Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Måling af mRNA niveauer Over tid under gær S. cerevisiae hypoksiske svar

Published: August 10, 2017 doi: 10.3791/56226
Automatic Translation
1, 2, 2, 2
1Department of Molecular Biology, Rowan School of Osteopathic Medicine, 2Department of Biological Sciences, Rowan University

Summary

Vi præsenterer her, en protokol, ved hjælp af RNA-seq for at overvåge mRNA niveauer over tid under det hypoksiske svar af S. cerevisiae celler. Denne metode kan tilpasses til at analysere genekspression under nogen cellulære reaktion.

Abstract

Komplekse ændringer i genekspression mægle typisk en stor del af en cellulær svar. Hvert gen kan ændre udtryk med unik kinetik, som genet er reguleret af de særlige timing af en af mange stimuli, signalering veje eller sekundære virkninger. For at fange hele genet blev udtryk svar på iltsvind i gær S. cerevisiae, RNA-seq analyse brugt til at overvåge mRNA niveauer af alle gener på bestemte tidspunkter efter udsættelse for hypoxi. Hypoxi blev etableret af voksende celler i ~ 100% N2 gas. Vigtigere, i modsætning til andre hypoksiske undersøgelser, blev ergosterol og umættede fedtsyrer ikke føjet til medierne fordi disse metabolitter påvirker genekspression. Tid point blev valgt i intervallet fra 0 - 4 h efter hypoxi fordi denne periode indfanger de store ændringer i genekspression. På hvert tidspunkt, medio log hypoksiske celler blev hurtigt filtreret og frosset, begrænsning af eksponering til O2 og samtidige ændringer i genekspression. Total RNA blev udvundet af celler og bruges til at berige for mRNA, som blev derefter omdannet til cDNA. Fra denne cDNA, multiplex biblioteker var lavet og otte eller flere prøver blev sekventeret i én vognbane af en næste-generations sequencer. Efter sekvensering rørledning er beskrevet, som omfatter kvalitet base trimning, læse kortlægning og fastsættelsen af antallet af læser per genet. DESeq2 inden for R statistiske miljø blev brugt til at identificere gener, der ændrer væsentligt ved et af punkterne hypoksiske tid. Analyse af tre biologiske replikater viste høj reproducerbarhed, gener af forskellige kinetik og et stort antal forventede O2-reguleret gener. Disse metoder kan bruges til at undersøge, hvordan cellerne i forskellige organismer reagere på hypoxi med tiden og tilpasset til at studere genekspression under andre cellulære svar.

Introduction

Mange organismer reagere på hypoxi, eller lav O2, ved at ændre gen expression 1,2,3. Dette svar hjælper celler klare med manglen på en kritisk for aerob respiration og flere biosyntetiske reaktioner substrat, men også med en skiftende redox stat 4. Flere microarray undersøgelser udført i S. cerevisiae vis at mRNA niveauer af hundredvis af gener ændre svar på hypoxi 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. for nylig, RNA-seq blev brugt til at karakterisere gen expression ændringer over tid under hypoxi 13. Her, de eksperimentelle detaljer præsenteres og diskuteres.

Hypoxi kan opnås på forskellige måder, hver producerer et andet niveau af O2. Her, hypoxi blev etableret af konstant strømmende ultra høj renhed N2 i flasker, der sænker [O2] opløst straks med reproducerbare kinetik 10. Det er muligt, at der er nogle O2 molekyler findes der bidrager til metabolisme og gen udtryk men dette miljø betragtes meget tæt på anaerobe. I mangel af O2, kan gærceller ikke biosynthesize hæm, ergosterol og umættede fedtsyrer 4,12,14. Således, tidligere undersøgelser har medtaget disse metabolitter, når de vokser gær uden ilt 5,10,15. Men mange hypoksiske svar er medieret af nedbrydningen af disse metabolitter og dermed efterfyldning dem vender hypoksiske gen expression svar 12,16. For at efterligne naturlige hypoxi, blev disse metabolitter ikke føjet til medierne. I den korte tid at celler blev udsat for hypoxi uden tilstedeværelsen af disse væsentlige metabolitter, var der ingen mærkbar stigning i celledød (data ikke vist) eller en langvarig stress respons 13.

Svaret er også afhængig af stammen og dens genotype. Specielt vigtigt er alleler af de kendte regulatorer af hypoksiske svar 2. S288C stamme baggrund er meget eftertragtede, således at resultaterne kan sammenlignes med de andre genomiske undersøgelser udført med denne stamme. S288C indeholder imidlertid en delvis tab af funktion allel af HAP1 genet 17, en transcriptional regulator kritisk til det hypoksiske svar. Denne allel blev repareret i S288C ved hjælp af en vildtype kopi fra Σ1278b stamme baggrund 11.

Genekspression er meget afhængige af den cellulære miljø. Derfor, når du udfører genome-wide mRNA analyse, er det vigtigt at opretholde en konstant miljø samtidig med varierende en anden parameter som tid, stimulus eller genotype. For at opnå meget reproducerbare resultater, overveje disse tre fremgangsmåder for undersøgelsen og alle dens biologiske eller tekniske replikater. Først, den samme experimenter(s) skal foretage undersøgelsen, da tekniske fremgangsmåder kan variere på tværs af eksperimentatorer. Andet, det samme parti af ingredienser skal bruges i vækst medier, som hvert parti har en lidt anderledes sammensætning, der kan påvirke genekspression. For det tredje for at minimere cellecyklus effekter, bør hvert tidspunkt bestå af asynkrone celler i midten log fase af vækst (1-2 x 107 celler/mL).

