Summary
Het doel van dit protocol is om niet-invasief beoordelen cardiale structurele en functionele veranderingen in een muismodel van hart-en vaatziekten door dwarse aorta vernauwing, met behulp van B- en M-mode echocardiografie en kleur / pulse wave Doppler imaging.
Protocol
Het protocol volgt de richtlijnen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de University of Washington.
1. Chirurgische Procedure en Voorbereiding voor Imaging
- Betreft C57BL / 6 muizen TAC of sham operatie zoals eerder beschreven 10.
- Een week na TAC gevarieerde ingrepen verdoven de muis in de inductie kamer met 2% isofluraan gemengd met 1 l / min O 2. Bevestig de juiste verdoving door ongevoeligheid tot teen of staart knijpen. Gebruik veterinaire zalf op de ogen tot droog te voorkomen dat tijdens het onder narcose. Verwijder het borsthaar door het toepassen van ontharingscrème. Ontsmet muis huid met 70% ethanol.
- Zet de muis om een dier-handling platform in de rugligging. Om een stabiel niveau van anesthesie te behouden, gebruik dan een neuskegel tot 0,5 leveren - 1% isofluraan gemengd met 1 l / min O 2.
- Toepassen elektrodengel aan de poten van de muis en plak ze het elektrodekussen.
- Plaats een rectale sonde om de lichaamstemperatuur te controleren. Handhaaf de lichaamstemperatuur op 37 ° C via een verwarmingselement of lamp.
- Breng een laagje voorverwarmde ultrasoongel de muis borst, vooral het gebied ligt over het hart. Let op: verwijder ultrasound gel en droog de muis met een steriel gaasje na de beeldvorming procedure.
2. In de aortaboog View, gebruik B-modus en Doppler Imaging te evalueren Transversale Aorta Vernauwing
- Met de B-instelling in de aortische boog weergave verkrijgen om de aorta, hoofdwegen takken en de vernauwing ter visualiseren.
- Kantel de linkerkant van het platform zo ver mogelijk voor de muis in linker decubitus positie te draaien. Houd de ultrasone transducer van stand in verticale positie en plaats het op de borst langs de rechter parasternale lijn, met de inkeping wijzend in de richting van de kin van de muis. Let op: niet te comprimeren de muis thorax bij het verlagen van de transducer; minimale hoeveelheid druk vereist.
- Kantel de transducer tot op het niveau van schouderblad en draai iets naar rechts draaien totdat aortaboog in zicht komt. Observeer de dwarse aorta vernauwing aanwezig, die zich tussen het vertakkingspunt onbenoemde slagader (IA) en linker gemeenschappelijke halsslagader (LCCA) (figuur 1).
Opmerking: geen vernauwing waargenomen in schijn-geopereerde muizen.
- Klik "color Doppler" op het werkstation te schakelen naar kleur Doppler modus om richting en snelheid van de bloedstroom in de insnoering plaats te controleren. Verwerven en beelden op te slaan door te klikken op de "cine store" knop.
- Klik op de knop "PW Doppler" over te schakelen naar pulse wave Doppler-modus, en de plaats monster volume (de gestippelde cursor doos) onmiddellijk distaal van de vernauwing site om te zoeken naar de vernauwde jet met de hoogste snelheid, klik vervolgens op de "PW Doppler" knop om golfvormen van aorta fl te verkrijgenow en meet pieksnelheid (figuur 2).
- Bereken drukgradiënt over de vernauwing site met behulp van de gemodificeerde Bernoulli-vergelijking: druk gradiënt = 4 x V max 2. Neem alleen muizen met een drukgradiënt bereik 40-80 mmHg voor verdere analyse.
3. In de parasternal Long As View, gebruik B-modus en de M-modus Imaging te beoordelen Cardiac Maten en contractiliteit
- Met de muis liggen in rugligging op het platform, houdt u de transducer in verticale wijze met de inkeping wijzend naar het hoofd van de muis. Laat de transducer op de thorax parallel aan de linker parasternale lijn en draai 30 ° tegen de klok in.
- Gebruik de B-modus beeldvorming tot een volledige lange as "sagittale" uitzicht op het hart te verkrijgen. Pas de hoek van de transducer en focus diepte linkerventrikel, het intraventriculaire septum wand en een kleine portie van de rechter ventrikel wand visualiseren. Save de afbeeldingen voor latere metingen van cardiale wanddikte en kamer dimensie. Met behulp van "cardiale pakket", selecteert u parameters zoals IVS of LVAW, LVID en LVPW en klik op de afbeelding om overeenkomstige lijnen te trekken voor elke parameter om de metingen te verkrijgen.
