Summary
Den primära cilium är fundamentalt viktig för neural stamcellsproliferation, neuronal differentiering och vuxna neuronal funktion. Här beskriver vi en metod för att studera ciliogenesis och handel med signalproteiner till cilier i neurala stam / ursprungsceller och differentierade neuroner som använder primära neurosfärkulturer.
Introduction
Den primära cilium är en mikrotubuli baserad dynamisk subcellulär avdelning som fungerar som en sensorisk antenn i koordinerande cellulära signaleringsvägar, inklusive Sonic hedgehog (Shh) -vägen under embryonal neuronal utveckling 1, 2, och compartmentalized subcellulär signalering i vuxen neuronal funktion 3, 4 . Signalering komponenter i dessa reaktionsvägar, såsom Shh receptorn Patched 5; vägen aktivator Smoothened (Smo) 6; och Gpr161 7, en föräldralös G-proteinkopplade receptorer (GPCR) som reglerar Shh pathway negativt, lokaliseras till cilier på ett dynamiskt sätt. Flera GPCR har rapporterats att lokalisera till flimmerhåren i neuroner i hjärnan 7, 8, 9, 10 sup>, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Defekter i cilier och cilier genererad signaleringsvägar påverka flera vävnader och är kollektivt kända som ciliopathies 17, 18, 19. Den ciliopathy sjukdom spektrum innefattar ofta nerv defekter, såsom kraniofaciala missbildningar 20, 21, 22. Dessutom primära cilier i hypotalamus neuroner reglera centrala mättnadsvägar, och defekter resulterar i central fetma 23, spegling fetma hos syndrom ciliopathies såsom Bardet Biedel syndrom 24. Dessutom neuropeptid-receptor signalering i cilier reglerar central mättnad vägar 11, 14. Ciliär lokalisering av adenylylcyklas III (ACIII) och GPCR såsom somatostatinreceptor 3 i hippocampusneuroner resultera i nya defekter objektigenkännings och minnesbrister 25, 26 och paralleller en brist på ciliär integritet 27. De utvecklingsmässiga aspekter av cilier genererad signalering är nära knutna till vävnad homeostas; i synnerhet cilier är viktiga för utvecklingen av Shh-subtyp medulloblastom härrör från granulat stamceller i lillhjärnan 28, 29. Således primära cilier spelar en viktig roll under foster, postnatal och vuxna neuronal utveckling och funktion.
Neurala stamceller (NSCs) bor i den subventrikulära zonen (SVZ) hos den laterala ventrikeln, den subgranular zonen av gyrus dentatus av hippocampus, ochventrikulära zonen av den tredje ventrikeln i hypotalamus hos däggdjur 30, 31, 32. NSCs är multipotenta, besitter förmåga till självförnyelse och är viktiga för hjärnans utveckling och regenerativ medicin 30. De flesta NSCs i SVZ är vilande och har en ensam primär cilium som i många fall sträcker sig ut till den laterala ventrikeln 33. De primära cilium signaler via lokalisering av olika receptorer, inducerande nedströms cellulära svar, särskilt i förhållande till Shh, TGFp, och receptortyrosinkinaser kinasvägar 2, 34, 35, 36. Eftersom primära cilier sträcker sig in i laterala ventrikeln, är det en hypotes att primära cilier detektera cytokiner i cerebrospinalvätskan (CSF) för att aktivera NSCs 37 38, 39, 40, 41. Men de mekanismer genom vilka CSF kommunicerar med NSCs och huruvida primära cilier är inblandade är inte kända. Vidhäftande NSCs i kultur cilie; lokalisera Shh pathway komponenter, såsom Smo och Gpr161 i cilier; och är Shh reagerar 42. Således kan NSCs tjäna som ett viktigt modellsystem för att studera Shh vägen, ciliär trafficking och neuronal differentiering vägar. Dessutom kan neuroner differentierade från NSCs även användas för ciliär trafficking assayer.
Neurosfärer utgörs av kluster av fritt flytande celler som härrör från spridningen av Neural stam / ursprungsceller som växer i närvaro av specifika tillväxtfaktorer och icke vidhäftande ytorna 43, 44. Neuro fungera som viktiga odling in vitro-modeller för att studera neurala stam / progenitorceller i normal utveckling och sjukdomar 31, 45, 46, 47. Här beskriver vi en neurosfär-baserad analys för odling neurala stam / progenitorceller och för differentiering till neuroner / glia. Vi betonar särskilt handeln med signaleringskomponenter till cilier av neurala stam / ursprungsceller och differentierade neuroner (figur 1). I motsats till att odla primära neuroner, primära neurosfärer är relativt lätta att odla, är mottagliga för flera passager och frysnings-upptiningscykler, och kan genomgå differentiering till neuroner / glia. Viktigt har vi bestämt att neurosphere härrör neuralstam / ursprungsceller och differentierade neuroner cilierade i kultur och lokalisera signalmolekyler som är relevanta för ciliär funktion i dessa avdelningar. Neurosfär-baserade odlingsmetoder kan tjäna som en idealisk modell system för att studera ciliogenesis och ciliär handel med NSCs och differentierade neuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering av Neurosfärer från vuxen mus hjärnans
- Euthanize en vuxen mus (ca 2 månader gamla) genom en överdos av isofluran. Dubbelkolla att musen har slutat andas och dissekera omedelbart efter döden.
- Med hjälp av en sax, gör en mittlinje snitt att öppna skallen. Ta bort hjärnan.
- Placera hjärnan i kall PBS i en 10 cm skål på is. Följa hela-mount dissektion metod för att erhålla SVZ från den laterala ventrikeln 48.
- Placera den laterala ventrikeln i ett 1,5 ml rör, tillsätt 500 | il av 0,05% trypsin-EDTA i PBS och inkubera röret i 15 min vid 37 ° C i ett vattenbad.
- Efter 15 minuter, tillsätt 500 | il av stoppmediet och försiktigt pipettera 20 - 30 gånger med en 1 ml spets. Undvika bildning av luftbubblor under pipettering.
OBS: Detta steg är avgörande för cellöverlevnad. - Centrifugera ner cellerna vid 500 xg under 8 minuter. Kassera supernatanten, tillsätt 1 ml av PBS och återsuspendera than celler genom att försiktigt pipettera 5x med en 1 ml spets.
- Spinn ner vid 500 xg under 8 minuter. Kassera supernatanten med användning av en 1 ml spets och tillsätt 1 ml av basmedium.
- (Valfritt) Om cellrester observeras, passerar cellerna genom en 70 | im cell sil.
- Räkna antalet celler med en hemocytometer; i allmänhet, cirka 30 tusen - är 60 tusen celler / SVZ erhölls.
- Utstrykning av celler från en SVZ in i en 10 cm skål med 10 ml NSC-medium och odling vid 37 ° C med 5% CO2.
- (Valfritt) För att undvika sammansmältning mellan sfärerna 49, satte 1000 celler i en enda brunn av en ultra-låg-bindande 6-brunnsplatta som är förfylld med 1,5 ml NSC-medium och odling vid 37 ° C med 5% CO2.
OBS: Efter 5-7 dagar, kan observeras neurosfärer (Figur 2A). Odlingsperioden kan skilja sig med en ålder av musen eller genetisk bakgrund. - Tillsätt 2 ml NSC medium var 3-4 dagar för att bibehålla kulturen(Ta inte bort den befintliga medium).
2. Analys av Differentiering Kapacitet på neurosfärer och Ciliogenesis Tester
- För att analysera differentieringskapaciteten, analysera neurospheres enligt adherenta förhållanden i differentieringsmedium.
- Sterilisera 12 mm runda täckglas genom autoklavering eller med UV-exponering före användning. För en vidhäftande cellkultur, sätta en steriliserad 12 mm rund täckglas i en brunn av en 24-brunnsplatta under aseptiska betingelser.
- Belägga täckglaset under 10 s med 500 mikroliter av 0,002% poly-L-lysin (PLL). Aspirera lösningen och torka den under 10-15 min.
- Tillsätt 500 pl av laminin-lösning (5 | ig / | il). Inkubera täckglaset under 1 h vid 37 ° C.
- Aspirera laminin och tillsätt 500 | il av differentieringsmedium eller NSC-medium (odifferentierade kontroll).
- För differentier analysen, plocka upp en 100 - 200 | im sfär med en 200 mikroliter spets under mikroskop. Lägg till5-10 neurosfärer till varje brunn i en 24-brunnsplatta och odling under 7-10 dagar i differentieringsmediet.
- För att analysera odifferentierade neurosfärer, tillsätt 5-10 neurosfärer i varje brunn på en 24-brunnar och kultur i 1-2 dagar i NSC medium. Bifogade neurosfärer sprida och växa som ett monoskikt (figur 2B).
- Efter noggrant avlägsnande av mediet, fixera cellerna med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS under 15 min vid RT, och sedan tvätta med PBS två gånger under 5 min vid RT. Plattan kan lagras vid 4 ° C under 1-2 månader.
OBS: För att visualisera neurala stam / ursprungsceller i NSC-medium och differentierade celler i differentieringsmedium, utföra immunfärgning mot nestin (neuronal stam- / stamfadercellmarkör), β-tubulin III (TUJ1 monoklonala, neuronal markör), GFAP (gliafibrillärt Acidic Protein , astrocyt markör), och O4 (oligodendrocyt markör) (Figur 2B-E). För att analysera cilier, utför immunfärgning mot Arl13b (primär cilia marker) och Gpr161 (ciliär GPCR) (Figur 3). - Montera täckglaset med monteringslösning på ett objektglas. Luta objektglas för att avlägsna överskott lösning.
