Summary
Echokardiographische Untersuchung wird häufig bei Mäusen verwendet. Teure hochauflösende Ultraschall-Geräte wurden für diesen Zweck entwickelt. Dieses Protokoll beschreibt eine erschwingliche echokardiographische Verfahren kombiniert mit histologischen morphometrische Analysen kardiale Morphologie zu bestimmen.
Abstract
Eine wachsende Zahl von genetisch veränderten Mäusen ist verfügbar in den letzten Jahren geworden. Darüber hinaus ist die Anzahl der pharmakologischen Studien an Mäusen hoch. Phänotypischen Charakterisierung dieser Maus-Modelle erfordert auch die Untersuchung der Herzfunktion und Morphologie. Echokardiographie und Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) sind häufig verwendete Ansätze Herzfunktion und Morphologie bei Mäusen zu charakterisieren. Echokardiographische und MRT-Geräte spezialisiert für den Gebrauch in kleinen Nagetieren ist teuer und erfordert einen eigenen Platz. Dieses Protokoll beschreibt kardiale Messungen bei Mäusen mit einem klinischen echokardiographische System mit einer menschlichen Kreislauf 15 MHz-Sonde. Messungen werden an narkotisierten erwachsenen Mäusen durchgeführt. Mindestens drei Bildsequenzen werden aufgezeichnet und analysiert für jedes Tier im M-Modus in der Parasternal kurze Achse Ansicht. Danach kardiologische histologische Untersuchung wird durchgeführt, und Cardiomyocyte Durchmesser richten sich auf Hämatoxylin-Eosin oder Weizenkeime Agglutinin (WGA)-gebeizt Paraffin Abschnitte. Schiff-Dichte ist bestimmt Morphometrically nach Pecam-1 Immunostaining. Das Protokoll wurde erfolgreich auf pharmakologische Studien angewendet und verschiedene genetische Tiermodellen unter geplanten Bedingungen sowie nach experimentellen Myokardinfarkt durch die dauerhafte Unterbindung des linken vorderen absteigenden Koronararterie ( (LAD). Nach unserer Erfahrung echokardiographische Untersuchung beschränkt sich auf narkotisierten Tiere und ist machbar in erwachsener Mäuse mit einem Gewicht von mindestens 25 g.
Introduction
Gibt es eine Vielzahl von genetisch veränderten Mäusen, und die Anzahl der pharmakologischen Studien an Mäusen ist hoch1,2. Echokardiographie und MRT sind häufig verwendete Ansätze zur phänotypischen Charakterisierung der Herzfunktion und Morphologie in diese Maus-Modelle-3. Das Ziel des vorliegenden Protokolls ist, Herzfunktion und Morphologie bei Erwachsenen Mäusen zu analysieren. Es verbindet echokardiographische, histologischen, und immunhistochemische Messungen. Echokardiographische Untersuchung ist in Mäusen4,5,6,7,8,9,10,11verbreitet, 12. Pachon Et al. 11 identifiziert 205 Studien veröffentlicht in Umlauf, Zirkulation Forschung, American Journal of Physiology - Herz und Herz-Kreislauf Physiologieund Herz-Kreislauf-Forschung zwischen 2012 und 2015 echokardiographische Untersuchung bei Tieren verwendet.
Die Echokardiographie dient zur Identifizierung kardiale Phänotypen in genetisch veränderte Mäuse,5,6,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22, sowie der Herzfunktion in chronische Überlastung-induzierte Hypertrophie, Myokardischämie und Kardiomyopathie Modelle bei Mäusen (rezensiert in12) zu analysieren. Verbesserte Echokardiographie Ausrüstung ermöglicht es, für die das Standardmaß von links-ventrikuläre (LV) systolischen und diastolischen Dimensionen, Gewebe-Doppler-Bildgebung, myokardiale Kontrast Sonografie und die Beurteilung der LV Regionalfunktion und koronare Reserve 12. im Idealfall echokardiographische Untersuchung durchgeführt werden sollte, im bewussten Mäuse, die negativen Auswirkungen der Narkose auf kontraktile Funktion, autonome reflex Kontrolle zu vermeiden und Herzfrequenz11. Dennoch wird dieser Ansatz durch das Erfordernis, die Tiere zu trainieren begrenzt; Schwierigkeiten die Körpertemperatur stabil zu halten; Bewegungsartefakte; Stress; sehr hohe Herz Frequenzen; und die Forderung für mindestens zwei Ermittler das Experiment durchführen, vor allem, wenn eine große Anzahl von Tieren untersucht werden. Eine aktuelle Studie berichtet Interessanterweise keine Unterschiede in der echokardiographische Parameter in trainierten und untrainierten Tiere19. Wir führen echokardiographische Messungen bei narkotisierten Mäusen. Verschiedenen Anästhesie Protokolle werden unten besprochen.
Obwohl Standardauflösung Echokardiographie (> 10 MHz) ist ausreichend, um Maßnahme LV systolischen und diastolischen Dimensionen und Herzfunktion bei Erwachsenen Mäusen, die Methode ist in seiner Beschreibung der zugrunde liegende strukturelle Phänomene begrenzt. So verbinden wir die in-Vivo -Messungen mit histologischen und Immunohistologische Analysen, z. B. Cardiomyocyte Durchmesser und Schiff Dichte zu messen. Andere histologischen und Immunohistologische Untersuchungen, wie z. B. die Bestimmung der Proliferation, Prüfung der Apoptose, Infarkt Größenmessungen, Bestimmung der Fibrose und spezifische Marker Ausdruck können auch auf die gleiche Art von erfolgen Gewebe verarbeitet, aber sind nicht Gegenstand dieses Protokolls. Die Kombination von in Vivo echokardiographische Untersuchung mit histologischen Analysen bietet weitere Einblicke in die zugrunde liegende strukturelle Veränderungen. In einem weiteren Schritt können wir diese Messungen mit molekularen und Ultra-strukturelle Untersuchungen durchführen. Histologische Analysen nicht nur die echokardiographische Untersuchung sondern auch unverzichtbar geworden, wenn die Auflösung der Echokardiographie nicht ausreichend ist. Dies gilt vor allem für Modelle von genetisch veränderten Mäusen, die embryonale tödliche23,24.
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Protocol
die hier beschriebenen Experimente wurden in Übereinstimmung mit den relevanten institutionellen und französischen Tierschutz Gesetze, Richtlinien und Richtlinien durchgeführt. Sie wurden von der französischen Ethikkommission genehmigt worden (Comité Institutionnel d ' Ethique Pour l ' Tier de Laboratoire; Nummer NCE/2012-106).
1. Echokardiographie
- bestimmen das Körpergewicht der Maus mit einer standard-Laborwaage halten Sie es leicht am Schwanz auf um die richtige Positionierung zu gewährleisten.
- Betäuben das Tier durch die intraperitoneale (i.p.) Injektion von 50 mg/kg Pentobarbital 25 , 26.
Hinweis: Jede andere Art von Narkose kann verwendet werden, wenn das gleiche Protokoll während der gesamten Studie verwendet wird. Vor- und Nachteile weiter unten besprochen werden. - Die Maus wieder im eigenen Käfig und warten, bis es nicht mehr reagiert ist, es zeigt stetige Atmung und Hinterfuss Reflexe sind nicht vorhanden. Um dies zu testen, drücken Sie einen Fuß leicht und beobachten, ob das Bein noch fährt.
- Die linke Seite des Thorax und die linke Achselhöhle mit einem kommerziellen Nagetier Rasierer rasieren.
Hinweis: Die Verwendung eines dedizierten Nagetier Rasierers ermöglicht die komplette Haarentfernung feine Maus zur Vermeidung von Interferenzen in der echokardiographischen Messung. Kommerzielle Haarentfernung Cremes oder Lösungen sollten vermieden werden, da sie in der Regel parfümiert sind, die das Tier stören wird, nachdem es weckt. Vermeiden Sie übermäßige rasieren, wie Wärmeverlust erhöht. - Setzen die schlafende Tier auf einem warmen Pad set 40-42 ° c in einer flachen linksseitige Position mit dem Kopf um 12 o ' Uhr und die Rute auf 6 o ' Uhr. Fixieren Sie den linken Arm, linkes Bein und Endstück mit Klebeband.
- Anwenden vorgewärmt Echokardiographie-Gel auf die rasierte Brust und Kopf des Aufnehmers.
- Legen Sie den Schallkopf Parasternal-links auf der rechten Seite des Halses eine zweidimensionale (2D) Parasternal lange Achse Ansicht auf der Ebene des papillären Muskels erhalten Regie. Drehen der Wandlers 90° im Uhrzeigersinn eine kurze Achse auf Papilary Muskel Ebene zu erhalten. Verwenden Sie eine minimale Tiefeneinstellung und ein Zoom Bild Qualität und Frame-Rate zu maximieren. Einstellen der Laufgeschwindigkeit bis zum Maximum.
- , Diese Einstellungen, verschiedene Zoom und Tiefe Einstellmöglichkeiten zu erhalten kann verwendet werden, je nach Maschine und Software. 2D-geführte M-Modus Aufnahmen in kurze Achse anzeigen 27. Siehe Abb. 1A und B 27.
Hinweis: Achten Sie darauf, übermäßigen Druck auf der Brust, da dies Bradykardie führen kann.
- , Diese Einstellungen, verschiedene Zoom und Tiefe Einstellmöglichkeiten zu erhalten kann verwendet werden, je nach Maschine und Software. 2D-geführte M-Modus Aufnahmen in kurze Achse anzeigen 27. Siehe Abb. 1A und B 27.
- Datensatz mindestens 3 Reihe 3 Herzen schlagen Cine Schleifen für jedes Tier.
Hinweis: Für die in dieser Studie verwendete Echokardiograph-Software drücken Sie die " erwerben/Save " Taste nur einmal. Diese Methode ist speziell für die Echokardiograph mit dieser speziellen Software. Andere Software-Pakete mit verschiedenen Maschinen verwendet werden. - Nach erfolgreichen Aufnahmen, wischen Sie die Echokardiographie von Maus Thorax, Heizkissen und Wandler gel. Entfernen Sie das Klebeband von der Gliedmaßen und Rute.
- Lassen Sie die Maus unter Beobachtung auf das Heizkissen, bedeckt mit einem Tuch zu vermeiden unnötige Exposition und Wärme Lichtverlust, bis es sich aufwacht
- Das Tier wieder in seinen Käfig.
- Analysieren aufgenommenen M-Modus Bilder aus Parasternal kurze Achse links ventrikulären (LV) Abmessungen und Funktion bestimmen. Messen Sie die Dicke von der vorderen Wand der LV in Systole und Diastole (LVAWs und LVAWd), die LV Ende systolischen und End-diastolischen Innendurchmesser (LVIDs und LVIDd) und die LV posterior Wandstärke (LVPW) in Systole und Diastole (LVPWs und LVPWd) mit der Identifikation der Gewebe-Blut-Schnittstelle auf die gespeicherten Bilder.
- Messen Sie die diastolischen Dimensionen zum Zeitpunkt der scheinbaren maximale LV diastolischen Dimensionen und LV-Ende-systolische Dimensionen zum Zeitpunkt der meisten anterioren systolischen Exkursion von der hinteren Wand des LV. Berühre den Touchscreen der " Analyse " Symbol und dann auf die " LVAWd " Symbol. Positionieren Sie die elektronische Bremssattel an der Schnittstelle zwischen dem rechtsventrikuläre Hohlraum und der vorderen Wand der LV in Diastole.
- Position des elektronischen Bremssattels an der Schnittstelle zwischen der vorderen Wand des LV und der LV-Hohlraum, die LV diastolische anterior Wandstärke zu erhalten, die Software wird direkt auf die interne End-diastolischen LV-Messung wechseln.
- Positionieren Sie den Bremssattel an der Schnittstelle zwischen dem LV Hohlraum und der hinteren Wand der LV den End-diastolischen LV-Innendurchmesser zu erhalten, die Software wird auf der hinteren Wand-Dickenmessung LV wechseln.
- Position der Bremssattel an der Schnittstelle zwischen der hinteren Wand des LV und das Perikard, die LV diastolische posterior Wandstärke zu erhalten. LV systolischen Dimensionen, tippen Sie auf den Touchscreen auf der " LVAWs " Symbol und Position der elektronischen Bremssattel an der Schnittstelle zwischen dem rechtsventrikuläre Hohlraum und der vorderen Wand des LV in Systole.
- Position der elektronischen Bremssattel an der Schnittstelle zwischen der vorderen Wand des LV und der LV-Hohlraum, die LV systolische anteriore Wandstärke zu erhalten. Wiederholen Sie den Vorgang wie oben beschrieben für den Ende systolischen LV-Innendurchmesser und die LV systolischen posterior Wandstärke. Verwenden die Vorderkante Konvention durch die amerikanische Gesellschaft der Echokardiographie nachzuvollziehen endokardialen und epicardial Grenzen 13 , 27.
Hinweis: LV kontraktile Funktionsparameter werden automatisch mit der vorherigen Messungen berechnet werden. Die LV gebrochene Verkürzung (FS) ist definiert als FS (%) = [(LVIDd-LVIDs)/LVIDd] X 100. Die LV Auswurffraktion (EF) errechnet sich mit der veränderten Teicholz Formel, wo EF (%) = [(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd 3] X 100 12. Siehe Abb. 1A und B. - Speichern die Daten auf CDs oder USB-Memory-Sticks und Sicherungskopien.
- Import, analysieren und exportieren Sie die Daten mit Hilfe der entsprechenden Software.
Hinweis: Nach dieser Baseline-Messungen kann das Experiment angehalten werden. Wenn Sie einen direkten Vergleich zwischen Ko Tiere und Wildtyp Wurfgeschwistern durchführen, fahren Sie mit der histologische Analysen- 6. Für Cre-ERT2; Lox/Lox Mauslinien, weiter am nächsten Tag mit Tamoxifen Induktion durch Injektion i.p., wie beschrieben 5 , 24. Bei experimentellen Myokardinfarkt durch die Ligatur der linken Koronararterie 5 , 28 induziert, konnte die Operation direkt nach der echokardiographischen Messungen durchgeführt werden wenn die Mäuse sind unter Narkose. Andernfalls sollte eine minimale Verzögerung von einer Woche zwischen den zwei Runden der Anästhesie, um die Rate der postoperativen Letalität zu begrenzen beibehalten werden.
2. Vorbereitung der Herz-Proben zur histologischen Auswertung
- die Tiere durch zervikale Dislokation zu opfern. Messen Sie ihr Körpergewicht. Brust und Bauch mit einem 70 % Alkoholtupfer desinfizieren.
- Machen eine Quereinschnitt in der Haut 1 cm distal des Brustbeins. Mit stumpfen Pinzette, entfernen Sie die Haut von Thorax, in Richtung des Kopfes. Das Brustbein leicht mit einer feinen Pinzette halten und öffnen das Zwerchfell durch das stumpfe Ende des feinen Schere einfügen.
- Senken des Brustkorbs auf beiden Seiten parallel zum Brustbein. Bewegen Sie das Brustbein in Richtung des Kopfes. Suchen Sie die Herzen im Brustkorb. Halten den vaskulären Stamm des Herzens mit feinen Zangen und unten mit einer feinen Schere geschnitten.
- Öffne die Truhe und Verbrauchsteuern das gesamte Herz aus der Brust, das Herz Gewicht zu messen und eine Herz-zu-Körper-Gewicht-Verhältnis 4 , 5 , 6 , 23 , 29 , 30 < /SUP >.
- Fix das Herz in 2 mL 10 % neutral gepuffertem Formalin-Lösung in 15 mL Röhrchen über Nacht bei 4 ° c
Vorsicht: Gefahr! Arbeiten mit Formalin Lösungen müssen in einem chemischen Abzug durchgeführt werden; Handschuhe und Schutzbrille zu tragen.
Hinweis: Da die Puffer-Komposition für Formalin-Lösungen mit verschiedenen Lieferanten unterscheiden, verwenden die gleichen Lieferanten während der gesamten Studie. - Am nächsten Tag die Herzen in der Querebene, in der Mitte geschnitten und in Kassetten für Paraffin einbetten, überführen, erfolgt in der Pathologielabor unter Verwendung eine automatisierte einbetten Vorrichtung.
- -Schnitt durchführen.
- Abschnitt Paraffin blockiert bei einer Dicke von 3 µm mit einem Mikrotom und schweben sie in einem 40 ° C Wasser mit destilliertem Wasser Baden.
- Übertragen die Abschnitte auf Folien. Ermöglichen die Folien über Nacht trocknen in einem Inkubator 37 ° C und bei 4 ° C aufbewahrt bis einsatzbereit.
Hinweis: Das Protokoll kann angehalten werden hier bis der Benutzer bereit ist für die Färbung (Schritt 3).
- Deparaffinize und rehydrieren das Gewebe gleitet.
- Legen Sie die Folien in der Färbung Gläser mit Glaseinsätzen in einem 55 ° C Ofen für 10 Minuten das Paraffin schmilzt.
- Deparaffinize Folien in zwei Änderungen von 200 mL Xylol oder Xylol Ersatz für 5 min.
Achtung: Leicht entzündlich und giftig! Arbeiten Sie in einem chemischen Abzug; Handschuhe und Schutzbrille zu tragen. - Übertragen die Folien auf 200 mL 100 % Alkohol. Zwei Änderungen für 3 min und einmal über 200 mL 95 % Alkohol für 3 min. übertragen
Achtung: Entzündlich! Von Zündquellen fernhalten; kein Rauchen. - Zweimal in 200 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) für 5 min spülen und fahren Sie mit Schritt 3, 4 oder 5.
