Summary
El cilio primario es fundamentalmente importante en la proliferación neuronal de células progenitoras, la diferenciación neuronal, y la función neuronal adulto. A continuación, describimos un método para estudiar ciliogenesis y el tráfico de proteínas de señalización a los cilios en las células madre / progenitoras neuronales y neuronas diferenciadas utilizando cultivos de neuroesferas primarias.
Introduction
El cilio primario es un compartimento subcelular dinámica basada en microtúbulos que funciona como una antena sensorial en la coordinación de vías de señalización celulares, incluyendo la vía de Sonic Hedgehog (Shh) durante el desarrollo neuronal embrionario 1, 2, y la señalización subcelular compartimentada en la función neuronal adulto 3, 4 . Señalización de componentes de estas vías, tales como el receptor de Shh Patched 5; el activador vía de Smoothened (Smo) 6; y Gpr161 7, un receptor acoplado a proteína G huérfano (GPCR) que regula negativamente la vía de Shh, localizar a los cilios de una manera dinámica. Múltiples GPCRs se han reportado para localizar a los cilios en las neuronas en el cerebro 7, 8, 9, 10 sup>, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Los defectos en los cilios y vías de señalización generada cilios-afectan a múltiples tejidos y se conocen colectivamente como ciliopatías 17, 18, 19. El espectro de la enfermedad ciliopathy incluye con frecuencia defectos del neurodesarrollo, tales como anomalías craneofaciales 20, 21, 22. Además, los cilios primarios en las neuronas hipotalámicas regular las vías centrales de saciedad, y los defectos resultan en obesidad central 23, lo que refleja la obesidad en ciliopatías sindrómicas como el síndrome de Bardet Biedel 24. Además, el neuropéptido señalización en cilios receptor regula central saciedad vías de 11, 14. Localización ciliar de adenilil ciclasa III (ACIII) y GPCRs, tales como receptores de somatostatina 3 en las neuronas del hipocampo como resultado nuevas defectos reconocimiento de objetos y los déficits de memoria 25, 26 y es paralelo a una falta de integridad ciliar 27. Los aspectos de desarrollo de la señalización generada cilios-están estrechamente ligados a la homeostasis del tejido; en particular, los cilios son importantes para la progresión de los meduloblastomas Shh subtipo que surgen a partir de progenitores granulares en el cerebelo 28, 29. Por lo tanto, los cilios primarios juegan un papel importante durante embrionario, postnatal y adulto el desarrollo neuronal y función.
Las células madre neurales (NSC) residen en la zona subventricular (SVZ) del ventrículo lateral, la zona subgranular del giro dentado del hipocampo, y lazona ventricular del tercer ventrículo en el hipotálamo en mamíferos 30, 31, 32. NSC son multipotentes, poseen la capacidad de auto-renovación, y son importantes para el desarrollo del cerebro y la medicina regenerativa 30. La mayoría de NSC en la SVZ son quiescentes y poseen un cilio primario solitario que, en muchos casos, se extiende hacia fuera al ventrículo lateral 33. Las señales cilio primario a través de la localización de diversos receptores, la inducción de respuestas celulares aguas abajo, particularmente en relación con Shh, TGF, y las vías de tirosina quinasa del receptor 2, 34, 35, 36. Desde cilios primarios se extienden en el ventrículo lateral, se plantea la hipótesis de que los cilios primarios detectar citoquinas en el líquido cefalorraquídeo (CSF) para activar NSCs 37 38, 39, 40, 41. Sin embargo, los mecanismos por los que CSF se comunica con NSCs y si los cilios primarios están implicados no son conocidos. NSCs adherentes en cultivo se ciliadas; localizar componentes de la vía de Shh, tales como Smo y Gpr161 en cilios; y son Shh sensible 42. Por lo tanto, NSCs pueden servir como un importante sistema modelo para estudiar la vía de Shh, el tráfico ciliar y vías de diferenciación neuronales. Además, las neuronas diferenciadas de NSCs también se pueden utilizar para ensayos de tráfico ciliar.