3. Analys av Ciliogenesis i Neurosfärer
- För att analysera celler i intakta neurosfärer genom immunofärgning, överföring 1 ml odlingsmedium innehållande multipla neurosfärer till ett 1,5 ml rör och centrifugera ner vid 500 xg under 8 minuter. Fixera sfärer med 4% (PFA) efter avlägsnande av mediet under 15 minuter och tvätta med PBS. Centrifugera ner sfärer vid 500 xg under 8 min, avlägsna supernatanten och inkubera sfärerna O / N med 30% sackaros vid 4 ° C.
- Kassera supernatanten med användning av en 1 ml spets och tillsätt 500 pl mellan ULT lösning med användning av ett snitt 1 ml spets. Skära kanten av spetsen för att vidga öppningen, som ULT viskös.
- Överföra ULT lösning innehållande neurosfärerna i en engångsplastfrys form (10 mm x 10 mm x 5 mm).
- Frysa mgammal på torr is i minst 15 min.
- (Valfritt) Stoppa experimentet och lagra formen i en -80 ° C frys under upp till ett år.
- Kapa sektioner med en kryostat; tjockleken på sektionerna bör vara 15-30 | im.
- Att visualisera den primära cilier i en neurosfär, utföra immunfärgning mot Arl13b (Figur 4).
4. Kultur och passage av Neurosfärer och vidhäftande NSCs
- Passage neurosfärema medan sfären storleken är mellan 100-200 | j, m; när neurosfärerna är för stora (300 pm eller ovan), är de inte idealiska för experiment.
- Överföra neurosfärerna in i ett 50 ml rör med användning av en 1 ml spets och spinn ner vid 500 xg under 8 minuter.
- Kassera supernatanten med användning av en aspirator, tillsätt 500 | il av 0,05% trypsin-EDTA i PBS och inkubera under 5 min vid 37 ° C. Mängden trypsin varierar beroende på antalet av sfärer.
- Tillsätt 500 mikroliter av serummedium och försiktigt rörett 20 gånger med en 1 ml spets.
- Spinn ner vid 500 xg under 8 minuter. Kassera supernatanten med användning av en 1 ml spets och tillsätt 1 ml av basmedium.
- (Valfritt) Om cellulärt skräp eller icke dissocierade neurosfärer ses, passerar cellerna genom en 70 | im cell sil.
- Passage av cellerna i en 10 cm skål vid en densitet av 10.000 celler / cm 2 i NSC medium; cellerna kommer att vara redo för nästa passage efter en vecka.
- (Valfritt) För att frysa cellerna, lägga frysmedium för att generera 500 tusen till en miljon celler / ml suspension. Frysa cellerna med hjälp av kryo-frysning behållare; icke dissocierade neurosfärer kan också frysas.
- För den vidhäftande kulturen, dillute cellerna till 50.000 celler / cm 2 på PLL- och Laminin-belagda täckglas med NSC-medium och odling under 1-2 dagar.
5. svält och Analys av Cilia
- Förbereda svältmedium (tabell 1).
- 1-2 dagar efter den initiala plating av vidhäftande celler efter dissociation, byt till NSC medium i en brunn (kontroll) och svält medium i en annan brunn (experiment).
- Kultur de vidhäftande cellerna för 24 h.
- Fixera cellerna med 4% PFA i PBS under 15 min vid RT och tvätta två gånger med PBS under 5 min vardera vid RT.
- (Valfritt) Stoppa experimentet och lagra de 24-brunnars plattor med täckglas i PBS vid 4 ° C under 1-2 månader.
- Utföra en immunofluorescens protokoll för färgning 7, 50.
- Montera täck använder monteringslösning. Torka glasskiva O / N vid RT i mörker.
- Förvärva bilder på en förening mikroskop vid den nödvändiga förstoringen. Använd ett mikroskop, en kamera, och mål (40X / 1.3 olja och 63X / 1.4 olja), styrs med den åtföljs programvara. Vidta tillräckliga z-sektioner vid 0,5-0,8 um intervall (Figur 5).
- För kvantitativ analys av ciliär lokalisering ividhäftande celler, förvärva staplar av bilder 3-8 konsekutiva fält med konfluenta celler genom att titta in i DAPI kanalen. Kvantifiera antalet primära cilier använda ImageJ / Fiji. Vanligtvis använder "Cell räknaren" verktyg i ImageJ Plugins> Analysera dialogrutan för att räkna cellerna med GPCR-positiva cilier; maximala utsprång från staplar av bilder kan också exporteras från ImageJ / Fiji.Use liknande bildintensitet och kontrastparametrar för alla bilder från samma experiment för räkning och exportera ändamål.
6. Transfektion av Neurosfärer
- Följ dissocierade celler till täck under 24 timmar. Använda en celltäthet typiskt mellan 75 tusen och 150.000 celler i 500 mikroliter av NSC-medium i en enda brunn i en 24-brunnsplatta.
