 21-402-550
    200 μl Pipette Tips Fisher 21-402-561
    1,000 μl Pipette Tips Fisher 21-402-581
    DMEM Lonza 12-604Q
    FBS Sigma F2442-500mL
    Penicillin/Streptomycin Lonza 17-602E
    2x EMEM Quality Biological 115-073-101
    Pipettor Drummond 4-000-101
    1,000 μl Pipette  Rainin  L-1000XLS+
    200 μl Pipette  Rainin  L-200XLS+
    12-Well, Multichannel 200 μl Pipettor Rainin L12-200XLS+
    8-Well, Multichannel 1,000 μl Pipettor Rainin LA8-1200XLS
    Attest Express Medical Supplies  MMM12192
    Autoclave Getinge GEB 2404 AMB-2
    Autoclave Bag Fisher 01-828E
    2,000 ml Beaker Fisher 02-591-10H
    Autoclave Tray Fisher 13-359-20B
    Pipette Tray Fisher 13-361-5
    37 °C Incubator Fisher WU-39321-00
    Biohazard Can Rubbermaid Commercial FG614500 RED
    Autoclave Tape Fisher 15-903
    Autoclave Rod Made by IRF Facility N/A
    Light Box Fisher S11552
    Heat Sealer Fisher NC9793612 
    Heat Seal Pouches Fisher 01-812-25H
    Biohazard Bag Fisher 01-828E

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 5th edn. Chosewood, L. C., Wilson, D. E. , , U.S. Dept. of Health and Human Services. Washington, D.C. Available from: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/ (2009).
    2. Bioterrorism agents/diseases by category. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA, USA. Available from: http://emergency.cdc.gov/agent/agentlist-category.asp (2014).
    3. Executive order 13546 -- Optimizing the security of Biological Select Agents and Toxins in the United States. , The White House, Office of the Press Secretary. Washington, DC. Available from: http://www.whitehouse.gov/the-press-office/executive-order-optimizing-security-biological-select-agents-and-toxins-united-stat (2010).
    4. Shurtleff, A. C., et al. The impact of regulations, safety considerations and physical limitations on research progress at maximum biocontainment. Viruses. 4, 3932-3951 (2012).
    5. de Kok-Mercado, F., Kutlak, F. M., Jahrling, P. B. The NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Appl Biosafety. 16, 58-66 (2011).
    6. Keith, L., et al. Preclinical imaging in BSL-3 and BSL-4 envrionments: imaging pathophysiology of highly pathogenic infectious diseases. Pharmaco-imaging in drug and biologics development. Moyer, B. R., Cheruvu, N. P. S., Hu, T. , Springer-Verlag. New York, NY. (2014).
    7. Janosko, K., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Laboratory Suite Entry and Exit Procedures. J Vis Exp. , (2015).
    8. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. , e52065 (2014).
    9. Gonzalez-Hernandez, M. B., Bragazzi Cunha, J., Wobus, C. E. Plaque assay for murine norovirus. J Vis Exp. , e4297 (2012).
    10. Biosafety manual for Texas Tech University. , Texas Tech University. Lubbock, TX. Available from: http://www.depts.ttu.edu/ehs/web/docs/ttu_biosafety_manual.pdf (2005).
    11. Working safely in your NuAire biological safety cabinet. , NuAire. Plymouth, MN. Available from: http://ors.uchc.edu/bio/resources/pdf/3.2.3.A.3_nuaireBSC.pdf (2015).
    12. Alfson, K. J., et al. Particle to plaque-forming unit ratio of Ebola virus influences disease course and survival in cynomolgus macaques. J Virol. , (2015).
    13. Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the filovirus plaque assay for use in preclinical studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
    14. Blow, J. A., Dohm, D. J., Negley, D. L., Mores, C. N. Virus inactivation by nucleic acid extraction reagents. J Virol Methods. 119, 195-198 (2004).

    Tags

    זיהום גיליון 116 בטיחות ביולוגית בטיחות ביולוגית ברמת 4 BSL4 BSL-4 Class II biosafety ממשלה Class II BSC בלימה גבוהה אטימה מרבית ציוד מגן אישי PPE פרוטוקול בסיסי

    Erratum

    Formal Correction: Erratum: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices
    Posted by JoVE Editors on 12/05/2016. Citeable Link.

    A correction was made to the authors section in: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices

    One of the authors names was corrected from:

    Nicole Joselyn

    to:

    Nicole Josleyn

    אמצעי בטיחות ונהלי הפעלה בבית (א) BSL-4 מעבדה: 2. שיטות כלליות
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Mazur, S., Holbrook, M. R.,… More

    Mazur, S., Holbrook, M. R., Burdette, T., Josleyn, N., Barr, J., Pusl, D., Bollinger, L., Coe, L., Jahrling, P. B., Lackemeyer, M. G., Wada, J., Kuhn, J. H., Janosko, K. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices. J. Vis. Exp. (116), e53600, doi:10.3791/53600 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter