Summary
Den primære cilium er fundamentalt viktig i neurale stamcelle proliferasjon, neuronal differensiering, og voksen neuronal funksjon. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å studere ciliogenesis og trafikkering av signalisering proteiner til cilia i nervestammen / forløperceller og differensierte nevroner ved hjelp av primær neurosfærekulturer.
Introduction
Den primære cilium er et mikrotubuli-baserte dynamisk subcellulære kammer som fungerer som en sensorisk antenne for å samordne cellulære signalveier, inkludert sonic hedgehog (Shh) veien under embryonal nevronal utvikling 1, 2, og romoppdelt subcellulær signalisering i voksen neuronal funksjon 3, 4 . Aliserte komponenter av disse reaksjonsveier, for eksempel Shh reseptoren Lappet 5; veien aktivator glattes (Smo) 6; og Gpr161 7, en orphan G-protein-koblet reseptor (GPCR) som negativt regulerer Shh veien, lokalisere til cilia på en dynamisk måte. Multiple GPCRs har blitt rapportert til å lokalisere å cilia i neuroner i hjernen 7, 8, 9, 10 sup>, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Defekter i cilia og cilia-genererte signalveier påvirke flere vev og er kollektivt kjent som ciliopathies 17, 18, 19. Den ciliopathy sykdom spekteret inneholder ofte nevrologiske defekter, slik som kraniofaciale abnormiteter 20, 21, 22. I tillegg, primær cilia i hypothalamus neuroner regulere sentrale metthetsfølelse veier, og defekter resultere i sentral fedme 23, speiling fedme i syndrom ciliopathies som Bardet Biedel syndrom 24. I tillegg, neuropeptid-reseptor-signalering i cilia regulerer central metthetsfølelse baner 11, 14. Ciliær lokalisering av adenylylcyklase III (ACIII) og GPCR som somatostatinreseptor 3 i hippocampalneuroner resultere i nye objekt gjenkjennelsesfeil og hukommelsessvikt 25, 26 og parallell til en mangel på integritet ciliære 27. Utviklingsområder av cilia-genererte signalering er nært knyttet til vev homeostase; Særlig cilia er viktige for utviklingen av Shh-subtype Medulloblastomas som følge av granule progenitorceller i lillehjernen 28, 29. Dermed primære flimmerhårene spiller viktige roller under embryonal, postnatal og voksen neuronal utvikling og funksjon.
Neurale stamceller (NSC) ligge i subventricular sone (SVZ) av den laterale ventrikkel subgranular sone av dentate gyrus av hippocampus, og denventrikulær sone av den tredje ventrikkel i hypothalamus hos pattedyr 30, 31, 32. NSC er multi, har evne til selvfornyelse, og er viktig for hjernens utvikling og regenerativ medisin 30. De fleste NSCs i SVZ er stillestående og har en enslig primær cilium som, i mange tilfeller, strekker seg ut til den laterale ventrikkel 33. De primære cilium signalene via lokalisering av forskjellige reseptorer, indusere nedstrøms cellulære responser, spesielt i forhold til Shh, TGFp, og reseptor-tyrosin-kinase-reaksjonsveier 2, 34, 35, 36. Siden primær cilia strekker seg inn i den laterale ventrikkel, er det en hypotese at primær cilia detektere cytokiner i cerebrospinalvæsken (CSF) for å aktivere NSCs 37 38, 39, 40, 41. Imidlertid, de mekanismer som står i forbindelse med CSF NSCs og om primær cilia er involvert er ikke kjent. Adherente NSCs i kultur er cilierte; lokalisere shh pathway komponenter, for eksempel Smo og Gpr161 i cilia; og er Hysj responsive 42. Således kan NSCs tjene som et viktig modellsystem for å studere Shh vei, ciliær trafikk, og neuronal differensiering veier. I tillegg kan neuroner differensiert fra NSC også anvendes for ciliære trafikkriterier analyser.
Neurosfærer utgjøres av klynger av frittflytende celler som stammer fra proliferasjon av neural stilk / progenitor-celler som vokser i nærvær av spesifikke vekstfaktorer og ikke-adhesive overflater 43, 44. Neurosfærer tjener som viktig in vitro kulturmodeller for å studere neuralstamceller / forløperceller i normal utvikling og sykdom 31, 45, 46, 47. Her beskriver vi en neurosfære basert assay for dyrking av nervestamceller / forløperceller og for differensiering til neuroner / gliaceller. Vi legger spesielt vekt trafikkering av signalisering komponenter til cilia av neuralstamceller / forløperceller og differensierte neuroner (figur 1). I motsetning til dyrking av primære nerveceller, primære neurosfærer er relativt enkle å kultur, er mottagelig for flere passasjer og fryse-tine-sykluser, og kan gjennomgå differensiering til neuroner / gliaceller. Viktigere, fant vi ut at neurosfære-avledet nervestilk / forløperceller og differensierte neuroner cilierte i kultur og lokalisere signalmolekyler som er relevante for ciliær funksjon i disse avdelinger. Neurosfære-baserte dyrkingsmetoder kan tjene som en ideell modellsystem for å studere ciliogenesis og ciliare handel med NSCs og differensierte neuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering av Neurosfærer fra Adult Mouse Brain
- Avlive en voksen mus (rundt 2 måneder gammel) av en overdose av isofluran. Dobbeltsjekk at musen har sluttet å puste og dissekere umiddelbart etter døden.