- Blanda 25 | il av reducerat serummedium och 1,5 mikroliter av transfektionsreagens i ett 0,5 ml mikrorör genom att vortexa i 5 s.
- Lägg 2,5 ug av endotoxinfri plasmid-DNA till en separat 0,5 ml mikroröre innehållande 25 mikroliter av minskade serummedier och blanda genom att vortexa i 5 s.
- Tillsätt 1 pl av transfektionsreagens till den andra mikrorör innehållande DNA och blanda genom att vortexa i 5 s.
- Tillsätt blandningen från DNA-innehållande rör till den första mikrorör och blanda genom pipettering.
- Inkubera blandningen under 10-15 min vid RT. Efter inkubation, försiktigt tillsätta Transfektionsblandningen droppvis till brunnarna på toppen av NSC-medium (500 | il / brunn).
- Ändra mediet 24 h efter transfektion för att styra medium (NSC-medium) eller svältmedium (500 | il / brunn).
- Fixera cellerna genom att ändra medium till 4% PFA efter 24 h och utför immunofärgning; typiskt upp till en 10% transfektionseffektivitet erhålles med användning av detta protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter plätering av cellerna från SVZ i NSC-medium i en vecka, var flytande neurosfärer observerades (Figur 2A). Storlekarna på sfärerna varierade mellan 50 och 200 um. Att undersöka om sfärerna var härledda från neurala stam / ursprungscellerna togs neurosfärerna pläterades på PLL- och Laminin-belagda täckglas i NSC-medium under 2 dagar. De sedan immun mot neurala stam / stamceller markör, nestin. Två dagar behövdes för att låta kulorna att fästa täck och att växa som ett monolager av celler. Monoskiktet av celler var positiv för nestin (Figur 2B). För att undersöka differentieringskapaciteten hos neurosfärer, klädd vi dem att följa stegen som beskrivs i avsnitt 2 på PLL- och laminin belagda täck i differentiering medium utan dissociation under 7-10 dagar. Det tar minst en vecka för differentiering. Neurosfärerna fästa vid täckglas och expanderaed att växa som ett monolager av celler. Vi fast cellerna och immun mot neuron, astrocyternas och oligodendrocyt-markörer. Vi observerade adherenta neurosfärer som differentierat till β-tubulin III-positiva neuroner, GFAP-positiva astrocyter, och O4-positiva oligodendrocyter (figur 2C-E). Sålunda, kan multineurosfärer härledas från vuxen mus SVZ.
För att bestämma om vidhäftande neurosfärer och differentierade neuroner har det primära cilier, vi immunostained mot Arl13b (primär cilium markör) 51 och Gpr161 (ciliär-lokaliserad GPCR) 7. Vår erfarenhet i tillgängliga musmodeller som uttrycker ARL13B-mCherry och i studier med att utveckla musen cortex, de flesta (om inte alla) neuronal flimmerhår i hjärnan uttrycka Arl13b, medan alla nervceller inte ACIII positiva 52, 53, 54. Thus, förlitar vi främst på Arl13b att upptäcka neuronal cilier. Vi detekterade primära cilier och lokalisering av Gpr161 till flimmerhåren av progenitorceller i vidhäftade neurosfärer (Figur 3A) och i differentierade neuroner (Figur 3B). Således är vidhäftande neurosfärer och differentierade härstamningar cilierade i kultur och lokalisera signalmolekyler.
För att bestämma om flytande neurosfärer har primära cilier, cryosectioned vi flytande neurosfärer efter fixering, som beskrivs i avsnitt 3. Vi observerade primära cilier i neurala stam / ursprungsceller i de sektionerade neurosfärer (Figur 4A-B). Det är viktigt att skaffa Z-profiler över neurospheres att fullt visualisera primära cilier, eftersom det är svårt att undersöka den primära cilier i ett enda z-planet. Sammanfattningsvis odifferentierade neurosfärer har heterogena populationer av cilie och icke-cilieceller.
(figur 5A-B). Dessutom noterade vi ett ökat antal Gpr161-positiva cilier vid svält (% Gpr161 positiva cilier / Arl13b-positiva cilier) (figur 5A-B). Intressant nog en tidigare studie med användning av odifferentierade humana embryonala stamcellslinjer visade att humana embryonala stamceller i odling besitter också primära cilier 55. Antalet och längden av cilier ökning vid serumsvält i dessa cellinjer, och dessa cilier besitter också komponenter i maskiner och Shh.