Neurospheres están constituidos por agrupaciones de células que flotan libremente que surgen de la proliferación de neuracélulas madre / progenitoras l que crecen en presencia de factores de crecimiento específicos y superficies no adhesivas 43, 44. Neurospheres sirven como importante en los modelos de cultivo in vitro para estudiar las células madre / progenitoras neurales en el desarrollo normal y la enfermedad de 31, 45, 46, 47. A continuación, describimos un ensayo basado en neurosphere para cultivar células neurales madre / progenitoras y para la diferenciación en neuronas / glia. En particular hincapié en el tráfico de señalización componentes a cilios de tallo neural / células progenitoras y las neuronas diferenciadas (Figura 1). A diferencia de cultivo de neuronas primarias, neuroesferas primarias son relativamente fáciles de cultura, son susceptibles de múltiples pases y ciclos hielo-deshielo, y pueden someterse a la diferenciación en neuronas / glia. Es importante destacar que, determinamos que neural neurosphere derivadoscélulas madre / progenitoras y neuronas diferenciadas se ciliadas en la cultura y localizar moléculas relevantes para la función ciliar en estos compartimentos de señalización. métodos de cultivo basados en Neurosphere pueden servir como un sistema de modelo ideal para el estudio ciliogenesis y ciliar trata de NSCs y neuronas diferenciadas.
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Protocol
1. Aislamiento de neuroesferas del cerebro de ratón adulto
- La eutanasia a un ratón adulto (alrededor de 2 meses de edad) por una sobredosis de isoflurano. Vuelva a comprobar que el ratón ha dejado de respirar y diseccionar inmediatamente después de la muerte.
- Con unas tijeras, hacer una incisión en la línea media para abrir el cráneo. Retire el cerebro.
- Coloque el cerebro en PBS frío en un plato de 10 cm en hielo. Siga todo el montaje el método de disección para obtener la SVZ desde el ventrículo lateral 48.
- Coloque el ventrículo lateral en un tubo de 1,5 ml, añadir 500 l de 0,05% de tripsina-EDTA en PBS, y se incuba el tubo durante 15 min a 37 ° C en un baño de agua.
- Después de 15 min, añadir 500 l de medio de frenado y pipetear suavemente 20 - 30 veces con una punta de 1 mL. Evitar la formación de burbujas de aire durante el pipeteado.
NOTA: Este paso es fundamental para la supervivencia celular. - Centrifugar las células a 500 xg durante 8 min. Descartar el sobrenadante, se añade 1 ml de PBS, y resuspender tél células pipeteando con suavidad 5x con una punta de 1 ml.
- Centrifugar a 500 xg durante 8 min. Descartar el sobrenadante usando una punta de 1 ml y añadir 1 ml de medio basal.
- (Opcional) Si se observan restos celulares, pasar las células a través de una célula colador de 70 m.
- Contar el número de células con un hemocitómetro; En general, aproximadamente 30.000 - se obtienen 60.000 células / SVZ.
- Placa de las células de un SVZ en una placa de 10 cm con 10 ml de medio y la cultura NSC a 37 ° C con 5% de CO2.
- (Opcional) Para evitar la fusión entre las esferas 49, poner 1.000 células en un único pocillo de una placa de ultra-bajo de unión de 6 pocillos que se llena previamente con 1,5 ml de medio y la cultura NSC a 37 ° C con 5% de CO2.
NOTA: Después de 5-7 días, las neuroesferas se pueden observar (Figura 2A). El período de cultivo puede variar con la edad de ratón o los antecedentes genéticos. - Añadir 2 ml de medio NSC cada 34 días para mantener la cultura(No retire el medio existente).
2. Análisis de la capacidad de diferenciación de las Pruebas de neuroesferas y ciliogenesis
- Para analizar la capacidad de diferenciación, analizar las neuroesferas en condiciones adherentes en medio de diferenciación.