- Ved hjelp av saks, lage en midtlinjen snitt til å åpne skallen. Fjern hjernen.
- Sett hjernen i kaldt PBS i en 10 cm tallerken på is. Flg hel-mount disseksjon metode for å oppnå den SVZ fra den laterale ventrikkel 48.
- Plasser den laterale ventrikkel inn i et 1,5 ml rør, tilsett 500 ul av 0,05% trypsin-EDTA i PBS, og inkuber røret i 15 minutter ved 37 ° C i et vannbad.
- Etter 15 minutter, tilsett 500 ul stoppe medium og forsiktig pipettér 20 - 30 ganger med en 1 ml spiss. Unngå å danne luftbobler under pipettering.
MERK: Dette trinnet er avgjørende for celle overlevelse. - Spinn ned cellene ved 500 x g i 8 min. Kast supernatanten, tilsett 1 ml PBS, og resuspender than celler ved forsiktig pipettering med en 5 x 1 ml spiss.
- Spinne ned ved 500 x g i 8 min. Kast supernatanten ved bruk av en 1 ml spiss og tilsett 1 ml basalmedium.
- (Valgfritt) Hvis cellerester er observert, passerer cellene gjennom et 70 pm-celle-sil.
- Tell antall celler med et hemocytometer; Hovedsakelig anvendes omtrent 30 000 - er 60.000 celler / SVZ oppnådd.
- Plate cellene fra en SVZ inn i en 10 cm skål med 10 ml NSC medium og kulturen ved 37 ° C med 5% CO2.
- (Valgfritt) For å unngå sammensmelting mellom kuler 49, satt 1000 celler i en enkelt brønn av en ultra-low-binding 6-brønns plate som er fylt på forhånd med 1,5 ml av NSC medium og kulturen ved 37 ° C med 5% CO2.
MERK: Etter 5-7 dager, neurosferer kan observeres (figur 2A). Den dyrkningsperioden kan variere med alderen på mus eller den genetiske bakgrunnen. - Tilsett 2 ml av NSC medium hver 3-4 dager for å opprettholde kulturen(Ikke fjerne det eksisterende medium).
2. Analyse av Differensiering kapasitet neurosfærer og Ciliogenesis tester
- For å analysere den differensieringskapasitet, analysere neurosfærene henhold adherente betingelser i differensieringsmedium.
- Steril 12 mm runde dekkglass ved autoklavering eller med UV-stråling før bruk. For en klebrige cellekultur, sette en sterilisert 12 mm runde dekkglass i en brønn av en 24-brønners plate under aseptiske betingelser.
- Belegge dekkglass i 10 sekunder med 500 ul av 0,002% poly-L-lysin (PLL). Aspirere løsningen og tørke den i 10-15 min.
- Tilsett 500 ul av laminin-løsning (5 ug / ul). Inkuber dekkglass i 1 time ved 37 ° C.
- Aspirere laminin og tilsett 500 ul av differensieringsmedium eller NSC medium (udifferensierte kontroll).
- For differensiering analysen, plukke opp en 100 til 200 um sfære med en 200 ul spiss under mikroskopet. Legg til5-10 neurosfærer til hver brønn av en 24-brønners plate og dyrking i 7-10 dager i differensieringsmedium.
- For å analysere udifferensierte neurosfærer, tilsett 5-10 neurosfærer til hver brønn av en 24-brønners plate og kultur i 1-2 dager i medium NSC. Vedlagte neurosfærer spre seg og vokse som et monolag (figur 2B).
- Etter forsiktig fjerning av medium, fikser cellene med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS i 15 min ved RT, og deretter vaskes to ganger med PBS i 5 minutter ved RT. Platen kan lagres ved 4 ° C i 1-2 måneder.
NB: For å visualisere neuralstamceller / forløperceller i NSC medium og differensierte celler i differensieringsmedium, utføre immunofarging mot nestin (neuralstamceller / progenitor-cellemarkør), β-tubulin III (TUJ1 monoklonalt, neuronal markør), GFAP (glial fibrillært surt protein , astrocytt markør), og O4 (oligodendrocytt markør) (figur 2B-E). For å analysere cilia, utføre immunofarging mot Arl13b (primær cilia marker) og Gpr161 (ciliær GPCR) (figur 3). - Monter dekkglasset med monterings oppløsning på en glassplate. Vippe glassplate for å fjerne overskudd av oppløsning.
