Summary
Здесь мы представляем адресно капелька microarrays (ЗРК), капелька массива на основе метода определить абсолютное белка изобилия в одиночных клетках. Мы демонстрируем ADMs возможность характеризовать гетерогенность в выражении опухолевые супрессоры белок р53 в человеческих раковых клеток линии.
Abstract
На уровне населения, где ответы многих клеток объединяются вместе, как средний результат, маскирование поведение богатых одну ячейку в пределах комплекса населения анализируются поведению часто клеток и клеточных реакций. Технологии обнаружения и количественного определения белка одноклеточных сделали замечательное влияние в последние годы. Здесь мы описываем практический и гибкий одноклеточного анализа платформу, основанную на microarrays адресно капелька. Это исследование описывает, как абсолютная копия количество целевых белков могут быть измерены с резолюцией одной ячейки. Наиболее часто мутировавший ген p53 усмирителя тумора в человека рак, с более чем 50% случаев всего рака экспонируется шаблон выражения не здоровый p53. Протокол описывает шаги для создания 10 nL капель, в рамках которых одного человека раковые клетки изолированы и копировать количество белка р53 измеряется с одной молекулы резолюции точно определить вариабельность в выражении. Этот метод может применяться в любой тип клеток, включая первичный материал для определения абсолютной копией количество любого целевого протеинов интереса.
Introduction
Цель этого метода необходимо определить различия в изобилии целевого белка в популяции клеток с резолюцией одну ячейку. Одноячеистый анализ обеспечивает ряд преимуществ, которые не доступны с традиционными ансамбль биохимические методы. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 во-первых, работа на уровне одной ячейке может захватить богатые гетерогенность популяции клеток, которые в противном случае будут потеряны путем усреднения что происходит с традиционными ансамбль биохимических методов. Большинство биохимических методов работы лошади работают с навалом, требующие, как они часто делают, миллионы клеток для получения результата. Конечно последствия оценки всей клеточных популяций зависит от целого ряда факторов, например, неоднородности в выражении протеина, где могут быть пропущены некоторые важные функции распределения плотности залегания белка. С практической точки зрения чувствительность, требуемых от одноклеточного методов сделать их способен работать с объемами биологического материала, который является недостаточным для даже более чувствительных методов массовых функционировать. Ключевым примером этого является исследование типов редких клеток как циркулирующих клеток опухоли (CTCs), где даже для пациентов с плохой прогностические outlook менее чем 10 CTCs могут присутствовать в одном 7,5 мл крови обратить. 6 . здесь мы представляем методологии, необходимые для выполнения одноклеточного белка измерений с помощью уменьшения объема на основе антител пробирного найма на капельки нефти максимум напечатаны на антитело microarray.
Microfluidic капелька платформы являются высокая пропускная способность, способны генерировать тысячи капель в секунду и способных изолировать и даже культивирования, единичных клеток в отдельные капельки для выполнения широкого спектра биохимических анализов. Методы, основанные на капельки хорошо подходят для анализа одной ячейки,7,8,9 с примечательных недавних примеров, включая DropSeq10 и inDrop11, которые значительно способствовало власть усиление методов. Ограниченное количество материала и не методы усиления белки сделать одну ячейку протеомики особенно сложным.
Капельки могут быть проанализированы ряд методов и широко используется микроскопии флуоресцирования. Одной молекулы методы, такие как полное внутреннее отражение микроскопии флуоресцирования (TIRF) позволяет флуоресцентных молекул, чтобы быть визуализированы с непревзойденной соотношение сигнал шум. 12 вследствие экспоненциального распада затухающих поля, только флуорофоров в высокой близости к поверхности (порядок 100нм) рады сделать TIRF хорошая стратегия для обнаружения небольших количеств молекулой цели в сложной смеси. Присущие оптических секущей сила TIRF также помогает избегать шагов, мыть и ограничения анализа времени и сложности. Однако TIRF требует плоских поверхностей и примеры TIRF микроскопии, применяется к капельки в потоке включают формирование плоской поверхности которого изображение. 13 с этой целью одну ячейку proteomic методы часто дизайн microfluidic фишки вокруг поверхности прикол захвата агентов в формате microarray. 4 , 14
Капельки, сами, могут быть сформированы в массивах на плоских поверхностях, так называемые капельки microarrays. 15 , 16 , 17 пространственно организовать капельки в массивы позволяет им удобно индексируются, легко контролироваться с течением времени, индивидуально рассмотрены и, если требуется извлечь. Капелька microarrays можно добиться высокой плотности микро-реакторов с тысячами элементов на чип, которые свободно стоящих или поддержанный микрорезервуар структур. 18 , 19 , 20 , они могут быть сформированы осаждением последовательных жидкой обработке роботов, струйный корректировщиков, свяжитесь с microarrayers21,,2223,24,25, 26 , или они могут самостоятельно собрать на таких поверхностях как superhydrophillic пятна узором на superhydrophobic поверхности. 27 , 28 , 29
С учетом этих соображений адресуемых капелька Microarrays (ЗРК) были призваны объединить универсальность, пространственные возможности адресации и сокращение объемов капелька microarrays с чувствительность микроскопии TIRF одной молекулы в количественном мера белка изобилия. 5 ADMs включить анализ одной ячейки, образуя microarray капли, содержащие отдельные ячейки над microarray антитела, которые затем покрытые маслом для предотвращения испарения. Объем капли дискретные для предотвращения потери образца, которая в противном случае может быть достигнуто путем на чипе запорной арматуры в непрерывный поток микрофлюидика. 30 абсолютное количество целевого белка из одной клетки крайне мала; Однако сокращение объема капель позволяет относительно высокой концентрацией местных с тем, чтобы они обнаруживаются с помощью анализа антител сэндвич - антитела иммобилизованных в собственный регион, или пятно, на поверхности, которая захватывает белка, который в свою очередь связывается для дневно помечены обнаружения антител в объем капли. Как лейбл свободный подход (то есть белок, цели не обязательно должны наноситься непосредственно), ЗРК обычно применяется для анализа клеток из первичных источников, таких, как обработанные крови, отлично нужно пунктаты и биопсий диссоциированных опухоли, а также клетки от культуры и их лизатов.
Измерение различий в изобилии белка по всей популяции клеток имеет важное значение при определении гетерогенность в ответ, например, наркотиков и поможет в предоставлении проницательность в клеточных функций и тропинки, оценки субпопуляций и их поведение, а также выявления редких событий, которые бы в противном случае быть замаскированы методы массового. Этот протокол описывает, как производить и использовать адресный капелька microarrays количественно определить обилие p53 фактор транскрипции в человеческих раковых клеток и могут быть использованы для изучения роли p53 в ответ химиотерапевтических препаратов. Целевого белка определяется выбором захвата и обнаружения антител и может быть изменен для включения более или различные цели. Инструкции для создания простой аппарат, включающий концентрических сопло из общего Лаборатории расходные материалы для вручную массив 10 капель nL, покрытые маслом. Полный экспериментальный процесс описан в соответствии с которым каждая капелька затем загружается с одну ячейку, которая затем лизированы и выражения протеина, определяется с одной молекулы резолюции, с помощью микроскопии TIRF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка
-
Фишки и microarrays антитела печати
- Придаем самоклеющиеся силиконовые/акриловый изолятор coverslip функционализированных поддержать антитело microarray. Это называется чип.
Примечание: Различные поверхности химия были протестированы на предмет их пригодности с адресно капельки. 5 поверхности химия может должны быть оптимизированы для альтернативных захвата агентов. ADM изоляторы коммерчески доступны или могут быть произведены Лазерная резка акрила (CAD файла для изоляторов, используемые в этой работе предоставляется для скачивания; Дополнительный файл кода). - Перейдите на microarrayer и установить влажность 75%.
Примечание: относительная влажность уменьшает испарение решение печати от microarray pin и уменьшает внутри и между spot различия. - Очистите microarray контактный штырь, моющий раствор на 5 мин, ultrasonication. Промойте ПИН с ультра-чистой водой с использованием вымойте бутылку и высушите азота.
Примечание: Приостановите pin как только погрузиться кончик PIN-код. Микроскопа с надлежащим образом просверленные набором отверстий поможет, если владелец PIN-код не может быть получен. - Сделайте 5 мл буфера печати, состоящий из 3 × солевой раствор натрия цитрата (SSC) буфера, Бетаин 1,5 М, с 0,01% лаурилсульфат натрия (SDS). Хранить при 4 ° C на неопределенный срок.
- Чтобы подготовить решение печати, оттепель антитела анти p53 (p53/Mdm2 ELISA комплекта; см. таблицу материалы) аликвоты, хранятся при температуре-80 ° C. Смешайте 1:1 с буфера печати до конечной концентрации 0.5 мг/мл. Загрузка 5-10 мкл раствора печати в 384 хорошо пластину, используя микропипеткой и место в microarrayer.
- Загрузить фишки, смонтирован на шаге 1.1.1 в microarrayer. Программа microarrayer для печати пятна в точке с координатами определяется в центре каждой скважины изолятора.
Примечание: Microarrayers используют широкий спектр, преимущественно, проприетарное программное обеспечение и поэтому читателю рекомендуется обратиться к соответствующей литературе. Необходимые для ADM изолятор, Рекомендуемые в сопутствующем файле CAD на шаге 1.1.1 microarray состоит из прямоугольных элементов; предусмотрены соответствующие расстояния. - Хранить фишки в герметичных контейнерах и оберните фольгой. Хранить при 4 ° C до 6 недель.
Примечание: Фольга-чтобы не повредить фото. Хранение при температуре 4 ° C ограничивает скорость деградации биомолекул и любых пагубных реакций, которые могут действовать, чтобы уменьшить активность microarray. Герметичном контейнере позволяет фишек, чтобы сбалансировать к комнатной температуре перед использованием без конденсации, образуя на поверхности чипа. Печать контакт microarray эксплуатирует поверхностное натяжение и адгезии между решением печати и печати подложки для производства пятна. Перед печатью или промокательной обычно требуется, чтобы удалить излишки раствора из microarray pin приносить равномерно размера пятна. Не выбрасывайте жертвенных допечатной coverslip, поскольку она может быть использована для оценки качества партии.
- Придаем самоклеющиеся силиконовые/акриловый изолятор coverslip функционализированных поддержать антитело microarray. Это называется чип.
-
Подготовьте шприцы, трубопроводы и концентрические сопло для дозирования адресно капельки
- Разберите 100 мкл (для водной капли) и 1 мл (для укупорки масла) стекла шприцы Гамильтон и промойте детали с дистиллированной H2O.
- Канал 100 мм длиной 150 мкм ID/360 мкм ОД сплавили кремния трубопровод через 40 мм длина 1,0 мм ID/1/16 "OD PFA труб до тех пор, пока она выступала на 2 мм. Это будет формируют концентрические сопла.
- Нанесите тонкий слой Цианакрилатный клей в конце кончика пипетки 10 мкл и вставьте в 40 мм кусок 1,0 мм ID/1/16 "OD PFA труб. Если требуется, переместите кварцевое труб для поддержания 2 мм выступ на насадку перед клей наборы.
- Вставьте другой конец кварцевое капилляров в конце длиной 200 мм 0.014" ID/0,062" OD трубопровод PTFE и подключить это к 100 мкл, Гамильтон шприц заполнены с 4% бычьим сывороточным белком (BSA) в фосфат амортизированное saline (PBS) (PBSA).
Примечание: Белков и других биохимических видов могут неспецифически привязку к поверхности и могут быть потеряны или денатурированный. BSA используется для «блок» поверхностей к минимуму неспецифической привязки жертвенно привязки для этих поверхностей. - 400 мм длина 1,0 мм ID/2.0 мм OD FEP труб можно Вставьте наконечник пипетки 200 мкл до тех пор, пока она образует уплотнение. Нанесите тонкий слой Цианакрилатный клей к другой 200 мкл наконечник пипетки и вставьте это в первый отзыв, чтобы исправить трубы в месте. Подключите открытый конец трубы OD FEP 1,0 мм ID/2.0 мм к 1 мл шприц Гамильтон заполнены с минеральным маслом.
- Вставьте 200 мкл пипеткой Совет Ассамблеи в кончик пипетки 10 мкл концентрические сопла. Место шприцы в отдельном шприц насосов, как им нужно будет эксплуатироваться независимо.
- Заполните шприц 100 мкл с 4% PBSA блокирования решения. Прикрепить и флеш «водный» трубки блокировки раствором. Повторите дважды для в общей сложности 3 флеши.
- Заполните шприц 100 мкл с 0,125 мкг мл-1 обнаружение антител (анти p53 антитела (ДУ-1) помечены с Alexa 488) 4% PBSA и заново подключите труб. Заменить блокирования решения в трубку подачи 25 мкл обнаружения раствор антител.
- Промойте трубы «нефть» с минеральным маслом, до тех пор, пока все трубы и насадки заполняет с маслом. Пополнить 1 мл шприц с минеральным маслом и заново подключите труб. Трубки и насадки в сборе крепится к XYZ манипулятора.
-
Подготовка microinjector и микроманипулятор
Примечание: Следующие шаги сделать конкретную ссылку на компоненты microinjector и микроманипулятор аппарата, указанные в таблице материалов, но в целом применимы к любой такой аппарат.- Соберите microinjector, крепления труб давление и капиллярной держателя.
- Медленно поверните ручку поршень пока минеральное масло полностью заполняет линии.
- Смонтируйте держателя капилляров в головы горе перевода.
- Исправьте капилляра в держателе капилляра с главой сцепление.
- Пипетка раствор 4% PBSA в одной из скважин изолятора.
- Перевести с помощью микроманипулятор и погрузите кончик капилляра в решение.
- Медленно заполните капилляра с 4% PBSA и оставить для блокирования на 10 мин.
- Извлеките микрокапиллярной и поворотный модуль перевода, так что Ассамблея ясно чипа.
2. форма адресации капельки и нагрузки с одной клетки
- Адресно капельки виде
- Закрепите чип на микроскопа.
Примечание: Микроскоп является Перевернутый флуоресценции, оснащен автоматизированной Микроскоп способен одной молекулы TIRF закодированные Ху этап и умножения зарядовой камеры (ЭМ-CCD) электрона. - Запишите координаты Этап микроскопа каждого места в массиве с помощью программного обеспечения управления автоматизированных микроскопа.
- Установка манипулятора XYZ на микроскопа. Поместите насадку под углом 50-60°. Убедитесь, что сопло имеет достаточную длину и распродажа достичь чипа. Установить «водный» и «нефть» шприцевые насосы обойтись 10 nL в 100 мкл/мин и 5 мкл, 100 мкл/мин, соответственно.
Примечание: Во время подготовки может сухой водный раствор на голову сопла. - Отказаться от водный раствор, пока шарик жидкости виден на голову сопла. Промокните салфеткой пыль бесплатно для его удаления.
Примечание: В зависимости от условий в рамках расследования, зарезервировать ряд скважин в качестве резервуаров для клеток. Для одной ячейки строки/типа будет достаточно одного водохранилища. - С помощью программного обеспечения управления автоматизированных микроскопа, задайте координаты Этап микроскопа антитела место в массив и сосредоточиться на поверхности coverslip.
- Осторожны, чтобы не нарушить месте, с помощью манипулятора XYZ, совместите кончик стекла капиллярного концентрические сопла в сторону антител пятна и обойтись 10 nL водный раствор. Без перехода на этапах, лунки 5 мкл нефти колпачок водный раствор. Медленно поднять насадку подальше от капли и перейти к следующему хорошо.
- Повторите шаг 2.1.6 для всех пятна антитела в массиве.
- После 30 минут изображение все места в массиве с помощью программного обеспечения управления автоматизированных микроскопом для определения фона одной молекулы, обязан каждое антитело пятно перед загрузкой клетки.
- Закрепите чип на микроскопа.
- Загрузить адресуемый капельки с ячейками
- Удаление колбы культуры клеток из инкубатора и отсоединение клетки, используя раствор трипсина/ЭДТА.
Примечание: В этом исследовании, линия клетки карциномы BE человека Толстой был использован и культивировали, используя Дульбекко изменение орлы среднего (DMEM) с 10% (v/v) плода бычьим сывороточным (ФБС) в инкубатор CO2 . - При необходимости, дневно запятнать клетки.
- Ресуспензируйте клетки в растворе 0,125 мкг/мл обнаружения антител (анти p53 антитела (ДУ-1) помечены с Alexa 488) в 10% FBS в L-15 массовой информации. Чтобы обеспечить одну ячейку подвеска, фильтр ячейки решения через стрейнер ячейку поле 40 мкм.
- Подсчитать ячейки с помощью Горяева и разбавлять или концентрации клеток решение к концентрации 25-400 × 103 клеток/мл. Это гарантирует, что клетки отложений с достаточным промежутком комфортно управлять микрокапиллярной.
- Загрузите отдельные ячейки в адресный капельки от водохранилища ячейки, используя микроманипулятор и микрокапиллярной.
Примечание: Non Сторонник клетки могут быть загружены навалом в микропипеткой и обойтись один за другим в адресуемой капельки. Несмотря на блокирование обработки поверхности адэрентных клеток линии будут склонны неспецифически придерживаться стекла микрокапиллярной внутренней стены и быть потеряны. - Используя объектив 10 × наблюдать, используйте microinjector для аспирационная одну ячейку в микрокапиллярной из клеток водохранилища.
- Хранить координаты стадии микроманипулятор, если с помощью электронных манипулятор стадии или вручную отметить положение по оси z.
- Убрать микропипеткой, переведя его вверх, чтобы снять 1 мм высота чипа. Выполните это вручную с помощью джойстика или автоматически с помощью функции «Извлечь» электронных манипулятор этапа.
- Набор, который стадии координирует на что из адресных капелька с помощью автоматизированных Микроскоп программное обеспечение управления. «Вставить» микропипеткой, возвращая его позиции z хранимой (или отметил). Выполнять это вручную с помощью джойстика или автоматически при использовании электронных манипулятор стадии.
Примечание: Микрокапиллярной проколоть укупорки масла и находиться в водной части адресно капли. - Обойтись в ячейку в адресуемой капелька, используя microinjector. Объем адресуемой капельку 10 nL возрастет менее чем на 1%.
- Повторите 2.2.5-2.2.9 для оставшихся адресно капельки, оставляя некоторые свободные для экспериментальной управления где адресно капельки не содержат ячейки.
Примечание: Более простой альтернативой загрузки одной клетки в адресный капельки, с помощью микрокапиллярной и микроманипулятор состоит в замене решения шаге 1.2.8 решения обнаружения антител в 4% PBSA содержащих клеток в концентрации порядка 10 5 клеток/мл, что эквивалентно 1 клеток/10 nL. Размещение одной ячейки будет реализуется и концентрации клеток будет необходимо оптимизировать.
- Удаление колбы культуры клеток из инкубатора и отсоединение клетки, используя раствор трипсина/ЭДТА.
- Лизировать клетки и массива изображения
- Изображение клетки в капельки, с помощью brightfield микроскопии, включая любые изображения флуоресценции.
Примечание: Изображения занимает примерно 3 мин для изображения ~ 100 капель с помощью автоматизированных микроскопа. Выполнение визуализации с 60 NA = 1,49 нефти погружение цели. Фильтры не требуются для brightfield изображений, тогда как для флуоресценции изображений используются наборы стандартных фильтров. - Изображение все места в массиве с помощью одной молекулы TIRF микроскопии.
