Summary
L'objectif de ce protocole est d'évaluer de manière non invasive des changements structurels et fonctionnels cardiaques dans un modèle murin de maladie cardiaque créée par constriction aortique transverse, en utilisant B et M-Mode échocardiographie et la couleur / impulsion Doppler imagerie.
Protocol
Le protocole suit les directives du soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de Washington.
1. Procédure chirurgicale et préparation pour l'imagerie
- Sujet C57BL / 6 au TAC ou une intervention chirurgicale fictive comme décrit précédemment 10.
- Une semaine après le CAT ou une intervention chirurgicale fictive, anesthésier la souris dans la chambre d'induction avec 2% d' isoflurane mélangé avec 1 L / min de O 2. Confirmer anesthetization appropriée par insensibilité aux pieds ou de la queue de pincement. Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. Retirez les cheveux de la poitrine en appliquant la crème d'épilation. Désinfecter la peau de souris avec 70% d'éthanol.
- Fixer la souris à une plate-forme d'animaux de manutention en position couchée. Pour maintenir un niveau stable de l' anesthésie, utilisez un nosecone pour fournir de 0,5 à 1% d' isoflurane mélangé avec 1 L / min O 2.
- Appliquer le gel d'électrode sur les pattes de la souris et les enregistrer sur le plot d'électrode.
- Insérez une sonde rectale pour surveiller la température du corps. Maintenir la température du corps à 37 ° C au moyen d'un coussin chauffant ou une lampe.
- Appliquer une couche de gel à ultrasons préchauffée à la poitrine de la souris, principalement la zone recouvrant le coeur. Remarque: retirer le gel échographique et sécher la souris avec de la gaze stérile après la procédure d'imagerie.
2. Dans la Aortic Arc View, utilisation en mode B et Doppler Imaging pour l'évaluation des Transverse Aortic Constriction
- Utilisez le réglage en mode B pour obtenir le point de vue de l'arc aortique afin de visualiser l'aorte, les principales branches artérielles, et le site de constriction.
- Inclinaison vers le côté gauche de la plate-forme aussi loin que possible de faire tourner la souris en position de décubitus gauche. Tenez le transducteur ultrasonore par support en position verticale et placez-le sur la poitrine le long de la ligne parasternale droite, avec le pointage de cran vers le menton de la souris. Note: Ne pas comprimer le thorax de la souris lors de la descente du TRANSDUcer; quantité minimale de pression est nécessaire.
- Inclinez le transducteur vers le haut au niveau de l'omoplate et de tourner légèrement vers la droite jusqu'à l'arc aortique est en vue. Observez le site de constriction aortique transverse, qui est situé entre la ramification de l' artère iliaque (IA) et gauche artère carotide commune (ACCV) (Figure 1).
Remarque: Aucun constriction est détecté dans la souris opération fictive.
- Cliquez sur le bouton "Doppler couleur" sur le poste de travail pour passer en mode Doppler couleur pour surveiller la directivité et la vitesse du flux sanguin à travers le site de constriction. Acquérir et stocker des images en cliquant sur le bouton "magasin de cine".
- Cliquez sur le bouton "Doppler" pour passer à l'impulsion mode Doppler, et le volume lieu de l'échantillon (la boîte de curseur en pointillés) immédiatement distal du site de constriction à la recherche du jet sténosée avec la plus grande vitesse, puis cliquez sur le bouton "Doppler" pour obtenir des formes d'onde de fl aortiquela vitesse de pointe ow et mesurer (Figure 2).
- Calculer un gradient de pression à travers le site de restriction en utilisant l' équation de Bernoulli modifiée: gradient de pression = 4 x V max 2. inclure uniquement les souris avec un gradient de pression allant de 40 à 80 mmHg pour une analyse ultérieure.
3. Dans le parasternale long Axis View, utilisation en mode B et M-Mode d'imagerie pour évaluer cardiaques Dimensions et contractilité
- Avec la souris se trouvant dans la position couchée sur la plate-forme, maintenez le transducteur de façon verticale avec le pointage de cran à la tête de la souris. Abaisser le transducteur sur le thorax parallèle à la ligne parasternale gauche et tourner à 30 ° dans le sens antihoraire.
