Summary
Первичная ресничка принципиально важным в нервной пролиферации клеток-предшественников, дифференцировки нейронов и взрослых функции нейронов. Здесь мы опишем метод для изучения цилиогенеза и торговлей сигнальных белков ресничек в нервных стволовых клеток / клеток-предшественников и дифференцированных нейронов с использованием первичных культур нейросфера.
Introduction
Первичная ресничка является микротрубочек на основе динамического субклеточная отсек , который функционирует в качестве сенсорной антенны в координации клеточных сигнальных путей, в том числе Звуковой еж (Тсс) пути во время эмбрионального развития нейронов 1, 2, и на секции субклеточном сигнализации во взрослой нейрональной функции 3, 4 , Сигнальные компоненты этих путей, такие как рецептор Shh исправленного 5; Путь активатора Smoothened (SMO) 6; и Gpr161 7, сирота G-белком рецептор (GPCR) , которые негативно регулирует путь Shh, чтобы локализовать ресничек в динамической моде. Несколько GPCRs сообщалось, локализуется в реснички в нейронах в головном мозге 7, 8, 9, 10 SUP>, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Дефекты ресничек и реснички генерируемых сигнальных путей влияют множественные ткани и все вместе известны как цилиопатии 17, 18, 19. Спектр болезни цилиопатии часто включает в себя психомоторный дефекты, такие как черепно - лицевые аномалии 20, 21, 22. Кроме того, первичные реснички в гипоталамических нейронах регулируют центральные пути сытости, и дефекты приводят к центральному ожирению 23, отражая ожирения у синдромальных цилиопатий , такие как синдром Барды Biedel 24. Кроме того, нейропептид рецепторы сигнализации в ресничках регулируют Centrаль сытость дорожки 11, 14. Цилиарная локализация аденилатциклазы III (ACIII) и GPCR , такие как рецептор соматостатина 3 в нейронах гиппокампа приводит к новым дефектам распознавания объекта и нарушению памяти 25, 26 и параллельна отсутствие целостности цилиарных 27. Аспекты развития ресничек генерируемых сигналов тесно связаны с гомеостазом ткани; в частности, реснички играют важную роль в прогрессировании Тсс-подтипа медуллобластомы , вытекающих из клеток - предшественников гранул в мозжечке 28, 29. Таким образом, первичные реснички играют важную роль в процессе эмбрионального, послеродовом и взрослых нейронов развития и функции.
Нейрональные стволовые клетки (NSC,) находятся в субвентрикулярной зоне (SVZ) бокового желудочек, то субгранулярная зона зубчатой извилины гиппокампа, ажелудочковая зона третьего желудочка в гипоталамусе у млекопитающих 30, 31, 32. NSCs мультипотентны, обладают способностью к самообновлению, и имеют важное значение для развития мозга и регенеративной медицины 30. Большинство NSCs в СВЗЕ находится в состоянии покоя и обладает уединенной первичной ресничкой , что во многих случаях проходит к боковому желудочку 33. Первичные сигналы реснички через локализацию различных рецепторов, индуцирующую вниз по течению клеточных реакций, в частности , по отношению к Shh, TGF - beta, и пути киназы рецептора тирозина 2, 34, 35, 36. Так как первичные реснички проходят в боковой желудочек, она выдвинута гипотеза , что первичные реснички обнаружить цитокины в спинномозговой жидкости (CSF) , чтобы активировать NSCs 37 38, 39, 40, 41. Однако механизмы, с помощью которых CSF взаимодействует с NSC, и является ли первичными ресничками участвуют не известны. Прикрепленные NSCs в культуре реснитчатые; локализовать компоненты путей метаболизма SHH, такие как Smo и Gpr161 в ресничках; и Тсс отзывчивым 42. Таким образом, NSC, может служить в качестве важной модельной системы для изучения пути Shh, мерцательной торговли и нейронных путей дифференцировки. Кроме того, нейроны, дифференцированные из NSC, также могут быть использованы для анализов торговли людьми цилиарного.
Нейросферы состоят из кластеров свободно плавающих клеток, возникающих из пролиферации neuraл стволовых / клетки - предшественники , которые растут в присутствии специфических факторов роста и неадгезивных поверхностей 43, 44. Нейросферы служат важными в пробирке моделей культуры для изучения нейронных стволовых клеток / клеток - предшественников в нормальном развитии и болезнях 31, 45, 46, 47. Здесь мы описываем анализ нейросфера основе для культивирования нервных стволовых клеток / клеток-предшественников и дифференцировки в нейроны / глии. В частности , мы подчеркиваем торговлю сигнализации компоненты ресничек нервных стволовых / клеток - предшественников и дифференцированных нейронов (рисунок 1). В отличие от культивирования первичных нейронов, первичных нейросферы относительно легко культуры, поддаются множественных пассажей и заморозить-оттаивания циклов, и может проходить дифференциацию в нейроны / глии. Важно отметить, что мы определили, что нейросфера полученных нейронныестволовые клетки / клеток-предшественников и дифференцированные нейроны в культуре мерцательные и локализовать сигнальные молекулы, имеющие отношение к функции цилиарной в этих отсеках. культуральные методы нейросферы основы могут служить в качестве идеальной модели системы для изучения цилиогенезом и цилиарные торговель NSCs и дифференцированных нейронов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выделение Нейросферы из мозга мышей для взрослых
- Эвтаназии взрослой мыши (около 2 месяцев) от передозировки изофлурана. Дважды проверьте, что мышь перестала дышать и рассекает сразу же после смерти.