- Observeer hartwand bewegingspatronen en controleren op mogelijke beweging afwijkingen, met inbegrip van akinesie, hypokinesie en asynchronie.
Opmerking: Akinesie en hypokinesie duiden volledig en gedeeltelijk verlies van de beweging van de hartwand, respectievelijk. Asynchrony geeft onregelmatige, ongecoördineerde hartwand beweging. - Overschakelen naar M-modus place M-modus cursor loodrecht op de LV wanden ter hoogte van de papillaire spier en afbeeldingen voor latere meting van cardiale afmetingen en fractionele verkorting (figuur 3) te verkrijgen.
4. In de parasternal korte as View, gebruik B-modus en de M-modus Imaging te beoordelen cardiale morfologie en functie
- FrOM de parasternale lange as te bekijken, krijgen parasternale korte view as door het draaien van de transducer 90 ° met de klok mee. Stel de transducer om een horizontale doorsnede "dwars" met het hart in B-modus geven, zowel papillaire spieren zichtbaar en aan de rechterzijde (de 2 en 4 uur positie).
- Overschakelen naar M-modus en zet de M-modus as op het mid-level van de linker hartkamer. Verwerven en afbeeldingen opslag voor latere metingen van cardiale wanddikte kamer dimensie en fractionele verkorting (figuur 4). Met behulp van "cardiale pakket", selecteert u de parameters in SAX (korte as), met inbegrip van IVS of LVAW, LVID en LVPW, en klik op de afbeelding om overeenkomstige lijnen te trekken voor elke parameter om de metingen te verkrijgen.
Opmerking: Metingen hier verkregen wanneer nauw correleren met die verkregen in de parasternale lange as aanzicht (figuur 5).
5. In de apicale Four-chamber View, gebruikDoppler Imaging om systolische en diastolische functie Assess
- Het verkrijgen van de apicale vier-kamer oog op zowel de linker en rechter ventrikels te visualiseren met de atria aan de onderkant van het scherm. In de B-mode, van de korte as, Gekanteld de linkerbovenhoek van het platform om de hoek het hoofd van de muis naar beneden en oriënteren de transducer naar de rechter schouder van de muis. Dit is in wezen een "coronale" uitzicht op het hart te kijken naar de top te bereiken.
- Visualiseren de mitralisklep in B-modus en schakelt kleur Doppler-stand plaatsen van het monstervolume (het gestippelde vak cursor) op het puntje van de mitralisklep.
- Overschakelen naar PW Doppler-modus om stromingspatronen beoordelen over de mitralisklep. Lijn de Doppler sonde cursor evenwijdig aan de richting van mitrale bloedstroming. Gebruik een probe hoek kleiner dan 20 ° pieksnelheid (Figuur 6) te bepalen.
- Sla de foto's voor later metingen. Gebruik "cardiale pakket" en selecteer "MV stroom. "Klik op elke parameter en trek overeenkomt lijnen om de metingen te verkrijgen beschikbare metingen zijn onder andere:. Piek E velocity (vroege vullen met actieve hartkamerrelaxatie), piek A velocity (late vullen met atriale contractie), mitralisklep isovolumetrische ontspanning en contractie tijden (IVRT en IVCT respectievelijk), en ejectie tijd (ET).
- Bereken hartspierprestatie index (MPI) van MPI = (IVCT + IVRT) / ET.
6. Post-procedurele behandeling van dierlijke
- Geven analgesie en / of steriele zoutoplossing intraperitoneaal chirurgische dieren wanneer nodig.
- Laat het dier te laten bekomen op een verwarmingselement in buikligging. Heeft een dier niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven. Heeft een dier dat de procedure heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld niet meer terug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de B-modus beelden van de aortaboog weergave van de muis hart onderworpen aan sham (figuur 1A) of TAC chirurgie (Figuur 1B). De aortaboog, innominate slagader, linker gemeenschappelijke halsslagader, en de linker subclavia worden getoond. Merk op dat de aorta vernauwing is duidelijk zichtbaar in TAC, maar niet sham hart. Color Doppler beelden van aorta-view zijn weergegeven in figuur 2A. De golfvormen van de aorta stroom over de vernauwing site zijn gevangen genomen door PW Doppler imaging (Figuur 2B). Succesvolle TAC leidt tot een aanzienlijk toegenomen stroomsnelheid stroomafwaarts van de vernauwing locatie (meestal ~ 4 m / sec TAC muizen). Drukgradiënt over de vernauwing berekend op basis van de piek stroomsnelheid volgens de gemodificeerde Bernoulli-vergelijking (Figuur 2C).
