Summary
我们描述了使用靶向外围照射到在小鼠中诱导的疲劳样行为的方法。选定的非致命辐射剂量导致自愿轮运行活动为期一周的减少。
Abstract
癌症有关的疲劳（CRF）是一个令人痛心的和昂贵的条件下，往往会影响接受癌症治疗，包括放射治疗的病人。在这里，我们描述了使用靶向外围照射到在小鼠中诱导的疲劳样行为的方法。用适当的屏蔽，照射靶向小鼠的下腹部/骨盆区域，不放过脑，以努力模型由与骨盆癌的个体接受放射治疗。我们提供的照射剂量足以诱导小鼠，通过自愿车轮运行的活性（VWRA）测定疲劳样行为，而不引起明显的病态。由于车轮跑在小鼠正常的，自愿的行为，它的使用应该有其他行为测试或生物措施很少混杂效应。因此，车轮的运行可以理解疲劳的行为和生物相关因素可以作为一种可行的测量结果。 CRF是频繁合作复杂条件的并发症，并且可能具有与既癌症和其各种处理的原因。本文介绍的方法是调查的，更普遍的促进CRF的发展辐射引起的变化，探索生物网络，可以解释像疲劳外围触发，但集中驱动行为的发展和维持有用。
Introduction
癌症有关的疲劳（CRF）是一个令人痛心的和昂贵的条件下，往往会影响接受癌症治疗1例。疲劳既不是正比于最近的活动，也没有由其余减轻，并且它与各种相关的情绪，动机，注意力障碍的相关联，并且认知2。 CRF的生物原因是未知的，尽管它已经在许多情况下，已显示在某些情况下，血红蛋白水平和各种激素系统的功能与炎症和细胞因子水平相关联，还（参见Saligan 等人 3的生物审查CRF的研究）。
利用动物模型的对照研究必须要了解这个复杂的条件相关联的行为和生物学。而肿瘤相关4或化疗相关5,6脂肪igue已在啮齿动物模型进行了研究，CRF的病因可能是治疗特定的。为了调查有关放射治疗CRF，我们的小组最近开发的辐射性疲劳7的小鼠模型。在对比涉及脑或全身照射8,9现有的CRF的模型，该模型探讨如何在中央驱动行为的变化，如疲劳，可通过外周定位的照射过程触发。
此处描述的方法被设计成施用于患者的盆腔癌症放射疗法的模型，使用铅屏蔽定位与照射下腹部/骨盆区域。然而，通过修改铅屏蔽或其相对于实验动物的位置，这过程可适于建模的身体的其他部分的照射。自愿车轮运行的活动（VWRA）被用来测量疲劳状behavio- [R;因为它是一个自愿的，正常的行为10，它应该允许同时使用其他行为和生物试验。我们已经发现，外围照射足以降低VWRA小鼠而不引起明显的发病率7。与这个模型以后的实验可能有助于揭示免疫和其他生物信号的外围照射，以及在能够产生与CRF相关的赤字中枢神经系统下游的变化的影响。
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Protocol
伦理学声明：本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）的动物护理和使用委员会。所有参与动物处理和研究成果衡量调查人员通过适当的动物护理和使用的NIH办公室和国家心脏，肺和血液研究所小鼠表型的核心培训。动物试验，住房，并在此研究中使用的环境条件各方面均符合本指南的护理和使用实验动物11。
1.住房和实验动物
注：房屋雄性C57BL / 6小鼠（到达后约5周龄）分别在整个实验，并提供食物和水随意存取。所有笼保持在12:12小时亮 - 暗循环的光照阶段开始于早上6点和黑暗阶段在下午6点。
- 确定老鼠并将它们分配到各个标准通风D鼠标笼。允许恢复识别程序后24小时。
注：尾纹身被推荐作为一种识别手段，以消除耳标可能会陷入一个跑轮的可能性。纹身上每只小鼠的尾部的数字，在尾巴匹配写在小鼠的笼的数目。 - 允许小鼠适应它们的笼子至少三天，轻轻处理每只小鼠的期间每天三分钟。
2.运行轮驯化和基准
- 引入小鼠个体VWRA笼，每个配备有连接到连续记录的电子计数器跑轮。
注：所有轮计数器通过一个USB接口连接到电脑（请参阅材料清单）。计算机软件计算车轮的转数，行驶距离，和平均速度在整个指定的总所需时间的每一个指定的时间间隔ñ。一旦录音停止，数据将自动两种文本和电子表格保存。 - 通过计算机软件接口发起VWRA的记录。设定记录间隔一小时的持续时间，以至少五天。继续录制VWRA至少五天。
注：在步骤2.2的结束时，所有的小鼠应达到每日车轮运行的活动的相对一致的量。如果没有，那么识别和排除任何异常值。 - 停止VWRA通过软件界面记录和老鼠返回（不运行轮笼）步骤描述1.1标准的笼子。