- Используя ножницы, сделать срединный разрез, чтобы открыть череп. Удалить мозг.
- Поместите мозг в холодном PBS в 10 см чашку на льду. Выполните все-Mount метод рассечение , чтобы получить SVZ от бокового желудочка 48.
- Поместите боковой желудочек в 1,5 мл пробирку, добавляют 500 мкл 0,05% трипсин-ЭДТА в PBS, и инкубировать трубку в течение 15 мин при 37 ° С в водяной бане.
- Через 15 мин добавляют 500 мкл тормозящей среды и осторожно пипеткой 20 - 30 раз с 1 мл наконечником. Избегайте образование воздушных пузырьков во время пипетки.
Примечание: Этот шаг имеет решающее значение для выживания клеток. - Спин вниз клетки при 500 мкг в течение 8 мин. Жидкость над осадком сливают, добавляют 1 мл PBS и ресуспендируют тон клетки осторожно пипеткой 5x с 1 мл наконечником.
- Спин вниз при 500 х г в течение 8 мин. Жидкость над осадком сливают с использованием 1 мл наконечник и добавить 1 мл базальной среды.
- (Необязательно) Если наблюдаются клеточные остатки, проходят клетки через 70 мкм-фильтр клеток.
- Подсчитайте число клеток с помощью гемоцитометра; в общем, около 30 000 - 60 000 клеток / SVZ получены.
- Пластина клетки от одного SVZ в 10 см чашку с 10 мл среды и культуры НСК при 37 ° C с 5% CO 2.
- (Необязательно) Чтобы избежать слияния между сферами 49, поместили 1000 клеток в одной скважине ультра-низкого связывания 6-луночный планшет , который предварительно заполненном 1,5 мл среды и культуры НСК при 37 ° С с 5% CO 2.
Примечание: Через 5-7 дней, нейросфера может наблюдаться (фиг.2А). Период культивирования может отличаться в зависимости от возраста мыши или генетического фона. - Добавляют 2 мл NSC среды каждые 3-4 дня, чтобы поддерживать культуру(Не удалить существующую среду).
2. Анализ дифференциации пропускной способностью нейросферы и цилиогенез испытаний
- Для анализа возможностей дифференциации, анализ нейросферы под прилипшими условиями дифференциации среды.
- Стерилизовать 12 мм круглые покровные автоклавированием или с помощью УФ-облучения до использования. Для культуры прикрепленных клеток, поставить стерилизовать 12 мм круглые покровного стекла в лунку 24-луночного планшета в асептических условиях.
- Шерсть покровного стекла в течение 10 с с 500 мкл 0,002% поли-L-лизин (PLL). Аспирируйте раствор и высушить его в течение 10-15 мин.
- Добавьте 500 мкл раствора ламинин (5 мкг / мкл). Инкубируйте покровного стекла в течение 1 ч при 37 ° С.
- Аспирируйте ламинин и добавьте 500 мкл среды или дифференциации среды НСК (недифференцированная контроль).
- Для анализа дифференциации, подобрать 100 - 200 мкм сферу с наконечником 200 мкл под микроскопом. Добавить5-10 нейросферы в каждую лунку планшета 24-луночного и культур в течение 7-10 дней в среде для дифференцировки.
- Для анализа недифференцированных нейросфер, добавьте 5-10 нейросфер в каждую лунку планшета 24-луночного и культуры в течение 1-2 дней в среде НСКА. Приложенные нейросферы распространяться и расти в виде монослоя (фигура 2В).
- После тщательного удаления среды, фиксации клеток с 4% параформальдегида (PFA) в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре, а затем промывают PBS в два раза в течение 5 мин при комнатной температуре. Пластина может храниться при температуре 4 ° С в течение 1-2 месяцев.
Примечание: Для визуализации нейронных стволовых клеток / клеток-предшественников в NSC среде и дифференцированных клеток в дифференциации среды, выполняют иммунное окрашивание против нестин (нейронные стволовые клетки / клеток-предшественников маркер), β-тубулина III (TUJ1 моноклональное, нейронный маркер), GFAP (глиального фибриллярного кислого белка , астроцитов маркер), и О4 (олигодендроцитов маркер) (фигура 2В-Е). Для анализа реснички, выполнять иммуноокрашивание против Arl13b (первичный CIЛия Маркер) и Gpr161 (цилиарный ХВГФ) (фигура 3). - Установить крышку стекло с монтажным раствором на предметное стекло. Наклон слайд стекла для удаления избытка раствора.