figuur 3 (figuur 3A) of TAC hart (Figuur 3B). Het bovenste paneel toont de B-modus beelden van de linker ventrikel, het septum, en een gedeelte van het rechterventrikel van sham of TAC muizen. Het onderste paneel toont de M-mode traces van een aantal cardiale cycli van sham of TAC muizen. De afmetingen van cardiale afmetingen worden weergegeven, inclusief de linker ventrikel anterior wanddikte (LVAW), linker ventriculaire binnendiameter (LVID), linkerventrikel posterieure wanddikte (LVPW) in diastole en systole. Opmerking aanzienlijk toegenomen wanddikte in de muis hart onderworpen aan TAC in vergelijking met sham operatie.
Figuur 4 toont beelden van de parasternale korte as uitzicht op sham (Figuur 4A) of TAC hart (Figuur 4B). Het bovenste deel van elk paneel toont het M-mode as (de dotted lijn) in het midden van de linker ventrikel. Het onderste gedeelte van elk paneel is de M-modus tracing met lijnen die cardiale afmetingen zoals hierboven beschreven. Als marker van hypertrofie, ventriculaire septum en wanddikte nauwkeurig kan worden bepaald. Muizen onderworpen aan TAC toonde verhoogde wanddikte gemeten met LVAWd en LVPWd, ventriculaire dilatatie zoals beoordeeld door LVISd en LVISs, verminderde contractiliteit zoals beoordeeld door LVFS en LVEF en verhoogde LV massa (Figuur 5).
Figuur 6 toont B-modus apicale vier kamermuziek (figuur 6A, B) en PW Doppler afbeeldingen transmitraal stromingspatronen (figuur 6C, D). Metingen van de piek E en A snelheid IVCT, IVRT en ET worden weergegeven. De E / A ratio en MPI berekend (Figuur 6E - I). Een gezond hart muis heeft een E / A-ratio ≥1 en een MPI waarde ≤0.5. In pathologische condities met diaStolić of systolische hartfunctie, zoals bij muizen blootgesteld aan TAC, een verminderde E / A-verhouding en / of een verhoogde MPI waarde worden typisch waargenomen.
Figuur 1. B-modus beeld van de aortaboog Gezien muizenhart Onderworpen aan Surgery (A) of TAC (B) Sham. Bekende aorta branches waaronder anonyma arterie (IA), linker gemeenschappelijke halsslagader (LCCA) en linker subclavia (LSA) getoond. Merk op dat dwarse aorta vernauwing (aangegeven door de witte pijl) kunnen worden gevisualiseerd in TAC, maar niet sham hart. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Kleur / PW Doppler beeldvorming van de Transverse Aorta Blood Fow van de aortaboog View. Color (A) en PW (B) Doppler beelden van sham en TAC harten worden getoond. Extra aorta snelheid verkregen PW Doppler beeldvorming wordt gebruikt om drukgradiënt te berekenen volgens de gemodificeerde Bernoulli vergelijking (C). Deze gegevens bevestigen een succesvolle TAC chirurgie met de drukgradiënt van ~ 70 mmHg. * P <0,05 vs. Sham. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± sem n = 15 Sham en n = 13 TAC. T-test Student's werd gebruikt om statistische significantie te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. parasternale Long As (PLAX) Zicht op de muis Hart Onderworpen aan Surgery (A) of TAC (B) schijnvertoning. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken .
Figuur 4. parasternale korte as (PSax) Zicht op de muis Hart Onderworpen aan Surgery (A) of TAC (B) schijnvertoning. M-modus beelden geven de plaatsing van het monster volume (gestippelde gele lijn in het bovenste paneel) en meting van cardiale afmetingen in diastole en systole (blauwe lijnen in het onderste paneel). De sterretjes geven papillairspieren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Echocardiografie Beoordeling van Cardiac morfologische en functionele veranderingen na TAC. M-modus beeldvorming in korte as oog werd uitgevoerd zoals in figuur 4. (A) LVAWd, linker ventrikel anterior wanddikte in diastole. (B) LVPWd, linkerventrikel posterieure wanddikte in diastole. (C) LVIDd, linkerventrikel inwendige diameter in diastole. (D) LVIDs, linker ventriculaire interne diameter in systole. (E) LVFS, linker ventrikel fractionele verkorting. LVFS (%) = (LVIDd-LVIDs) / LVIDd x100%. (F) LVEF, linker ventrikel ejectiefractie. LVEF (%) = (LVEDV-LVESV) / LVEDV x100%. LVEDV en LVESV duiden linker ventrikel eind diastolische en eind systolische volume, respectievelijk. LV volume en ejectiefractie worden nauwkeurig beoordeeld door Simpso n methode. LV volume wordt geschat door het aanbrengen van een groot aantal schijven in het ventrikel: Simpson volume = [gebied (1) + gebied (2) + ... + gebied (n)] x lengte. Simpson gebied en de lengte worden verkregen door het traceren van de endocardgrens van de LV in de lange as en de korte as uitzicht. (G) LV (linker ventrikel) massa. LV massa (mg) = 1,05 x [(LVIDd + LVPWd + IVSd) 3 - (LVIDd) 3]. De factor 1,05 is de specifieke dichtheid van het myocardium. (H) HR, hartslag. * P <0,05 vs. Sham. Het aantal muizen geanalyseerd wordt in de staven van elk paneel. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM t-toets werd gebruikt om statistische significantie te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
p_upload / 54101 / 54101fig6.jpg "/>
Figuur 6. Beoordeling van transmitraal Blood Flow van Doppler Imaging. (A en B) B-mode apicale vier-kamer uitzicht op sham (A) of TAC (B) hart. LV, linker ventrikel; RV, rechter ventrikel; MV, mitralisklep; TV, tricuspidalisklep; LA, linker atrium; RA, rechter atrium. (C en D) PW Doppler golfvorm van trans-mitrale doorbloeding sham (C) of TAC (D) hart. Relevante metingen worden getoond. (E) E / A, piek E en A snelheidsverhouding. (F) IVCT, isovolumetrische contractie tijd. (G) IVRT, isovolumische ontspanning tijd. (H) ET, uitwerpen tijd. (I) MPI, myocard prestatie-index. * P <0,05 vs. Sham. Het aantal muizen geanalyseerd wordt in de staven van elk paneel. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde77; sem t-toets werd gebruikt om statistische significantie te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Echocardiografie is op grote schaal gebruikt om de hartfunctie in knaagdier modellen van hart-en vaatziekten 2,6 beoordelen. In vergelijking met invasieve of terminal methodieken zoals druk-volume lus meting 11 en ex vivo werken hart 12, echocardiografie biedt een krachtige, niet-invasieve tool om lopende cardiale structurele en functionele veranderingen in levende dieren te beoordelen. Betrouwbare gegevens te verkrijgen, is het belangrijk om de lichaamstemperatuur en hartslag binnen fysiologische bereik 13 handhaven door zorgvuldige aanpassing van de verwarmingsinrichting en de anesthesie niveau. Alle afbeeldingen moeten worden vastgelegd en geanalyseerd consequent volgens de gestandaardiseerde beeldvormende procedures voor de vergelijking tussen muizen van verschillende stam of genotype vergemakkelijken.
TAC wordt vaak gebruikt om cardiale hypertrofie en hartfalen in muizen induceren 1. Niet-invasieve drukmeting gradiënt over de vernauwing website van Dopplerbeeldvorming is een betrouwbare beoordeling van de mate van drukoverbelasting bij muizen. Succesvolle TAC produceert typisch een drukgradiënt ≥40 mmHg. Alleen muizen om een gelijkaardige mate van drukoverbelasting worden opgenomen voor verdere analyse, terwijl muizen met een drukgradiënt te laag of te hoog worden uitgesloten. Na TAC worden muizen verwacht harthypertrofie binnen 1-2 weken en hartdilataties ontstaan na 4 weken, afhankelijk van de mate van drukoverbelasting en de genetische achtergrond van de geteste muizen. De dynamische remodellering en functionele veranderingen na TAC betrouwbaar worden beoordeeld door echocardiografische beeldvorming zoals hierboven beschreven.
In tegenstelling tot zijn frequent gebruik bij de mens 14, kleur / PW Doppler is pas sinds kort verkrijgbaar in knaagdieren echografie 9 geweest. Hier beschrijven we ook de toepassingen van Doppler meten drukgradiënt evenals systolische en diastolische prestatie. Maatregelment van de mitralisklep en tricuspidalisklep bloedstroom richting en snelheid (bijv., E / A ratio, IVRT, IVCT, ET, en MPI) levert belangrijke informatie op de hartfunctie. Zo echocardiografische beeldvorming vormt een belangrijk instrument om de cardiale fysiologie en pathofysiologie studeren in kleine dieren.