- Esterilizar 12 mm cubreobjetos redondos por tratamiento en autoclave o con la exposición UV antes de su uso. Para un cultivo de células adherentes, poner una cubierta de vidrio redonda esterilizado 12 mm en un pocillo de una placa de 24 pocillos bajo condiciones asépticas.
- Escudo de la cubierta de vidrio durante 10 s con 500 l de 0,002% de poli-L-lisina (PLL). Aspirar la solución y se seca durante 10-15 min.
- Añadir 500 l de solución de laminina (5 g /? L). Incubar la cubierta de vidrio durante 1 h a 37 ° C.
- Aspirar el laminina y añadir 500 l de medio de diferenciación o medio NSC (control no diferenciado).
- Para el ensayo de diferenciación, recoger un 100 - esfera m 200 con una punta de 200 l bajo el microscopio. Añadir5-10 neuroesferas a cada pocillo de una placa de 24 pocillos y la cultura durante 7-10 días en medio de diferenciación.
- Para analizar neuroesferas indiferenciadas, añadir 5-10 neuroesferas a cada pocillo de una placa y cultivo de 24 pocillos durante 1-2 días en medio NSC. Neuroesferas adjuntos propagan y crecen como una monocapa (Figura 2B).
- Después de retirar cuidadosamente el medio, fijar las células con paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS durante 15 min a TA, y luego lavar con PBS dos veces durante 5 min a RT. La placa puede almacenarse a 4 ° C durante 1-2 meses.
NOTA: Para visualizar las células madre / progenitoras neurales en medio NSC y células diferenciadas en medio de diferenciación, lleve a cabo la inmunotinción contra Nestin (tallo neural / marcador de células progenitoras), β-tubulina III (monoclonal Tuj1, marcador neuronal), GFAP (proteína glial fibrilar ácida , marcador de astrocitos), y O4 (marcador de oligodendrocitos) (Figura 2B-e). Para el análisis de los cilios, lleve a cabo la inmunotinción contra Arl13b (ci primarialia marker) y Gpr161 (GPCR ciliar) (Figura 3). - Montar la cubierta de vidrio con una solución de montaje en un portaobjetos de vidrio. Incline el portaobjetos de vidrio para eliminar el exceso de solución.
3. Análisis de ciliogenesis en Neurospheres
- Para analizar las células en neuroesferas intactas por inmunotinción, la transferencia de 1 ml de medio de cultivo que contiene múltiples neuroesferas a un tubo de 1,5 ml y centrifugar a 500 xg durante 8 min. Fijar las esferas con 4% (PFA) después de retirar el medio durante 15 minutos y lavar con PBS. Centrifugar esferas a 500 xg durante 8 min, eliminar el sobrenadante, y se incuba las esferas O / N con 30% de sacarosa a 4 ° C.
- Descartar el sobrenadante usando una punta de 1 ml y añadir 500 l de solución de octubre usando una punta de corte 1 mL. Corte el borde de la punta para ensanchar la abertura, como OCT es viscoso.
- Transferir la solución octubre que contiene las neuroesferas en un molde de plástico de congelación desechable (10 mm x 10 mm x 5 mm).
- Congelar la mviejo en hielo seco durante al menos 15 min.
- (Opcional) detener el experimento y almacenar el molde en un congelador a -80 ° durante hasta 1 año.
- Cortar las secciones con un criostato; el espesor de las secciones debe ser de 15-30 m.
- Para visualizar los cilios primaria en un neurosphere, lleve a cabo la inmunotinción contra Arl13b (Figura 4).
4. Cultura y aprobación de neuroesferas y NSC adherentes
- Passage las neuroesferas mientras que el tamaño de la esfera es de entre 100-200 micras; cuando las neuroesferas son demasiado grandes (300 micras o superior), no son ideales para los experimentos.
- Transferencia de las neuroesferas en un tubo de 50 ml con una punta de 1 ml y centrifugar a 500 xg durante 8 min.