3. Анализ цилиогенеза в нейросферах
- Для анализа клеток в интактных нейросферах иммунного окрашивания, передача 1 мл культуральной среды, содержащие несколько нейросфер в 1,5 мл пробирки и спин вниз со скоростью 500 мкг в течение 8 мин. Закрепить сферы с 4% (PFA), после удалени среды в течение 15 мин и промывают PBS. Спин вниз сферы при 500 х г в течение 8 мин, удаления надосадочной жидкости, и инкубировать сферы O / N с 30% сахарозы при 4 ° С.
- Жидкость над осадком сливают с использованием 1 мл кончик и добавляют 500 мкл раствора OCT с использованием разреза 1 мл кончик. Обрежьте край наконечника, чтобы расширить отверстие, в октябре является вязким.
- Переносят раствор, содержащий OCT нейросферы в одноразовый плесени пластиковые замораживания (10 мм х 10 мм х 5 мм).
- Замораживание мстарый на сухом льду в течение не менее 15 мин.
- (Необязательно) Остановить эксперимент и сохранить форму в морозильной камере C -80 ° до 1 года.
- Нарезать участки с криостатом; толщина секций должна быть 15-30 мкм.
- Для визуализации первичной реснички в нейросфера, выполняют иммунное окрашивание против Arl13b (рисунок 4).
4. Культура и прохождение Нейросферы и прилипшие NSCs
- Прохождение нейросфера в то время как размер шара между 100-200 мкм; когда нейросферы слишком велики (300 мкм или выше), они не являются идеальными для экспериментов.
- Передача нейросферы в трубку 50 мл с использованием 1 мл наконечника и спин вниз со скоростью 500 мкг в течение 8 мин.
- Жидкость над осадком сливают с помощью аспиратора, добавляют 500 мкл 0,05% трипсин-ЭДТА в PBS, и инкубируют в течение 5 мин при 37 ° С. Количество трипсина варьирует в зависимости от количества сфер.
- Добавьте 500 мкл сыворотки среды и мягко трубыт в 20 раз с 1 мл наконечником.
- Спин вниз при 500 х г в течение 8 мин. Жидкость над осадком сливают с использованием 1 мл наконечник и добавить 1 мл базальной среды.
- (Необязательно) Если клеточный дебрис или недиссоциированные нейросферы видны, проходят клетки через клетку-сито 70 мкм.
- Прохождение клеток в 10 см чашки при плотности 10000 клеток / см 2 в NSC среде; клетки будут готовы к следующему прохождению через неделю.
- (Необязательно) Чтобы заморозить клетки, добавить замораживание среды для генерации 500000 до 1000000 клеток / мл суспензии. Замораживание клеток с использованием крио-замораживание контейнеров; недиссоциированные нейросферы также могут быть заморожены.
- Для культуры прикрепленной, dillute клетки до 50000 клеток / см 2 на PLL- и ламинин покрытие покровных с НСК средой и культур в течение 1-2 дней.
5. Голодание и анализ ресничек
- Подготовьте голодание среды (таблица 1).
- 1-2 дней после первоначального плюноши и девушки адгезивных клеток после диссоциации, изменений в НСКЕ среду в одну лунке (контроль) и голодной среду в других скважинах (эксперимент).
- Культура прилипших клеток в течение 24 часов.
- Закрепить клетки с 4% PFA в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре и дважды промывают PBS в течение 5 мин каждый при комнатной температуре.
- (Необязательно) Остановка эксперимента и хранить 24-луночные планшеты с покровными в PBS при 4 ° С в течение 1-2 месяцев.
- Выполнение протокола иммунофлюоресценции для окрашивания 7, 50.
- Установите покровные с помощью монтажного раствора. Сушат предметное стекло O / N при комнатной температуре в темноте.
- Получение изображений на соединение микроскопа при необходимом увеличении. С помощью микроскопа, камеры и целей (40X / 1.3 масла и 63X / 1.4 масла), управляемый с помощью прилагаемого программного обеспечения. Возьмем достаточное количество Z-секции с интервалом 0,5-0,8 мкм (рисунок 5).
- Для количественного анализа локализации цилиарной вприлипшие клетки приобретают стеки изображений из 3-8 последовательных полей с сливающимися клетками, глядя в канал DAPI. Количественно число первичных ресничек с использованием ImageJ / Фиджи. Как правило, использует «Счетчик клеток» инструмент в ImageJ плагин> диалоговое окно для подсчета клеток с ХВГФ-положительной ресничек Анализа; максимальные проекции из стопок изображений также могут быть экспортированы из ImageJ / Fiji.Use аналогичной интенсивности изображения и параметров контраста для всех изображений из того же эксперимента для подсчета и целей экспорта.
6. Трансфекция нейросфер
- Придерживаться диссоциированными клетки к покровным в течение 24 ч. Использование плотности клеток, как правило, между 75000 и 150000 клеток в 500 мкл среды NSC в одном лунку 24-луночного планшета.