Vi transfekterade också vidhäftande neurala stam / progenitor celler, som det beskrivs i avsnitt 6. Vi detekteras typiskt en transfektion verkningsgrad på upp till 10%, i likhet med primära neuronkulturer i labbet (Figur 6).
| Lösning | Komponent |
| 1x PBS | Späd 10x PBS med autoklaverat vatten |
| NSC-medium | 2 ml 50x B27 |
| 1 ml 100x N2 | |
| 1 ml 200 mM L-glutamin | |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| FGF-basisk (human bFGF) (Stamlösning 25 ng / ml i Neurobasal-medium): 20 ng / ml eller 2 mg totalt för 100 ml media | |
| EGF (Stamlösning 25 ng / ml i Neurobasal-medium): 20 ng / ml eller 2 mg totalt för 100 ml media | |
| 95 ml basalmedium | |
| Humana FGF-basisk (human bFGF) | 1 ml grundmedium kommersiellt humant bFGF 25 ug flaska |
| Lagra i sterila mikrorör i -20 ° C eller lägre. Använda en enda 80 mikroliter alikvot eller 2 ^ g / 100 ml NSC media. | |
| EGF | Lägga 8 ml basalmedium för kommersiell EGF 20 pg flaska |
| Lagra som sterila mikrorör i -20 ° C eller lägre. Använda en enda 80 pg alikvot / 100 ml medium. | |
| stoppa mediet | 1 ml FBS |
| 75 U Dnase I (75 U / uL i PBS) | |
| 9 ml PBS | |
| serummedium | 1 ml FBS |
| 9 ml Basal-medium | |
| frysmedium | 4 ml DMSO |
| 24 ml basalmedium | |
| 12 ml 30% FBS | |
| differentieringsmedium | 90 ml basalmedium |
| 5 ml 5% FBS | |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| 1 ml 200 mM L-glutamin | |
| 1 ml 100x N2 | |
| 2 ml 50x B27 | |
| FGF-basisk (human bFGF) (Stamlösning av 25 ng / ml i Neurobasal-medium): 10 ng / ml eller 1 mg totalt för 100 ml | |
| svältmedium | 95 ml basalmedium |
| 1 ml 100x Pen / Strep | |
| 1 ml 200 mM L-glutamin | |
| 1 ml 100x N2 | |
| 2 ml 50x B27 |
Tabell 1: Recept av Solutions.
ve_content" fo: keep-together.within-page = "1">
Figur 1: Schematiskt diagram av neurosfärkultur och differentiering Protocols. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Neurosfärer Exhibit Differentiering Kapacitet. (A) Representativa neurosfärer visas. (B) Neurosfärer ströks ut på PLL- och Laminin-belagda täckglas i NSC-medium under 2 dagar och immunofärgades mot nestin (neuronal stam- / stamfadercellmarkör). (CE) Neurosfärer pläterades följa stegen som beskrivs i avsnitt 2 på PLL- och Laminin-belagda täckglas i differentieringsmedium under 7 dagar without dissociation; fast; och immun mot β-tubulin III (neuronal markör), GFAP (astrocyt markör), och O4 (oligodendrocyt-markör). Kärnorna färgades av DAPI. Scale bar = 100 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Neurosfärer och Neuroner i vidhäftande Differentierade Neurosfärer är cilierade. (A) odissocierad neurosfärer ströks ut på belagda täckglas i NSC-medium för 2 d; fast; och immun mot Gpr161 (grön), Arl13b (röd), och DNA (blått). (B) Differentierade neuroner immunofärgades mot Gpr161 (grön), Arl13b (röd, A) eller β-tubulin III (rött, B), och DNA (blått). Vita pilar indikerar Gpr161 lokalisering i cilier.De högra panelerna i (A) är förstorade vyer av den primära cilium indikeras av den vita pilen. Den Gpr161 positiva cilium i den vita-boxed neuron visas till höger i (B). Skala = 10 ^ m (A); 50 | j, m (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Flytande, odifferentierad Neurosfärer Besitter cilierade celler. Flytande neurosfärer fixerades, inbäddad i OCT, cryosectioned, och bearbetades för immunfluorescens mot Arl13b (röd) och DNA. Arl13b-positiva primära cilier i en neurosfär är visade. Panelen i (A) är ett maximum intensitet projektion av 14 z-sektioner på 0.8 | j, m intervall från en neurosfär. Panelerna i (B) visar förstorad vy av ciliated celler i den vita-boxed regionen i (A). Den maximala projektionsbilden från alla z-sektioner visas som en stapel, medan siffrorna 1 till 14 indikerar individuella z-sektioner. De vita pilarna visar primära cilier. Scale bar = 50 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Starvation inducerar Ciliogenesis i dissocierade Adherent Neurala stam / ursprungscellerna. (A) Dissocierade