3. Analyse av Ciliogenesis i Neurosfærer
- For å analysere celler i intakte neurosfærer ved immunofarging, overføre 1 ml av dyrkingsmedium som inneholder flere neurosfærer til et 1,5 ml rør og spinne ned ved 500 x g i 8 min. Fest kuler med 4% (PFA) etter fjerning av mediet i 15 minutter og vask med PBS. Spinne ned kuler ved 500 x g i 8 minutter, fjern supernatanten og inkuber kulene O / N med 30% sukrose ved 4 ° C.
- Kast supernatanten ved bruk av en 1 ml spiss og tilsett 500 ul av oktober oppløsning ved hjelp av et kutt 1 ml spiss. Skjær kanten av spissen for å utvide åpningen, som oktober er tyktflytende.
- Overfør den oktober oppløsning inneholdende neurosfærene i en engangs plastfryseform (10 mm x 10 mm x 5 mm).
- Fryse mgamle på tørr is i minst 15 min.
- (Valgfritt) Stopp eksperimentet og lagre formen i en -80 ° C fryser i opp til ett år.
- Skjær seksjonene med en kryostat; tykkelsen av seksjonene skal være 15-30 um.
- For å visualisere det primære flimmerhårene i en neurosfære, utføre immunofarging mot Arl13b (figur 4).
4. Kultur og Passage av Neurosfærer og Heft NSCs
- Passasje neurosfærene mens kulen størrelse er mellom 100 til 200 um; når neurosfærene er for stor (300 nm eller høyere), de er ikke ideelt for eksperimenter.
- Overfør neurosfærene inn i et 50 ml rør ved anvendelse av en 1 ml spiss og spinne ned ved 500 x g i 8 min.
- Kast supernatanten ved hjelp av en aspirator, tilsett 500 ul av 0,05% trypsin-EDTA i PBS, og inkuber i 5 minutter ved 37 ° C. Mengden av trypsin varierer avhengig av antall sfærer.
- Tilsett 500 ul av serum-mediet og forsiktig ørett 20 ganger med 1 ml spiss.
- Spinne ned ved 500 x g i 8 min. Kast supernatanten ved bruk av en 1 ml spiss og tilsett 1 ml basalmedium.
- (Valgfritt) Hvis cellerester eller dissosierte neurosfærer er sett, passerer cellene gjennom et 70 pm-celle-sil.
- Passasje cellene i en 10 cm skål ved en tetthet på 10.000 celler / cm2 i NSC medium; cellene vil være klar for neste passering etter en uke.
- (Valgfritt) å fryse celler tilsettes frysemediet for å generere 500.000 til 1.000.000 celler / mL suspensjon. Fryse celler ved anvendelse av Cryo-frysing beholdere; dissosiert Neurosfærene kan også fryses.
- For den heftende kultur, dillute cellene til 50.000 celler / cm2 på PLL- og Laminin-belagte dekkglass med NSC medium, og kultur i 1-2 dager.
5. sult og analyse av Cilia
- Forbered sultemedium (Tabell 1).
- 1-2 dager etter den første plating av adherente celler etter dissosiasjon, skifte til NSC medium i en brønn (kontroll) og sultemedium i en annen brønn (eksperiment).
- Culture de adherente cellene i 24 timer.
- Fikser cellene med 4% PFA i PBS i 15 minutter ved romtemperatur og vaskes to ganger med PBS i 5 minutter hver ved RT.
- (Valgfritt) Stopp eksperimentet og lagre 24-brønners plater med dekkglassene i PBS ved 4 ° C i 1-2 måneder.
- Utføre en immunfluorescens protokoll for farging 7, 50.
- Monter Dekk bruker monteringsløsning. Tørk objektivglass O / N ved romtemperatur i mørket.
- Hente bilder på et sammensatt mikroskop på nødvendig forstørrelse. Bruk et mikroskop, et kamera, og mål (40X / 1.3 olje- og 63X / 1.4 olje), styres via ledsaget programvare. Ta tilstrekkelig z-seksjonene på 0,5-0,8 mikrometer intervaller (figur 5).
- For kvantitativ analyse av ciliær lokalisering iadherente celler, erverve stabler av bilder fra 3-8 på hverandre følgende felt med sammenflytende celler ved å se inn i DAPI kanalen. Kvantifisere antallet primære cilier bruke ImageJ / Fiji. Vanligvis bruker "Cell counter" verktøy i ImageJ Tillegg> Analyse dialogboksen for å telle cellene med GPCR-positive cilia; maksimale anslag fra stabler av bildet kan også bli eksportert fra ImageJ / Fiji.Use lignende bildeintensitet og kontrast parametre for alle bilder fra det samme eksperiment for telling og eksport formål.