- Utilisez l'imagerie en mode B pour obtenir un plein axe vision à long terme "sagittal" du cœur. Ajustez l'angle du transducteur et concentrer la profondeur pour visualiser ventricule gauche, la paroi septale intraventriculaire, et une légère partie de la paroi ventriculaire droite. Save les images pour les mesures ultérieures de l'épaisseur de la paroi cardiaque et la dimension de la chambre. Utilisation de "package cardiaque", sélectionnez des paramètres tels que IVS ou LVAW, lvid et LVPW, puis cliquez sur l'image pour dessiner des lignes correspondantes pour chaque paramètre pour obtenir les mesures.
- Observer les habitudes de déplacement de la paroi cardiaque et vérifier les anomalies de mouvement possibles, y compris l'akinésie, hypokinésie et asynchronisme.
Note: akinésie et hypokinesia désignent la perte totale et partielle du mouvement de la paroi cardiaque, respectivement. Asynchronisme dénote irrégulière, non coordonnée mouvement de la paroi cardiaque. - Passez en mode M, le lieu M mode curseur perpendiculaire aux parois BT au niveau du muscle papillaire, et acquérir des images pour la mesure ultérieure des dimensions cardiaques et la fraction de raccourcissement (figure 3).
4. Dans le parasternale court Axis View, utilisation en mode B et M-Mode d'imagerie pour évaluer cardiaque Morphologie et fonction
- From la vue parasternale long axe, obtenir parasternale vue axe court en faisant tourner le transducteur de 90 ° dans le sens horaire. Ajustez le transducteur pour donner un "transversal" vue en coupe horizontale du cœur en mode B, avec les deux muscles papillaires clairement visibles et situés à droite (la position 2 et 4 heures).
- Passez en mode M et placez l'axe en mode M à la mi-niveau du ventricule gauche. Acquérir et stocker des images pour des mesures ultérieures de l' épaisseur de la paroi cardiaque, dimension de la chambre, et la fraction de raccourcissement (figure 4). Utilisation de "package cardiaque", sélectionnez les paramètres dans SAX (axe court), y compris IVS ou LVAW, lvid et LVPW, et cliquez sur l'image pour tracer des lignes correspondantes pour chaque paramètre pour obtenir les mesures.
Remarque: Les mesures obtenues ici devraient correspondre étroitement à ceux obtenus dans la vue de l' axe à long parasternale (Figure 5).
5. Dans la vue apicale Quatre-chambre, utilisationDoppler Imaging pour évaluer la fonction diastolique et systolique
- Obtenir la vue apicale quatre cavités pour visualiser ventricules gauche et droit avec les oreillettes au bas de l'écran. En mode B, du point de vue de l'axe court, inclinez le coin supérieur gauche de la plate-forme à l'angle de la tête de la souris vers le bas et orienter le transducteur vers l'épaule droite de la souris. Ceci est essentiellement de parvenir à une vue "coronal" du cœur regardant vers le sommet.
- Visualisez la valve mitrale en mode B, et passer en mode Doppler couleur, en plaçant le volume de l'échantillon (la boîte de curseur en pointillés) à la pointe de la valve mitrale.
- Passer en mode Doppler pour évaluer les modèles d'écoulement à travers la valvule mitrale. Aligner la sonde Doppler curseur parallèlement à la direction du flux sanguin mitrale. Utilisez un angle de la sonde inférieure à 20 ° pour déterminer la vitesse de pointe (figure 6).
- Enregistrez les images pour les mesures ultérieures. Utilisez "package cardiaque" et sélectionnez "flux MV». Cliquez sur chaque paramètre et tracer des lignes correspondant à obtenir les mesures des mesures disponibles comprennent:. E vitesse de pointe (remplissage précoce avec la relaxation ventriculaire active), pic Une vitesse (remplissage en retard avec la contraction auriculaire), la relaxation isovolumique mitrale et temps de contraction (IVRT et IVCT respectivement), et le temps d'éjection (eT).
- Calculer l'indice de performance myocardique (MPI) par MPI = (IVCT + IVRT) / ET.
Traitement 6. post-procédurale des animaux
- Donnez l'analgésie et / ou une solution saline stérile intrapéritonéale aux animaux chirurgicaux lorsque cela est nécessaire.
- Laisser l'animal de récupérer sur un coussin chauffant en position couchée. Ne pas laisser un animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale. Ne retournez pas un animal qui a subi la procédure à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète.