- Смешайте 25 мкл восстановленного сыворотки среды и 1,5 мкл реагента для трансфекции в 0,5 мл микропробирки встряхиванием в течение 5 сек.
- Добавить 2,5 мкг эндотоксина свободной ДНК плазмиды в отдельных 0,5 мл microtubе, содержащие 25 мкл восстановленной сыворотки сред и перемешать встряхивание в течение 5 с.
- Добавить 1 мкл реагента для трансфекции ко второму микропробирок, содержащий ДНК и перемешать встряхиванием в течение 5 с.
- Добавьте смесь из ДНК-содержащей трубки к первому микропробирок и перемешать с помощью пипетки.
- Выдержите смесь в течение 10-15 мин при комнатной температуре. После инкубации, осторожно добавляют по каплям к трансфекции смеси в лунки на верхней части среды НБК (500 мкл / лунку).
- Изменение среды 24 ч после трансфекции среду для контроля (NSC среднего) или голодание среду (500 мкл / лунку).
- Закрепить клетки путем изменения среды до 4% PFA через 24 ч и выполняют иммунное окрашивание; как правило, до эффективности трансфекции 10% получают с использованием этого протокола.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После посева клеток из SVZ в NSC среде в течение недели, плавающие нейросферы наблюдались (фиг.2А). Размеры сфер варьировались от 50 до 200 мкм. Чтобы исследовать, если шарики были получены из нервных стволовых клеток / клеток-предшественников, то нейросферы высевали на PLL- и ламинин покрытие покровных в НБК среды в течение 2-х дней. Затем они были иммуноокрашивание против нервных стволовых / прогениторных клеток маркеров, Nestin. были необходимы два дня, чтобы сферы прикрепить к покровные и расти в виде монослоя клеток. Монослой клеток был положительным для нестин (рис 2В). Для того, чтобы изучить способность дифференциации нейросфер, мы высевали их следующие шаги, описанные в разделе 2 на PLL- и ламинин покрытие покровных в среде для дифференцировки без диссоциации в течение 7-10 дней. Он занимает по меньшей мере неделю для дифференциации. В нейросферы прикрепляется к покровным и расширитьред расти в виде монослоя клеток. Мы зафиксировали клетки и иммуноокрашивание против нейрона, астроцитов, и маркеров олигодендроцитов. Мы наблюдали , что прилипшие нейросферы дифференцировались в β-тубулина III-позитивных нейронов, GFAP-позитивных астроцитов, и О4-положительных олигодендроциты (рис 2С-Е). Таким образом, мультипотентные нейросферы могут быть получены из взрослого СВЗА мыши.
Для того, чтобы определить , является ли прилипшие нейросферы и дифференцированные нейроны имеют первичные реснички, мы иммуноокрашивание против Arl13b (первичная ресничка маркера) 51 и Gpr161 (мерцательной локализованной GPCR) 7. По нашему опыту, в доступных моделях мышея , экспрессирующих ARL13B-mCherry, и в исследованиях с развивающейся корой мыши, большинство (если не все) нейронные реснички в мозге выразить Arl13b, в то время как все нейроны не ACIII-инфицированные 52, 53, 54. четвергs, мы в основном полагаемся на Arl13b обнаружить нейронные реснички. Мы обнаружили первичные реснички и локализацию Gpr161 на реснички клеток - предшественников в прилипших нейросферах (фиг.3А) и в дифференцированных нейронах (рис 3B). Таким образом, прилипшие нейросферы и дифференцированные клоны являются реснитчатыми в культуре и локализовать сигнальные молекулы.
Для того, чтобы определить , есть ли плавающие нейросферы имеют первичные реснички, мы cryosectioned плавающие нейросферы после фиксации, как описано в разделе 3. Мы наблюдали первичной реснички в нервных стволовых клеток / клеток - предшественников в секционированных нейросферах (рис 4A-B). Важно, чтобы получить Z-секции через нейросферы полностью визуализировать первичную ресничку, потому что трудно исследовать первичные реснички в одной плоскости г. Таким образом, недифференцированные нейросферы имеют гетерогенные популяции мерцательного и не ресничных клеток.
(рис 5A-B). Кроме того, было отмечено увеличением числа Gpr161-положительных ресничек при голодании (% Gpr161-положительной ресничка / Arl13b-положительной ресничка) (Фигура 5А-Б). Интересно, что предыдущее исследование с использованием недифференцированных эмбриональных линий стволовых клеток человека показали , что человеческие эмбриональные стволовые клетки в культуре также обладают первичной реснички 55. Количество и длина увеличения ресничек при сывороточном голодании в этих клеточных линиях, и эти реснички обладают также компонентами механизма Shh.