- Descartar el sobrenadante utilizando un aspirador, añadir 500 l de 0,05% de tripsina-EDTA en PBS, y se incuba durante 5 min a 37 ° C. La cantidad de tripsina varía en función del número de esferas.
- Añadir 500 l de medio de suero y suavemente tuberíaT 20 veces con una punta de 1 ml.
- Centrifugar a 500 xg durante 8 min. Descartar el sobrenadante usando una punta de 1 ml y añadir 1 ml de medio basal.
- (Opcional) Si se observan residuos celulares o no disociadas neuroesferas, pasar las células a través de una célula colador de 70 m.
- Passage las células en una placa de 10 cm a una densidad de 10.000 células / cm2 en medio NSC; las células estarán listos para el siguiente paso después de una semana.
- (Opcional) Para congelar las células, añadir medio de congelación para generar 500.000 a 1.000.000 células / ml de suspensión. Congelar las células utilizando recipientes crio-congelación; neuroesferas disociadas También se pueden congelar.
- Para el cultivo adherente, dillute las células a 50.000 células / cm 2 en PLL- y cubreobjetos con medio de NSC, y la cultura recubiertas con laminina durante 1-2 días.
5. El hambre y el análisis de los cilios
- Preparar medio de inanición (Tabla 1).
- 1-2 días después de la pl inicialating de células adherentes después de la disociación, el cambio de medio NSC en un pocillo (control) y medio de inanición en otro pozo (experimento).
- Cultivar las células adherentes durante 24 h.
- Fijar las células con PFA al 4% en PBS durante 15 min a TA y se lava dos veces con PBS durante 5 min cada uno a TA.
- (Opcional) detener el experimento y almacenar las placas de 24 pocillos con cubreobjetos en PBS a 4 ° C durante 1-2 meses.
- Realizar un protocolo de inmunofluorescencia para la tinción de 7, 50.
- Montar el cubreobjetos utilizando solución de montaje. Secar el portaobjetos de vidrio O / N a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Adquirir imágenes en un microscopio compuesto en la ampliación necesaria. Utilizar un microscopio, una cámara y objetivos (40X / 63X 1.3 de petróleo y / 1.4 aceite), controlado mediante el software acompañado. Tome suficientes secciones Z en 0,5-0,8 m intervalos (Figura 5).
- Para el análisis cuantitativo de la localización ciliar enlas células adherentes, adquieren pilas de imágenes de 3-8 campos consecutivos con células confluentes mirando en el canal de DAPI. Cuantificar el número de cilios primarios usando ImageJ / Fiji. Típicamente, utilice la herramienta "contador de células" en el ImageJ Plugins> cuadro de diálogo para contar las células con cilios GPCR-positivo Analizar; proyecciones máximas de pilas de imágenes también se pueden exportar desde ImageJ / Fiji.Use intensidad de la imagen similar y parámetros de contraste para todas las imágenes desde el mismo experimento para contar y propósitos de exportación.
6. La transfección de neuroesferas
- Adherir disociarse células para cubreobjetos durante 24 h. Utilice una densidad celular típicamente entre 75.000 y 150.000 células en 500 l de medio NSC en un solo pocillo de una placa de 24 pocillos.
- Mezclar 25 l de medio de suero reducido y 1,5 l de reactivo de transfección en un microtubo ml 0,5 por agitación durante 5 s.
- Añadir 2,5 g de ADN plasmídico sin endotoxina a un separado 0,5 ml microtube que contiene 25 l de medio de suero reducido y mezclar mediante agitación durante 5 s.
- Añadir 1 l de reactivo de transfección a la segunda ADN microtubo que contiene y mezclar mediante agitación durante 5 s.
- Añadir la mezcla del tubo que contiene ADN a la primera microtubo y se mezcla mediante pipeteo.
- Incubar la mezcla durante 10-15 min a TA. Después de la incubación, añadir gota a gota suavemente la mezcla de transfección a los pocillos en la parte superior del medio de NSC (500! L / pocillo).
- Cambiar el medio 24 h post-transfección para controlar medio (medio NSC) o medio de inanición (500! L / pocillo).
- Fijar las células cambiando el medio a 4% PFA después de 24 h y llevar a cabo la inmunotinción; típicamente, hasta una eficiencia de transfección del 10% se obtiene usando este protocolo.
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Representative Results
Después de sembrar las células de la SVZ en medio NSC durante una semana, neuroesferas flotantes se observaron (Figura 2A). Los tamaños de las esferas variaron entre 50 y 200! M. Para examinar si las esferas se derivan de las células madre / progenitoras neurales, las neuroesferas se sembraron en PLL- y cubreobjetos en medio NSC recubiertas con laminina durante 2 días. Luego fueron inmunoti~neron contra el marcador / célula progenitora madre neurales, nestina. Se necesitaban dos días para permitir que las esferas se adhieren a los cubreobjetos y para crecer como una monocapa de células. La monocapa de células fue positivo para nestina (Figura 2B). Para examinar la capacidad de diferenciación de las neuroesferas, les plateó siguiendo los pasos descritos en la sección 2 en PLL- y cubreobjetos en medio de diferenciación recubiertas con laminina sin disociación durante 7-10 días. Se necesitan al menos una semana para la diferenciación. Las neuroesferas unidos a los cubreobjetos y se expandened para crecer como una monocapa de células. Hemos fijado las células y immunostained en contra de las neuronas, astrocitos, oligodendrocitos y los marcadores. Hemos observado neuroesferas adherentes que diferenciaban en β-tubulina neuronas III-positivos, astrocitos GFAP-positivas, y oligodendrocitos O4-positivas (Figura 2C-E). Por lo tanto, neuroesferas multipotentes pueden derivar de SVZ ratón adulto.
Para determinar si neuroesferas adherentes y neuronas diferenciadas tienen cilios primarios, que immunostained contra Arl13b (marcador cilio primario) 51 y Gpr161 (GPCR ciliar-localizada) 7. En nuestra experiencia, en modelos de ratón que expresan disponibles ARL13B-mCherry, y en los estudios con el desarrollo de la corteza del ratón, la mayoría (si no todos) los cilios neuronal en el cerebro expresar Arl13b, mientras que todas las neuronas no están ACIII positivo 52, 53, 54. Jues, que se basan principalmente en Arl13b para detectar los cilios neuronal. Detectamos cilios primarios y la localización de Gpr161 a los cilios de las células progenitoras en neuroesferas adheridas (figura 3A) y en neuronas diferenciadas (Figura 3B). Por lo tanto, neuroesferas adherentes y linajes diferenciados se ciliadas en la cultura y localizar moléculas de señalización.
Para determinar si neuroesferas flotantes tienen cilios primarios, que cryosectioned neuroesferas flotantes después de la fijación, como se describe en la sección 3. Observamos cilios primarios de células madre / progenitoras neurales en las neuroesferas seccionadas (Figura 4A-B). Es importante adquirir z secciones a través de las neuroesferas para visualizar completamente los cilios primarios, debido a que es difícil examinar los cilios primarios en un solo plano z. En resumen, neuroesferas diferenciadas tienen poblaciones heterogéneas de células ciliadas y no ciliadas.
(Figura 5A-B). Además, hemos observado un aumento del número de los cilios Gpr161-positiva a la inanición (% cilios Gpr161-positivo / cilios Arl13b-positivo) (Figura 5A-B). Curiosamente, un estudio anterior utilizando líneas de células madre embrionarias humanas indiferenciadas demostró que las células madre embrionarias humanas en cultivo también poseen cilios primarios 55. El número y la longitud de aumento cilios a la inanición de suero en estas líneas celulares, y estos cilios también poseen componentes de la maquinaria Shh.