Примечание: Параметры используются как в шаге 2.3.1 с специализированными TIRF фильтрации набора. Эти изображения будут впоследствии проанализированы в разделе 3 для определения фона одной молекулы, обязан каждое пятно антитела до lysis. Одной молекулы изображений, с помощью микроскопии флуоресцирования (TIRF) полное внутреннее отражение занимает около 5 минут для изображения ~ 100 мест. - Фокус на ячейку в адресуемой капли. Достичь полной оптических лизиса, сосредоточив внимание на один 6 ns лазерного импульса (длина волны 1064 нм, импульсов энергии 14.1 ± 0,3 µJ в импульсе) недалеко от расположение ячейки.
Примечание: Лазерного импульса устанавливает расширение пузырь кавитации, ножницы ячейку и освобождает клеточных компонентов в объем капли. 4 , 31 механических процессов за счет лазерно индуцированным лизис не беспокоить нефть вода интерфейс в низкой импульсов энергии. Оптических лизис обычно занимает около 20-30 мин до лизируют 100 клеток. Как обсуждалось в разделе обсуждения, существует ряд альтернативных методов для лизируют отдельные клетки, если оптические лизис установки невозможно. - Повторите для всех клеток содержащих адресно капельки, оставив 5 бесплатно для экспериментальной управления где адресно капель содержат ООН лизированных ячейки.
- Обратите внимание на время, в котором каждой клетки лизированы.
Примечание: Эти времена будет использоваться для исправления кривых отдельные привязки для каждого пятна на шаге 3.1.9. Часто бывает достаточно отметить времена, когда первой и последней ячеек анализироваться и оценить себя адекватно согласуется время между событиями лизис остальные. - Приобретение одной молекулы изображения, с помощью микроскопии TIRF всех пятен каждые 10 мин для первые 30 мин затем каждые 20 мин еще 60 мин. Если только заинтересованные размере белка связаны в равновесии, изображение все пятна после инкубации чип для 90 минут при комнатной температуре.
Примечание: Время, чтобы достичь равновесия будет зависеть объем капли и сродства антитела, которые используются в assay. TIRF микроскопии осуществляется с помощью лазерного источника возбуждения = 488 нм и 1,5 МВт мощности измеренные на спине диафрагмы, используя Измеритель оптической мощности. Одной молекулы изображения приобретаются, установив параметры приобретения на EM-CCD камеры на время приобретения 900 МС, оцифровка 16-разрядной скоростью считывания 1 МГц и EM получить коэффициент 10. Изолятор может использоваться повторно, тщательно удалив coverslip.
- Изображение клетки в капельки, с помощью brightfield микроскопии, включая любые изображения флуоресценции.
3. анализ данных
-
Одной молекулы подсчета (не перегружена/цифровой режим)
- С помощью Фиджи (или Matlab), для любого не перегружена антител пятна Загрузите изображения, приобретенные до лизис (фон, БКД).
Примечание: В следующих шагах прямолинейно операции с помощью программного обеспечения для анализа изображений Фиджи. Руководство пользователя можно найти по следующей ссылке https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html. - В Фиджи выберите изображение БКД. В разделе меню «Изображение» выберите «Дублировать» для повторяющихся БКД. Выберите дубликат изображения и в разделе «Процесс > фильтры», выберите «Гауссово размывание» и укажите радиусом 50 пикселей.
- Сгладить изображение BKD так что есть распределение эффективной единой интенсивность источника света возбуждения, разделив на BKD изображение размытое изображение BKD, производство BKD_FLAT.
- Под «Процесса» выберите «изображение калькулятор...», указав операции «Пропасть», изображения требуется и флажки «Создать новое окно» и «32-разрядный (float) результат.»
- Вычесть каждый пиксел в изображении на 1 («процесс > математика», выберите «Вычесть...» и укажите значение 1). Интенсивность средняя пикселей должно быть 0.
Примечание: Поле уплощение и уплощенная фоновых изображений может легко проверить, поскольку сумма всех пикселей должно быть 0 и любые оставшиеся смещение может компенсироваться более прямолинейно для. - Выберите область пикселов × 50 50 пикселей в любой из 4 углов изображения BKD_FLAT. Измерьте интенсивность пикселя стандартное отклонение (σ), выбрав «Анализировать» и «Измерения».
Примечание: Сводные статистические данные выделения будет представлен в окне результатов. Это определяет фон место где есть вряд ли может быть высокой плотности одного молекул. Области, чтобы быть измерены могут быть выбраны вручную, с помощью инструментов выделения меню по умолчанию или путем запуска макроса код «makeRectangle (x, y, ширина, высота)»; Это создает прямоугольное выделение, где x и y аргументы являются координатами верхнего левого угла (в пикселях). - Установите порог изображения 3σ и создайте двоичный образ SM_MASK.
- Под «Изображение > Настройка» выберите «порог» и установите нижнего порогового уровня 3σ.
Примечание: Пикселы, значение которых находятся ниже порога равным нулю и пикселей, превышающих пороговые значения устанавливаются в 1. Порог будет определять доверие, с которым показатели пикселей принадлежат к одной молекулы.
- Под «Изображение > Настройка» выберите «порог» и установите нижнего порогового уровня 3σ.
- В изображении сегментированный SM_MASK, значения интенсивности набор пикселей к нулю любые объекты, которые не имеют размер 4-9 пикселей2 и округлости 0,5 - 1, выбрав «Анализировать» следуют «Анализ частиц» и указав размер и округлость.
Примечание: Размер пикселя может потребоваться быть оптимизированы для других флуорофоров и Микроскоп набора ИБП. Из-за типа шума камеры одного пикселей может быть выше этого порога и не должен отбрасываться несмотря на не одной молекулы. Критерий размер пикселя будет правильно отменить такие пикселов. Одной молекулы, как правило круглую форму. Цикличность значение 1 указывает идеальный круг, а приближается к 0 значение все более продолговатой формы. Оставшиеся объекты являются одной молекулы и может быть отнесен. Маски могут быть установлены для демаркации области место дискриминацию на месте и - пятно рассчитывает на кадр. Это проще для кадров, полученные в более поздние времена когда есть достаточно сигнал на месте, которые затем могут быть применены к ранее кадры. - На том же месте не перегружена антитела нагрузки и повторите шаги 3.1.1 - 3.1.7 для всех кадров изображения захвачен как раз решить серии приобрела пост lysis. Используйте лизис раз отмечается в шаге 2.3.5. чтобы исправить любые привязки кривых.
- С помощью Фиджи (или Matlab), для любого не перегружена антител пятна Загрузите изображения, приобретенные до лизис (фон, БКД).
-
Одной молекулы подсчета (перегруженных/аналоговый режим)
- Для расчета средней интенсивности одной молекулы, прежде чем продолжить, повторите шаги 3.1.1 - 3.1.8.
- Умножьте изображений BKD_FLAT и SM_MASK производить изображение, whereby значения пикселов нуля связаны с одной молекулы.
- Для выполнения этого, под меню «Процесс», выберите «Изображение калькулятор...», укажите операцию «Умножение» и необходимые изображения и выберите коробки «Создать новое окно» и «32-разрядный (float) результат.»
- Сумма всех значений интенсивности пикселей, выбрав «Анализировать» и затем «Мера»; Сводная статистика отбора будет представлен в окне результатов. Разделите на количество подсчитанных одной молекулы согласно шаг 3.1.8 для вычисления средней интенсивности в одну молекулу.
- Для любых загруженных антитела пятно загрузить изображение приобрел после лизиса и придавить с размытым фоном изображения согласно шаги 3.1.2 и 3.1.3.
- Вычесть каждый пиксель в сведенное изображение 1 («процесс > математика», выберите «Вычесть...» и укажите значение 1)
- Выберите область пикселов × 50 50 пикселей в любой из 4 углов изображения и измерить интенсивности пикселей стандартное отклонение (σ). Смотрите Шаг 3.1.5 для деталей.
- Создайте двоичный образ маски, установив порог изображения 3σ и установите значения интенсивности пикселей равным нулю любых объектов с размером менее 4 пикселя2. Чтобы выполнить это, под меню «Анализ», выберите «Анализировать частиц» и укажите размер и округлость.
- Умножьте "СПОТ имаж" плоский перегруженных антитела двоичное изображение-маску.
- Для выполнения этого, под меню «Процесс», выберите «Изображение калькулятор...», укажите операцию «Умножение» и необходимые изображения и выберите коробки «Создать новое окно» и «32-разрядный (float) результат.»
- Сумма оставшихся интенсивности пикселей, выбрав «Анализировать» следуют «Мера»; Сводная статистика отбора будет представлен в окне результатов.
- Разделите сумму пиксель света, интенсивность средняя одной молекулы для вычисления числа молекул одного обязан перегруженных пятно.
-
Калибровочная кривая для количественного определения абсолютной
- Повторите разделы 1 и 2 к форме 10 nL адресно капельки с обнаружения антител в 4% раствор PBSA с известной концентрации рекомбинантных белков шипами.
- Выполнить серию концентрации 102- 107 рекомбинантных белков в капли, меняя известной концентрации рекомбинантных белков, добавлены в решение. Рекомендуется для работы с точки зрения количества белков на капли, чтобы сделать простой калибровки одну ячейку данных.
- Используйте серии концентрацию данных на шаге 3.3.2 для калибровки любой одной молекулы рассчитывает на месте к изобилию белка на капли и расширение белка изобилия в одну ячейку.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Номер копии абсолютной базальной белка p53 был определен с резолюцией одну ячейку в человека толстой кишки рак клеток линии, BE клетки. Мы демонстрируем, как выражение p53 может различаться на несколько порядков и показать слабо положительная корреляция между размер и белка копии номер ячейки в пределах покоя популяции клеток BE.
Адресный капелька Microarrays образуются, когда водные капельки обойтись в месте расположения антитела и ограничен с маслом. Здесь капли поддерживают assay протеина чувствительных p53. Coverslips выстроились с захвата антитела пятна с помощью контактной microarrayer и ПИН-код. Захват антитела анти p53 берется из коммерческих комплект тест ELISA. Печати условия были таковы, что захват пятна были около 100 мкм в диаметре с максимальный захват мощностью 6,2 ± 0,5 x 105 белков на месте. 32
Использование изолятор, приклеенная к coverslip позволяет повысить плотность капель формироваться, поскольку он ограничивает распространение нефти в близлежащем антитела захвата пятна. В каждом хорошо изолятора капельки образуются путем отказа водный раствор, который затем покрытые маслом для предотвращения испарения (рис. 1A). Минимальное количество нефти может обойтись колпачок капли; Однако полезно распределить сумму который заполняет каждый изолятор Ну точно что нефти поверхность является плоской для воображения. Изоляторы либо коммерчески источников или сделанные лазерной резки акриловые листы. Силиконовые изоляторы находятся доступные нарезанные скважин в массиве 4 x 6 (n = 24), но могут быть изменены в массив 4 x 11 (n = 44) с использованием удар кожа биопсии или несколькими отверстиями. Лазерной резки изолятор на рисунке 1B показывает массив 100 гексагональной скважин с максимальным диаметром 2.89 мм, центр центр разделения 3,9 мм и высотой 0,5 мм. Капельки могут храниться и остаются стабильными в течение длительных периодов времени (до 3 месяцев).
Капельки создаются вручную с помощью дом построен аппарат, который преобразует концентрические трубы насадку (рис. 1 c), который подключен к два шприца насоса (рис. 1A). Концентрические трубы сопло состоит из капилляров, плавленый кварц, который распределяет водной фазе, кормили через короткая длина труб PEEK, который распределяет масляной фазы. С помощью микроскопа, сопло выравнивается по пятно антитела и насосы сначала будет обходиться водный раствор, сразу же после нефти (Рисунок 1E, шаги 1-4). После того, как образуются все капельки в ADM, microinjector и микроманипулятор (см. таблицу материалы) используются для загрузки каждой капли с одной ячейкой (рис. 1 d). Микропипеткой бы захватить ячейку из водохранилища клеток, в одной из скважин на чипе, переведено на капельки хорошо и затем проникнуть нефти колпачок для доставки в ячейку в водные капельки (рис. 1 d, шаги 5-8).
Все пятна в пределах капли отражаются до лизис и будет использоваться для определения степени неспецифической привязки (рисунок 2A) пятен. Отдельные клетки полностью лизированы (включая ядро) с помощью оптических методов. 31 оптических лизис опирается на усилие сдвига расширяющейся лазерного импульса индуцированной кавитации пузырь сорвать клетки. Уход должны быть сделаны, что нефть вода интерфейс не беспокоили этих процессов, ограничивая энергии импульса и сдаче клетки от интерфейса масло/вода. После того, как клетки лизированы, массив образы, TIRF микроскопии с помощью автоматизированных микроскопа; Фоторамки приобретаются каждые 10 мин за 30 мин и затем каждые 20 минут для дальнейшего 60 мин. Условия, такие как сродства антитела, белок диффузии и объем капли, таковы, что привязка равновесие достигается в рамках приобретения 90 мин. Типичный одной ячейке выпадающего показано на рисунке 2А.