Мы также трансфицировали клейкий нервной стволовой / progenitoг клетка, как описана в разделе 6. Как правило , мы обнаружили эффективность трансфекции до 10%, похожей на первичные культуры нейронов в лаборатории (рисунок 6).
| Решение | Компонент |
| 1x PBS | Разведите 10й PBS с автоклавной водой |
| NSC среда | 2 мл 50x В27 |
| 1 мл 100x N2, | |
| 1 мл 200 мМ L-глутамина | |
| 1 мл 100x пенициллина / стрептомицина | |
| FGF-основной (человеческий bFGF) (Исходный раствор 25 нг / мл в среде Neurobasal): 20 нг / мл или 2 мг общие на 100 мл среды | |
| ЭФР (Исходный раствор 25 нг / мл в среде Neurobasal): 20 нг / мл или 2 мг общего на 100 мл среды | |
| 95 мл базальной среды | |
| Человеческий FGF-основной (человеческий bFGF) | 1 мл базальной среды для коммерческого человеческого bFGF 25 мкг бутылки |
| Хранить в стерильных микропробирках в -20 ° С или ниже. Использование одного 80 мкл аликвоты или 2 мкг / 100 мл NSC средств массовой информации. | |
| EGF | Добавить 8 мл базальной среды к коммерческому ЭФР 20 мкг бутылки |
| Хранить в стерильные микропробирки в -20 ° С или ниже. Использование одного 80 мкг аликвоты / 100 мл среды. | |
| Остановка среднего | 1 мл ФБС |
| 75 U ДНКазы I (75 ед / мкл в PBS) | |
| 9 мл PBS, | |
| Сыворотка среда | 1 мл ФБС |
| 9 мл базальной среды | |
| Замораживание среда | 4 мл ДМСО |
| 24 мл базальной среды | |
| 12 мл 30% FBS, | |
| Дифференциация среда | 90 мл базальной среды |
| 5 мл 5% ЭБС | |
| 1 мл 100x пенициллина / стрептомицина | |
| 1 мл 200 мМ L-глутамина | |
| 1 мл 100x N2, | |
| 2 мл 50x В27 | |
| FGF-основной (человеческий bFGF) (Исходный раствор 25 нг / мл в среде Neurobasal): 10 нг / мл или 1 мг общие для 100 мл | |
| Голодание среда | 95 мл базальной среды |
| 1 мл 100x пенициллина / стрептомицина | |
| 1 мл 200 мМ L-глутамина | |
| 1 мл 100x N2, | |
| 2 мл 50x В27 |
Таблица 1: Рецепт решений.
ve_content»ВОК: Keep-together.within-страницы = "1">
Рисунок 1: Принципиальная схема нейросфера культуры и дифференцировка протоколов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Нейросферы Приложение Дифференцирование Емкость. (А) Представительные нейросферы показано на рисунке. (B) Нейросферы высевали на покровные PLL- и ламинин покрытия в НБК среды в течение 2 дней и подвергали иммунные против нестин (нейронного маркер стволовых клеток / клеток - предшественников). (CE) Нейросферы высевали следующие шаги , описанные в разделе 2 на PLL- и ламинин покрытие покровных в среде для дифференцировки в течение 7 дней withoут диссоциация; исправлено; и иммуноокрашиванию против бета-тубулина III (нейронального маркера), GFAP (астроцитов маркер) и O4 (олигодендроцитов маркер). Ядра окрашивали DAPI. Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Нейросферы и Нейроны в Приверженец дифференцированной нейросферы Ресничные. (A) недиссоциированные нейросферы высевали на покровные с покрытием в NSC среды в течение 2 дней; исправлено; и иммуноокрашиванию против Gpr161 (зеленый), Arl13b (красный) и ДНК (синий). (B) Дифференцированные нейроны подвергали иммунному против Gpr161 (зеленый), Arl13b (красный, А) или бета-тубулина III (красный, В), и ДНК (синий). Белые стрелки показывают локализацию Gpr161 в ресничках.Правые панели в (A) представляют собой увеличенные виды первичной реснички, указанной белой стрелкой. Gpr161-положительным реснички в белом штучной упаковке нейрона показано справа в (B). Шкала = 10 мкм (А); 50 мкм (Б). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Плавающее, недифференцированные Нейросферы Обладайте ресничные клетки. Плавающие нейросферы фиксировали, заливали в ОСТ, cryosectioned, и обрабатывали для иммунофлуоресценции против Arl13b (красного цвета) и ДНК. Arl13b-позитивные первичные реснички в нейросфера показаны. Панели в (А) является максимальной интенсивностью проекцией 14 г сечений с интервалом 0,8 мкм от более нейросферы. Панели в (B) показывает увеличенный вид сiliated клеток в белой области в штучной упаковке (A). Максимальная проекция изображения из всех Z-секций показана в виде стопки, в то время как число от 1 до 14 указывают на индивидуальные Z-секции. Белые стрелки указывают на первичные реснички. Шкала бар = 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Голодание Индуцирует цилиогенеза в диссоциированных Адгезивная нервных стволовых клеток / клеток - предшественников. (A) Диссоциированные