Når kendetegner en kompleks reaktion som gen expression svar på hypoxi, er et tidsforløb fordelagtige for bestemmelse af kinetik af forskellige arrangementer. Bestemt tidspunkt punkter bør vælges der vil fange de store forandringer af respons. I denne undersøgelse, blev tidspunkter mellem 0 og 4 h observeret, fordi tidligere eksperimenter revealed omfattende ændringer i genekspression under denne periode 13.

For at måle globale genekspression var RNA-seq brugt 18,19. Denne metode bruger next generation sequencing til at bestemme den relative forekomst af hvert gen udskrift. I forhold til DNA microarray analyse, udstiller RNA-seq højere følsomhed (at opdage mindre rigelige afskrifter), et større dynamikområde (til at måle større fold ændringer) og overlegen reproducerbarhed (til præcist følger genekspression over tid). Mest cellulære RNA er typisk ribosomale RNA så mange metoder er blevet udviklet for at berige for specifikke RNA arter 20. Her, poly-T perler blev brugt til at rense poly-A-holdige mRNA udskrifter, selv om de forskellige kommercielt - tilgængelige rRNA udtynding kits kunne også være effektiv i mRNA berigelse.

Her, var S. cerevisiae gen expression svar på hypoxi karakteriseret. Celler blev udsat for iltsvind og derefter stikprøven på otte tiden point (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 og 240 min). At bekræfte reproducerbarhed og identificere statistisk ændrede udskrifter blev tre biologiske replikater udført. RNA blev udvundet ved mekaniske forstyrrelser og kolonne rensning, og derefter behandlet for RNA-seq analyse. Efter sekvensering rørledningen er beskrevet og programmering scripts er forudsat at give nøjagtige replikering af analyserne udføres. Specifikt, blev Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, R statistiske miljø 24og DESeq2 pakke 25 brugt til at behandle RNA-seq data og identificere 607 gener, der ændrer sig væsentligt i løbet hypoxi. Principal komponent analyse (PCA) og genekspression af replikater angivet reproducerbarhed af teknikken. Clustering og heatmaps afsløret vidtrækkende udtryk kinetik, mens gen ontologi (GO) Analysen viste, at mange cellulære processer, som aerob respiration, er beriget med ilt-regulerede gener sæt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. inducerende hypoxi

  1. En dag eller mere før hypoxi tidsforløb: forberede rugemaskinen, cell filtrering system, vakuum, gastank, kolber, propper, glas rør og slanger, som i Materialer tabel.
  2. Place N2 tank, inkubator, vakuum og filtrering system i umiddelbar nærhed, der gør hurtig behandling af celler.
  3. Forberede sterile flydende YPD medier (1% gær-ekstrakt, 2% pepton, 2% glukose) ved at blande komponenterne i en glasflaske og autoklavering.
  4. Plan layout af kolberne i rugemaskinen.
    Bemærk: Fra N2 tank, den første kolben vil være en vandlås, den anden kolbe bliver det sidste tidspunkt, tredje kolben vil være den anden til sidste tidspunkt og så videre indtil den sidste kolben, som er en endelige vandlåsen. Figur 1 viser den orden og forbindelser mellem kolberne.
  5. Dagen før tidsforløb, podes en gær koloni i en kultur af 5 mL væske YPD i en steril reagensglas. Specifikt, afhente en fuld koloni fra en plade ved hjælp af en steril applikator stick. Placer stick ind i den flydende YPD og ryste pinden, indtil de fleste af cellerne i suspension.
  6. Rotere rørene ved 30 ° C natten over (~ 16 h).
    Bemærk: Efter 16 h, vildtype celler vil opnå mætning (~ 2 x 108 celler/mL), angivet ved en meget overskyet kultur. Andre stammer kan tage længere tid at nå mætning og skal testes ved at måle celle koncentration med et spektrofotometer, som angivet i trin 1.9.4.
  7. På dagen selvfølgelig tid efter 16 h inkubation, fortyndes den mættede kultur natten 1:50 ved hjælp af en 5 mL pipette til 4 ml af kultur til 196 mL flydende YPD i en steril 500 mL kolbe. Vokse med rysten på ~ 200 rpm i 4 timer ved 30 ° C.
    Bemærk: Efter 4 h, en vildtype kultur vil nå en midten log koncentration af ~ 1-2 x 107 celler/mL.
  8. Under 4 h inkubation, mærke kolberne (for hypoxi og vand fælder) og 50 mL indsamling rør. Hvis inkubator i trin 1.7 ovenfor ikke bruges til tidsforløb hypoxi Tænd anden rugemaskinen og indstillet til 30 ° C.
  9. Lige før udsætter celler at hypoxi:
    1. Tilsæt ~ 50 mL vand til to af de sterile 250 mL kolber, der vil tjene som fælder under vand.
    2. Fylde 1/3 af en is spand med flydende kvælstof og dykke en polystyren skum rack til at holde 50 mL centrifugeglas.
    3. Angive filter systemet til indsamling af celler. Tilføje en steril filter disk på bunden enhed af de vandfiltrering system ved hjælp af steril pincet, være omhyggelig med at kun røre kanterne af filter disken. Placer den øverste filterenhed på bunden filterenhed og fastgør med klemmer leveres sammen med systemet. Sikre at bund og top enhederne er justeret således at der er en tæt forsegling og ingen lækage.
    4. Måle celle koncentration med et spektrofotometer. Fortynd celler, således at de kan måles i spektrofotometret – OD600 mellem ~0.2 - 0,6, afhængigt af spektrofotometret lineære område.
      Bemærk: En OD600 enhed er ~ 3 x 107 celler/mL, afhængigt af celle morfologi og Spektrofotometer. En koncentration af ~ 1-2 x 107 celler/mL er forventet, svarende til ~0.33 - 0.66 OD,600 .
    5. Hurtigt få Tidsprøven 0.
      1. Forbinde filter-system til en stærk (~ 10 mbar) vakuum via vakuum rør og en 1000 mL målekolbe fælde. Tænde en vakuum. Hæld kultur (normalt ~ 20 mL) i den øverste enhed og vente på væske til at blive trukket igennem filteret (~ 10 s, afhængigt af styrken af tomrummet).
      2. Forsigtigt fjerne filteret disken med en ren pincet og placere i en 50 mL-centrifugerør. Umiddelbart Placer centrifugeglasset i racket neddykket i flydende kvælstof. Vigtigere, ikke pre-chill rør, før du indsætter filteret som rør vil eksplodere.
      3. Efter > 30 s, sted røret ind i et-80 ° C fryser for senere RNA udvinding. Efter hver filtrering, rense og samle filtersystem. Skylle systemet ved at trække vand for 10 s uden en filter disk. Endelig tør system med et stykke køkkenrulle.
    6. Fortynd 4 h kultur i forskellige flasker til de forskellige tidspunkter, således at hver kolbe når midten log koncentration (~ 1-2 x 107 celler/mL) for den angivne tidspunkt af hypoxi.
      Bemærk: Tabel 1 viser fortyndinger, der er anvendt til wild-type S288C HAP1+ haploide stamme. Det anbefales at teste hver stamme i disse hypoksiske dyrkningsbetingelserne og justere Fortyndingerne i overensstemmelse hermed.
    7. Når celler og medier er føjet til kolber, erstatte aluminiumsfolie dækker kolbens åbning med en prop, der indeholder to glasrør indsat.
    8. Placer kolberne i rugemaskinen i layout bestemmes tidligere.
    9. Sikkert Tilslut slangen som vist i figur 1.
    10. Tjek at alle propper er stramt skubbet ind i kolben åbningerne.
  10. På tidspunkt 0, åbne regulator ventil. Angiv derefter flowmåler til 3 L/min.
    Bemærk: Boblende vil observeres i både vand kolber, med angivelse af korrekt gasstrømmen. Hvis dette ikke er tilfældet, skal du kontrollere, at alle propper er stram og slangesættet er korrekt fastgjort.
  11. Luk rugemaskine og indstille ryster hastigheden til ~ 200 rpm. Start en timer.
  12. Før hvert tidspunkt, angive filter systemet som beskriver ovenfor i trin 1.9.3.
  13. For hvert tidspunkt (fx, 5 min, 10 min, etc.), har to mennesker hurtigt behandle cellerne som følger:
    1. Første person: den passende kolben fjernes fra indehaveren og tage ud proppen (med glas slange vedhæftet).
      Bemærk: Dette vil ikke bryde strømmen af N2 til nogen af de resterende kultur kolber men vil midlertidigt afbryder strømmen til sidste vandlåsen.
    2. Anden person: afpipetteres 1 mL af kultur og dispensere til en kuvette. Tilslut slangen fra kultur kolben, som er nu i slutningen af linjen til det sidste vandlås (et rør og en prop vil blive fjernet i processen.). Derefter, måle celle koncentration i kuvette, som beskrevet ovenfor i trin 1.9.4.
    3. Første person: Hæld den resterende del af kulturen i vakuum filtreringssystem, og derefter udføre filtrering og frysning som beskrevet ovenfor i trin 1.9.5.
  14. Når du er færdig med alle punkterne, tid, slå fra N2 gas. Først lukke regulator og vente på, at presset for at frigive, og derefter slukke flowmåler. Endelig, demontere systemet og rense alle materialer med vand og derefter 70% ethanol.

2. RNA udvinding

  1. Forberede RLT buffer til RNA kolonne rensning, som beskrevet i Materialer tabel.
  2. Forberede en brugsopløsning af DNase ved at føje 10 µL af stamopløsningen DNase til 70 µL af buffer RDD per prøve (Se Materialer tabel).
  3. Fjern 50 mL rør indeholdende filtre og celler fra-80 ° C fryser og Anbring på is at tø (~ 15 min). Udfør følgende trin med rør på is.
  4. Mærke 2 mL skruelåg rør og placere dem på is, et rør til hver prøve. Syrevasket perler ~0.6 mL tilsættes til hvert glas, ved hjælp af en 1,5 mL microcentrifuge tube scoop og måle perlerne.
  5. Tilføje 0,6 mL koldt RLT buffer til 50 mL rør.
  6. Med pipette overfoeres op og ned for at fjerne celler fra filter og suspendere i løsning. Undgå at lade filteret forbliver i løsningen, som filteret vil opsuge løsningen. Fjerne alle løsning absorberes i filteret ved hjælp af afpipetteres tip for at presse filter mod mur af røret.
  7. Overføre alle væsken fra 50 mL tube til skruelåg rør indeholdende perler.
  8. Placer skruelåg rør i en perle mill homogeniseringsapparat og løb i et minut.
    Umiddelbart Placer rør på is i tre minutter. Igen, Placer rør i homogeniseringsapparat og løb i et minut.
  9. Fjerne rør fra homogeniseringsapparat og sted i isbad i 5 min. Perlerne vil bilægge til bunden af rørene.
  10. Udføre resten af trinnene ved stuetemperatur.
  11. Med en pipette, overføres kun de lysate (~ 350 µL), undgå perler, til en ny 1,5 mL microcentrifuge tube.
  12. Microcentrifuge for 2 min på max hastighed og derefter overføre supernatanten til en ny 1,5 mL microcentrifuge tube.
  13. Tilføj 1 bind af 70% ethanol (lavet af 200 bevis molekylær biologi-grade ethanol). Bland godt af pipettering.
  14. Overføre løsningen og nogen bundfald til en RNA-kolonne, der er blevet placeret inde i et 2 mL collection tube.
  15. Centrifugeres i 15 s på ≥12, 000 x g og kassér gennemstrømnings-(væske i røret).
  16. Tilføje 350 µL af buffer RW1 til kolonnen. Der centrifugeres i 15 s på ≥12, 000 x g og kassér gennemstrømnings.
  17. Tilsættes 80 µL DNase jeg inkubation mix til kolonne membran (får ikke på sider af røret) og lad det sidde i 15 min.
  18. Tilføje 350 µL af buffer RW1 til kolonne. Microcentrifuge for 15 s på ≥12, 000 x g og kassér gennemstrømnings.
  19. Tilføje 500 µL af buffer ÅV til kolonnen. Microcentrifuge for 15 s på ≥12, 000 x g og kassér gennemstrømning.
  20. Tilføje 500 µL af buffer ÅV til kolonnen. Microcentrifuge for 2 min på ≥12, 000 x g.
  21. Forsigtigt fjerne kolonnen og placere i et nyt 2 mL collection tube. Microcentrifuge på fuld hastighed i 1 minut (til helt tørre membranen).
  22. Kassér collection tube og placere kolonnen i en 1,5 mL microcentrifuge tube. Tilføje 30 µL af RNase-fri vand til kolonne membran.
  23. Elueres RNA fra kolonnen af microcentrifuging for 1 min på ≥12, 000 x g. Når indlæsning kolonnerne i microcentrifuge, Sørg for låg af collection tube vender i den retning centrifugen spins, for at forhindre lågene brækker.
  24. Tilføje en anden 30 µL af RNase-fri vand til kolonne membran, samtidig med at kolonnen i den samme microcentrifuge rør.
  25. Microcentrifuge for 1 min på ≥12, 000 x g, således at den endelige eluat volumen er 60 µL.
  26. Gemme hver 1,5 mL rør indeholdende 60 µL af RNA i-80 ° C fryser.

3. bestemmelse af RNA koncentration og kvalitet

  1. Mål koncentrationen af RNA og DNA i hver RNA prøve, ved hjælp af en fluorometer, (b) DNA - og RNA-specifikke fluorescerende farvestoffer og c assay rør, som anført i Materialer tabel. Følg instruktionerne i fluorometer og farvestoffer.
  2. Alternativt kan du måle nukleinsyre koncentration med en UV spektrofotometret indstillet på 260 nm.
    Bemærk: En A260 læsning af 1.0 er svarende til ~ 40 µg/mL enkeltstrenget RNA.
  3. Teste RNA kvalitet ved at køre RNA på en kommerciel nukleinsyre analyzer (Se Materialer tabel) eller på en standard formaldehyd/Agarosen gel 26.

4. RNA-seq analyse

  1. Fra det samlede RNA materiel, udgør 21 µL af 100 ng/µL RNA i RNase-fri vand. Brug 1 µL af denne 21 µL til test RNA-koncentrationen som ovenfor. Indsende de resterende 20 µL (2 µg) total RNA til en ekstern sequencing center for mRNA berigelse, strand-specifikke bibliotek forberedelse (med otte eller flere stregkoder for multiplexing) og sekventering (Se Materialer tabel). Alternativt, lokalt udføre mRNA berigelse og bibliotek forberedelse, og derefter indsende bibliotek til sekvensering.
  2. Pool otte eller flere multipleksede prøver og sekvens i én vognbane af en næste-generations sequencer.
  3. Hent filen FASTQ indeholder alle sekvens læser og de tilsvarende index-læser. Også downloade den tekstfil, der indeholder den multiplex stregkoder.
    Bemærk: Indeks læser kan være til stede i en separat fil, FASTQ. Placere alle disse filer i et bibliotek.
  4. Placer shellscript leveres her, "fastq_pipeline.sh", i den samme mappe. Rediger denne instruks som passende for eksperimentet og computer mapper.
    Bemærk: dette script indeholder omfattende anmærkninger forklarer trin. Kort sagt, script kvalitet beskærer læser, knytter læser til genomet, og genererer en tabulatorsepareret fil, der indeholder antallet af læser per genet for hver prøve.
  5. Indbetale FASTQ filer og raw Læs count data på NCBIS gen Expression Omnibus før publikation 27. Følg instruktionerne for "Indsendelse høj overførselshastighed sekvens data GEO": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
  6. Importere Læs count data i R statistiske miljø og statistisk analyse, ved hjælp af R script leveres her, "time_course_script. R". Rediger denne instruks som passende for eksperimentet og computer mapper.
    Bemærk: Dette script indeholder omfattende anmærkninger forklarer trin. Kort sagt, dette script importerer de Læs data, normaliserer læser, identificerer gener, der ændrer sig væsentligt i tiden løbet, udfører PCA analysen og grafer udtryk for valgte gener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hypoxi tidsforløb og RNA-seq analyse blev udført uafhængigt tre gange. For at undersøge de tre replikater reproducerbarhed, blev genekspression data for alle gener analyseret ved hjælp af Principal komponent analyse (PCA). Figur 2 viser, hvordan prøverne ændres over de første to vigtigste komponenter, som tilsammen repræsenterer 58,9% af variabiliteten. Denne analyse viste, at hver gang kursus udviser lignende ændringer (som afbildet ved hver kurves lignende form). Desuden, blev de sidste to replikater mere lig hinanden end til den første kopiere. Dette stemmer overens med det faktum, at de sidste to replikater blev udført af den samme person med samme partier af medier komponenter, mens den første kopiere blev udført af en anden person og partier. Dette fund understreger, at sammenhængen i teknik og kemikalier er en vigtig faktor i at opnå høj reproducerbarhed. Endelig er PCA analyse nyttig i vurderingen af, om de valgte tidspunkter fange de store forandringer, der opstår under tid kurset. Fokuserer på én Repliker kurve, er der større afstande mellem de tidligere prøver, der viser store ændringer i genekspression og mindre afstande mellem de senere prøver, med angivelse af mindre ændringer og eventuelt afslutningen af skiftet fra aerobe til hypoksiske genekspression.

Næste, DESeq2 pakken i R25 blev brugt til at identificere gener viser en væsentlig ændring i forhold til tid 0 (p-værdier i supplerende tabel 1). Af disse betydelige gener, 607 ændret mere end bukkes 4 gange (fold ændringer i supplerende tabel 1). Udtrykket mønstre af disse gener var grupperet, så det tilsvarende reguleret gener var grupperet sammen, og derefter vises i en heatmap (figur 3). Denne figur viser, at udtrykket ændringer er meget reproducerbare på tværs af replikater. Også udstille gener variable kinetik med stigninger og fald i udtryk. Mange gener udviser en peak stigning eller fald på 30 min, sandsynligvis på grund af en forbigående stress reaktion 13.

Figur 4 viser udtrykket af to downregulated og to upregulated gener tidligere fundet for at være O2-reguleret. Generne ændre udtryk reproducerbar, med lignende kurver mellem de biologiske replikater. Gen med den mindste variation mellem replikater er DAN1, med overlappende kurver. Gen med de mest variation er CYC1, måske fordi udtryk for dette gen er naturligvis variable. Denne figur viser også, at store fold (op til 1,024-fold) blev fundet ændringer.

At identificere de cellulære processer beriget i 607 O2sæt-regulerede gener, GO sigt berigelse blev udført (supplerende tabel 2). Som forventet, mange O2-regulerede gener spiller en rolle i cellulære respiration, andre aspekter af metabolisme, og ribosomale processer 13.

Sample # Gang i hypoxi mL kultur + mL YPD
2 5 min 20 mL + 0 mL
3 10 min 20 mL + 0 mL
4 30 min 20 mL + 0 mL
5 60 min 10 mL + 10 mL
6 120 min 10 mL + 10 mL
7 180 min. 5 mL + 15 mL
8 240 min 4 mL + 16 mL

Tabel 1. Celle fortyndinger udføres på tidspunkt 0.
Disse fortyndinger har været eksperimentelt bestemmes resultere i midten log koncentration (1-2 × 107 celler/mL) efter det angivne tidsrum i N2.