Процесс анализа изображений для определения одной молекулы подсчитывает схематически изображен на рисунке 2B. Образы пятен, либо считаются не перегружена, где концентрация целевого белка такова, что хорошо отделены и легко отличить или перегруженным, где концентрация целевого белка находится выше и одной молекулы изображения одной молекулы перекрытие и являются больше не индивидуально различимы. Поскольку профиль TIRF возбуждения является неравномерным, важно, что все приобретенные изображения быть плоским полем исправлены. Гауссу применяется к рамке не перегружена, который действует как сглаживающий фильтр для удаления деталей и шум и производить изображение с средний профиль TIRF возбуждения профиля. Это обработанное изображение может использоваться для выравнивания» исходное изображение. Для изображений, не перегружена, где, даже в равновесии, есть несколько одной молекулы, кадр может быть обработана исправить себя. Этот подход применяется не к перегруженных место, где одной молекулы плотно занимают место и требует фоновое изображение, чтобы быть приобретены для рихтовки. Плоские рамы, то показатели для пикселей с интенсивностью по крайней мере 3 раза стандартное отклонение фон плюс ее среднее значение. Одной молекулы автоматически обнаруживаются путем выявления 4-9 кластерных пикселей округлость больше 0.5, используя возможности анализа частиц из Фиджи. От результатов может рассчитываться средняя интенсивность одной молекулы. Он используется для определения числа одной молекулы в перегруженных месте путем деления пятно общая интенсивность антитела, известных средней интенсивности одной молекулы. Эти шаги могут быть автоматизированы с помощью редактора сценариев Фиджи.
Концентрация серии выполняется для определения одной молекулы в равновесие в капельках с известной концентрации белка р53 рекомбинантных (рис. 3A). Условия таковы, что пятна антитела захвата захватить часть общего целевого белка, примерно 1% в регионе линейность (для 10 белков8 5-10 за капли R2 = 0,99). Уровень неспецифической привязки в капельки-187 ± 60 молекул. Результаты pulldowns одну ячейку затем может быть преобразован для достижения дистрибутивов абсолютным белка копия числа в ячейке. Рисунок 3B показывает распределение экспрессии белка р53 абсолютной в одиночных клетках BE с помощью ADMs. Выражение протеина p53 в BE клеток, которые могут быть восприняты генетически идентичных или схожих, стохастический процесс. Распределение гамма как - асимметричные и регулирующих с длинным хвостом. Следовательно среднее (1.82 × 106 белков) можно переоценить модальных белка изобилия (bin 0 - 5.0 белки5 × 10), и стандартное отклонение (1.88 × 106 белков) не полностью отражает особенности распределения. Это распределение является примером важности измерения одной ячейки для захвата неоднородность экспрессии белков в популяции клеток, которые в противном случае будут потеряны при среднем с массовых измерений. Дополнительные параметры для каждой ячейки могут быть измерены. Здесь клетки объем оценивается путем измерения каждой ячейки диаметром до лизиса в капли и предполагая, что ячейка находится приблизительно сферически. Рисунок 3 c показывает сравнение числа копии p53 абсолютным белка в одиночных клетках BE как функция размера ячейки. Существует тенденция для более крупных клеток имеют более высокий номер копии всего p53. Интересно, что это возможно из распределения, что существует координация между экспрессия р53 и размер ячейки, поскольку там, как представляется, ряд копии минимальный p53 в клетке; Однако механизмы, посредством которых это возникает требует дальнейшего расследования.
Рисунок 1: адресный капелька Microarray аппарат и чип. () капельки обойтись вручную с помощью манипулятора 3-оси перевести концентрические трубы сопла. Водные капельки разливают в конкретных местах в microarray антитела, следуют укупорки масла. (b) изолятор обеспечивает более высокую плотность адресно капель на подложке путем ограничения распространения нефти. Изоляторы может производиться путем лазерной резки 0,5 мм акриловые листы. Для оказания помощи в визуализации капелек, синий краситель краска наносится с помощью аппарата в). Масштаб бар 10 мм., Врезные шкалы бар 1 мм. (c) концентрические трубы сопла позволяет адресно капельки формироваться, собранные как шаг 1.2 протокола. (d microinjector и микроманипулятор используются для изоляции клеток в отдельных адресных капельки, подготовленных как в шаге 1.3 протокола. (e) показано основные шаги в процессе создания и загрузки адресно капельки. Пятно антитела расположен, с помощью закодированных перевод этапе (1) где выравнивается кончик капиллярной трубки (2) и обойтись водный (3) затем масло (4) компоненты. Отдельные ячейки могут быть загружены с использованием стекла микрокапиллярной (5-8), который можно многократно решать водные капельки (7) и депозитные ячейки (8). Масштаб 100 мкм баров. Красная стрелка (5) и (8) подчеркивает изолированных одну ячейку и врезные (8) показывает изолированы одна ячейка с высоким увеличением (шкалы и 10 мкм). Части эта цифра была изменена ссылка12, воспроизводится с разрешения Королевского общества химии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: изображение шаги анализа. Каждое пятно в массиве периодически образы при микроскопии TIRF до достижения равновесия (тEq) (90 мин для p53 assay). Уравновешение время зависит от t в решения, а также сродства антител пары для целевых белков. ) пример одной молекулы TIRF микроскопии изображений фона, а также пример одной ячейке выпадающего (шкала баров 20 мкм). Врезные изображение показывает увеличенная часть фонового изображения с некоторыми одной молекулы, отмеченные красными стрелками (шкалы 5 мкм). b) структура анализа изображений, подробно описанные в шаге 3 протокола. Вкратце существует два широких режимов, где пятна могут считаться не перегружена, одной молекулы разреженных и перегруженных, где плотность одной молекулы такова, что существует значительное дублирование и уже не может быть отдельно идентифицированы. Важным шагом в области анализа изображения является поле уплощение удалить эффект неравномерного интенсивность профиля лазерного возбуждения. В цифровой режим подсчета одной молекулы определяются непосредственно, на основе их формы и интенсивности параметров. В аналог подсчет режим количество одной молекулы рассчитывается путем измерения всего пятно интенсивности равновесия и деления средней интенсивности одной молекулы, который известен из режима цифровой подсчета. Шаги могут быть автоматизированы прямолинейно в ImageJ для анализа данных. Нижней панели последовательность изображений показывает совокупность целевого белка на захват антитела пятно; Первоначально, пятна, не перегружена (т1), тогда как как целевых белков накапливается на месте антитела, одной молекулы могут становиться все более перегруженных (tn) до достижения равновесия (тeq). Обратите внимание, что пятно остается, не перегружена ли становится перегруженным зависит от целого ряда факторов, в частности обилие целевого белка в объеме анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: одна ячейка данных. Абсолютная количественной достигается с помощью калибровочной кривой. () одной молекулы графов с помощью известных концентрациях рекомбинантных белков. Это калибровочной кривой и используется для преобразования одной молекулы, рассчитывали на каждом месте количество белков-мишеней в объеме анализ и следовательно Одноместный номер копия клетки. Горизонтальные красная пунктирная линия показывает уровень неспецифической привязки 187 ± 60 молекул. Планки погрешностей, что одно стандартное отклонение среднего 3 экспериментальных работает. Пунктирная линия представляет 100% обнаружение белка. (b) распределение базальной p53 одноклеточных белков в раковых клетках BE показывается длиннохвостый распределения гамма как где выражение протеина p53 в некоторых ячейках значительно выше, чем значение modal. (c) разброс участок p53 белка копировать количество на ячейку как функция объем ячейки, показаны как выражение протеина варьируется в зависимости от размера ячейки. Части этой фигуры были изменены от 12 и воспроизводится с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Адресный капелька Microarrays являются чувствительными и расширяемый метод количественного определения абсолютной копией количество белка в одной ячейке.