клетки высевали на покровные с покрытием в среде NSC или голодной среде в течение 24 ч; исправлено; и иммуноокрашиванию против Gpr161 (зеленый), Arl13b (красный) и ДНК (синий). Gpr161-позитивная ресничка наблюдается в контроле (слева) и голодали (справа) клетку. Нижние панели представляют собой увеличенные виды указанных белых коробок в соответствующемВерхние панели. Белые стрелки и стрелки указывают Gpr161-положительные и -отрицательные реснички, соответственно. Шкала бар = 100 мкм. (В) Количественное Arl13b-положительных клеток мерцательного (левый график) и Gpr161 локализации в Arl13b-положительной ресничек (правый график) в контроле и голодали клеток. Процентное содержание обоих Arl13b-положительных клеток и ресничных Gpr161 локализации в Arl13b-положительной ресничек повышается при голодании. Количественное было выполнено из двух полех зрения каждых из двух технических повторов одного эксперимента. Данные представлены как среднее значение из всех 4 полого зрения ± стандартного отклонения. *, P <0,05; **, p <0,01. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: Трансфекция вДиссошиэйтед Адгезивные нейрональные стволовые / Клетка-предшественников. Диссоциированные клетки высевали на покровных с покрытием были трансфицированы LAP-TULP3 N-конец (1-183 аа) mut12 конструкции , которая не связывается с основным IFT-A комплексом 56. Среду заменяли на голодание среды 24 ч после трансфекции. Клетки фиксировали через 24 ч и иммуноокрашивание против GFP (зеленый), Gpr161 (красный), Arl13b (пурпурный) и ДНК (синий). Трансфицированная клетка с Gpr161- и Arl13b-положительной ресничкой отмечена белой стрелкой, в то время как трансфицировала клетка без ресничек показана с белой стрелкой. Желтые стрелки и стрелки указывают на нетрансфицированных клеток с или без Gpr161 / Arl13b, соответственно. Шкала бар = 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы опишем метод для создания и поддержания нейросферы культуры от взрослого СВЗА мыши. Несколько соответствующие моменты, касающиеся культуры заключаются в следующем. Во-первых, размеры сфер, как правило, в пределах от 50 - 200 мкм. По нашему опыту, когда нейросфера получает больше, чем 300 мкм в диаметре, оптимальное время для пересева было пропущено. Эти большие сферы содержат мертвые клетки в ядре. Во-вторых, в качестве нейросферы обычно используются для изучения нервных стволовых клеток / клеток-предшественников, важно использовать EGF и FGF-основной (bFGF) для поддержания стволовости этих клеток. Таким образом, факторы, которые индуцируют дифференцировку, такие как FBS, следует избегать во время технического обслуживания нейросфер. Было показано , что 10% FBS могут дифференцироваться в астроциты нейросферы 47. В-третьих, степень дифференцировки нейронов может зависеть от возраста мыши. Если один хочет более нейрональную дифференцировку от нейросфер, молодой мышея (послеродовой дау 0) могут быть использованы. В-четвертых, если начинать новые культуры, это всегда хорошо, чтобы исследовать потенциал дифференциации нейросферах. В-пятых, наш метод позволяет также замораживание и оттаивание от установленной нейросферы культур для дальнейшего экспериментального использования. После оттаивания, клетки обычно растут как адгезивные клетки веретенообразных без поли-L-лизина или ламинина. Это может быть вызвано повреждением морозостойкости к клеткам. Важно, чтобы сохранить клетки расти, пока они не станут 60 - 80% сплошности до прохождения. После прохода, как правило, клетки растут как нейросферы и в целом могут быть пассировать до 5 - 10 раз.
Методы культивирования нейросфера основе позволяют изучать торговлей цилиарное и сигнальных путей в нервных стволовых клеток / клеток-предшественников и дифференцированных нейронов. Мы исследовали первичные реснички в плавающих / адгезивных и дифференцированных нейросферах. Важно, чтобы приобрести несколько Z-секцию, чтобы визуализировать реснички на протяжении полной протяженности нейросфер. Кроме того, на кормеэр генерация прилипших культур этих нейросфер и голодал их в течение 24 ч, большинство клеток мерцательные (рисунок 5) и обогащенный сирота ХВГФ, Gpr161. Однако, длительное голодание прилипших культур приводят к внутриклеточным вакуолям структур. Таким образом, важно тщательно оптимизировать периоды голодания для конкретных экспериментальных целей.