También transfectadas adherentes madre neurales / progenitor células, como se indica en la sección 6. Por lo general detectaron una eficacia de transfección de hasta el 10%, similar a cultivos de neuronas primarias en el laboratorio (Figura 6).
| Solución | Componente |
| 1x PBS | Diluir 10x PBS con agua esterilizada en autoclave |
| medio NSC | 2 ml 50x B27 |
| 1 ml 100x N2 | |
| 1 ml 200 mM de L-glutamina | |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| FGF-básico (bFGF humano) (solución de 25 ng / ml en medio Neurobasal): 20 ng / ml o 2 mg total de 100 ml de medio | |
| EGF (solución Stock 25 ng / ml en medio Neurobasal): 20 ng / ml o 2 mg total de 100 ml de medio | |
| 95 ml de medio basal | |
| FGF-básico humano (bFGF humano) | 1 ml de medio basal de bFGF 25 botella g humano comercial |
| Almacenar en microtubos estériles en -20 ° C o inferior. Utilice una sola parte alícuota de 80 l o 2 g / 100 ml de medio NSC. | |
| EGF | Añadir 8 ml de medio basal para comercial EGF 20 botella g |
| Almacenar microtubos como estériles en -20 ° C o inferior. Use un solo 80 g alícuota / 100 ml de medio. | |
| medio detener | 1 ml de FBS |
| 75 U ADNasa I (75 U / uL en PBS) | |
| 9 ml de PBS | |
| medio de suero | 1 ml de FBS |
| medio 9 ml Basal | |
| medio de congelación | 4 ml de DMSO |
| 24 ml de medio basal | |
| 12 ml 30% de FBS | |
| medio de diferenciación | 90 ml de medio basal |
| 5 ml 5% de FBS | |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| 1 ml 200 mM de L-glutamina | |
| 1 ml 100x N2 | |
| 2 ml 50x B27 | |
| FGF-básico (bFGF humano) (Stock solución de 25 ng / ml en medio Neurobasal): 10 ng / ml o 1 mg total de 100 ml | |
| medio de privación | 95 ml de medio basal |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| 1 ml 200 mM de L-glutamina | |
| 1 ml 100x N2 | |
| 2 ml 50x B27 |
Tabla 1: Receta de las soluciones.
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Figura 1: diagrama esquemático de Neurosphere cultura y Diferenciación Protocolos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Prueba Neurospheres Diferenciación Capacidad. (A) se muestran neuroesferas representativos. (B) Las neuroesferas se sembraron en cubreobjetos recubiertos con laminina PLL- y en medio NSC durante 2 días y se inmunotiñeron contra Nestin (marcador de células madre / progenitoras neurales). (Ce) neuroesferas se sembraron siguiendo los pasos descritos en la sección 2 en PLL- y cubreobjetos en medio de diferenciación recubiertas con laminina durante 7 días withodisociación ut; fijo; y se inmunotiñeron contra β-tubulina III (marcador neuronal), GFAP (marcador astrocito), O4 y (marcador de oligodendrocitos). Los núcleos se tiñeron por DAPI. Barra de escala = 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Las neuroesferas y neuronas en Adherente diferenciada Neurospheres son ciliado. (A) neuroesferas disociadas se sembraron en cubreobjetos recubiertos en medio NSC para 2 d; fijo; y se inmunotiñeron contra Gpr161 (verde), Arl13b (rojo), y el ADN (azul). (B) neuronas diferenciadas se inmunotiñeron contra Gpr161 (verde), Arl13b (rojo, A) o β-tubulina III (rojo, B), y el ADN (azul). Las flechas blancas indican la localización en Gpr161 cilios.Los paneles de la derecha en (A) son vistas ampliadas de la cilio primario indicado por la flecha blanca. El cilio Gpr161-positiva en la neurona en caja blanco se muestra a la derecha en (B). Escala = 10 m (A); 50 m (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Flotante, indiferenciado Neurospheres Poseer células ciliadas. neuroesferas flotantes se fijaron, embebido en OCT, cryosectioned, y se procesaron para inmunofluorescencia contra Arl13b (rojo) y ADN. cilios primarios Arl13b-positiva en un neurosphere se muestran. El panel en (A) es una proyección de máxima intensidad de 14 Z-secciones en 0.8 m intervalos de una neuroesfera. Los paneles en (B) muestran la vista ampliada de ccélulas iliated en la región en caja blanco en (A). La imagen de proyección máxima de todas las secciones Z se muestra como una pila, mientras que los números 1 a 14 indican z secciones individuales. Las flechas blancas indican los cilios primarios. Barra de escala = 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: La inanición Induce ciliogenesis en las células progenitoras disociada adherente Neural Stem /. Las células disociadas (A) se sembraron en cubreobjetos recubiertos en medio NSC o medio de inanición durante 24 h; fijo; y se inmunotiñeron contra Gpr161 (verde), Arl13b (rojo), y el ADN (azul). cilios Gpr161-positivas se observan en control (izquierda) y las células de hambre (derecha). Los paneles inferiores son vistas ampliadas de las cajas blancas indican en las respectivaspaneles superiores. Las flechas blancas y puntas de flecha indican los cilios Gpr161-positivos y negativos, respectivamente. Barra de escala = 100 m. (B) Cuantificación de las células Arl13b-positivos ciliadas (gráfico de la izquierda) y Gpr161 localización en cilios Arl13b-positivo (derecha gráfico) en el control y las células de hambre. Los porcentajes de ambas células ciliadas Arl13b-positivas y Gpr161 localización en cilios Arl13b-positivas aumentaron a la inanición. La cuantificación se realizó a partir de dos campos de visión de cada uno de dos repeticiones técnica de un solo experimento. Los datos se representan como la media de los 4 campos de visión ± la desviación estándar. *, P <0,05; **, P <0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: La transfección enDisociada adherente Neural Stem / células progenitoras. Las células disociadas chapados en cubreobjetos recubiertos fueron transfectadas con un LAP-TULP3 N-terminal (1-183 aa) mut12 constructo que no se une al núcleo IFT-Un complejo 56. El medio se cambió a medio de inanición 24 h post-transfección. Las células se fijaron después de 24 h y se inmunotiñeron contra GFP (verde), Gpr161 (rojo), Arl13b (magenta), y el ADN (azul). Una célula transfectada con Gpr161- y Arl13b-positivo cilio está marcada por una flecha blanca, mientras que una célula transfectada sin cilios se muestra con una punta de flecha blanca. Las flechas amarillas y puntas de flecha apuntan a células no transfectadas con o sin Gpr161 / Arl13b, respectivamente. Barra de escala = 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
A continuación, se describe un método para generar y mantener los cultivos de neuroesferas de SVZ ratón adulto. Unos pocos puntos pertinentes con respecto a los cultivos son las siguientes. En primer lugar, los tamaños de las esferas son típicamente entre 50 - 200 micras. En nuestra experiencia, cuando un neurosphere se hace más grande de 300 m de diámetro, el momento óptimo para los pases se ha perdido. Estas esferas grandes contienen las células muertas en el núcleo. En segundo lugar, como neuroesferas se utilizan comúnmente para estudiar las células madre / progenitoras neurales, es importante utilizar EGF y FGF-básico (bFGF) para mantener la stemness de estas células. Por lo tanto, los factores que inducen la diferenciación, tales como FBS, se deben evitar durante el mantenimiento de las neuroesferas. Se ha demostrado que el 10% de FBS puede diferenciar neuroesferas en astrocitos 47. En tercer lugar, el grado de diferenciación neuronal podría depender de la edad del ratón. Si se desea la diferenciación neuronal más de neuroesferas, ratones más jóvenes (da postnataly 0) se puede utilizar. En cuarto lugar, si el inicio de nuevas culturas, siempre es bueno para examinar la capacidad de diferenciación de las neuroesferas. En quinto lugar, nuestro método también permite la congelación y descongelación de los cultivos de neuroesferas establecidas para uso experimental futuro. Después de la descongelación, las células normalmente crecen las células en forma de huso como adherentes sin poli-L-lisina o laminina. Esto puede ser causado por daño de congelación-descongelación a las células. Es importante mantener las células en crecimiento hasta que se convierten 60 - 80% confluentes antes de la aprobación. Después del paso, las células normalmente crecen como neuroesferas y generalmente pueden ser pasados hasta 5 - 10 veces.
métodos de cultivo basados en Neurosphere nos permiten estudiar el tráfico ciliar y vías de señalización en madre neurales / células progenitoras y las neuronas diferenciadas. Examinamos los cilios primarios en neuroesferas flotantes / adherentes y diferenciados. Es importante adquirir varias secciones z para visualizar los cilios en toda la extensión total de las neuroesferas. Además, a popaer la generación de cultivos adherentes de estas neuroesferas, y de hambre durante 24 h, la mayoría de las células son ciliadas (Figura 5) y enriquecido en el GPCR huérfano, Gpr161. Sin embargo, el hambre de las culturas resultados adherentes en vacuolar estructuras subcelulares prolongada. Por lo tanto, es importante para optimizar cuidadosamente periodos de ayuno con fines experimentales particulares.
Actualmente, los estudios sobre ciliogenesis se realizan predominantemente en unos pocos ciliado, líneas celulares inmortalizadas 57. Estas líneas celulares no siempre fielmente recapitulan las neuronas y las células madre / progenitoras neurales en la expresión de los componentes de señalización, tales como los GPCR o maquinaria vía de Shh, por lo que es imperativo desarrollar nuevos métodos para estudiar la función de los cilios en los procesos biológicos. Los métodos basados en neuroesferas descritos aquí permiten estudiar las vías celulares cilios reguladas, incluyendo GPCR y la señalización de Shh en el contexto de células neurales madre / progenitoras y differentiated neuronas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm round cover glass | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Affymetrix | 19943 | |
| 50 mL tube | Falcon | 352098 | |
| 95 mm x 15 mm petri dish, slippable lid | Fisherbrand | FB0875714G | 10 cm dish |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-545-152 | Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody |
| Arl13B, Clone N295B/66 | Neuromab | AB_11000053 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504001 | B27 |
| Centrifuge | Thermo scientific | ST 40R | |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| DAPI | Sigma | D9542-10MG | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancrease | Sigma | D5025-15KU | Dnase I |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418-100ML | DMSO |
| Disposable Vinyl Specimen Molds | Sakura Tissue-Tek Cryomold | 4565 | 10 mm x 10 mm x 5 mm |
| Dulbecco's Phosphate-buffered Saline 10X, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1408-500ML | DPBS |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11254-20 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9026-500ML | |
| Fluoromount-G solution | Southern Biotech | 0100-01 | mounting solution |
| GFAP | DAKO | Z0334 | |
| Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21127 | Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody |
| Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21137 | Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody |
| Gpr161 | home made | N/A | |
| human bFGF | Sigma | F0291 | FGF |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 0.100 mm deep | improved neubauer |
| Isothesia | Henry Schein | NDC 11695-0500-2 | Isofluorane |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | Laminin |
| L-Glutamine (200 mM) | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000 | |
| Mr. Frosty | Nalgene | 5100-0036 | |
| N-2 supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | N2 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| OCT compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | OCT |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma | P4707 | |
| Recombinant human EGF protein, CF | R and D systems | 236-EG-200 | EGF |
| Scissor | Fine science tools | 14060-10 | |
| Superfrost plus microscope slide | Fisher scientific | 12-550-15 | slides |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |
| Trypsin-EDTA solution (10X) | Sigma | T4174-100 | Trypsin |
| COSTAR 6-Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile | Corning | 3471 | ultra-low binding 6-well plate |
| β-tubulin III | Covance | MMS-435P | TUJ1 |
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