3. Hämatoxylin und Eosin Färbung
- die Folien mit ihren Sektionen in destilliertem Wasser abspülen.
- Färben Sie die Kerne mit Hämatoxylin Lösung für 8 min.
- Spülen unter fließendem Leitungswasser für 10 min.
- Färben mit Eosin-Lösung für 2 min.
- Gelief dreimal für 2 min bei 100 % igem Ethanol (EtOH). Klar drei Mal für 2 Minuten in Xylol und Xylol zu ersetzen. Berg in Xylol-basierte Eindeckmedium.
- Die Folien zu fotografieren und Messen Sie den Durchmesser des Cardiomyocyte auf der Ebene des Zellkerns in Längsprofile der interventricular Septum. Messen Sie mindestens 100 Zellen pro Abschnitt und drei Abschnitte pro Herz.
4. WGA Färbung
- inkubieren Sie die Folien aus Schritt 2.7 mit Tetramethylrhodamine (oder andere Fluoreszenzfarbstoffe) gewonnen-WGA (1: 100 mit PBS-Puffer) für 60 min bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer konjugiert.
- Für 5 min dreimal mit PBS waschen. Mount
- mit Fluoreszenz Montage Medium mit DAPI. Shop bei 4 ° C im Dunkeln vor der Analyse.
Achtung: Tragen Sie Augenschutz und kompatibel-chemikalienbeständige Handschuhe. - Die Folien zu fotografieren.
- Verwendung setzt ein Mikroskop mit Fluoreszenz-Epi-Beleuchtung und Filter ausgestattet für DAPI und Tetramethylrhodamine (siehe die Tabelle der Materialien). Stellen Sie die Blende, die maximale und die Helligkeit auf Belichtungsautomatik. Bilder bei 400 X Vergrößerung für die blaue und die rote Kanäle getrennt
- erwerben. Öffnen Sie die Bilder in ImageJ. Stellen Sie die Helligkeit und Kontrast bei Bedarf (Bild > Adjust > Helligkeit/Kontrast).
- Jedes Bild auf 8-Bit festgelegt (Bild > Typ > 8-Bit). Das DAPI und WGA Bilder zu überlagern. Verwenden Sie den blauen Kanal für DAPI und den Rot-Kanal für WGA; die grünen und grauen Kanäle auf none gesetzt (Bild > Farbe > Kanäle zusammenführen) 31.
- Bestimmen die Cardiomyocyte Durchmesser auf der Ebene des Zellkerns in Querschnitte der interventricular Scheidewand.
- Definieren die Skalierung der Bilder in ImageJ. Zu diesem Zweck Fotografieren ein Objekts bekannter Größe (z. B. einer Hemocytometer-Kammer mit der gleichen Vergrößerung als die Herz-Abschnitte, Schritt 4,4).
- Verwenden Sie das lineare Werkzeug zum Zeichnen einer Linie von Anfang bis Ende der bekannten Struktur (Analyze > Maßstab).
Hinweis: Der Abstand in Pixel wird automatisch angezeigt werden; die bekannten Abstand und Längeneinheit müssen eingegeben werden. Fahren Sie fort mit Cardiomyocyte Messungen auf der Ebene des Zellkerns. - Zeichnen einer geraden Linie von der WGA-positiven Membrane durch DAPI-positiven Kern auf der gegenüberliegenden Seite der Zellmembran WGA-positiv (Analyze > Maßnahme). Im Ergebnisfenster stellen sicher, dass die Längenwerte eine sinnvolle Anzahl von Dezimalstellen (Analyze > Set Messungen > stellen nach dem Komma).
- Maßnahme mindestens 100 Zellen pro Abschnitt und drei Abschnitte pro Herz. Die Ergebnisse in Excel exportieren (Klicken Sie auf Ergebnisse > Datei > speichern als > CSV) 6 , 31.
5. PECAM-1 Immunostaining
- führen Sie Antigen Demaskierung.
- Hinzufügen, 1.600 mL Natriumcitrat-Puffer (10 mM Natriumcitrat, 0,05 % Tween 20, pH 6.0), einen Schnellkochtopf. Setzen Sie den Schnellkochtopf auf die Herdplatte und schalten Sie ihn auf volle Leistung. Sichern Sie den Deckel des Schnellkochtopfes zu diesem Zeitpunkt nicht; ruhen sie sich einfach an der Spitze.
Vorsicht: Heiß! - Sobald die Natrium-Citrat-Puffer kocht, die Folien von Schritt 2.5 auf den Schnellkochtopf übertragen. Sichern Sie den Schnellkochtopf Deckel. Sobald der Herd voll Druck erreicht hat, 7 min. warten. Wenn 7 min. vergangen sind, schalten Sie die Herdplatte und legen Sie den Schnellkochtopf in eine leere sinken. Aktivieren Sie das Überdruckventil und laufen Sie kaltes Wasser über den Herd. Sobald es de-unter Druck gesetzt hat, öffnen Sie den Deckel und führen Sie kaltes Wasser in den Herd für 5 min. Ort Folien in 200 mL PBS.
Hinweis: Alternativ Mikrowelle Antigen Demaskierung genutzt werden, obwohl die Gefahr der Überhitzung erhöht wird.
- Hinzufügen, 1.600 mL Natriumcitrat-Puffer (10 mM Natriumcitrat, 0,05 % Tween 20, pH 6.0), einen Schnellkochtopf. Setzen Sie den Schnellkochtopf auf die Herdplatte und schalten Sie ihn auf volle Leistung. Sichern Sie den Deckel des Schnellkochtopfes zu diesem Zeitpunkt nicht; ruhen sie sich einfach an der Spitze.