Ограничение уровня неспецифической привязки (NSB) имеет решающее значение в рамках протокола для достижения как низкий предел обнаружения как можно скорее. Белков и других биохимических видов могут неспецифически связывать количество интерфейсов в капли — поверхности coverslip, пятно антитела и масло/вода интерфейс. Белки могут быть потеряны путем разбиения на интерфейсе или нефти, сам. Мы показали, что 4% BSA в водные капельки способен ограничения NSB белков с использованием антител, указанных в протоколе. Альтернативные белковых мишеней и антитела, которые используются для их обнаружения может потребовать блокировки альтернативные подходы, такие неионных моющие средства или совместимость ПАВ. Фторированные масла могут также проверяться на предмет их пригодности в качестве укупорки масла. В таких случаях необходимо предпринять дополнительные соображения, как концентрация мицеллообразования критических и плотность укупорки масла.
Немытые печати буфер, который остается в каждом месте месте после одевающ СПИДа в выравнивание. Первоначально, вкладывая капельки, ухода должны быть приняты чтобы не поцарапать или повредить пятно антитела кончик насадки концентрические трубы. В разработке метода далее, Флюоресцентная краска может допированном в буфер печати антитела, который становится иммобилизованных помимо захвата антитела. Это дало бы возможность для мытья и преграждать шаги выполнены до капли одевающ; Однако такой шаг не будет обязательно требуется при использовании автоматизированных методов капелька, одевающ, например методов печати струйных.
С гидрофильного полимера и водные капельки покрытием поверхности коммерчески источников coverslips, на которых образуются капельки производится на них с объемом 10 nL имеют диаметр 751 ± 42 мм. Существует ограничение на сколько депозита капли следует мокрой поверхности или распространяется из-за веса укупорки масла, так как ниже минимальной толщины есть увеличение оптического рассеяния от лазерного возбуждения TIRF. Разброс увеличивает средний уровень фона и может заглушить сигнал при обнаружении одной молекулы. Пятно антитела также должен быть расположен подальше от края капелька с момента возбуждения лазерного света может частично или полностью удар в область за пределами водной капли. Критический угол будет больше не условие для света, яркие интерфейс стекла масло вместо стекла вода интерфейс.
Чтобы количественно определить обилие белка количество одной молекулы, привязан к пятно должны быть определены путем анализа изображений. Чтобы определить общее количество белка в растворе из одной молекулы граф Калибровочная кривая является обязательным и позволяет техника быть абсолютно количественные.
Чтобы свести к минимуму Фотообесцвечивание, пятна не отражаются непрерывно и мощность источника лазерного возбуждения TIRF сводится к минимуму. Протокола, представленные успешно использовался для фотостабилен флуорофоров такие, как Alexa Fluor красители. Могут использоваться альтернативные флуорофоров, но Фотообесцвечивание должны быть оценены и визуализации протокола адаптированы при необходимости. Общее количество одной молекулы в кадре может заговор против времени, чтобы воспроизвести привязки кривой, хотя это конечно не обязательно, если привязки кинетика не ценятся и изображений один кадр в точке равновесия будет достаточно.
Хотя есть требование двух высокое сродство антитела, это приводит к весьма деликатным и весьма специфические пробирного, решающее значение для измерений на уровне отдельной ячейки. P53 антитела, используемые в настоящем Протоколе, хорошо оптимизированы в обнаружения свободного p53 от одиночных клеток. Целевого белка определяется выбором антител и могут быть изменены в ряд способов: 1, записи и обнаружения антител может быть заменен для привязки альтернативных целей; 2, обнаружение антитела могут быть заменены прозондирует область взаимодействия протеин протеина или столб-поступательные изменения белка обязательно захвата антитела, например определить статус фосфорилирование захваченных p53; 3, мультиплексированных анализов может быть достигнуто путем печати несколько пятна антитела захвата в непосредственной близости от — печать 3 × 3 месте массив возможен в пределах 10nL капель. Конечно для любого изменения целевого белка количество антител экранов, элементы управления и оптимизации должны быть предприняты.
Несколько методов для лизировать одной клетки поступало. 33 оптических лизис — химико свободный подход к быстро лизируют отдельные клетки без изменения содержимого ячеек и сохранения целостности белков и их комплексов. Химические лизис с использованием моющих средств представляет собой проблему для целостности капель при использовании минерального масла и может мешать взаимодействия между молекулами. 34 однако для анализов, где химических лизис совместимый это привлекательным подход так как это не зависит от оборудования, таких как лазеры или micropatterned электродов. 35
Капельки Показать сопоставимой производительности с методами альтернативной одну ячейку. В нынешнее поколение капель, используя предлагаемые p53 антитела уровень NSB-187 ± 60 молекул на месте. Отсчеты одной молекулы exhibit сильные линейность (R2 = 0,99) в регионе, охватывающий 105 –108 p53 рекомбинантных белков за капли. Это свидетельствует о том, что, хотя более низкие уровни белка могут быть обнаружены в клетках, есть предел количественный 10 белков p535 ; Это соответствует одной молекулы рассчитывать на пятна 901 ± 83. Преимущественно это ограничивается объем капли и адсорбции на интерфейс. P53 assay является таким образом, что при выполнении в 10 nL объем только 1.1 ± 0,2% от общего целевого белка улавливается из раствора; Это увеличивает до 85 ± 9% при уменьшении объема анализа до 0,2 nL. 36 путем сокращения объема капель для ниже 1nL и уменьшение адсорбции, есть потенциал, используя указанный антител к p53 в улучшении предел обнаружения для < 50 белков в клетку. Таким образом адресуемых капли имеют потенциал, чтобы быть использованы для измерения очень низкие изобилии белки от одиночных клеток.
Адресуемость капельки, обеспечиваемой крышка легко проницаемые масла позволяет анализ объема клетки последовательно быть оспорено. Использование микропипеткой позволяет инъекции нужное количество клеток в каждой капли в вилка 10-20 ком, который не значительно увеличить объем. Для чипа, показано на рисунке 1B с 100 скважин, сформировать капельки и загрузить их с одной клетки обычно занимает 75-90 мин погрузки клетки также может быть достигнуто путем устранения капелька, используя концентрические трубы сопла вместо микропипеткой или с помощью раствор, содержащий ячейки, когда первоначально формирования капли. Последний будет полезным в ограничении числа шагов в протоколе, но в обоих случаях, размещение в капли будет следовать реализуется распределения. Это было бы ограничить долю одной ячейки данных за чип; Однако капель с нуля или нескольких ячеек будет служить элементами управления. Дополнительное ограничение в использовании концентрические насадку в адрес капельки является капелька объем возрастет в 10nL шагом. С предлагаемые изменения выше, это может быть улучшено. На чипе капелька микрофлюидика способны производить капельки на высоких частотах и имеют потенциал в автоматически сочетаясь с ADMs производить и манипулировать капельки и последовательно внести их в Вселенский массив. Это безусловно будет преодолеть ограничения в производстве ЗРК, позволяя при этом индикация одной молекулы капель.
Способность решать каждый индивидуальный капли имеет широкий спектр возможных применений. Мы продемонстрировали способность последовательно загрузить отдельные клетки. Он также разрешает удаление несвязанных клеточного материала пост лизис и последующего анализа в пипетку для анализа с использованием других методов. Последующего анализа будут примеры количественной ПЦР в реальном времени или масс спектрометрии.
Один из нынешних узких мест для лабораторий, желающих принять количественный подход к анализу одноклеточного белка является высокий технический барьер и необходимости специализированного оборудования. С ADMs, миниатюрных высокая чувствительность анализа может быть достигнуто без необходимости для чистых помещений для изготовления microfluidic приборы лаборатории на чипе. Эксперименты не ограничивается дизайн чипа и их объем и позиции могут быть изменены без необходимости изготовления новых хозяев. Конечно есть возможности для улучшения в упрощении технику и понижать барьер для вступления для анализа одной ячейки просто microarrayer, печать антитела и капелька microarrays и Считыватель микропланшетов флуоресценции, изображение.
Ряд клинических приложений анализа одной ячейки появляются, особенно в лечении рака. Неоднородность опухоли является серьезной проблемой для эффективной химиотерапии. В развитие опухоли, мутации возникают с увеличением частоты и неоднородность может привести к морфологических, генетические и протеомных изменчивости. Анализ одной ячейки разрешить сотовой гетерогенностью внутри опухоли и обеспечить платформу, чтобы помочь лучше понять и предсказать лекарственной терапии сопротивление и руководство.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
ASR разработан эксперименты, разработали протоколы и анализировали данные. СК и СП выполненных экспериментов размер ячейки. ASR и OC написал рукопись. Авторы хотели бы с благодарностью отметить поддержку профессор Дэвид р. Klug за предоставление доступа к оборудованию. Авторы хотели бы поблагодарить Императорского расширенный Hackspace колледж для доступа к изготовлению и прототипов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D6429 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| cell culture flasks | Corning | SIAL0639 | |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, UK | OmniGrid Micro | |
| Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
| Coverslips (Nexterion) | Schott, Europe | 1098523 | Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17 |
| p53 capture antibody | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled | Santa Cruz | sc-126 | stock concentration 200μg/mL |
| Saline-sodium citrate buffer | Gibco | 15557-044 | |
| Betaine | Sigma | 61962 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma | L3771 | |
| 384 well plate (low volume) | Sigma | CLS4511 | |
| Nitrogen gas cylinder | BOC | Industrial grade, oxygen-free | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Droplets | |||
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Manual Microinjector | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipette | Origio, Denmark | MBB-FP-L-0 | |
| Syringe pumps | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μL syringe | Hamilton | 81020 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| 1 mL syringe | Hamilton | 81327 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| Silicone isolator | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6x4 well silicone isolator with adhesive |
| Laser cutter | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | for laser cutting of custom isolators |
| 1mm thick acrylic sheet | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | for laser cutting of custom isolators |
| Adhesive sheet | 3M | used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips | |
| Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing | IDEX | FS-115 | |
| 1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing | IDEX | 1503 | |
| 0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing | IDEX | 1673 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Ultra-pure water | Millipore, Germany | MilliQ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy & Optics | |||
| TIRF microscope with encoded XY stage | Nikon, Japan | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Technologies, Ireland | IXON DU-897E | |
| Laser excitation source | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
| Optical lysis laser source | Continuum, USA | Surelite SLI-10 | |
| Microscope filter cube for TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
| Microscope filter cube for Optical Lysis | Laser 2000, UK | LPD01-532R-25 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Fiji | Open Source | Image analysis software | |
| Matlab | Mathworks | version 7.14 or higher | Image analysis software |
References
- Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
- Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).
- Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).
- Salehi-Reyhani, A., et al. A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection. Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).
- Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis. Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).
- Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).
- Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).
- Ramji, R., et al. Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (3), 34104 (2014).
- He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).
- Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode. New J. Phys. 11 (31), 75017 (2009).
- Shi, Q., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).
- Sun, Y., et al. A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing. Lab Chip. 14 (18), 3603 (2014).
- Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery. Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).
- Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray. Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).
- Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings. RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).
- Chen, F., et al. Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate. Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).
- Zhu, Y., Zhu, L. -N., Guo, R., Cui, H. -J., Ye, S., Fang, Q. Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot. Sci. Rep. 4, 5046 (2014).
- Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing. Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).
- Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. "One cell-one well": A new approach to inkjet printing single cell microarrays. ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).
- Yusof, A., et al.
- Zhu, Y., Zhang, Y. -X., Liu, W. -W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot. Sci. Rep. 5, 9551 (2015).
- Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications. Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).
- Kozak, K. R., et al. Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates. Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and Micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).
- Lai, H. -H., et al. Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S113-S121 (2008).
- Salehi-Reyhani, A., et al. Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis. Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S131-S138 (2008).
- Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes. BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).
- Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets. J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).
- Burgin, E., et al. Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray. Analyst. 139 (13), 3235 (2014).