celler ströks ut på belagda täckglas i NSC medium eller svält medium under 24 h; fast; och immun mot Gpr161 (grön), Arl13b (röd), och DNA (blått). Gpr161 positiva cilier observeras i kontroll (vänster) och svalt (höger) celler. De lägre panelerna är förstorade vyer av de indikerade vita fälten i respektiveövre paneler. De vita pilar och pilspetsar indikerar Gpr161 positiva och -negativa cilier, respektive. Scale bar = 100 | im. (B) Kvantifiering av Arl13b positiva cilie celler (vänster graf) och Gpr161 lokalisera i Arl13b-positiva cilier (högra diagrammet) i kontroll och svultna celler. Procentandelarna av både Arl13b-positiva cilieceller och Gpr161 lokalisera i Arl13b-positiva cilier ökade vid svält. Kvantifieringen utfördes från två synfält vardera från två tekniska replikat av ett enda experiment. De data representeras som medelvärdet från alla 4 synfält ± standardavvikelsen. *, P <0,05; **, P <0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Transfektion iDissocierade Vidhäftande Neurala stam / ursprungscellerna. Dissocierade celler utstrukna på belagda täckglas transfekterades med en LAP-TULP3 N-terminalen (1-183 aa) mut12 konstrukt som inte binder till kärn IFT-Komplex 56. Mediet byttes till svält mediet 24 timmar efter transfektion. Cellerna fixerades efter 24 h och immun mot GFP (grön), Gpr161 (röd), Arl13b (magenta) och DNA (blått). En transfekterad cell med Gpr161- och Arl13b-positiva cilium markeras med en vit pil, medan en transfekterad cell utan cilier visas med en vit pilspets. Gula pilar och pilspetsar pekar på otransfekterade celler med eller utan Gpr161 / Arl13b, respektive. Scale bar = 10 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi en metod för att generera och underhålla neurosfärkulturer från vuxen mus SVZ. Några relevanta punkter om kulturer är som följer. Först, storlekarna hos sfärerna är typiskt mellan 50 - 200 um. Enligt vår erfarenhet, när en neurosfär blir större än 300 nm i diameter, har den optimala tiden för passage missats. Dessa större sfärer innehåller döda celler i kärnan. Andra, såsom neurosfärer används vanligen för att studera neurala stam / ursprungscellerna, är det viktigt att använda EGF och FGF-basic (bFGF) för att bibehålla stemness av dessa celler. Därför, faktorer som inducerar differentiering, såsom FBS, måste undvikas under upprätthållandet av neurosfärerna. Det har visat sig att 10% FBS kan differentiera neurosfärer i astrocyter 47. För det tredje kan graden av neuronal differentiering beroende på ålder av mus. Om man önskar mer neuronal differentiering från neurosfärer, yngre möss (postnatal day 0) kan användas. För det fjärde, om att starta nya kulturer, är det alltid bra att undersöka differentiering kapacitet neurospheres. Femte, vår metod tillåter även nedfrysning och upptining från etablerade neurosfärkulturer för framtida experimentell användning. Efter upptining celler växer typiskt som vidhäftande spindelformade celler utan poly-L-lysin eller laminin. Detta kan orsakas av frysning-tining skada på cellerna. Det är viktigt att hålla cellerna växa tills de blir 60-80% sammanflytande före passagen. Efter passagen, celler växer typiskt som neurosfärer, och kan i allmänhet passe upp till 5 - 10 gånger.
Neurosphere-baserade odlingsmetoder ger oss möjlighet att studera ciliär trafficking och signalvägar i neurala stam / progenitorceller och differentierade neuroner. Vi undersökte primära cilier i flytande / vidhäftande och differentierade neurosfärer. Det är viktigt att skaffa sig flera Z-sektioner för att visualisera cilier genom hela omfattningen av neurosfärer. Vidare akteruter generering adherenta kulturer av dessa neurosfärer, och svältande dem under 24 timmar, de flesta av cellerna cilierade (figur 5) och berikad i den föräldralösa GPCR, Gpr161. Men långvarig svält av fastsittande kulturer resulterar i subcellulära vakuolära strukturer. Därför är det viktigt att noga optimera svältperioder för särskilda experimentsyfte.