De beperking van cardiale ultrageluid beeldvorming is gerelateerd aan meting variabiliteit en reproduceerbaarheid. Om inter- en intra-operator variabiliteit te verminderen, is het belangrijk om te standaardiseren hoe de beelden worden verkregen en geanalyseerd. De metingen worden uitgevoerd vanuit meerdere vensters en akoestische modes (B-modus, M-modus en PW / color Doppler) en tenminste 3 afzonderlijke metingen worden gemiddeld om de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid. Bovendien zijn er beperkte akoestische ramen en beelden soms lage kwaliteit worden verkregen in kleine knaagdieren onderworpen aan chirurgische procedures zoals TAC, door delen zwelling, chirurgische littekens en longoedeem die interfereren met de ultrasonebalken. Voor Doppler, soms is het moeilijk om afzonderlijke E en A golven en het verkrijgen van een volledige golfvorm van de mitrale stroom, als gevolg van een relatief hoge hartslag in kleine knaagdieren, vooral muizen blootgesteld aan TAC of MI chirurgie. Het verlagen van de hartslag kan nuttig zijn om metingen te krijgen, maar dit beïnvloedt verkregen waarden Doppler beeldvorming en dus de interpretatie van gegevens.
Met de recente technische ontwikkelingen, onlangs vrijgegeven ultrasone systemen bieden een hoge resolutie en frame / sampling rates om nauwkeurige kwantitatieve meting te garanderen in kleine dieren. Echocardiografie nieuwe technologieën zullen ook de gevoeligheid van echocardiografische evaluatie van de hartfunctie verbeteren en mogelijk vroegtijdige detectie van cardiale pathologie. Zo heeft speckle-tracking-strain imaging 15 gebruikt om nauwkeurig te meten plaatselijke myocardiale functie. Nieuwe transducer technologieën die momenteel in ontwikkeling zal het potentieel voor real-time, 3D of 4D verschaffenbeeldvorming. Contrast echocardiografie die in geavanceerde ontwikkeling zal zorgen voor volumetrische metingen, weefselperfusie assessments, moleculaire beeldvorming van hart-en vaatziekten, en de levering van therapeutische middelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia equipment | Harvard Apparatus, 84 October Hill Road Holliston, MA |
723015 | |
| Vevo 2100 Imaging System | VisualSonics Inc., 3080 Yonge Street Suite 6100, Box 66, Toronto, Ontario, Canada | Vevo 2100 | |
| Aquasonic ultrasound gel | Parker Laboratories, 286 Eldridge Rd, Fairfield, NJ | 03-50 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare, Inc, 3950 Schelden Circle Bethlehem, PA |
NDC 66794-017-25 | |
| F/air anesthesia gas filter unit | A.M. Bickford, Inc, 12318 Big Tree Rd, Wales Center, NY | 80120 |
References
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- Tanaka, N., et al. Transthoracic echocardiography in models of cardiac disease in the mouse. Circulation. 94 (5), 1109-1117 (1996).
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2 (2), 138-144 (2009).
- Heineke, J., Molkentin, J. D. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 589-600 (2006).
- Oka, T., et al. Cardiac-specific deletion of Gata4 reveals its requirement for hypertrophy, compensation, and myocyte viability. Circ Res. 98 (6), 837-845 (2006).
- Gardin, J. M., Siri, F. M., Kitsis, R. N., Edwards, J. G., Leinwand, L. A. Echocardiographic assessment of left ventricular mass and systolic function in mice. Circ Res. 76 (5), 907-914 (1995).
- Respress, J. L., Wehrens, X. H.
- Pistner, A., Belmonte, S., Coulthard, T., Blaxall, B. Murine echocardiography and ultrasound imaging. J Vis Exp. (42), e2100 (2010).
- Patten, R. D., Aronovitz, M. J., Bridgman, P., Pandian, N. G. Use of pulse wave and color flow Doppler echocardiography in mouse models of human disease. J Am Soc Echocardiogr. 15 (7), 708-714 (2002).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H.
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Bátkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3 (9), 1422-1434 (2008).
- Larsen, T. S., et al. The isolated working mouse heart: methodological considerations. Pflugers Arch. 437 (6), 979-985 (1999).
- Roth, D. M., Swaney, J. S., Dalton, N. D., Gilpin, E. A., Ross, J. Jr Impact of anesthesia on cardiac function during echocardiography in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282 (6), H2134-H2140 (2002).
- Pearlman, A. S., Stevenson, J. G., Baker, D. W. Doppler echocardiography: applications, limitations and future directions. Am J Cardiol. 46 (7), 1256-1262 (1980).
- Bauer, M., et al. Echocardiographic speckle-tracking based strain imaging for rapid cardiovascular phenotyping in mice. Circ Res. 108 (8), 908-916 (2011).