- Verwendung 0,3 % Wasserstoffperoxid in Methanol zu Block endogene Peroxidase-Aktivität für 5 min. Spülen Sie die Folien für dreimal jeweils in 200 mL PBS für 2 min.
Achtung: Entzündlich und giftig! - Inkubieren Sie die Folien für 15 min in verdünnte normale blockierende Serum (5 % normalem Ziegenserum mit PBS-Puffer), der auch einen Avidin-Block (4 Tropfen in 1 mL) enthält.
- Vorsichtig Tippen Sie die Flüssigkeit aus den Abschnitten und inkubieren sie mit Pecam-1 Antikörper vom Kaninchen, verdünnte 01:50 in PBS mit 2,5 % normalem Ziegenserum und 4 Tropfen Biotin Block pro mL. Inkubieren Sie die Folien über Nacht in einer feuchten Kammer bei 4 ° c
- Die Folien drei Mal für 5 min in 200 mL PBS waschen. Inkubieren Sie die Abschnitte mit biotinylierte Ziege Anti-Kaninchen IgG Antikörper verdünnt 1: 200 mit PBS-Puffer mit 2,5 % normalem Ziegenserum für 1 h bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Folien drei Mal für 5 min in 200 mL PBS.
- Inkubieren tHe-Abschnitte mit einem Avidin/Biotin-basierte Peroxidase-System für 20 min (Reagenz A und Reagenz B müssen kombinierte 30 Minuten vorher zu verwenden). Waschen Sie die Folien drei Mal für 5 min in 200 mL PBS.
- Auflösen 1 3,3 '-Diaminobenzidine (DAB) und 1 Harnstoff Wasserstoffperoxid tablet in 5 mL bidestilliertem Wasser. Inkubieren Sie die Abschnitte mit DAB Lösung für ca. 3 min, Farbe Entwicklung sorgfältig zu überwachen. Die Farbreaktion vorbeischauen, sanft waschen die Folien in 200 mL PBS.
Achtung: Krebserregend; chemisch beständige Handschuhe! - Counterstain die Kernen für 6 min mit Hämatoxylin. Spülen Sie in fließendem Leitungswasser für 2 min. gelief dreimal für 2 min in 200 mL 100 % Alkohol. Deaktivieren Sie dreimal für 2 min jeweils in 200 mL Xylol oder Xylol Ersatz. Berg in Xylol-basierte Eindeckmedium.
- Folien (mindestens zehn Felder bei 40 X Vergrößerung aus der interventricular Scheidewand von jedes Herz) zu fotografieren und die Flächendichte Pecam-1 mit Hilfe der frei verfügbare ImageJ Software 31 messen. Verwenden Sie die Farbe Dekonvolution 32 Plugin für DAB und Hämatoxylin und passen Sie den Kontrast des Bildes auf das gleiche Niveau.
Hinweis: für den Fall, dass die Farbe braune und lila/blau haben erhebliche spektrale Überlappung, die Schwierigkeiten mit Farbe Dekonvolution verursachen könnte, könnte man verschiedene Marken von Hämatoxylin Lösung um klare, hellblaue nuklearen Färbung zu erhalten versuchen. Alternativ, Immunfluoreszenz oder manuelle Zählung der Kapillaren durchgeführt werden konnte.
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Representative Results
In Abbildung 1zeigen repräsentative echokardiographische Aufnahmen die Nützlichkeit der Echokardiographie, kardiale Phänotypen bei genetisch veränderten Mäusen zu identifizieren. Der Unterschied zwischen einer Maus mit normalen Herzfunktion (Abbildung 1A) und ein Tier mit einem dilatierten linken Ventrikel und reduzierte LV-Funktion (Abb. 1 b) kann leicht identifiziert werden. Abbildung 2 zeigt den Vergleich der Cardiomyocyte Durchmesser Messungen bei Tieren ohne (Abb. 2A) und mit Herzhypertrophie (Abb. 2 b) mit Hämatoxylin-Eosin-gefärbten Paraffin Herz Abschnitte und Messungen von Längsprofile von Herzgewebe. Abbildung 3 zeigt die Messung der Cardiomyocyte transversalen Durchmesser mit WGA-gefärbten Paraffin Abschnitten vom Herzen des Steuerelements Mäuse (Abbildung 3A) und Tiere mit Herzhypertrophie (Abb. 3 b). Abbildung 4 zeigt das Dienstprogramm Pecam-1 Immunohistochemistry (DAB Substrat, braune Färbung) der kardialen Abschnitte des Schiffes Dichte normal Herzgewebe (Abbildung 4A) und Herzen mit mehr Angiogenese (Abbildung 4 b bestimmt ).
Abbildung 1: Standardauflösung Echokardiographie (> 10 MHz) Maßnahme LV systolischen und diastolischen Dimensionen und Herzfunktion bei Mäusen mit dilatierten Herzhypertrophie nach Myokardinfarkt im Vergleich zu Kontrolltieren.
Repräsentative echokardiographische Aufnahmen von normalen, gesunden Mäusen (A) und Tiere mit LV-Dilatation und reduzierte LV-Funktion nach Myokardinfarkt (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + Tamoxifen Mäuse)5 (B). Die LVAW, LVID und LVPW werden angezeigt. Die weißen Balken repräsentieren systolischen und diastolischen Messpunkte. Sie entsprechen den Cursor Punkte für Messungen festgelegt und werden im Protokoll Schritt 1.12 erklärt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Hämatoxylin-Eosin-gefärbten Sektionen längs geschnittenen Zellen von Mäusen mit Cardiomyocyte Durchmesser messen geweitet kardiale Hypertrophie und Kontrolle Tiere. Repräsentative Bilder Cardiomyocyte Durchmesser bei Mäusen mit normalen Cardiomyocyte Größen (A) und Tiere mit erhöhten Cardiomyocyte Größen (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + Tamoxifen Mäuse)5 (B). Die schwarzen Linien zeigen die gemessenen Durchmesser. Die Werte für jede Messung werden dargestellt. Skalieren von Balken = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: WGA-gefärbten Abschnitte Cardiomyocyte transversalen Durchmesser in Abschnitten von Herzgewebe von Mäusen mit dilatierten Herzhypertrophie versus Messen Steuern Tiere. Repräsentative Bilder für Cardiomyocyte Durchmesser bei Mäusen mit normalen Cardiomyocyte Größe (A) und Tiere mit erhöhten Cardiomyocyte Größen (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + Tamoxifen Mäuse)5 (B). Kerne wurden mit DAPI counterstained. Die weißen Linien geben die gemessenen Durchmesser auf der Ebene der Zellkerne (blau). Die Werte für jede Messung werden dargestellt. Skalieren von Balken = 50 µm. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Pecam-1 Immunolabeled Abschnitte, Herz-Gefäß-Dichte in Kontroll-Mäusen und Tiere mit mehr Angiogenese zu analysieren.
Repräsentative Bilder für Schiff Kennzeichnung bei Mäusen mit normalen Kreislauf-Dichte (A) und Tiere mit verstärkten Vaskularisation (Tie2-CreERT2; PPARβ/δ + Tamoxifen Mäuse)5 (B). Kerne wurden mit Hämatoxylin counterstained. Die Pfeile zeigen auf Pecam-1-positiven Schiffe. Skalieren von Balken = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um kardiale Struktur und Funktion bei Mäusen, einschließlich Echokardiographie, Kontrast-verstärkte MRI, Mikro-CT und PET-Scan zu bewerten. Aufgrund seiner Wirtschaftlichkeit und Einfachheit ist Echokardiographie die am weitesten verbreitete Technik zur Funktionsanalyse in Mäusen11. In der Regel wegen der geringen Größe des Herzens und der hohen Frequenz der Herzfrequenz bei Mäusen, Wandler mit einer Frequenz > 10 MHz sollte verwendet werden, obwohl erfolgreichere Messungen mit 8 oder 9 MHz Wandler4,7 gemeldet wurden . Da der Herzfunktion, Körpertemperatur und Herzfrequenz eng verwandt ist, ist es wichtig, diese Parameter während der gesamten Studie steuern. Platzieren des Cursors auf ein Heizkissen ist wichtig, die Körpertemperatur des narkotisierten Tier konstant zu halten. Im Idealfall sollte eine kontrollierte Heizkissen mit einer rektale Sonde die Körpertemperatur auf 38 ° C festgelegt verwendet werden. Wenn dies nicht möglich ist, sollte das Heizkissen auf zwei bis drei Grad über diesen Wert festgelegt werden. Heizung Lampen sollte vermieden werden, da sie die Aufgabe für die Ermittler und das Risiko eine Überhitzung der Tiere erschweren.
Um die Herzfrequenz und die Herzfunktion zu steuern, ist die Art der Narkose sehr wichtig. Die meisten Studien verwenden Isofluran, Anästhesie ist leicht durch Inhalation in einer Induktion Kammer (3 % Isofluran) induzieren, kann über eine Inhalationsmaske (1-2 % Isofluran) beibehalten werden und ist nur von kurzer Dauer. Andere häufig verwendeten Substanzen sind 2,2,2-Tribromoethanol, Pentobarbital und Ketamin + Xylazin Mischungen11,12. Überraschend, Isofluran wurde berichtet, der Herzfunktion in echokardiographische Messungen beeinträchtigen, und dieser Effekt war noch ausgeprägter in der Ketamin + Xylazin Gruppe11. Ketamin allein am besten funktionierte in dieser Studie11. Gao Et Al. die meisten reproduzierbare Ergebnisse mit 2,2,2-Tribromoethanol12gemeldet. Die Ergebnisse wurden in der gleichen Größenordnung für Isoflurane, 2,2,2-Tribromoethanol und Pentobarbital12. Auch Herzfrequenzen unterschieden sich nicht in die 2,2,2-Tribromoethanol und Pentobarbital Gruppen12. Herz Et Al. berichteten niedriger Herzfrequenz in der Ketamin + Xylazin-Gruppe im Vergleich zu den 2,2,2-Tribromoethanol Gruppe16. In unseren Experimenten mit verschiedenen transgenen Mausstämme und Pentobarbital Anästhesie, die mittlere Herzfrequenz lag zwischen 350 und 450 Bpm. Dennoch Auswurf Fraktionen waren > 80 %, was die Werte bewusst Tiere11entspricht. Echokardiographische Messungen unter Baseline sind Konditionen aus unserem Labor4,5,6 in der gleichen Größenordnung wie berichtet an anderer Stelle11,12,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,26 . Im Gegensatz zu Pentobarbital zeichnen sich durch raschen Wirkungseintritt und Recovery Ketamin, Isofluran und 2,2,2-Tribromoethanol. So sollte das Timing zwischen Anästhesie und die echokardiographischen Messungen dasselbe für alle Tiere in der Studie zu unterschiedlichen Grad der Erholung aus der Narkose zu vermeiden. Pentobarbital wirkt länger, hat aber den Nachteil eines kleinen therapeutischen Fensters machen es notwendig, die Dosis fest in Bezug auf Körpergewicht anpassen. Die lang anhaltende Anästhesie mit Pentobarbital hat den Vorteil, der ohne die Notwendigkeit der Re-Injektion5nach echokardiographischen Basisberechnungen, chirurgische Eingriffe durchgeführt werden kann. Sich wiederholende Anästhesie mit Pentobarbital sollte vermieden werden, da nach unserer Erfahrung Injektionen in einem Abstand von weniger als einer Woche erhöhte postoperative Mortalität geführt.
Bei der Echokardiographie bei Mäusen mit Durchführung einer > 10-Mhz-Schallkopf, der Qualität der Bilder sollte ausreichen, um globale LV Funktion zu bestimmen. Mehrere Aufnahmen müssen für jedes Tier, Beat-to-Beat-Variationen und Bewegungsartefakte zu reduzieren. Fachkundige Beratung durch einen geschulten Kardiologen oder ein Wissenschaftler mit Erfahrung in der Echokardiographie bei Mäusen sollte am Anfang aufgefordert, die Qualität der Bilder zu bewerten. Die meisten Echokardiographie Maschinen berechnen EF von LV Innendurchmesser mit der Teicholz Formel11,12. Auch wenn LV Abmessungen einfach zu messen sind, bieten sie eine unvollständige Bewertung der LV Volumen und Flächen weil die LV keine ideale, vereinfachte geometrische Form entspricht. Weder gebrochene Verkürzung noch Auswurf Bruchteil erhalten mit der Teicholz Formel ist eine perfekte Parameter, LV kontraktile Funktion zu bestimmen, wie sie beide auf eine geometrische Annahme basieren und die Kontraktilität der nur zwei Wände beschreiben. Auswurffraktion bewertet mit dem Doppeldecker Simpson Methode wäre genauer, aber das war unmöglich, in jedem Tier mit den hier verwendeten Geräten zu erhalten.
Nach Myokardinfarkt standen wir mehrere Probleme im Zusammenhang mit der echokardiographischen Bildgebung. Zunächst wurde Bildqualität durch die Thorakotomie Narbe stark beeinträchtigt. Zweitens waren die Tiere sehr viel empfindlicher auf wiederholte Betäubung. Zu guter Letzt annehmen M-Modus-basierte LV Volumen und Funktion Messungen, dass LV Geometrie homogen ist. Infolgedessen wird der Einsatz dieser Indizes nach Myokardinfarkt umstrittener im Beisein von LV Wand Bewegung Anomalien.
In unseren Händen erlaubt die Verwendung einer 15-MHz-Sonde für die gelegentliche, aber nicht systematisch, Aufzeichnung von Doppler Bilder. Viel höhere Frequenzen sind erforderlich, um LV Regionalfunktion bestimmen oder myokardiale Kontrast-Echokardiographie durchzuführen, die nur mit Geräten gewidmet Nagetiere12erreicht werden kann.
Angesichts der zusätzlichen Möglichkeiten und höhere Auflösung dieser Nagetier-spezifische Systeme, sollte man mit ihnen in die Zukunft. Nachteile sind die höheren Kosten und die Notwendigkeit eines eigenen Raumes. Diese High-End-, Nagetier-eigene Echocardiographs werden profitabel sein, nur, wenn genug Tiere untersucht werden und eine kritische Anzahl von Wissenschaftlern, die das Gerät benutzen. Mit dem speziellen Training für diese Maschinen angeboten, können sie von den Wissenschaftlern nicht Experte in der Kardiologie verwendet werden. Die klinische Echokardiographie-Ausrüstung bietet eine begrenzte Auflösung, wie oben erwähnt. Dennoch ist es weiterhin erfolgreich in verschiedenen erfahrenen l verwendetPrüflaboratorien11,12; kann leicht durch qualifizierte Wissenschaftler und Kardiologen verwendet werden; mobiler und weniger anspruchsvoll auf ein Raum gewidmet ist; und aufgrund der hohen Anzahl an Maschinen, ermöglicht die Berücksichtigung der verschiedenen Optionen zur Reduzierung der Kosten (z. B. Vermietung, Geräte, die nicht in der klinischen Anwendung zu erhalten oder aus zweiter Hand Käufe).
Histologische Analysen ist der erste kritische Punkt zur Minimierung der Zeit zwischen Orgel Isolation und Fixierung des Gewebes. Wie in diesem Protokoll basieren die meisten Färbung und histologische Analysen auf übertragene Lichtmikroskopie; Immersion Fixierung von Herzgewebe in Formalin ist ausreichend. Wenn ein Projekt mehr auf Fluoreszenz mikroskopisch kleine Färbung geht, sollte man überlegen die Perfusion Fixierung der narkotisierten Tiere, die roten Blutkörperchen aus dem Gewebe zu entfernen die helle Auto-Fluoreszenz zeigen.
Um Variationen in das Paraffin einbetten zu vermeiden, verwenden wir eine automatische Einbettung Vorrichtung. Da der Schmelzpunkt und Härte zwischen den Marken des Paraffins unterscheiden, empfehlen wir den gleichen Lieferanten während der gesamten Studie. Paraffin-Schnitt sollte vorgekühlt Blöcke mit einer rotierenden Mikrotom erfolgen. Schnittdicke muss konstant gehalten werden. Abschnitt 3 µm Dicke ermöglicht klare Visualisierung der Membran Grenzen im Herzen Hämatoxylin-Eosin-gefärbten Abschnitte, die für die genaue Messung des Cardiomyocyte Durchmesser erforderlich ist. Da die Form der Kardiomyozyten unregelmäßig ist, müssen auf der Ebene des Zellkerns Messungen durchgeführt werden. WGA Färbung bietet eine alternative Möglichkeit, die Zellmembran zu beflecken und führt die gleichen Werte wie Hämatoxylin-Eosin-Färbung. Vor morphometrische Analysen man sollte klar zu definieren, welcher Teil des Herzens (z. B. links- oder rechtsventrikuläre freie Wand oder Septum) gemessen wird und ob Cardiomyocyte Querschnitte in der langen oder kurzen Achse bestimmt sind. Durch die quer, Spirale und längs Ausrichtung der Herzmuskelzellen im Herzen ist es möglich, auf den gleichen Querschnitt längs- und Querrichtung Abschnitten der Herzzellen zu erhalten. Ob längs oder quer Durchmesser gemessen werden ist eine Frage der Konvention, solange die Zellen auf der Ebene des Zellkerns analysiert werden.
In unseren Studien beobachteten wir eine Vereinbarung zwischen der echokardiographischen Dimensionen und die Herz-zu-Körper-Gewichts-Verhältnis und Cardiomyocyte Größen4,5,6, aber histologische Messungen der Cardiomyocyte Größe nicht immer entsprechen Sie den Werten der Auswurffraktion. Zum Beispiel führt Übung Training erhöhte kardiale Dimensionen, mit erhaltener Auswurffraktion und erhöhte Cardiomyocyte Durchmesser. Jedoch zeichnet sich durch erhöhte kardiale Dimensionen, mit einem reduzierten Ejektionsfraktion und erhöhte Cardiomyocyte Durchmesser33dekompensierten Herzinsuffizienz. Darüber hinaus haben wir vor kurzem gezeigt, dass erhöhte kardiale Schiff Dichte aufgrund von Endothelzellen-spezifische Überexpression von PPARβ nicht in verbesserte Herzfunktion unter geplanten Bedingungen noch in verbesserte Wiederherstellung nach Myokardinfarkt5 .
Für Immunohistochemistry ist es wichtig, negative Kontrollen umfassen und zum Ausführen der verschiedenen blockierenden Schritte in das Protokoll zur Verfügung gestellt. Der Antigen-Demaskierung Schritt in das Protokoll ist spezifisch für den primären Antikörper verwendet. Für verschiedene primäre Antikörper ist es notwendig, um festzustellen, ob ein besseres Signal niedrig oder hohem pH-Wert Demaskierung Puffer ergeben. Unterschiedliche Fixierung Techniken können verwendet werden, um ein spezifisches Antigen zu erkennen. Zum Beispiel wurde Pecam-1 Kennzeichnung berichtet, am besten auf Zink-repariert, Paraffin-eingebetteten Gewebe zu arbeiten, während die gleichen Fixierung, zusätzliche Maßnahmen zur Reduzierung der Hintergrund für eine Thrombomodulin Antikörper34 erforderlich. Daher verwenden wir regelmäßige Formalin Fixierung, die für die Ausweitung der Studie zu einer Vielzahl von verschiedenen Antigenen erlaubt. Alternative zu Pecam-1 Immunostaining, Isolectin B4 wird häufig verwendet, um Schiffe zu visualisieren. Neben einen Anteil von Endothelzellen35Etiketten Isolectin B4 auch Glia36 und Makrophagen37. Darüber hinaus könnte eine Vielzahl von Antigenen verwendet werden, um arterielle und venöse Endothelzellen38unterscheiden. Die elegante Art zu visualisieren, funktionale durchblutet Schiffe oder um festzustellen, Gefäß sprießen oder Regression ist die intravenöse Injektion von Fluoreszenz-gekoppelten Lektin gefolgt von der Analyse der Cryosections24. Dieser Ansatz ist jedoch weitgehend die Möglichkeiten, zusätzliche Antigene erkennen und morphometrische Analysen aufgrund der unterschiedlichen Qualität der Cryosections beschränkt.
Auf Immunostained Abschnitte, wo das Signal mit DAB visualisiert wird, kann die Flächendichte quantitativ bestimmt werden mit Hilfe der frei verfügbaren ImageJ-Software. Jedoch da das Signal nicht linear ist, übereinstimmen der Grad der braunen Färbung nicht genau auf die Ebene der Proteinexpression.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Arbeit wurde von der französischen Regierung (National Research Agency, ANR) durch das Programm "Investitionen für die Zukunft" LABEX SIGNALIFE (Referenz ANR-11-LABX-0028-01) unterstützt und durch Zuschüsse, K. D. W. von der Association pour la Recherche Sur le Cancer Fondation de France, und planen Sie Krebs Inserm. D. B. und A. V. Feldkamp von der Fondation Pour la Recherche Médicale und von der Stadt Nizza, beziehungsweise. Die Echokardiograph und der Wandler wurden uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Philips. Wir danken A. Borderie, S. Destree, M. Cutajar-Bossert, A. Landouar, A. Martres, A. Biancardini und S. M. Wagner für ihre qualifizierte technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine | Life Technologies, Molecular Probes | W849 | |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vectorlabs | BA-1000 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vectorlabs | SP-2001 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vectorlabs | PK-6100 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4168 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | |
| Anti-Pecam-1 (CD31) antibody | Abcam | ab28364 | |
| Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100 | Parker | ||
| Linear ultrasound probe, L15-7io | Philips Healthcare | ||
| Echocardiograph, IE33 xMATRIX | Philips Healthcare | ||
| Microscope, Leica DMi8 | Leica | ||
| Fluorescence Filterset DAPI | Leica | 11525304 | |
| Filterset TxR | Leica | 11525310 | |
| Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider | Spot Imaging | ||
| Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software | Spot Imaging | ||
| Imaging Computer | Dell | ||
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14501-14 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11650-10 | |
| Rodent shaver | Harvard Apparatus | 34-0243 | |
| cassettes for paraffin embedding | Sakura | 4155F | |
| neutral buffered Formalin | Sakura | 8727 | |
| Xylene | Sakura | 8733 | |
| Paraffine TEK III | Sakura | 4511 | |
| automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP | Sakura | 6032 | |
| paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5 | Sakura | 5229 | |
| microtome blades,Accu-Edge S35 | Sakura | 4685 | |
| microscopy slides, Tissue-Tek | Sakura | 9533 | |
| cover slips, Tissue-Tek | Sakura | 9582 | |
| Mounting medium Tissue-Tek | Sakura | 1408 | |
| slide boxes | Sakura | 3958 | |
| eosine solution | Sakura | 8703 | |
| hematoxyline solution | Sakura | 8711 | |
| microtome, RM2125RT | Leica | 720-1880 (VWR) | |
| water bath, Leica HI1210 | Leica | 720-0113(VWR) | |
| Ethanol | VWR | ACRO444220050 | |
| 15 ml tubes | VWR | 734-0451 | |
| staining glass dish | VWR | MARI4220004 | |
| staining jars | VWR | MARI4200005 | |
| Incubator | Binder | 9010-0012 | |
| DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | |
| PBS (10X) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 |
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