В настоящее время исследования по цилиогенезу преимущественно осуществляется в нескольких мерцательных, увековечены клеточных линиях 57. Эти клеточные линии не всегда верно резюмировать нейронов и нейронных стволовых клеток / клеток-предшественников в выражении сигнальные компоненты, такие как GPCRs или Тсс затрагивающего пути машины, что делает его крайне важно разработать новые методы для изучения роли ресничек в биологических процессах. Методы нейросфера на основе описанных здесь позволяют исследовать реснички регулируемых клеточных путей, в том числе GPCR и сигнализации Тсс в контексте нервных стволовых клеток / клеток-предшественников и диффerentiated нейроны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm round cover glass | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Affymetrix | 19943 | |
| 50 mL tube | Falcon | 352098 | |
| 95 mm x 15 mm petri dish, slippable lid | Fisherbrand | FB0875714G | 10 cm dish |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-545-152 | Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody |
| Arl13B, Clone N295B/66 | Neuromab | AB_11000053 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504001 | B27 |
| Centrifuge | Thermo scientific | ST 40R | |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| DAPI | Sigma | D9542-10MG | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancrease | Sigma | D5025-15KU | Dnase I |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418-100ML | DMSO |
| Disposable Vinyl Specimen Molds | Sakura Tissue-Tek Cryomold | 4565 | 10 mm x 10 mm x 5 mm |
| Dulbecco's Phosphate-buffered Saline 10X, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1408-500ML | DPBS |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11254-20 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9026-500ML | |
| Fluoromount-G solution | Southern Biotech | 0100-01 | mounting solution |
| GFAP | DAKO | Z0334 | |
| Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21127 | Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody |
| Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21137 | Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody |
| Gpr161 | home made | N/A | |
| human bFGF | Sigma | F0291 | FGF |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 0.100 mm deep | improved neubauer |
| Isothesia | Henry Schein | NDC 11695-0500-2 | Isofluorane |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | Laminin |
| L-Glutamine (200 mM) | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000 | |
| Mr. Frosty | Nalgene | 5100-0036 | |
| N-2 supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | N2 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| OCT compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | OCT |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma | P4707 | |
| Recombinant human EGF protein, CF | R and D systems | 236-EG-200 | EGF |
| Scissor | Fine science tools | 14060-10 | |
| Superfrost plus microscope slide | Fisher scientific | 12-550-15 | slides |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |
| Trypsin-EDTA solution (10X) | Sigma | T4174-100 | Trypsin |
| COSTAR 6-Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile | Corning | 3471 | ultra-low binding 6-well plate |
| β-tubulin III | Covance | MMS-435P | TUJ1 |
References
- Mukhopadhyay, S., Rohatgi, R. G-protein-coupled receptors, Hedgehog signaling and primary cilia. Semin Cell Dev Biol. 33, 63-72 (2014).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nat Rev Genet. 11, 331-344 (2010).
- Guemez-Gamboa, A., Coufal, N. G., Gleeson, J. G. Primary cilia in the developing and mature brain. Neuron. 82, 511-521 (2014).
- Louvi, A., Grove, E. A. Cilia in the CNS: the quiet organelle claims center stage. Neuron. 69, 1046-1060 (2011).
- Rohatgi, R., Milenkovic, L., Scott, M. P. Patched1 regulates hedgehog signaling at the primary cilium. Science. 317, 372-376 (2007).
- Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437, 1018-1021 (2005).
- Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary G-protein-coupled receptor Gpr161 negatively regulates the Sonic hedgehog pathway via cAMP signaling. Cell. 152, 210-223 (2013).
- Hilgendorf, K. I., Johnson, C. T., Jackson, P. K. The primary cilium as a cellular receiver: organizing ciliary GPCR signaling. Curr Opin Cell Biol. 39, 84-92 (2016).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol Biol Cell. 19, 1540-1547 (2008).
- Berbari, N. F., Lewis, J. S., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Bardet-Biedl syndrome proteins are required for the localization of G protein-coupled receptors to primary cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 4242-4246 (2008).
- Loktev, A. V., Jackson, P. K. Neuropeptide Y family receptors traffic via the Bardet-Biedl syndrome pathway to signal in neuronal primary cilia. Cell Rep. 5, 1316-1329 (2013).
- Marley, A., Choy, R. W., von Zastrow, M. GPR88 reveals a discrete function of primary cilia as selective insulators of GPCR cross-talk. PLoS One. 8, e70857 (2013).
- Marley, A., von Zastrow, M. DISC1 regulates primary cilia that display specific dopamine receptors. PLoS One. 5, e10902 (2010).
- Omori, Y., et al. Identification of G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) in Primary Cilia and Their Possible Involvement in Body Weight Control. PLoS One. 10, e0128422 (2015).
- Koemeter-Cox, A. I., et al. Primary cilia enhance kisspeptin receptor signaling on gonadotropin-releasing hormone neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 10335-10340 (2014).
- Brailov, I., et al. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. Brain Res. 872, 271-275 (2000).
- Hildebrandt, F. .,,T. .,&K. atsanis,N. ., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N Engl J Med. 364, 1533-1543 (2011).
- Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
- Badano, J. L., Mitsuma, N., Beales, P. L., Katsanis, N. The ciliopathies: an emerging class of human genetic disorders. Annu Rev Genomics Hum Genet. 7, 125-148 (2006).
- Novarino, G., Akizu, N., Gleeson, J. G. Modeling human disease in humans: the ciliopathies. Cell. 147, 70-79 (2011).
- Brugmann, S. A., Cordero, D. R., Helms, J. A. Craniofacial ciliopathies: A new classification for craniofacial disorders. Am J Med Genet A. 152A (12), 2995-3006 (2010).