- 小鼠随机进入任一假照控制或照射组。
3.辐照
注：执行对所有小鼠以下步骤两组，每天一次为三个连续天。每天在相同的顺序处理的小鼠。
- 通过腹腔注射麻醉每只小鼠氯胺酮（100毫克/千克）和赛拉嗪（10毫克/千克）的混合物。
- 确认麻醉用脚趾捏和使用软膏的眼睛，防止干燥时的麻醉下。
- 转移麻醉鼠标变成铅屏蔽设备。安排在屏蔽鼠标以便只有下腹部/骨盆区域露出。
注：屏蔽由两个率先“盒子”，在两者之间，使辐射照射到鼠标的一个小的，有针对性的区域狭窄的空地上（ 见图1）。 - 用医用胶布鼠标尾部的固定底座在屏蔽范围内的位置。
注意：步骤3.4是可选的，但这样做可以帮助确保鼠标的位置在以下步骤不改变。 - 传输屏蔽装置进入照射器，确保在屏蔽内的动物的位置被保持。
- 如果鼠标是照射组，提供800 cGy的在DOS约110 cGy的/分ê率。如果鼠标是假照对照组中，离开鼠标的等效时间不活动的辐射。
注：最佳辐照设置将取决于特定的设备上。的从137铯源递送110 cGy的/分钟的剂量率是此处所用的辐照的中心的剂量率。曝光时间调节至达到800 cGy的所期望的总剂量。 - 从辐射和屏蔽取出小鼠，然后将其返回到在步骤1.1中提到其原始的，标准笼。
- 连续监视鼠标，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧。
4.辐射性疲劳测量
- 上的照射连续三天结束后的第二天，将小鼠转移到在步骤2.1中描述他们的个人VWRA笼中。
- 记录VWRA，如在步骤2.2中所述，除了这里设置记录持续时间超过15天。在15天结束时，手动停止VWRA通过软件界面记录。
注意：从各记录期间的数据被自动保存为电子表格，每一个包括旋转，距离和速度在整个记录期间所有动物（列），并在所有的时间间隔（行）的测量。在实验结束时，存在由该记录软件产生两个电子表格：一个用于照射预VWRA，和一个用于辐照后VWRA。
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Representative Results
小鼠的三个批通过上述协议运行。共有16假和20照射（2 400 cGy的，3×800 cGy的/天）小鼠者。照射后连续三天，照射组有显著减少VWRA相比，假（混合重复测量方差分析：照射治疗，女1,13 = 19.233，P <0.001的主要作用）。效果是前七天显著照射后（简单主效应，P <0.05和Bonferroni校正），与发生在第三天的最低平均VWRA距离辐射（ 图2A）之后。天25和26中，没有数据被收集由于其他行为测试。
图2B示出在VWRA从之前照射后的变化的分布。而所测试的大多数小鼠显示疲劳样症状（减少我N刃运行的活动），有小鼠变动不大，甚至在VWRA（增加图2B，下面的曲线）的一个小数目。由于这种变化，与样本量小实验可能无法捕捉疲劳样行为。
图1： 铅屏蔽装置。屏蔽，这是在内部开发，被组装为两个相同的盒子。小鼠放置在箱子领先之间的差距只露出他们的骨盆区域。 （A）在其容器屏蔽的照片。引线盒由聚苯乙烯泡沫包围保持它们在适当的位置，这是由被设计用于照射的10.5英寸直径的有机玻璃容器包围。铅屏蔽（B）示意图。铅屏蔽是由铅AR的1英寸厚的块依次为两个箱子。每个盒由四个部分组成：顶部和底部件是4.25“×3”×1“，而侧片是〜0.5”×3“×1”。当组装时，每个箱子的外部尺寸是4.25“×3”×3“，并且有一个1”它们之间的间隙。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：每日自愿转轮跑步的距离。 （A）平均总距离被老鼠每天跑（N = 16控制，20照射）。小鼠照射在天14，15和16。天25和26中，没有数据被收集由于其他行为测试。误差条表示平均值的标准误差。 * P <0.05。 （B）在VWRA变化的直方图，在这里定义为T的平均重稀土天前立即照射（11日 - 13）减去三天辐射后立即（17日 - 19）的平均值。正数指示VWRA减少。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