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Representative Results
La figure 1 montre les images en mode B de la vue de l' arc aortique du coeur de souris soumis à sham (figure 1A) ou la chirurgie TAC (figure 1B). La crosse de l'aorte, l'artère iliaque, gauche artère carotide commune et gauche artère sous-clavière sont présentés. Notez que la constriction aortique est clairement visible dans TAC mais pas feignants cœur. Images Doppler couleur de la vue de l' aorte sont présentés dans la figure 2A. Les formes d'onde de débit aortique à travers le site de restriction ont été capturés par imagerie Doppler (figure 2B). Le succès TAC conduira à une vitesse d'écoulement sensiblement augmenté en aval du site de constriction (typiquement ~ 4 m / s chez les souris TAC). Gradient de pression à travers l'étranglement est calculé en fonction de la vitesse d'écoulement maximale, en fonction de l'équation de Bernoulli modifiée (figure 2C).
Figure 3 (figure 3A) ou cardiaque TAC (figure 3B). Le panneau supérieur montre les images en mode B du ventricule gauche, le septum interventriculaire, et une partie du ventricule droit de souris sham ou TAC. Le panneau inférieur montre les tracés en mode M de plusieurs cycles cardiaques de souris sham ou TAC. Les mesures des dimensions sont indiquées cardiaques, y compris l'épaisseur du ventricule gauche de la paroi antérieure (LVAW) ventriculaire gauche diamètre intérieur (lvid), l'épaisseur de la paroi postérieure du ventricule gauche (LVPW) en diastole et de systole. Remarque augmenté de manière significative l'épaisseur de la paroi dans le coeur de souris soumis à TAC par rapport à une intervention chirurgicale fictive.
La figure 4 montre des images de la vue de l' axe court parasternale du trompe - l'œil (figure 4A) ou cardiaque TAC (figure 4B). La partie supérieure de chaque panneau montre l'axe en mode M (dottligne ed) placé au centre du ventricule gauche. La partie inférieure de chaque panneau est le mode M de traçage de lignes indiquant les dimensions cardiaques, comme décrit ci-dessus. En tant que marqueur de l'hypertrophie ventriculaire et l'épaisseur de la paroi septale peut être déterminée avec précision. Les souris soumises à TAC ont montré une augmentation épaisseur de paroi évaluée par LVAWd et LVPWd, dilatation ventriculaire évaluée par LVISd et LVISs, a diminué la contractilité évaluée par LVFS et FEVG, et augmentation de la masse LV (figure 5).
La figure 6 montre en mode B apical de vue à quatre chambres (figure 6A, B) et PW Doppler images de modèles d'écoulement transmitral (Figure 6C, D). Les mesures de pic E et A vitesse, IVCT, IVRT, et ET sont présentés. Le rapport E / A et MPI sont calculés (Figure 6E - I). Un cœur de la souris en bonne santé a un rapport E / A ≥1 et une valeur ≤0.5 MPI. Dans des conditions pathologiques avec diaStolic ou un dysfonctionnement cardiaque systolique, comme chez des souris soumises à l'ATC, une diminution du rapport E / A et / ou une augmentation de la valeur MPI sont généralement observés.
Figure 1. mode B Image de l'Aortic Arche Vue de Coeur Souris Soumise à Sham Surgery (A) ou TAC (B). Branches aortiques majeures , y compris innominate artère (IA), l' artère carotide gauche commune (ACCV) et gauche artère sous - clavière (LSA) sont présentés. Notez que la constriction aortique transverse (indiqué par la flèche blanche) peut être visualisé dans le TAC , mais pas sham cœur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Couleur / Doppler Imaging de l'Transverse Aorte Sang Fow de l'arc aortique View. Color (A) et PW (B) images Doppler de simulacres et TAC coeurs sont présentés. La vitesse de l' aorte pic obtenue à partir d' imagerie Doppler est utilisée pour calculer le gradient de pression en fonction de l'équation de Bernoulli modifiée (C). Ces données confirment une opération TAC réussie avec le gradient de pression de ~ 70 mm Hg. * P <0,05 vs. Faux. Les données sont exprimées en moyenne ± ETM n = 15 Sham et n = 13 pour le TAC. Test t de Student a été utilisé pour déterminer la signification statistique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. parasternale long axe (PLAX) Vue de coeur souris soumise à Sham Surgery (A) ou TAC (B). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .
Figure 4. parasternale petit axe (PSAX) Vue de coeur souris soumise à Sham Surgery (A) ou TAC (B). Les images en mode M indiquent l'emplacement du volume d'échantillon (pointillé ligne jaune dans le panneau supérieur) et la mesure de cardiaque dimensions en diastole et systole (lignes bleues dans le panneau inférieur). Les astérisques indiquent les muscles papillaires. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Évaluation échocardiographique of Cardiac Morphologique et changements fonctionnels suivants TAC. M en mode imagerie courte vue de l' axe a été réalisée comme dans la figure 4. (A) LVAWd, gauche épaisseur de la paroi ventriculaire antérieure en diastole. (B) LVPWd, ventriculaire gauche épaisseur de la paroi postérieure de la diastole. (C) LVIDd, gauche diamètre intérieur ventriculaire en diastole. (D) LVIDs, diamètre intérieur du ventricule gauche en systole. (E) LVFS, ventriculaire gauche fraction de raccourcissement. LVFS (%) = (LVIDd-LVIDs) / LVIDd x100%. (F) FEVG, la fraction d'éjection ventriculaire gauche. FEVG (%) = (VTDVG-LVESV) / VTDVG x100%. LVEDV et LVESV gauche indiquent le volume en fin de diastole et de systole ventriculaire extrémité, respectivement. volume de LV et de la fraction d'éjection sont précisément évalués par Simpso La méthode n. le volume LV est estimé par de nombreux disques de montage dans le ventricule: le volume Simpson = [zone (1) + zone (2) + ... + zone (n)] x longueur. zone Simpson et la longueur sont obtenus en traçant la frontière endocardique du LV dans l'axe long et à court vue de l'axe. (G) LV (ventricule gauche) de masse. Masse LV (mg) = 1,05 x [(LVIDd + LVPWd + IVSd) 3 - (LVIDd) 3]. Le facteur 1,05 représente la densité spécifique du myocarde. (H) HR, la fréquence cardiaque. * P <0,05 vs. Faux. Le nombre de souris analysées est indiqué dans les barres de chaque panneau. Les données sont exprimées en moyenne ± test t de Student sem a été utilisé pour déterminer la signification statistique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 6. Évaluation de transmitral flux sanguin par imagerie Doppler. (A et B) en mode B apicale quatre cavités du trompe - l'œil (A) ou TAC (B) coeur. LV, le ventricule gauche; RV, le ventricule droit; MV, la valve mitrale; TV, tricuspide; LA, oreillette gauche; RA, oreillette droite. (C et D) PW Doppler forme d' onde du flux sanguin trans-mitral en trompe - l'œil (C) ou TAC (D) coeur. mesures pertinentes sont indiquées. (E) E / A, E pic et un rapport de vitesse. (F) IVCT, isovolumique temps de contraction. (G) IVRT, isovolumique temps de relaxation. (H) ET, le temps d'éjection. (I) MPI, l' indice de performance myocardique. * P <0,05 vs. Faux. Le nombre de souris analysées est indiqué dans les barres de chaque panneau. Les données sont exprimées en moyenne77; test t de Student sem a été utilisé pour déterminer la signification statistique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
L' échocardiographie a été largement utilisé pour évaluer la fonction cardiaque dans des modèles rongeurs de 2,6 de maladie cardiaque. Par rapport aux méthodes invasives ou terminaux comme pression-volume de mesure de la boucle 11 et ex vivo travaillant coeur 12, l' échocardiographie fournit un outil puissant, non invasive pour évaluer les changements structurels et fonctionnels cardiaques en cours chez les animaux vivants. Pour obtenir des données fiables, il est important de maintenir la température du corps et le rythme cardiaque dans la plage physiologique 13 par ajustement prudent l'appareil de chauffage et le niveau de l' anesthésie. Toutes les images doivent être capturées et analysées systématiquement en fonction des procédures d'imagerie normalisées afin de faciliter la comparaison entre les souris de souche ou d'un génotype différent.
TAC est couramment utilisé pour induire l' hypertrophie cardiaque et l' insuffisance cardiaque chez les souris 1. la mesure non invasive de gradient de pression à travers le site de rétrécissement par effet Dopplerimagerie représente une évaluation fiable du degré de surcharge de pression chez les souris. Réussi TAC produit généralement un gradient de pression ≥40 mmHg. Seules les souris soumises à une même degré de surcharge de pression doivent être inclus pour une analyse plus poussée, alors que les souris avec un gradient trop basse ou trop haute pression doivent être exclus. À la suite de TAC, les souris doivent développer une hypertrophie cardiaque dans les 1-2 semaines, et une dilatation cardiaque au bout de 4 semaines, en fonction du degré de surcharge de pression et le fond génétique de souris testées. Le remodelage cardiaque dynamique et des changements fonctionnels suivants TAC peuvent être évalués de manière fiable par imagerie échocardiographique comme décrit ci-dessus.
Contrairement à son usage fréquent chez l' homme 14, la couleur / PW Doppler n'a été récemment disponible en rongeur échographie 9. Ici aussi, nous avons décrit les applications de l'imagerie Doppler dans la mesure de gradient de pression, ainsi que la performance systolique et diastolique. Mesurement des valvules mitrale et tricuspide directionnalité du flux sanguin et de la vitesse (ie., rapport E / A, IVRT, IVCT, ET et MPI) fournit des informations importantes sur la fonction cardiaque. Ainsi l'imagerie échocardiographique représente un outil important pour étudier la physiologie cardiaque et de la physiopathologie chez les petits animaux.
La limitation de l'imagerie par échographie cardiaque est liée à la variabilité et la reproductibilité de mesure. Pour réduire la variabilité inter et intra- de l'opérateur, il est important de normaliser la façon dont les images sont acquises et analysées. Les mesures doivent être effectuées à partir de plusieurs fenêtres acoustiques et modes (mode B, M-mode, et PW / Doppler couleur) et au moins 3 mesures distinctes devraient être en moyenne pour assurer l'exactitude et la fiabilité. En outre, il existe des fenêtres acoustiques limitées et parfois des images de faible qualité sont obtenus chez les petits rongeurs soumis à des procédures chirurgicales telles que la TAC, due à un gonflement des tissus, des cicatrices chirurgicales et un oedème pulmonaire qui interfèrent avec l'échographiepoutres. Pour l'imagerie Doppler, il est parfois difficile de séparer E et des ondes A et obtenir une forme d'onde complète de l'écoulement mitral, en raison d'un rythme cardiaque relativement élevé chez les petits rongeurs, en particulier chez des souris soumises à une intervention chirurgicale ou TAC IM. L'abaissement de la fréquence cardiaque peut être utile pour obtenir des mesures, mais cela aura une incidence sur les valeurs obtenues par imagerie Doppler et donc l'interprétation des données.
Avec les progrès techniques récents, des systèmes à ultrasons nouvellement libérés fournissent une résolution d'image élevée et les taux trame / d'échantillonnage pour assurer une mesure quantitative précise chez les petits animaux. Les nouvelles technologies de l'échocardiographie permettra également d'améliorer la sensibilité de l'évaluation échocardiographique de la fonction cardiaque et de permettre la détection précoce de la pathologie cardiaque. Par exemple, le chatoiement de suivi souche imagerie 15 a été utilisé pour mesurer avec précision la fonction myocardique régionale. Les nouvelles technologies de transducteurs actuellement en cours de développement fournira le potentiel en temps réel, en 3D ou 4Dimagerie. Échocardiographie de contraste qui est en développement avancé permettra des mesures volumétriques, des évaluations de la perfusion des tissus, l'imagerie moléculaire des maladies cardiovasculaires, et l'administration d'agents thérapeutiques.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia equipment | Harvard Apparatus, 84 October Hill Road Holliston, MA |
723015 | |
| Vevo 2100 Imaging System | VisualSonics Inc., 3080 Yonge Street Suite 6100, Box 66, Toronto, Ontario, Canada | Vevo 2100 | |
| Aquasonic ultrasound gel | Parker Laboratories, 286 Eldridge Rd, Fairfield, NJ | 03-50 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare, Inc, 3950 Schelden Circle Bethlehem, PA |
NDC 66794-017-25 | |
| F/air anesthesia gas filter unit | A.M. Bickford, Inc, 12318 Big Tree Rd, Wales Center, NY | 80120 |
References
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