För närvarande är studier på ciliogenesis huvudsakligen utförs i ett fåtal cilierade, förevigat cellinjer 57. Dessa cellinjer inte alltid troget rekapitulera neuroner och neurala stam / progenitorceller i att uttrycka signalerings komponenter, såsom GPCR eller Shh pathway maskiner, vilket gör det absolut nödvändigt att utveckla nyare metoder för att studera rollen av cilier i biologiska processer. Neurosphere baserade metoder som beskrivs här ger oss möjlighet att studera cilier reglerade cellulära vägar, inklusive GPCR och Shh signalering i samband med neurala stamceller / progenitorceller och differentiated neuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm round cover glass | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Affymetrix | 19943 | |
| 50 mL tube | Falcon | 352098 | |
| 95 mm x 15 mm petri dish, slippable lid | Fisherbrand | FB0875714G | 10 cm dish |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 711-545-152 | Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody |
| Arl13B, Clone N295B/66 | Neuromab | AB_11000053 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504001 | B27 |
| Centrifuge | Thermo scientific | ST 40R | |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| DAPI | Sigma | D9542-10MG | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancrease | Sigma | D5025-15KU | Dnase I |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418-100ML | DMSO |
| Disposable Vinyl Specimen Molds | Sakura Tissue-Tek Cryomold | 4565 | 10 mm x 10 mm x 5 mm |
| Dulbecco's Phosphate-buffered Saline 10X, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1408-500ML | DPBS |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11254-20 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9026-500ML | |
| Fluoromount-G solution | Southern Biotech | 0100-01 | mounting solution |
| GFAP | DAKO | Z0334 | |
| Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21127 | Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody |
| Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21137 | Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody |
| Gpr161 | home made | N/A | |
| human bFGF | Sigma | F0291 | FGF |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 0.100 mm deep | improved neubauer |
| Isothesia | Henry Schein | NDC 11695-0500-2 | Isofluorane |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | Laminin |
| L-Glutamine (200 mM) | Sigma | G7513 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | L3000 | |
| Mr. Frosty | Nalgene | 5100-0036 | |
| N-2 supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | N2 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| OCT compound | Sakura Tissue-Tek | 4583 | OCT |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma | P4707 | |
| Recombinant human EGF protein, CF | R and D systems | 236-EG-200 | EGF |
| Scissor | Fine science tools | 14060-10 | |
| Superfrost plus microscope slide | Fisher scientific | 12-550-15 | slides |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |
| Trypsin-EDTA solution (10X) | Sigma | T4174-100 | Trypsin |
| COSTAR 6-Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile | Corning | 3471 | ultra-low binding 6-well plate |
| β-tubulin III | Covance | MMS-435P | TUJ1 |
References
- Mukhopadhyay, S., Rohatgi, R. G-protein-coupled receptors, Hedgehog signaling and primary cilia. Semin Cell Dev Biol. 33, 63-72 (2014).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nat Rev Genet. 11, 331-344 (2010).
- Guemez-Gamboa, A., Coufal, N. G., Gleeson, J. G. Primary cilia in the developing and mature brain. Neuron. 82, 511-521 (2014).
- Louvi, A., Grove, E. A. Cilia in the CNS: the quiet organelle claims center stage. Neuron. 69, 1046-1060 (2011).
- Rohatgi, R., Milenkovic, L., Scott, M. P. Patched1 regulates hedgehog signaling at the primary cilium. Science. 317, 372-376 (2007).
- Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437, 1018-1021 (2005).
- Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary G-protein-coupled receptor Gpr161 negatively regulates the Sonic hedgehog pathway via cAMP signaling. Cell. 152, 210-223 (2013).
- Hilgendorf, K. I., Johnson, C. T., Jackson, P. K. The primary cilium as a cellular receiver: organizing ciliary GPCR signaling. Curr Opin Cell Biol. 39, 84-92 (2016).
- Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol Biol Cell. 19, 1540-1547 (2008).
- Berbari, N. F., Lewis, J. S., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Bardet-Biedl syndrome proteins are required for the localization of G protein-coupled receptors to primary cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 4242-4246 (2008).
- Loktev, A. V., Jackson, P. K. Neuropeptide Y family receptors traffic via the Bardet-Biedl syndrome pathway to signal in neuronal primary cilia. Cell Rep. 5, 1316-1329 (2013).
- Marley, A., Choy, R. W., von Zastrow, M. GPR88 reveals a discrete function of primary cilia as selective insulators of GPCR cross-talk. PLoS One. 8, e70857 (2013).
- Marley, A., von Zastrow, M. DISC1 regulates primary cilia that display specific dopamine receptors. PLoS One. 5, e10902 (2010).
- Omori, Y., et al. Identification of G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) in Primary Cilia and Their Possible Involvement in Body Weight Control. PLoS One. 10, e0128422 (2015).
- Koemeter-Cox, A. I., et al. Primary cilia enhance kisspeptin receptor signaling on gonadotropin-releasing hormone neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 10335-10340 (2014).
- Brailov, I., et al. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. Brain Res. 872, 271-275 (2000).
- Hildebrandt, F. .,,T. .,&K. atsanis,N. ., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N Engl J Med. 364, 1533-1543 (2011).
- Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
- Badano, J. L., Mitsuma, N., Beales, P. L., Katsanis, N. The ciliopathies: an emerging class of human genetic disorders. Annu Rev Genomics Hum Genet. 7, 125-148 (2006).
- Novarino, G., Akizu, N., Gleeson, J. G. Modeling human disease in humans: the ciliopathies. Cell. 147, 70-79 (2011).
- Brugmann, S. A., Cordero, D. R., Helms, J. A. Craniofacial ciliopathies: A new classification for craniofacial disorders. Am J Med Genet A. 152A (12), 2995-3006 (2010).
- Valente, E. M., Rosti, R. O., Gibbs, E., Gleeson, J. G.