6. Transfeksjon av Neurosfærer
- Følge dissosierte celler til dekkglass i 24 timer. Bruke en celletetthet vanligvis mellom 75.000 og 150.000 celler i 500 ul medium NSC i en enkelt brønn av en 24-brønners plate.
- Bland 25 ul av redusert serummedium og 1,5 ul av transfeksjon reagens i et 0,5 ml mikrorør ved virvling i 5 sek.
- Legg 2,5 ug endotoksin-fritt plasmid DNA til et separat 0,5 ml microtube inneholdende 25 mL av redusert serum media og bland ved virvling i 5 sek.
- Tilsett 1 pl av transfeksjon reagens til den andre mikrorør inneholdende DNA, og bland ved virvling i 5 sek.
- Tilsett blandingen fra DNA-inneholdende rør til den første mikrorør og blandes ved pipettering.
- Inkuber blandingen i 10-15 minutter ved RT. Etter inkubering tilsett transfeksjonen blandingen tilsatt til brønnene på toppen av NSC medium (500 pl / brønn).
- Skift medium 24 timer etter transfeksjon for å styre medium (NSC medium) eller sultemedium (500 pl / brønn).
- Fikser cellene ved å endre mediet til 4% PFA etter 24 timer og utføre farging; typisk opp til en 10% transfeksjonseffektiviteten er oppnådd ved anvendelse av denne protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter utsåing av cellene fra den SVZ i NSC medium for en uke, ble det flytende neurosfærer observert (figur 2A). Størrelsene på sfærene varierte mellom 50 og 200 pm. For å undersøke om kulene var avledet fra neuralstamceller / forløperceller ble neurosfærene sådd ut på PLL- og Laminin-belagte dekkglass i NSC medium i 2 dager. De ble deretter immunostained mot nevrale stilk / stamcelle markør, Nestinmarkøren. To dager var nødvendig for å tillate kulene å feste til Dekk og å vokse som en monolayer av celler. Monolaget av celler som var positive for nestin (figur 2B). For å undersøke differensiering kapasiteten til neurosfærer, vi belagt dem å følge fremgangsmåten beskrevet i seksjon 2 på PLL- og Laminin-belagte dekkglass i differensieringsmedium uten dissosiering i 7-10 dager. Det tar minst en uke for differensiering. Neurosfærene festet til dekkglassene og utvideed å vokse som en monolayer av celler. Vi har løst cellene og immunofarget mot neuron, astrocytt, og oligodendrocytt markører. Vi observerte adherente neurosfærer som differensiert til β-Tubulin III-positive neuroner, GFAP-positive astrocytter og oligodendrocytter O4-positive (figur 2C-E). Således kan multipotente neurosfærer være avledet fra voksen mus SVZ.
For å bestemme om heft neurosfærene og differensierte neuroner har hoved cilia, vi immunomerket mot Arl13b (primær cilium markør) 51 og Gpr161 (ciliare lokalisert GPCR) 7. Vår erfaring er i butikken musemodeller uttrykker ARL13B-mCherry, og i studier med å utvikle mus cortex, de fleste (om ikke alle) nevronale flimmerhårene i hjernen uttrykke Arl13b, mens alle nevronene ikke ACIII-positive 52, 53, 54. tos, vi hovedsakelig stole på Arl13b å oppdage neuronal flimmerhårene. Vi oppdaget primære cilia og lokalisering av Gpr161 til cilia av forløperceller i adherert neurosfærer (figur 3A) og i differensiert neuroner (figur 3B). Dermed er adherente neurosfærene og differensierte linjene cilierte i kultur og lokalisere signaliseringsmolekyler.
For å bestemme om flytende neurosfærer har hoved cilia, cryosectioned vi flytende neurosfærer etter fiksering, som beskrevet i seksjon 3. Det ble observert primære cilia i nervestammen / forløperceller i den snittede neurosfærene (Figur 4A-B). Det er viktig å skaffe z-seksjonene på tvers av neurosfærene å fullt visualisere primær cilia, fordi det er vanskelig å undersøke den primære flimmerhårene i en enkelt z-planet. I sammendrag, udifferensierte neurosfærer er heterogene populasjoner av cilierte og ikke-cilierte celler.
(Figur 5A-B). I tillegg bemerket vi et økt antall Gpr161-positive cilia på sult (% Gpr161-positive cilia / Arl13b-positive cilia) (Figur 5A-B). Interessant nok en tidligere studie ved hjelp av udifferensierte humane embryoniske stamcellelinjer demonstrert at humane embryonale stamceller i kultur også ha primære cilia 55. Antallet og lengden av cilia økning på serum sult i disse cellelinjer, og disse cilia også ha komponenter av Shh maskineri.