我们已经描述了使用靶向外围照射到在小鼠中诱导的减少VWRA而不混淆发病率或死亡率的协议。重要的是，一个简单的屏蔽装置允许照射在这个协议始终如一的目标期望的区域，通过模仿患者盆腔癌接受放射治疗。相反，涉及大脑和全身照射8，9现有车型CRF，这个模型探讨了周边针对性的照射过程如何影响集中驱动的疲劳性能。在我们的代表性的结果，我们表明，在这种方式交付周边辐射足以大约一周后，产生了一个完整的恢复疲劳样行为。
视疲劳的措施，VWRA允许每天24小时，距离和速度的简单和客观的评估，需要最少的培训和实验时间。它做ES需要在单独的笼子中住房的小鼠，使得设施空间的可能的限制因素。而个人住房可能影响小鼠的行为，可能导致焦虑12或机能亢进13，有证据表明，车轮运行可降低这些负面影响14。轮运转性能也已显示出具有较少帧内鼠标变性和比身体活动15的其他评估更大的再现性。然而，这是可能的，身体疲劳可能在比自愿活性的其它方式来更有选择性捕获，因为自愿活性可能取决于动机或不是严格身体疲劳16的其他因素。进一步的实验中，有必要作出这样的判定。
但是，也有这对成功的关键在协议中的几个点。重要的是，老鼠被允许的时间来recove到达在一个新的设施，以及处理后ř如上所述，在此期间进行。这些程序减轻压力和焦虑，这可能会影响志愿活动17。在辐照过程中保持完整的麻醉也很关键，这不仅是因为封闭空间（铅屏蔽）内被限制可以为动物18显著应激，同时也避免照射其他器官/组织的不必要的暴露。确保了麻醉剂的剂量是足够的年龄和小鼠的应变开始本协议的照射部之前，它是重要的。另外，小鼠的运行车轮最少五天的驯化是严重之前进行分析照射和适当的数据，以获得稳定的行为。
要解决不寻常的VWRA数字，VWRA笼应定期对可能出现的问题进行监测。对于examp乐，如果铺垫材料成为上或车轮的正下方堆积起来，或者如果正在运行的轮子不够干净，这可以增加抵抗车轮纺丝和降低活动水平测量。此外，由于在黑暗小时7大多数发生跑轮，VWRA可以在光线波动周期敏感，应注意保持光周期定期和不间断。
这个协议可以容纳不同水平的照射的使用。例如，我们描述了三天，这个协议与800 cGy的剂量，但我们已经使用600 cGy的用量7三天看出疲劳略低的水平。一个特定照射剂量的效应将依赖于小鼠19的应变，所述照射器20的剂量率，分馏多天21，和该区域的exp可能的大小osed屏蔽之下。 1000 cGy的全身照射剂量单已在C57 / BL6小鼠使用是没有死亡率增加22，但应采取预防措施以确保高剂量的辐射不产生并发症的迹象。
除了辐射剂量，其他几个步骤可以修改以适合手头上的实验。通过修改铅屏蔽或屏蔽内的动物的位置，这些方法可以适用于指定的其他身体区域与照射。然而，为了屏蔽装置改变应与剂量进行验证，以确保辐射不会穿透屏蔽区域。该协议也可以适于掺入各种行为的措施，如自愿运行的活动不会妨碍行为实验是更身体或精神上苛刻。例如，CRF往往与认知功能障碍发生3沿;未来实验可以探讨其放射治疗可在该协会发挥的作用。车轮运行的活动的存在必须进行额外的行为测试时加以考虑，如VWRA可以在许多方面16影响生理和行为。
随辐照剂量800 cGy的或更小的，小鼠不应该从麻醉中恢复后需要特别小心。然而，辐照过程和产生的疲劳可能会潜在地与其他干预措施，如附加行为测试或药物治疗进行交互。动物应密切在天照射后立即改变或加入到这个描述的过程，每当监控。小鼠不同品系还可以显示照射19个不同的灵敏度，所以谨慎是必要的使用比C57BL / 6其他菌株时。
尽管该技术被设计为表示辐射在duced疲劳，它只有一个复杂的CRF概念的组件。 CRF是，可能有许多原因和发生在患有癌症，并经常接受多次治疗的患者的情况。因此CRF的理解，可能需要两组实验用荷瘤小鼠和与其他治疗如化疗或激素治疗。将这些变量分为生物学和行为学测试将允许研究人员确定这一复杂情况作出的贡献。这里所描述的小鼠模型可能有助于了解辐射对CRF的具体作用和发展潜力的疗法。
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Disclosures
这项研究是由院内研究，护理研究的研究所，美国国立卫生研究院的支持部门。
Acknowledgments
笔者想感谢美国国立卫生研究院的国家心，肺和血液研究所（NHLBI）（NIH）的米歇尔·艾伦慷慨地分享她的专业知识在小鼠表型的方法和她持续不断的技术援助，以及为NHLBI的蒂莫西·亨特帮助我们开发出屏蔽装置。这项研究是由美国国立卫生研究院的护理研究和验证试验的一部分国立研究所院内研究司的支持是通过从肿瘤护理学会基金资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mice | Charles River | Strain code 027 (http://www.criver.com/products-services/basic-research/find-a-model/c57bl-6n-mouse) | |
| Ketamine HCl | Putney | 100 mg/mL stock solution | |
| Xylazine HCl | Lloyd Laboratories | 100 mg/mL stock solution | |
| Rodent Tattoo System | AIMS | ATS-3 | http://animalid.com/lab-animal-identification-systems/ats-3-general-rodent-tattoo-system |
| Lead Shielding Apparatus | (custom made) | One-inch thick lead shielding arranged as two boxes with a one-inch thick gap between them for targeted irradiation | |
| Plexiglass shielding container | (custom made) | Plexiglass container filled with styrofoam. Styrofoam cutouts hold the lead shielding in place. | |
| GammaCell 40 Exactor | Best Theratronics | http://www.theratronics.ca/product_gamma40.html | |
| RAD Disk Ultra | Best Theratronics | http://www.theratronics.ca/product_rad.html | |
| Mouse Single Activity Wheel Chamber | Lafayette Instrument Company | #80820 | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=980 |
| Activity Wheel Counter for Computer Monitoring | Lafayette Instrument Company | #86061 | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1052 |
| Modular Cable for Wheel Counters | Lafayette Instrument Company | #86051-7 | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1046 |
| USB Computer Interface for Activity Wheel Counters | Lafayette Instrument Company | #86056A | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1047 |
| Activity Wheel Monitor Software | Lafayette Instrument Company | #86065 | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1053 |
References
- Minton, O., et al. Cancer-related fatigue and its impact on functioning. Cancer. 119, Suppl 11. 2124-2130 (2013).
- Bower, J. E. Cancer-related fatigue--mechanisms, risk factors, and treatments. Nat Rev Clin Oncol. 11 (10), 597-609 (2014).
- Saligan, L. N., et al. The biology of cancer-related fatigue: a review of the literature. Support Care Cancer. 23 (8), 2461-2478 (2015).
- Norden, D. M., et al. Tumor growth increases neuroinflammation, fatigue and depressive-like behavior prior to alterations in muscle function. Brain Behav Immun. 43, 76-85 (2015).
- Ray, M. A., Trammell, R. A., Verhulst, S., Ran, S., Toth, L. A. Development of a mouse model for assessing fatigue during chemotherapy. Comp Med. 61 (2), 119-130 (2011).
- Zombeck, J. A., Fey, E. G., Lyng, G. D., Sonis, S. T. A clinically translatable mouse model for chemotherapy-related fatigue. Comp Med. 63 (6), 491-497 (2013).
- Renner, M., et al. A murine model of peripheral irradiation-induced fatigue. Behav Brain Res. 307, 218-226 (2016).
- Van der Meeren, A., Lebaron-Jacobs, L. Behavioural consequences of an 8 Gy total body irradiation in mice: Regulation by interleukin-4. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 79 (2), 140-143 (2001).
- York, J. M., et al. The biobehavioral and neuroimmune impact of low-dose ionizing radiation. Brain Behav Immun. 26 (2), 218-227 (2012).
- Meijer, J. H., Robbers, Y.
- The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th Edition, National Research Council of the National Academies. (2011).
- Heredia, L., Torrente, M., Domingo, J. L., Colomina, M. T. Individual housing and handling procedures modify anxiety levels of Tg2576 mice assessed in the zero maze test. Physiol Behav. 107 (2), 187-191 (2012).
- Varty, G. B., Paulus, M. P., Braff, D. L., Geyer, M. A. Environmental enrichment and isolation rearing in the rat: effects on locomotor behavior and startle response plasticity. Biol Psychiatry. 47 (10), 864-873 (2000).
- Pham, T. M., Brene, S., Baumans, V. Behavioral assessment of intermittent wheel running and individual housing in mice in the laboratory. J Appl Anim Welf Sci. 8 (3), 157-173 (2005).
- Knab, A. M., et al.
- Novak, C. M., Burghardt, P. R., Levine, J. A. The use of a running wheel to measure activity in rodents: relationship to energy balance, general activity, and reward. Neurosci Biobehav Rev. 36 (3), 1001-1014 (2012).
- Mineur, Y. S., Belzung, C., Crusio, W. E. Effects of unpredictable chronic mild stress on anxiety and depression-like behavior in mice. Behav Brain Res. 175 (1), 43-50 (2006).
- Perhach, J. L. Jr, Barry, H. 3rd Stress responses of rats to acute body or neck restraint. Physiol Behav. 5 (4), 443-448 (1970).
- Iwakawa, M., et al. Different radiation susceptibility among five strains of mice detected by a skin reaction. J Radiat Res. 44 (1), 7-13 (2003).
- Travis, E. L., Peters, L. J., McNeill, J., Thames, H. D. Jr, Karolis, C. Effect of dose-rate on total body irradiation: lethality and pathologic findings. Radiother Oncol. 4 (4), 341-351 (1985).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
- Duran-Struuck, R., et al. Differential susceptibility of C57BL/6NCr and B6.Cg-Ptprca mice to commensal bacteria after whole body irradiation in translational bone marrow transplant studies. J Transl Med. 6, 10 (2008).
