Summary
Мы опишем метод с использованием целевого периферийного облучения, чтобы вызвать усталость, как поведение у мышей. Выбранная нелетального доза облучения приводит к недельным сокращению добровольного колесного хода деятельности.
Abstract
усталость, связанных с раком (ХПН) является огорчает и дорогостоящим условием, что часто влияет на пациентов, получающих лечение рака, включая лучевую терапию. Здесь мы опишем метод с использованием целевого периферийного облучения, чтобы вызвать усталость, как поведение у мышей. При наличии соответствующего экранирования, облучение цели нижней части живота / тазовой области мыши, избавляя мозг, в попытке смоделировать лучевую терапию, полученные физическими лицами с тазовыми видов рака. Мы доставить дозу облучения, которая достаточна, чтобы вызвать усталость поведение как у мышей, измеренных с помощью добровольного колесного хода деятельности (VWRA), не вызывая при очевидной заболеваемости. Так как колесо, идущее является нормальным, волевое поведение у мышей, его использование должно быть немного сбивающий влияние на других поведенческих тестов или биологических мер. Следовательно, колесо, идущее может быть использован в качестве возможного оценки результата в понимании поведенческих и биологических коррелятов усталости. CRF является сложным условием при частом соболезненности, и, вероятно, имеет причины, связанные как с раком и его различных методов лечения. Методы, описанные в данной работе, могут быть использованы для исследования изменений радиационные, которые вносят вклад в развитие ХПН и, в более общем плане, для изучения биологических сетей, которые могут объяснить развитие и сохранение периферийно-триггерным но центрально-ведомой поведение как усталость ,
Introduction
Усталость , связанных с раком (ХПН) является огорчает и дорогостоящим условием , что часто влияет на пациентов , получающих лечения рака 1. Усталость не является ни пропорциональна недавней активности , ни облегчены покоя, и это связано с широким спектром нарушений , связанных с настроением, мотивации, внимания, и познанием 2. Биологические причины ХПН неизвестны, хотя и было показано , во многих случаях, коррелирует с воспалением и цитокин уровнях, и в некоторых случаях с уровнем гемоглобина и функции различных систем гормонов (см Saligan и др. 3 для обзора биологической исследования CRF).
Контролируемые исследования с использованием животных моделей необходимы для понимания поведения и биологии, связанный с этим сложным условием. В то время как опухоли , связанные с 4 или химиотерапии , связанных с 5, 6 жираigue была изучена в моделях на грызунах, этиология CRF может быть лечение конкретного. Для исследования ХПН , связанные с лучевой терапией, наша группа недавно разработала модель мыши облучения , вызванной усталостью 7. В отличие от существующих моделей CRF , связанных с мозгом или общее облучение тела 8, 9, эта модель исследует , как изменение в центрально-ведомой поведение, как усталость, может быть вызвано периферически целевой процедуры облучения.
Процедура, описанная здесь, предназначена для моделирования лучевой терапии вводят пациентам с тазовой раком, с использованием свинца экранирование для целевой нижней части живота / тазовой области с облучением. Тем не менее, путем модификации свинцовой защиты или его размещение по отношению к экспериментальным животным, эта процедура может быть приспособлена для моделирования облучение других частей тела. Добровольное колесо выполняющихся активность (VWRA) используется для измерения усталости как behavioр; потому что это добровольное и нормальное поведение 10, он должен позволять одновременное использование других поведенческих и биологических тестов. Мы обнаружили , что периферическое облучения достаточна для снижения VWRA у мышей , не вызывая откровенного заболеваемости 7. Дальнейшие эксперименты с этой моделью может помочь выявить эффекты периферического облучения на иммунную и других биологических сигналов, а также вниз по течению изменений в центральной нервной системе, которые могут производить дефицита при ХПН.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике: Данное исследование было одобрено Национальным институтом здоровья (NIH) уходу и использованию животных комитета. Все исследователи, принимающие участие в обработке животных и измерения результатов исследования были должным образом обучены НИЗ Управления уходу и использованию животных и Национального сердца, легких и крови институт мышиной Фенотипирование Core. Все аспекты испытаний на животных, жилье и условия окружающей среды , используемые в данном исследовании , были в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных 11.
1. Корпус и экспериментальных животных
Примечание: Дом мужчина C57BL / 6 мышей (примерно пять недель по прибытии) в индивидуальном порядке в течение всего эксперимента и обеспечить вволю доступ к пище и воде. Все клетки сохраняются на 12:12 ч свет-темнота цикла с легкой фазы, начиная с 6 утра и темной фазы в 6 часов вечера.
- Определить мышей и назначать их индивидуальным стандартным Вытяжкаd мыши садках. Разрешить 24 ч после процедуры идентификации для восстановления.
Примечание: Хвост татуировки рекомендуется в качестве средства идентификации, чтобы исключить возможность того, что ушная бирка может попасть в ходовое колесо. Татуировка номер на хвосте каждой мыши, с номером на хвосте, соответствующего номеру написанный на клетке мыши. - Разрешить мыши, чтобы акклиматизироваться в их клетки по крайней мере еще три дня, обработку каждой мыши на медленном огне в течение трех минут в день.
2. Запуск колеса акклиматизации и базовой линии
- Введем мышей отдельных VWRA клеток, каждая из которых оснащена ходовое колесо, соединенного с электронным счетчиком для непрерывной записи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все колеса установлены счетчики на подключение к компьютеру через единый интерфейс USB (см список материалов). Компьютерная программа вычисляет количество оборотов колеса, пройденного расстояния, а средняя скорость по каждому указанному интервалу времени указанного общего duratioп. После остановки записи, данные автоматически сохраняются как в виде текста и в виде электронных таблиц. - Инициировать запись VWRA через интерфейс компьютерного программного обеспечения. Установите записи интервалы в один час и продолжительность, по крайней мере в течение пяти дней. Продолжить запись VWRA по крайней мере в течение пяти дней.
Примечание: В конце стадии 2.2, все мыши, должны достичь относительно постоянной количества суточного колесо, идущее деятельности. Если нет, то выявить и исключить любые выбросы. - Остановка VWRA записи через интерфейс программного обеспечения, и вернуть мышей их стандартные клетки, описанные в шаге 1.1 (клетки без ходовых колес).
- Перемешайте мышей в любой фиктивным-облученного управления или облучаемых групп.
3. Облучение
Примечание: Выполните следующие действия для всех мышей в обеих группах, один раз в день в течение трех последовательных дней. Treat мышей в том же порядке, каждый день.
- Обезболить каждой мыши путем внутрибрюшинной инъекциикетамина (100 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг) смеси.
- Подтверждение анестезии с пальца щепоткой и использовать мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
- Передача под наркозом мышь в свинцовый устройство экранирования. Расположите мышь в экранированием, так что только в нижней части живота / тазовой области подвергается.
Примечание: Экран состоит из двух свинцовых "коробки" с узким открытым пространством между ними , что позволяет радиационного облучения небольшой, целевой области мыши (рисунок 1). - Используйте медицинскую ленту, чтобы закрепить основание хвоста мыши в положении внутри экранирования.
Примечание: Шаг 3.4 не является обязательным, но это может помочь гарантировать, что положение мыши не изменяется в течение следующего шага. - Транспортировка устройства экранирования в облучателя, гарантируя, что положение животного в экранировании поддерживается.
- Если мышь находится в группе облучения, доставить 800 сГр в досе скорость около 110 сГр / мин. Если мышь находится в контрольной группе фиктивным-облучения, оставьте мышь в неактивном облучателя для эквивалентного времени.
Примечание: Оптимальные настройки облучателя будет зависеть от конкретного устройства. Мощность дозы 110 сГр / мин доставлен из 137 источника цезий является центральной дозы облучателя , используемого здесь. Время экспозиции доводили до достижения желаемой суммарной дозы 800 сГр. - Отключив мышь от облучателя и экранирования, а затем вернуть его в исходное, стандартной клетке, упомянутой в пункте 1.1.
- Постоянно следить за мышь, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее.
4. Радиационный Усталость измерения
- На следующий день после завершения трех последовательных дней облучения, передают мышей в их индивидуальные клетки VWRA, описанные на стадии 2.1.
- Запись VWRA, как описано в пункте 2.2, за исключением того, здесь установкой записипродолжительность более чем 15 дней. В конце 15 дней, необходимо вручную остановить VWRA записи через интерфейс программного обеспечения.
Примечание: Данные каждого периода записи автоматически сохраняются в виде электронных таблиц, каждая из которых включает в себя поворот, расстояния и измерения скорости для всех животных (столбцов) и на всех интервалов (строк) в течение всего срока записи. В конце эксперимента, есть две таблицы, генерируемые программным обеспечением записи: один для дорадиационного VWRA, и один для пост-облучения VWRA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Три партии мышей проводили по протоколу, описанному выше. Были в общей сложности 16 притворство и 20 облученной (2400 сГр, 3 х 800 / день сГр) мышей. После трех последовательных дней облучения облученный группа показала значительно снижается по сравнению с VWRA притворство (смешанные повторные измерения ANOVA: основной эффект обработки облучением, F 1,13 = 19.233, р <0,001). Эффект был значительным в течение первых семи дней после облучения (простые основные эффекты, р <0,05 с коррекцией Бонферрони), с самым низким средним VWRA расстояния происходит на третий день после облучения (рис 2А). В те дни, 25 и 26, никакие данные не были собраны за счет других поведенческих тестов.
На фиг.2В показано распределение изменения VWRA из прежде чем после облучения. В то время как большинство мышей испытания показали усталость симптомы как (а я сокращениеп колесо , идущее активность), там было небольшое количество мышей , которые показали незначительное изменение или даже увеличение VWRA (рис 2В, нижняя участок). Из-за этой изменчивости, эксперименты с малыми размерами образца не может захватить усталости как поведение.
Рисунок 1: Свинец Экранирование аппарат. Экран, который был разработан в доме, собрана в виде двух одинаковых коробок. Мыши размещены только с их тазовой области открытой в зазоре между свинцовыми коробки. (А) Фотография экранирования в контейнере. Свинцовые ящики окружены пенополистирола, чтобы держать их в положении, которое окружено 10,5-дюймовым плексигласа диаметром контейнера, который был разработан для облучателя. (В) Схема свинцовой защиты. Свинцовая защита состоит из 1-дюймовых толстых блоков свинца арварьировались как две коробки. Каждая коробка состоит из четырех частей: верхняя и нижняя части являются 4,25 "х 3" х 1 ", в то время как боковые части являются ~ 0,5" х 3 "х 1". В собранном состоянии, наружные размеры каждой коробки являются 4,25 "х 3" х 3 ", и есть 1" разрыв между ними. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Ежедневная Добровольное колесо , идущее расстояние. (А) Среднее общее расстояние в ведении мышей каждый день (п = 16 управления, 20 облученный). Мыши были облучены в дни 14, 15 и 16. В дни 25 и 26, никакие данные не были собраны за счет других поведенческих тестов. Столбики ошибок показывают стандартную ошибку среднего значения. * Р <0,05. (Б) Гистограммы изменения VWRA, определяется здесь как среднее Третри дней непосредственно перед облучением (дни 11 - 13), за вычетом среднего значения трех дней сразу после облучения (дни 17 - 19). Положительные числа указывают на снижение VWRA. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описали протокол с использованием целевого периферийного облучения, чтобы вызвать снижение VWRA у мышей без путая заболеваемости и смертности. Важно отметить, что простое экранирование устройство позволяет облучения в данном протоколе для целевой желаемый регион последовательно, имитируя процедуры облучения, полученные от пациентов с тазовой раком. В отличие от существующих моделей CRF , связанных с мозгом или общее облучение тела 8, 9, эта модель исследует , как периферически таргетингом процедура облучения может влиять на центрально-Driven поведение усталости. В наших репрезентативных результатов, мы показываем, что периферическое облучение доставлены таким образом, достаточно для получения усталости, как поведение с полным восстановлением примерно на одну неделю позже.
В качестве меры усталости, VWRA обеспечивает простой и объективной оценки расстояния и скорости в течение 24 часов в сутки, требует минимальной подготовки и эксперимента время. Это сделатьэс требуют жилье мышей в отдельных клетках, что делает объект пространства возможным ограничивающим фактором. В то время как индивидуальное жилье может повлиять на поведение мыши, что может привести к беспокойству 12 или гиперактивности 13, есть доказательства того, что колесо , идущее может уменьшить эти негативные последствия 14. Колесо , идущее поведение также было показано , что имеют меньшую изменчивость внутри мыши и большей воспроизводимостью , чем другие оценки физической активности 15. Тем не менее, возможно , что физическая усталость может быть более избирательно захвачены в других , чем добровольной активности способами, так как добровольной активности может зависеть от мотивации или иных , чем строго физическую усталость 16 факторов. Дальнейшие эксперименты будут необходимы, чтобы сделать такое определение.
Тем не менее, существует несколько точек в пределах протокола, которые имеют решающее значение для успеха. Важно, что мыши могут время Recoveг по прибытии в новую установку, и что обработка будет проводиться в течение этого периода, как отмечено. Эти процедуры уменьшают стресс и беспокойство, которые могут повлиять на добровольной деятельности 17. Поддержание полной анестезии во время процесса облучения также имеет важное значение, не только потому , что будучи стесненными в закрытых пространствах (свинец экранирования) может быть значительным стрессором для животных 18, но и избежать ненужного воздействия других органов / тканей к облучению. Поэтому очень важно, чтобы гарантировать, что доза анестетика достаточна для возраста и штамма мышей перед началом облучения часть этого протокола. Кроме того, акклиматизации мышей на ходовых колес в течение как минимум пяти дней имеет решающее значение для получения стабильного поведения до облучения и подходящих данных для анализа.
Чтобы устранить необычные номера VWRA, то VWRA клетки должны регулярно контролироваться на предмет потенциальных проблем. Для exampле, если постельные принадлежности материалы становятся сложено на или непосредственно под колесом, или, если ходовые колеса не являются достаточно чистыми, это может добавить сопротивление вращения колеса и уменьшить измерения уровня активности. Кроме того, так как большинство колесо , идущее происходит в темное время суток 7, VWRA могут быть чувствительны к колебаниям цикла света, и следует позаботиться , чтобы держать легкие циклы регулярные и бесперебойно.
Этот протокол может вместить использование различных уровней облучения. Например, мы описали три дня дозирования с 800 сГр в этом протоколе, но мы уже видели несколько более низкие уровни усталости с использованием трех дней 600 сГр дозировке 7. Эффекты определенной дозы облучения будет зависеть от штамма мышей 19, величина дозы облучателя 20, фракционирование в течение нескольких дней , 21, и , вероятно , размер области ехрosed под защитой. Разовые дозы 1000 сГр облучения всего тела были использованы у мышей C57 / BL6 без повышенной смертности 22, но следует принять меры предосторожности , чтобы гарантировать , что высокие дозы радиации не вызывают каких - либо признаков заболеваемости.
К тому же дозы облучения, несколько других шагов могут быть изменены в соответствии с экспериментом под рукой. Изменяя свинцовой защиты или размещения животного в пределах защиты, эти методы могут быть адаптированы в отношении других областей тела с облучением. Тем не менее, изменения защитного устройства должно быть подтверждено с дозиметрии, чтобы гарантировать, что облучение не проникает в защищаемой области. Этот протокол также может быть выполнен с возможностью включать в себя широкий спектр поведенческих мер, поскольку добровольный бег деятельность не исключает поведенческие эксперименты, которые являются более физически или психически требовательным. Например, ХПН часто происходит наряду с когнитивными нарушениями 3; будущееэксперименты могли бы изучить роль, которую лучевая терапия может играть в этой ассоциации. Наличие беговой активности колеса должны быть приняты во внимание при выполнении дополнительных поведенческие тесты, а VWRA может повлиять на физиологию и поведение во многих отношениях 16.
При дозах облучения 800 сГр или менее, мыши не должны нуждаться в особом уходе после восстановления от анестезии. Тем не менее, процедура облучения и в результате усталость может потенциально взаимодействовать с другими мерами, такими как дополнительные испытания поведения или фармацевтического лечения. Животных следует пристально следить на дни сразу после облучения, когда изменения или добавления к этой описанной процедуры. Различные штаммы мышей также могут показать разную чувствительность к облучению 19, так что осторожность является оправданным при использовании других , чем C57BL / 6 штаммов.
Хотя этот метод предназначен для представления радиационно-иннаведенной усталость, это всего лишь один из компонентов комплексной концепции CRF. CRF является условием, что, вероятно, имеет множество причин, и возникает у пациентов, которые имеют рак и часто получают несколько процедур. Поэтому понимание CRF может потребовать множества экспериментов с мышей с опухолями и с другими методами лечения, такие как химиотерапия или гормональной терапии. Включение этих переменных в биологических и поведенческих тестов позволит исследователям определить их вклад в этом сложном состоянии. Модель мыши, описанный здесь, может помочь понять специфическую роль радиации в CRF и развивать потенциальные терапевтические средства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Это исследование было поддержано Отделом Intramural исследований, Национальный институт медсестер исследований Национального института здоровья.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Мишель Аллен из Национального сердца, легких и крови институт (NHLBI) Национальных Институтов Здоровья (NIH) для щедро делится своим опытом в мышиных методами фенотипирования и за ее постоянной технической помощи, а также для Тимоти Хант NHLBI за помощь в разработке устройства экранирования. Это исследование проводится при поддержке Отдела Intramural исследований Национального института исследований по уходу за больными НИЗ, а также часть судебного процесса валидации поддерживается грантом онкологии медсестер общества Фонд.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mice | Charles River | Strain code 027 (http://www.criver.com/products-services/basic-research/find-a-model/c57bl-6n-mouse) | |
| Ketamine HCl | Putney | 100 mg/mL stock solution | |
| Xylazine HCl | Lloyd Laboratories | 100 mg/mL stock solution | |
| Rodent Tattoo System | AIMS | ATS-3 | http://animalid.com/lab-animal-identification-systems/ats-3-general-rodent-tattoo-system |
| Lead Shielding Apparatus | (custom made) | One-inch thick lead shielding arranged as two boxes with a one-inch thick gap between them for targeted irradiation | |
| Plexiglass shielding container | (custom made) | Plexiglass container filled with styrofoam. Styrofoam cutouts hold the lead shielding in place. | |
| GammaCell 40 Exactor | Best Theratronics | http://www.theratronics.ca/product_gamma40.html | |
| RAD Disk Ultra | Best Theratronics | http://www.theratronics.ca/product_rad.html | |
| Mouse Single Activity Wheel Chamber | Lafayette Instrument Company | #80820 | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=980 |
| Activity Wheel Counter for Computer Monitoring | Lafayette Instrument Company | #86061 | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1052 |
| Modular Cable for Wheel Counters | Lafayette Instrument Company | #86051-7 | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1046 |
| USB Computer Interface for Activity Wheel Counters | Lafayette Instrument Company | #86056A | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1047 |
| Activity Wheel Monitor Software | Lafayette Instrument Company | #86065 | http://www.lafayetteneuroscience.com/product_detail.asp?itemid=1053 |
References
- Minton, O., et al. Cancer-related fatigue and its impact on functioning. Cancer. 119, Suppl 11. 2124-2130 (2013).
- Bower, J. E. Cancer-related fatigue--mechanisms, risk factors, and treatments. Nat Rev Clin Oncol. 11 (10), 597-609 (2014).
- Saligan, L. N., et al. The biology of cancer-related fatigue: a review of the literature. Support Care Cancer. 23 (8), 2461-2478 (2015).
- Norden, D. M., et al. Tumor growth increases neuroinflammation, fatigue and depressive-like behavior prior to alterations in muscle function. Brain Behav Immun. 43, 76-85 (2015).
- Ray, M. A., Trammell, R. A., Verhulst, S., Ran, S., Toth, L. A. Development of a mouse model for assessing fatigue during chemotherapy. Comp Med. 61 (2), 119-130 (2011).
- Zombeck, J. A., Fey, E. G., Lyng, G. D., Sonis, S. T. A clinically translatable mouse model for chemotherapy-related fatigue. Comp Med. 63 (6), 491-497 (2013).
- Renner, M., et al. A murine model of peripheral irradiation-induced fatigue. Behav Brain Res. 307, 218-226 (2016).
- Van der Meeren, A., Lebaron-Jacobs, L. Behavioural consequences of an 8 Gy total body irradiation in mice: Regulation by interleukin-4. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 79 (2), 140-143 (2001).
- York, J. M., et al. The biobehavioral and neuroimmune impact of low-dose ionizing radiation. Brain Behav Immun. 26 (2), 218-227 (2012).
- Meijer, J. H., Robbers, Y.
- The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th Edition, National Research Council of the National Academies. (2011).
- Heredia, L., Torrente, M., Domingo, J. L., Colomina, M. T. Individual housing and handling procedures modify anxiety levels of Tg2576 mice assessed in the zero maze test. Physiol Behav. 107 (2), 187-191 (2012).
- Varty, G. B., Paulus, M. P., Braff, D. L., Geyer, M. A. Environmental enrichment and isolation rearing in the rat: effects on locomotor behavior and startle response plasticity. Biol Psychiatry. 47 (10), 864-873 (2000).
- Pham, T. M., Brene, S., Baumans, V. Behavioral assessment of intermittent wheel running and individual housing in mice in the laboratory. J Appl Anim Welf Sci. 8 (3), 157-173 (2005).
- Knab, A. M., et al.
- Novak, C. M., Burghardt, P. R., Levine, J. A. The use of a running wheel to measure activity in rodents: relationship to energy balance, general activity, and reward. Neurosci Biobehav Rev. 36 (3), 1001-1014 (2012).
- Mineur, Y. S., Belzung, C., Crusio, W. E. Effects of unpredictable chronic mild stress on anxiety and depression-like behavior in mice. Behav Brain Res. 175 (1), 43-50 (2006).
- Perhach, J. L. Jr, Barry, H. 3rd Stress responses of rats to acute body or neck restraint. Physiol Behav. 5 (4), 443-448 (1970).
- Iwakawa, M., et al. Different radiation susceptibility among five strains of mice detected by a skin reaction. J Radiat Res. 44 (1), 7-13 (2003).
- Travis, E. L., Peters, L. J., McNeill, J., Thames, H. D. Jr, Karolis, C. Effect of dose-rate on total body irradiation: lethality and pathologic findings. Radiother Oncol. 4 (4), 341-351 (1985).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
- Duran-Struuck, R., et al. Differential susceptibility of C57BL/6NCr and B6.Cg-Ptprca mice to commensal bacteria after whole body irradiation in translational bone marrow transplant studies. J Transl Med. 6, 10 (2008).