- Davenport, J. R., et al. Disruption of intraflagellar transport in adult mice leads to obesity and slow-onset cystic kidney disease. Curr Biol. 17, 1586-1594 (2007).
- Zaghloul, N. A., Katsanis, N. Mechanistic insights into Bardet-Biedl syndrome, a model ciliopathy. J Clin Invest. 119, 428-437 (2009).
- Einstein, E. B., et al. Somatostatin signaling in neuronal cilia is critical for object recognition memory. J Neurosci. 30, 4306-4314 (2010).
- Wang, Z., Phan, T., Storm, D. R. The type 3 adenylyl cyclase is required for novel object learning and extinction of contextual memory: role of cAMP signaling in primary cilia. J Neurosci. 31, 5557-5561 (2011).
- Berbari, N. F., et al. Hippocampal and cortical primary cilia are required for aversive memory in mice. PLoS One. 9, e106576 (2014).
- Han, Y. G., Alvarez-Buylla, A. Role of primary cilia in brain development and cancer. Curr Opin Neurobiol. 20, 58-67 (2010).
- Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nat Med. 15, 1062-1065 (2009).
- Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A. The Adult Ventricular-Subventricular Zone (V-SVZ) and Olfactory Bulb (OB) Neurogenesis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 8, (2016).
- Shimada, I. S., LeComte, M. D., Granger, J. C., Quinlan, N. J., Spees, J. L. Self-renewal and differentiation of reactive astrocyte-derived neural stem/progenitor cells isolated from the cortical peri-infarct area after stroke. J Neurosci. 32, 7926-7940 (2012).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. eLife. 3, e02669 (2014).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell stem cell. 3, 265-278 (2008).
- Pedersen, L. B., Mogensen, J. B., Christensen, S. T. Endocytic Control of Cellular Signaling at the Primary Cilium. Trends Biochem Sci. , (2016).
- Christensen, S. T., Clement, C. A., Satir, P., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of receptor tyrosine kinase (RTK) signalling. J Pathol. 226, 172-184 (2012).
- Clement, C. A., et al. TGF-beta signaling is associated with endocytosis at the pocket region of the primary cilium. Cell reports. 3, 1806-1814 (2013).
- Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 465-502 (2014).
- Joiner, A. M., Green, W. W., McIntyre, J. C. Primary Cilia on Horizontal Basal Cells Regulate Regeneration of the Olfactory Epithelium. J Neurosci. 35, 13761-13772 (2015).
- Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
- Peng, T., et al. Hedgehog actively maintains adult lung quiescence and regulates repair and regeneration. Nature. 526, 578-582 (2015).
- Rauhauser, A. A., et al. Hedgehog signaling indirectly affects tubular cell survival after obstructive kidney injury. Am J Physiol: Renal Physiol. 309, F770-F778 (2015).
- Chavez, M., et al. Modulation of Ciliary Phosphoinositide Content Regulates Trafficking and Sonic Hedgehog Signaling Output. Dev Cell. 34, 338-350 (2015).
- Lobo, M. V., et al. Cellular characterization of epidermal growth factor-expanded free-floating neurospheres. J. Histochem. Cytochem. 51, 89-103 (2003).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
- Nishino, J., Kim, I., Chada, K., Morrison, S. J. Hmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16Ink4a and p19Arf Expression. Cell. 135, 227-239 (2008).
- Shimada, I. S., Peterson, B. M., Spees, J. L. Isolation of locally derived stem/progenitor cells from the peri-infarct area that do not migrate from the lateral ventricle after cortical stroke. Stroke. 41, e552-e560 (2010).
- Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
- Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26, 2938-2944 (2008).
- Pal, K., et al. Smoothened determines beta-arrestin-mediated removal of the G protein-coupled receptor Gpr161 from the primary cilium. J Cell Biol. 212, 861-875 (2016).
- Caspary, T., Larkins, C. E., Anderson, K. V. The graded response to Sonic Hedgehog depends on cilia architecture. Dev Cell. 12, 767-778 (2007).
- Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nat Cell Biol. 17, 113-122 (2015).
- Berbari, N. F., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Lewis, J. S., Mykytyn, K. Hippocampal neurons possess primary cilia in culture. J Neurosci Res. 85, 1095-1100 (2007).
- Paridaen, J. T., Wilsch-Brauninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155, 333-344 (2013).
- Kiprilov, E. N., et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery. J Cell Biol. 180, 897-904 (2008).
- Mukhopadhyay, S., et al. TULP3 bridges the IFT-A complex and membrane phosphoinositides to promote trafficking of G protein-coupled receptors into primary cilia. Genes Dev. 24, 2180-2193 (2010).
- Ishikawa, H., Marshall, W. F. Efficient live fluorescence imaging of intraflagellar transport in mammalian primary cilia. Methods Cell Biol. 127, 189-201 (2015).