Supplerende tabel 1. Udtryk og statistiske Data for alle gener.
Denne tabel indeholder den systematiske navn, de justerede p-værdier for syv DESeq2 test (dvs5 min vs 0 min, 10 min. vs. 0 min, osv.), minimum justeret p-værdi, og log2 maksimal fold-ændringen. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 2. GÅ sigt berigelse resultater.
Denne tabel viser GO processer, deres repræsentation i gruppen af 607 O2-reguleret gener og deres repræsentation i genomet. Derefter, chi-square test blev brugt til at identificere GO vilkår, der lå betydeligt over - eller under-repræsenteret i sættet af 607 gener. GÅ berigelse analyse blev udført ved hjælp af GO Slim Mapper på SGD 28. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Figure 1
Figur 1. Hypoxi Set-up til at tage tid point uden at forstyrre gasstrømmen til nyere tid point.
Det er vigtigt, at alle forbindelserne forbliver sikker, som beskrevet i protokollen. Bemærk placeringen af kort (9 cm) og lange (17 cm) glasrør. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Principal komponent analyse (PCA) viser forholdet mellem de tre biologiske replikater.
Hver kurve har 0 min til 240 min prøver i orden. Log2 normaliseret genekspression for alle gener blev brugt i partnerskabs-og samarbejdsaftalen. PC1 tegner sig for 34,7% af den samlede afvigelse og PC2 konti for 24,2%. Den sorte linie er den første kopiere, den røde linje er andet, og den blå linje er tredje. Bemærk at pilene bruges til at påpege 240 min tid-punkt i forskellige prøver. Principal komponent analyse (PCA) blev gennemført i R ved hjælp af funktionen prcomp (Q-mode, eller ental værdi nedbrydning) på log2-omdannet matrix, der indeholder gener i kolonner og tidspunkter i rækker 29. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Heatmap viser udtryk for 607 gener identificeret som O2-reguleret.
Disse gener var betydelig i mindst en af DESeq2 testene og ændret udtryk af mere end bukkes 4 gange. Vist er log2(relative udtryk). Rød = øget udtryk. Grøn = nedsat udtryk. Farveintensiteten er proportional med graden af forandring. Før du opretter heatmap i TreeView 30, Gen-ekspression var k-middel grupperet med k = 10 i klynge 3.0 31. Tasten under heatmap viser skalaen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Relative mRNA niveauer af fire gener Over tid i tre replikater.
Den sorte linie er den første kopiere, den røde linje er andet, og den blå linje er tredje. Fælles/systematisk gen navne er CYC1/YJR048W, ERG5/YMR015C, DAN1/YJR150Cog NCE103/YNL036W. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil 1. fastq_pipeline.sh
Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2. time_course_script. RASMUSSEN
Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne undersøgelse, mRNA niveau for alle gener blev målt under hypoxi i gær S. cerevisiae. Målet var at analysere hvordan global gen expression ændringer som følge af vækst i en kontrolleret nær iltfrit miljø. Blev taget flere skridt til at sikre, at metoden beskrevet her var omhyggeligt kontrolleret og reproducerbar. Første celler blev udsat for et præcist definerede hypoksiske miljø: 99,999% N2 i rig medier (YPD). Andre undersøgelser af hypoxi har lukket kolbe eller rør til luft 32, brugt hypoxi-mimetiske cobalt chlorid 33eller ansat hypoxi-inducerende anaerob kamre eller poser 34. Hver af disse metoder kan resultere i varierende grader af hypoksi eller andre utilsigtede miljøforandringer. Det ville være nyttigt at studere genekspression mens systematisk varierende gasblandingen (f.eks.90% N2 og 10% O2), som gær i naturen er tilbøjelige til at opleve mindre svær hypoksiske betingelser. For det andet blev ergosterol og umættede fedtsyrer (fxTween 80) ikke føjet til dyrkningsmedier, da de påvirker genekspression, som omtalt i indledningen. For det tredje bestemt for at minimere gen expression ændringer forårsaget af forskellige faser i vækst, empirisk fortyndinger blev foretaget således at når en kultur nået et tidspunkt, det var i midten log fase af vækst (~ 1-2 x 107 celler/mL). Fjerde, den hurtig filtrering og frysning (~ 15 s) af celler, der er blevet fjernet fra hypoxi er kritisk, som gen expression ændringer kan forekomme i < 5 min af eksponering for O2, som opstår, når cellerne er indsamlet ved centrifugering (data ikke vist). Den tid, at cellerne er udsat for O2 kunne reduceres ved at udføre væksten og høst af celler i et iltfrit hood eller kammer. For det femte blev en passende stamme valgt for denne undersøgelse; for at være i overensstemmelse med andre genomisk undersøgelser, var fælles S288C lab stamme baggrunden ansat. Men S288C stammer indeholder en mutant hap1 allel og dermed var repareret 11. Dette tillod studiet af gener som CYC1 , der reagerer på O2 niveauer via Hap1 transskription faktor 11.

Tid point blev valgt fordi de udviste stor gene expression ændringer i tidligere hypoxi eksperimenter. Resultaterne vist her kan informere fremtidige eksperimenter. For eksempel, ville det være nyttigt at bruge en højere opløsning af tidspunkter under mellemrum, der viser store ændringer (f.eks., 0-30 min. hypoxi) til mere fint fange den forskelligartede kinetik. Derudover kan senere tid point, ud over den tidsperiode analyseres her (dvs., 4 h af hypoxi) afsløre yderligere udtryk ændringer.

RNA-seq blev brugt til at måle mRNA niveau, fordi dens reproducerbarhed og bredt dynamikområde tillader måling af store fold ændringer 18,35. RNA blev udvundet af mekanisk afbrydelse af celler ved hjælp af kraftigt rystet perler og renset på en kolonne. Kunne anvendes andre RNA oprensning metoder såsom hot phenol 36. Ideelt, RNA-koncentrationen vil være i størrelsesordenen 200 ng/µL - 1000 ng/µL da RNA-koncentrationen vil være fortyndet til 100 ng/µL til reverse transkription og bibliotek forberedelse. RNA-koncentrationen skal måles med en fluorometer og RNA-specifikke farvestoffet; Spektrofotometer UV er begrænset, fordi den måler den samlede koncentration af nukleinsyrer, bestående af både RNA og DNA. Kvaliteten af RNA bestemmes af gelelektroforese; ribosomale RNA bands skal være veldefineret på gelen og udtværing angiver RNA nedbrydning. Her, mRNA afskrifter blev beriget, men der er forskellige metoder til isolering af forskellige RNA typer 20 der kan også være vigtigt i svaret.

At spare ressourcer, mellem 8 og 12 prøver var multipleksede og sekventeret sammen i én vognbane, hvilket resulterede i et gennemsnit på mindst 693 læser per genet for hver prøve, tilstrækkeligt at reproducerbar bestemme antallet af læser per genet. I virkeligheden, kunne mere end 12 prøver være multipleksede i én vognbane, sandsynligvis resulterer i passende stikprøver af de fleste gener. For at beregne gennemsnitlige læser per gen, var det samlede antal læsninger, der knyttet til gener (i filen HTSeq) divideret med antallet af gener som HTSeq (i denne undersøgelse, 7140). Når estimering af det maksimale antal prøver, der kan være multipleksede i én vognbane, overveje gener af interesse at udstille den laveste udtryk (dvs.laveste normaliseret tæller), ved hjælp af data fra dette og andre RNA-FF. undersøgelser. Hvis de normaliserede Læs tæller for et gen varierer betydeligt på tværs af replikater, så antallet af læser kan være for lav, tyder på, at mindre prøver bør være multipleksede pr. sekventering lane.