- Valente, E. M., Rosti, R. O., Gibbs, E., Gleeson, J. G.
- Davenport, J. R., et al. Disruption of intraflagellar transport in adult mice leads to obesity and slow-onset cystic kidney disease. Curr Biol. 17, 1586-1594 (2007).
- Zaghloul, N. A., Katsanis, N. Mechanistic insights into Bardet-Biedl syndrome, a model ciliopathy. J Clin Invest. 119, 428-437 (2009).
- Einstein, E. B., et al. Somatostatin signaling in neuronal cilia is critical for object recognition memory. J Neurosci. 30, 4306-4314 (2010).
- Wang, Z., Phan, T., Storm, D. R. The type 3 adenylyl cyclase is required for novel object learning and extinction of contextual memory: role of cAMP signaling in primary cilia. J Neurosci. 31, 5557-5561 (2011).
- Berbari, N. F., et al. Hippocampal and cortical primary cilia are required for aversive memory in mice. PLoS One. 9, e106576 (2014).
- Han, Y. G., Alvarez-Buylla, A. Role of primary cilia in brain development and cancer. Curr Opin Neurobiol. 20, 58-67 (2010).
- Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nat Med. 15, 1062-1065 (2009).
- Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A. The Adult Ventricular-Subventricular Zone (V-SVZ) and Olfactory Bulb (OB) Neurogenesis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 8, (2016).
- Shimada, I. S., LeComte, M. D., Granger, J. C., Quinlan, N. J., Spees, J. L. Self-renewal and differentiation of reactive astrocyte-derived neural stem/progenitor cells isolated from the cortical peri-infarct area after stroke. J Neurosci. 32, 7926-7940 (2012).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. eLife. 3, e02669 (2014).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell stem cell. 3, 265-278 (2008).
- Pedersen, L. B., Mogensen, J. B., Christensen, S. T. Endocytic Control of Cellular Signaling at the Primary Cilium. Trends Biochem Sci. , (2016).
- Christensen, S. T., Clement, C. A., Satir, P., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of receptor tyrosine kinase (RTK) signalling. J Pathol. 226, 172-184 (2012).
- Clement, C. A., et al. TGF-beta signaling is associated with endocytosis at the pocket region of the primary cilium. Cell reports. 3, 1806-1814 (2013).
- Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 465-502 (2014).
- Joiner, A. M., Green, W. W., McIntyre, J. C. Primary Cilia on Horizontal Basal Cells Regulate Regeneration of the Olfactory Epithelium. J Neurosci. 35, 13761-13772 (2015).
- Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
- Peng, T., et al. Hedgehog actively maintains adult lung quiescence and regulates repair and regeneration. Nature. 526, 578-582 (2015).
- Rauhauser, A. A., et al. Hedgehog signaling indirectly affects tubular cell survival after obstructive kidney injury. Am J Physiol: Renal Physiol. 309, F770-F778 (2015).
- Chavez, M., et al. Modulation of Ciliary Phosphoinositide Content Regulates Trafficking and Sonic Hedgehog Signaling Output. Dev Cell. 34, 338-350 (2015).
- Lobo, M. V., et al. Cellular characterization of epidermal growth factor-expanded free-floating neurospheres. J. Histochem. Cytochem. 51, 89-103 (2003).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
- Nishino, J., Kim, I., Chada, K., Morrison, S. J. Hmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16Ink4a and p19Arf Expression. Cell. 135, 227-239 (2008).
- Shimada, I. S., Peterson, B. M., Spees, J. L. Isolation of locally derived stem/progenitor cells from the peri-infarct area that do not migrate from the lateral ventricle after cortical stroke. Stroke. 41, e552-e560 (2010).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
- Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26, 2938-2944 (2008).
- Pal, K., et al. Smoothened determines beta-arrestin-mediated removal of the G protein-coupled receptor Gpr161 from the primary cilium. J Cell Biol. 212, 861-875 (2016).
- Caspary, T., Larkins, C. E., Anderson, K. V. The graded response to Sonic Hedgehog depends on cilia architecture. Dev Cell. 12, 767-778 (2007).
- Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nat Cell Biol. 17, 113-122 (2015).
- Berbari, N. F., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Lewis, J. S., Mykytyn, K. Hippocampal neurons possess primary cilia in culture. J Neurosci Res. 85, 1095-1100 (2007).
- Paridaen, J. T., Wilsch-Brauninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155, 333-344 (2013).
- Kiprilov, E. N., et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery. J Cell Biol. 180, 897-904 (2008).
- Mukhopadhyay, S., et al. TULP3 bridges the IFT-A complex and membrane phosphoinositides to promote trafficking of G protein-coupled receptors into primary cilia. Genes Dev. 24, 2180-2193 (2010).
- Ishikawa, H., Marshall, W. F. Efficient live fluorescence imaging of intraflagellar transport in mammalian primary cilia. Methods Cell Biol. 127, 189-201 (2015).