Vi har også transfektert adherent neuralstamceller / progenitor-celler, som beskrevet i seksjon 6. Vi karakteristiske påvist en transfeksjonseffektivitet på opp til 10%, i likhet med primær neuronkulturer i laboratoriet (figur 6).
| Løsning | Komponent |
| 1 x PBS | Fortynn 10x PBS med vann autoklavert |
| NSC medium | 2 ml 50x B27 |
| 1 ml 100x N2 | |
| 1 ml 200 mM L-glutamin | |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| FGF-basic (human bFGF) (Stamoppløsning 25 ng / ml i Neurobasal medium): 20 ng / ml eller 2 mg totalt 100 ml media | |
| EGF (lagerløsning 25 ng / ml i Neurobasal medium): 20 ng / ml eller 2 mg totalt i 100 ml media | |
| 95 ml basalmedium | |
| Human FGF-basic (human bFGF) | 1 ml basalmedium til kommersiell humant bFGF 25 ug flaske |
| Oppbevar i sterile mikrorør på -20 ° C eller lavere. Bruke en enkelt 80 pl prøve eller 2 ug / 100 ml NSC media. | |
| EGF | Tilsett 8 ml basalmedium for kommersiell EGF 20 ug flaske |
| Lagre som sterile mikrorør på -20 ° C eller lavere. Bruke en enkelt 80 pg alikvot / 100 ml medium. | |
| stoppe medium | 1 ml FBS |
| 75 U-DNase I (75 U / ul i PBS) | |
| 9 ml PBS | |
| Ytterligere serummedium | 1 ml FBS |
| 9 ml basalmedium | |
| frysing medium | 4 ml DMSO |
| 24 ml basalmedium | |
| 12 ml 30% FBS | |
| differensiering medium | 90 ml basalmedium |
| 5 ml 5% FBS | |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| 1 ml 200 mM L-glutamin | |
| 1 ml 100x N2 | |
| 2 ml 50x B27 | |
| FGF-basic (human bFGF) (lagerløsning av 25 ng / ml i Neurobasal medium): 10 ng / ml eller 1 mg Totalt 100 mL | |
| utsultingsmedium | 95 ml basalmedium |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| 1 ml 200 mM L-glutamin | |
| 1 ml 100x N2 | |
| 2 ml 50x B27 |
Tabell 1: Oppskrift of Solutions.
ve_content" fo: keep-together.within-page = "1">
Figur 1: Skjematisk fremstilling av neurosfærekulturer Kultur og Differensiering protokoller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Neurosfærer Utstillings Differensiering kapasitet. (A) er vist Representative neurosfærer. (B) Neurosfærer ble utsådd på PLL- og Laminin-belagte dekkglass i NSC medium i 2 dager og ble immunofarget for nestin (neuralstamceller / progenitor-cellemarkør). (CE) Neurosfærer ble platet å følge fremgangsmåten beskrevet i seksjon 2 på PLL- og Laminin-belagte dekkglass i differensieringsmedium i 7 dager uten huut dissosiasjon; fast; og immunofarget mot β-Tubulin III (neuronal markør), GFAP (astrocytt markør), og O4 (oligodendrocytt markør). Kjernene ble farget av DAPI. Skala bar = 100 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Neurosfærer og neuroner i Heft Differensiert Neurosfærer er cilierte. (A) dissosierte neurosfærer ble utsådd på belagte dekkglass i NSC medium i 2 dager; fast; og immunofarget mot Gpr161 (grønn), Arl13b (rød), og DNA (blå). (B) Differensierte nevronene ble immunofarget mot Gpr161 (grønn), Arl13b (rød, A) eller β-Tubulin III (rød, B), og DNA (blå). Hvite piler indikerer Gpr161 lokalisering i flimmerhårene.De rette paneler i (A) er forstørrede oppriss av det primære cilium antydet med den hvite pilen. Den Gpr161-positive cilium i hvit-eske neuron er vist til høyre i (B). Målestokk = 10 um (A); 50 um (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Flytende, udifferensiert Neurosfærer Inneha Cilierte celler. Flytende neurosfærer ble fiksert, innstøpt i OCT cryosectioned, og bearbeidet for immunofluorescens mot Arl13b (rød) og DNA. Arl13b-positiv primær flimmerhårene i en neurosfære er vist. Panelet i (A) er et maksimum intensitet projeksjon av 14 z-seksjoner 0.8 mikrometer intervaller fra en neurosfærer. Panelene i (b) viser i større målestokk av ciliated celler i den hvite-eske region i (A). Den maksimale projeksjon bilde fra alle z-seksjoner er vist som en stabel, mens tallene 1 til 14 viser individuelle z-seksjoner. De hvite piler indikerer primær flimmerhårene. Skala bar = 50 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: sult induserer Ciliogenesis i Spaltet Heft neuralstamceller / forløperceller. (A) Dissosierte celler ble sådd ut på belagte dekkglass i NSC medium eller sultemedium i 24 timer; fast; og immunofarget mot Gpr161 (grønn), Arl13b (rød), og DNA (blå). Gpr161-positive cilia er observert i kontroll (venstre) og sultet (høyre) celler. De nedre paneler er forstørrede utsnitt av de angitte hvite boksene i de respektiveøvre paneler. De hvite piler og pilspisser angir Gpr161-positive og -negative flimmerhårene, henholdsvis. Skala bar = 100 um. (B) Kvantifisering av Arl13b-positive cilierte celler (venstre graf) og Gpr161 lokalisering i Arl13b-positive cilia (til høyre graf) på kontroll og sultet celler. Prosentandelene av både Arl13b-positive cilierte celler og Gpr161 lokalisering i Arl13b-positive cilia øket på sult. Kvantifiseringen ble utført fra to synsfelt hver fra to tekniske replikater av et enkelt eksperiment. Dataene er angitt som gjennomsnittet av alle 4 synsfelt ± standardavvik. * P <0,05; **, p <0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Transfeksjon iDissosiert Heft Neural Stem / stamceller. Dissosierte cellene sådd ut på belagte dekkglass ble transfektert med en LAP-TULP3 N-terminale ende (1-183 aa) mut12 konstruksjon som ikke bindes til kjernen IFT-A-komplekset 56. Mediet ble forandret til sultemedium 24 timer etter transfeksjon. Cellene ble fast etter 24 timer og immunofarget mot GFP (grønt), Gpr161 (rød), Arl13b (magenta), og DNA (blå). En celle transfektert med Gpr161- og Arl13b-positive cilium er markert med en hvit pil, mens en transfektert celle uten cilia er vist med en hvit pilspiss. Gule piler og pilspisser peker til ikke-transfekterte celler med eller uten Gpr161 / Arl13b, henholdsvis. Skala bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en metode for å generere og vedlikeholde neurosfærekulturer fra voksen mus SVZ. Noen relevante punkter i forbindelse med kulturer er som følger. Først størrelsene av kulene er typisk mellom 50 til 200 um. I vår erfaring, når en neurosfæren blir større enn 300 mikrometer i diameter, har det optimale tidspunktet for aging vært savnet. Disse større kuler inneholder døde celler i kjernen. For det andre, som neurosfærer blir ofte brukt til å studere neuralstamceller / progenitor-celler, er det viktig å bruke EGF og FGF-basiske (bFGF) for å opprettholde den stemness av disse cellene. Derfor, faktorer som induserer differensiering, for eksempel FBS, må unngås under opprettholdelse av neurosfærene. Det har vist seg at 10% FBS kan skille neurosferer i astrocytter 47. Tredje, kan graden av neuronal differensiering avhengig av alderen på musen. Hvis man ønsker flere neuronal differensiering av neurosfærer, yngre mus (postnatal day 0) kan anvendes. Fjerde, hvis du starter nye kulturer, er det alltid godt å undersøke differensiering kapasiteten neurosfærene. Femte, vår metode gjør det også frysing og tining fra etablerte neurosfærekulturer for fremtidig eksperimentell bruk. Etter tining blir vanligvis dyrket som adherente spindelformede celler uten poly-L-lysin eller laminin. Dette kan være forårsaket av fryse-tine skader på cellene. Det er viktig å holde cellene vokse til de blir 60-80% konfluent før passering. Etter passering, blir vanligvis dyrket som neurosfærer, og kan generelt passert opp til 5 - 10 ganger.
Neurosfære-baserte kulturmetoder tillate oss å studere ciliær handel og signalveier i neuralstamceller / forløperceller og differensierte nevroner. Vi undersøkte primære cilia i flytende / adherente og differensierte neurosfærer. Det er viktig å skaffe flere z-seksjoner for å visual cilia gjennom hele omfanget av neurosfærene. Videre akterer generering av adherente kulturer av disse neurosfærer, og sulter dem i 24 timer, er de fleste av cellene cilierte (figur 5) og som er anriket på foreldreløse GPCR, Gpr161. Men forlenget utsulting av de adherente kulturer resulterer i subcellulære vacuolar strukturer. Derfor er det viktig å nøye optimalisere sulteperioder for spesielle eksperimentelle formål.
For tiden blir studier på ciliogenesis hovedsakelig utført i et par ciliated, udødeliggjorte cellelinjer 57. Disse cellelinjene ikke alltid trofast rekapitulere neuroner og neuralstamceller / forløperceller i å uttrykke signalkomponenter, så som GPCR eller Shh svei maskiner, noe som gjør det nødvendig å utvikle nye metoder for å studere rollen av flimmerhårene i biologiske prosesser. Neurosfærene-baserte metoder som er beskrevet her tillater oss å studere cilia regulerte cellulære reaksjonsveier, inkludert GPCR og Shh signalering i forbindelse med neurale stamceller / progenitorceller og differentiated nevroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm round cover glass | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Affymetrix | 19943 | |
| 50 mL tube | Falcon | 352098 | |
| 95 mm x 15 mm petri dish, slippable lid | Fisherbrand | FB0875714G | 10 cm dish |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-545-152 | Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody |
| Arl13B, Clone N295B/66 | Neuromab | AB_11000053 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504001 | B27 |
| Centrifuge | Thermo scientific | ST 40R | |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| DAPI | Sigma | D9542-10MG | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancrease | Sigma | D5025-15KU | Dnase I |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418-100ML | DMSO |
| Disposable Vinyl Specimen Molds | Sakura Tissue-Tek Cryomold | 4565 | 10 mm x 10 mm x 5 mm |
| Dulbecco's Phosphate-buffered Saline 10X, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1408-500ML | DPBS |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11254-20 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9026-500ML | |
| Fluoromount-G solution | Southern Biotech | 0100-01 | mounting solution |
| GFAP | DAKO | Z0334 | |
| Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21127 | Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody |
| Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21137 | Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody |
| Gpr161 | home made | N/A | |
| human bFGF | Sigma | F0291 | FGF |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 0.100 mm deep | improved neubauer |
| Isothesia | Henry Schein | NDC 11695-0500-2 | Isofluorane |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | Laminin |
| L-Glutamine (200 mM) | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000 | |
| Mr. Frosty | Nalgene | 5100-0036 | |
| N-2 supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | N2 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| OCT compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | OCT |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma | P4707 | |
| Recombinant human EGF protein, CF | R and D systems | 236-EG-200 | EGF |
| Scissor | Fine science tools | 14060-10 | |
| Superfrost plus microscope slide | Fisher scientific | 12-550-15 | slides |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |
| Trypsin-EDTA solution (10X) | Sigma | T4174-100 | Trypsin |
| COSTAR 6-Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile | Corning | 3471 | ultra-low binding 6-well plate |
| β-tubulin III | Covance | MMS-435P | TUJ1 |
References
- Mukhopadhyay, S., Rohatgi, R. G-protein-coupled receptors, Hedgehog signaling and primary cilia. Semin Cell Dev Biol. 33, 63-72 (2014).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nat Rev Genet. 11, 331-344 (2010).
- Guemez-Gamboa, A., Coufal, N. G., Gleeson, J. G. Primary cilia in the developing and mature brain. Neuron. 82, 511-521 (2014).
- Louvi, A., Grove, E. A. Cilia in the CNS: the quiet organelle claims center stage. Neuron. 69, 1046-1060 (2011).
- Rohatgi, R., Milenkovic, L., Scott, M. P. Patched1 regulates hedgehog signaling at the primary cilium. Science. 317, 372-376 (2007).
- Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437, 1018-1021 (2005).
- Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary G-protein-coupled receptor Gpr161 negatively regulates the Sonic hedgehog pathway via cAMP signaling. Cell. 152, 210-223 (2013).
- Hilgendorf, K. I., Johnson, C. T., Jackson, P. K. The primary cilium as a cellular receiver: organizing ciliary GPCR signaling. Curr Opin Cell Biol. 39, 84-92 (2016).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol Biol Cell. 19, 1540-1547 (2008).
- Berbari, N. F., Lewis, J. S., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Bardet-Biedl syndrome proteins are required for the localization of G protein-coupled receptors to primary cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 4242-4246 (2008).
- Loktev, A. V., Jackson, P. K. Neuropeptide Y family receptors traffic via the Bardet-Biedl syndrome pathway to signal in neuronal primary cilia. Cell Rep. 5, 1316-1329 (2013).
- Marley, A., Choy, R. W., von Zastrow, M. GPR88 reveals a discrete function of primary cilia as selective insulators of GPCR cross-talk. PLoS One. 8, e70857 (2013).
- Marley, A., von Zastrow, M. DISC1 regulates primary cilia that display specific dopamine receptors. PLoS One. 5, e10902 (2010).
- Omori, Y., et al. Identification of G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) in Primary Cilia and Their Possible Involvement in Body Weight Control. PLoS One. 10, e0128422 (2015).
- Koemeter-Cox, A. I., et al. Primary cilia enhance kisspeptin receptor signaling on gonadotropin-releasing hormone neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 10335-10340 (2014).
- Brailov, I., et al. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. Brain Res. 872, 271-275 (2000).
- Hildebrandt, F. .,,T. .,&K. atsanis,N. ., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N Engl J Med. 364, 1533-1543 (2011).
- Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
- Badano, J. L., Mitsuma, N., Beales, P. L., Katsanis, N. The ciliopathies: an emerging class of human genetic disorders. Annu Rev Genomics Hum Genet. 7, 125-148 (2006).
- Novarino, G., Akizu, N., Gleeson, J. G. Modeling human disease in humans: the ciliopathies. Cell. 147, 70-79 (2011).
- Brugmann, S. A., Cordero, D. R., Helms, J. A. Craniofacial ciliopathies: A new classification for craniofacial disorders. Am J Med Genet A. 152A (12), 2995-3006 (2010).
- Valente, E. M., Rosti, R. O., Gibbs, E., Gleeson, J. G.
- Davenport, J. R., et al. Disruption of intraflagellar transport in adult mice leads to obesity and slow-onset cystic kidney disease. Curr Biol. 17, 1586-1594 (2007).
- Zaghloul, N. A., Katsanis, N. Mechanistic insights into Bardet-Biedl syndrome, a model ciliopathy. J Clin Invest. 119, 428-437 (2009).
- Einstein, E. B., et al. Somatostatin signaling in neuronal cilia is critical for object recognition memory. J Neurosci. 30, 4306-4314 (2010).
- Wang, Z., Phan, T., Storm, D. R. The type 3 adenylyl cyclase is required for novel object learning and extinction of contextual memory: role of cAMP signaling in primary cilia. J Neurosci. 31, 5557-5561 (2011).
- Berbari, N. F., et al. Hippocampal and cortical primary cilia are required for aversive memory in mice. PLoS One. 9, e106576 (2014).
- Han, Y. G., Alvarez-Buylla, A. Role of primary cilia in brain development and cancer. Curr Opin Neurobiol. 20, 58-67 (2010).
- Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nat Med. 15, 1062-1065 (2009).
- Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A. The Adult Ventricular-Subventricular Zone (V-SVZ) and Olfactory Bulb (OB) Neurogenesis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 8, (2016).
- Shimada, I. S., LeComte, M. D., Granger, J. C., Quinlan, N. J., Spees, J. L. Self-renewal and differentiation of reactive astrocyte-derived neural stem/progenitor cells isolated from the cortical peri-infarct area after stroke. J Neurosci. 32, 7926-7940 (2012).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. eLife. 3, e02669 (2014).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell stem cell. 3, 265-278 (2008).
- Pedersen, L. B., Mogensen, J. B., Christensen, S. T. Endocytic Control of Cellular Signaling at the Primary Cilium. Trends Biochem Sci. , (2016).
- Christensen, S. T., Clement, C. A., Satir, P., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of receptor tyrosine kinase (RTK) signalling. J Pathol. 226, 172-184 (2012).
- Clement, C. A., et al. TGF-beta signaling is associated with endocytosis at the pocket region of the primary cilium. Cell reports. 3, 1806-1814 (2013).
- Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 465-502 (2014).
- Joiner, A. M., Green, W. W., McIntyre, J. C. Primary Cilia on Horizontal Basal Cells Regulate Regeneration of the Olfactory Epithelium. J Neurosci. 35, 13761-13772 (2015).
- Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
- Peng, T., et al. Hedgehog actively maintains adult lung quiescence and regulates repair and regeneration. Nature. 526, 578-582 (2015).
- Rauhauser, A. A., et al. Hedgehog signaling indirectly affects tubular cell survival after obstructive kidney injury. Am J Physiol: Renal Physiol. 309, F770-F778 (2015).
- Chavez, M., et al. Modulation of Ciliary Phosphoinositide Content Regulates Trafficking and Sonic Hedgehog Signaling Output. Dev Cell. 34, 338-350 (2015).
- Lobo, M. V., et al. Cellular characterization of epidermal growth factor-expanded free-floating neurospheres. J. Histochem. Cytochem. 51, 89-103 (2003).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
- Nishino, J., Kim, I., Chada, K., Morrison, S. J. Hmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16Ink4a and p19Arf Expression. Cell. 135, 227-239 (2008).
- Shimada, I. S., Peterson, B. M., Spees, J. L. Isolation of locally derived stem/progenitor cells from the peri-infarct area that do not migrate from the lateral ventricle after cortical stroke. Stroke. 41, e552-e560 (2010).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
- Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26, 2938-2944 (2008).
- Pal, K., et al. Smoothened determines beta-arrestin-mediated removal of the G protein-coupled receptor Gpr161 from the primary cilium. J Cell Biol. 212, 861-875 (2016).
- Caspary, T., Larkins, C. E., Anderson, K. V. The graded response to Sonic Hedgehog depends on cilia architecture. Dev Cell. 12, 767-778 (2007).
- Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nat Cell Biol. 17, 113-122 (2015).
- Berbari, N. F., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Lewis, J. S., Mykytyn, K. Hippocampal neurons possess primary cilia in culture. J Neurosci Res. 85, 1095-1100 (2007).
- Paridaen, J. T., Wilsch-Brauninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155, 333-344 (2013).
- Kiprilov, E. N., et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery. J Cell Biol. 180, 897-904 (2008).
- Mukhopadhyay, S., et al. TULP3 bridges the IFT-A complex and membrane phosphoinositides to promote trafficking of G protein-coupled receptors into primary cilia. Genes Dev. 24, 2180-2193 (2010).
- Ishikawa, H., Marshall, W. F. Efficient live fluorescence imaging of intraflagellar transport in mammalian primary cilia. Methods Cell Biol. 127, 189-201 (2015).