Næste generation sequencing vil generere FASTQ filer, der indeholder læser og andre oplysninger. Hvis multiplexing blev udført, kan der oprettes en stregkode-fil og en ekstra FASTQ fil. Disse filer kan downloades til lokale analyse, som i denne protokol. Alternativt er der flere online næste generations sekvens analyseværktøjer til dem der ikke kender kommandolinjefunktioner eller R. I den forbindelse anbefaler vi Galaxy (https://usegalaxy.org/) 37 og GenomeSpace (http://www.genomespace.org/). I denne protokol bruges to scripts, der er blevet skrevet af forfatterne til FASTQ forarbejdning og udtryk analyse. Scriptene, der er godt kommenteret og kan redigeres for forskellige eksperimentelle design og computer opsætninger. Også, de to scripts og tabellen "Materialer" giver websites for at downloade de værktøjer, der anvendes i disse scripts. Den første script, "fastq_pipeline.sh", er en shellscript skal køres fra kommandolinjen i en UNIX/Linux terminal. Dette script multiplex de den oprindelige FASTQ fil som indeholder alle læser fra én vognbane af sequencer, dermed genererer en FASTQ fil til hver prøve i vognbane. Dernæst er læser i hver FASTQ fil kvalitet trimmet ved hjælp af Trimmomatic med standard indstillinger 21. De klippede læser knyttes derefter til S. cerevisiae S288C reference genom (SGD R64-1-1_20110203) ved hjælp af TopHat2 med standard indstillinger 22. Scriptet endelig bruger HTSeq til at bestemme antallet af læser, der knyttes til hver kommenteret funktion 19.

Scriptet "time_course_script. R", har også været skrevet af forfatterne og drives inden for R statistiske miljø 24. Scriptet i starten indførsel er Læs count data genereret af HTSeq. Hver prøve antages for at være et tidspunkt og dermed er organiseret i forhold til de andre tidspunkter. De rå Læs tæller er derefter importeres til pakken Rasmussen, DESeq2 25, for at identificere gener, der udtrykkes varierende på alle tidspunkter i forhold til først (dvs., aerob, tid 0). På grund af sin fleksibilitet, kan DESeq2 bruges til at udføre andre statistiske tests, såsom hvorvidt udtryk ændres som en funktion af tid 13. Alternativt, læse andre værktøjer beskæftiger parametrisk og ikke-parametrisk statistik for RNA-seq count data kunne være brugt 20. Scriptet derefter normaliserer Læs tæller til kontrol for graden af sekventering af hver prøve, og log2 omdanner tæller. Disse forarbejdede læser bruges til at udføre PCA analysen, til at bestemme den maksimale fold-ændring for hvert gen, og til at oprette udtryk grafer i figur 4.

Et vigtigt spørgsmål er hvordan man bedst til at ansætte statistik til at identificere gener, der reagerer betydeligt på hypoxi. Mindst tre biologiske replikater selvfølgelig tid er nødvendige for at beregne den naturlige variation af hvert gen og dermed bestemme gener, der reagerer på hypoxi mere markant end forventet ved en tilfældighed. Alternativt er det muligt at med held identificere gener, der reagerer over tid, uden biologiske replikater 13,25,38,39. Den væsentligste ulempe at disse metoder er at de ikke tager hensyn til den biologiske variation af hvert Gen. Men hvis RNA-seq replikater ikke udføres, individuelle gen expression ændringer kunne kontrolleres ved at udføre RT-qPCR med flere biologiske replikater 13.

Der er to primære fordele til vurdering af flere tidspunkter af en reaktion. Først, som diskuteret tidligere (især i figur 2), et tidsforløb identificerer de intervaller, der udviser stor udtryk ændringer, informere om ekstra tid points er nødvendig for at forbedre opløsning af kinetik eller at observere senere begivenheder af den svar. For det andet et tidsforløb giver mulighed for differentiering af hvert gen expression kinetik. Dette hjælper med at identificere unikke signaling veje, at handle på bestemte tidspunkter i løbet af svaret, og giver indblik i tidsplanen for indledning og afslutning af signalering. Specifikt, resulterede klynger af gener af udtryk mønster, der blev udført her i sæt af co regulerede gener. Initiativtagerne til et gen sæt kan dele en transskription faktor bindingssted, tyder på, at transskription faktoren bliver aktiv, når generne ændrer udtryk.

Når man studerer en cellulære reaktion, er den observerede variation ideelt på grund af stimulus (fx, iltmangel) og ikke til andre eksperimentelle variabler. Men, som det ses i figur 2, den enkelte forsker og/eller partier af medier komponenter gøre betydelige bidrag til variabiliteten i genekspression. Således, disse parametre bør overvejes for at opnå høj reproducerbarhed og minimal eksperimentel variation. Så lidt tid som muligt bør adskille hver replikeres, fordi eksperimentelle variabler er mere tilbøjelige til at ændre som tiden går.

Til sidst, kan denne metode bruges til at nøjagtigt overvåge genome-wide ændringer i mRNA niveau (eller andre begivenheder såsom Histon ændringer eller protein niveauer) under en hypoxi tidsforløb. Metoden kan tilpasses til andre organismer, især mikrobielle arter, der kan dyrkes i flydende kultur. Sådanne genome-wide tidsforløb analyser vil supplere undersøgelser af celle morfologi, protein aktivitet og stofskifte. Sammen, vil disse data føre til en rigere forståelse af cellulære svar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker Lewis-Sigler Institute for Integrativ genomforskning sekventering Core facilitet på Princeton University for teknisk rådgivning og RNA bibliotek forberedelse og sekventering. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Rowan Universitet og NIH NIGMS R15GM113187 til M.J.H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Enclosed dry incubator Thermo Scientific MaxQ 4000 Set at 30 °C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures.
Micro-analysis Filter Holder Millipore XX1002530 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask
Strong vacuum Edwards E-LAB 2 The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here.
1,000 mL flask To act as vacuum trap.
~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in Tygon 38TT Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system.
High-pressure N2 gas tank 99.999% purity, >1,000 psi, with a regulator and gas flow controller
Autoclaved 500 mL flask Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain.
Autoclaved 250 mL flasks Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps.
Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter) Sterilized with 70% ethanol. One for each flask.
Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes.
~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm Tygon E-3603 One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol.
Sterile filter discs Millipore HAWP02500 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point
Sterile dH2O (~100 mL)
1 mL cuvettes For measuring OD600 (i.e., cell concentration)
50 mL sterile centrifuge tubes One for each time point
Clean and sterile tweezers
liquid nitrogen For freezing cells
acid-washed beads Sigma G8772 Keep at 4 °C for lysing cells
Qiagen RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 For RNA column purification
Qiagen RLT buffer Prepare by adding 10 µL of β-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 °C.
2 mL collection tubes Qiagen included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RPE Qiagen included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RW1 Qiagen included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
DNase I stock and working solutions Qiagen 79254 The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 °C) in single-use aliquots (80 µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen.
Buffer RDD Qiagen included in the Qiagen DNase Kit
Ice cold 2 mL screw-cap tubes For lysing cells during RNA extraction
bead mill homogenizer Biospec Mini-Beadbeater-24 112011 Keep in cold room
Bacto Peptone BD DF0118 for liquid YPD media
Bacto Yeast Extract BD DF0886 for liquid YPD media
glucose Fisher D16 for liquid YPD media
Qubit assay tubes Thermo Fisher Q32856 for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit Thermo Fisher Q32853 for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM RNA Assay Kit Thermo Fisher Q32855 for measuring nucleic acid concentration
Qubit Fluorometer Thermo Fisher Q33216 for measuring nucleic acid concentration
Commercial electrophoresis system Agilent Bioanalyzer 2100 for measuring nucleic acid quality
Next-generation sequencer Illumina HiSeq 2500 for sequencing libraries
automated liquid handling system Wafergen Apollo 324 for creating sequencing libraries
PrepX PolyA mRNA Isolation Kit Wafergen 400047 for isolating mRNA from total RNA
PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit Wafergen 400039 for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA
Barcode Splitter https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d
Samtools, which includes the gzip command http://www.htslib.org/download/
Trimmomatic http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Bowtie2 (installed before TopHat) http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
TopHat https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
HTSeq http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html
R (installed before R Studio) https://cran.rstudio.com
R Studio (free version) https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
  2. Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
  3. Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).
  4. Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
  5. Ter Linde, J. J., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).
  6. Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).
  7. Kwast, K. E., et al. Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response. J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).
  8. Becerra, M., et al. The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions. Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).
  9. Lai, L. -C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media. Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).
  10. Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae. Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).
  11. Hickman, M. J., Winston, F. Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor. Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).
  12. Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 188 (2), 325-338 (2011).
  13. Bendjilali, N., et al. Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response. G3. 7 (1), 221-231 (2017).
  14. Chellappa, R., et al. The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator. J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).
  15. Abramova, N. E., et al. Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (3), 1169-1177 (2001).
  16. Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast. Cell. 120 (6), 831-842 (2005).
  17. Gaisne, M., Bécam, A. M., Verdière, J., Herbert, C. J. A "natural" mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1). Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).
  18. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).
  19. Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11 (10), R106 (2010).
  20. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 17 (1), 13 (2016).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  22. Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
  23. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--A Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).
  24. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna. Available from: https://www.R-project.org (2015).
  25. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
  26. Brown, T., Mackey, K., Du, T. Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization. Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).
  27. Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).
  28. Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).
  29. Hothorn, T., Everitt, B. S. A Handbook of Statistical Analyses using R. , 3rd ed, CRC Press: Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL. (2014).
  30. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
  31. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).
  32. Davies, B. S. J., Rine, J. A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 174 (1), 191-201 (2006).
  33. Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae. Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).
  34. Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -M. Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).
  35. Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains. Genetics. 200 (2), 505-521 (2015).
  36. Collart, M. A., Oliviero, S., et al. Preparation of yeast RNA. Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).
  37. Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).
  38. Martini, P., et al. timeClip: pathway analysis for time course data without replicates. BMC Bioinf. 15, Suppl 5. (2014).
  39. Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach. BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).

Tags

Genetik sag 126 anaerob aerob transkriptom næste-generations tidsforløb gær
Måling af mRNA niveauer Over tid under gær <em>S. cerevisiae</em> hypoksiske svar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Willis, S. D., Hossian, A. K. M. N., … More

Willis, S. D., Hossian, A. K. M. N., Evans, N., Hickman, M. J. Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response. J. Vis. Exp. (126), e56226, doi:10.3791/56226 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter