Summary
Här presenterar vi ett protokoll som använder RNA-seq för att övervaka mRNA nivåer över tid under hypoxisk svaret från S. cerevisiae celler. Denna metod kan anpassas att analysera genuttryck under någon cellulära svar.
Abstract
Komplexa förändringar i genuttryck medla vanligtvis en stor del av ett cellulärt svar. Varje gen kan ändra uttryck med unika kinetik genen regleras av särskilda tidpunkten för en av många stimuli, signalering vägar eller sekundära effekter. För att fånga hela genen användes uttrycket svar till hypoxi i jästen S. cerevisiae, RNA-seq analys att övervaka de mRNA nivåerna av gener vid specifika tidpunkter efter exponering för hypoxi. Hypoxi grundades av växande celler i ~ 100% N2 gas. Ännu viktigare, till skillnad från andra hypoxisk studier, har ergosterol och omättade fettsyror inte lagts till media eftersom dessa metaboliter påverka genuttryck. Tidpunkter valdes i intervallet 0 - 4 h efter hypoxi eftersom den perioden fångar de stora förändringarna i genuttryck. Vid varje tidpunkt, mitten av log hypoxisk celler var snabbt filtreras och frysta, begränsa exponering för O2 och samtidig förändringar i genuttryck. Total-RNA var extraheras från celler och används för att berika för mRNA, som omvandlades sedan till cDNA. Från denna cDNA, multiplex bibliotek skapades och åtta eller fler prover var sekvenserade i ett körfält av en nästa generations sequencer. Efter sekvensering rörledning beskrivs, vilket inkluderar kvalitet bas trimning, Läs kartläggning och fastställande av antalet läsningar per genen. DESeq2 inom R statistiska miljön användes för att identifiera gener som förändras avsevärt vid någon av hypoxisk punkter. Analys av tre biologiska replikat visade hög reproducerbarhet, gener av olika kinetik och ett stort antal väntat O2-reglerade gener. Dessa metoder kan användas för att studera hur cellerna i olika organismer reagera på hypoxi över tid och anpassas för att studera genuttryck under andra cellulära svar.
Introduction
Många organismer reagera på hypoxi eller låg O2, genom att ändra gene expression 1,2,3. Detta svar hjälper celler klara med avsaknaden av ett substrat som är kritiska för aerob respiration och flera biosyntetiska reaktioner, men också med en föränderlig redox state 4. S. cerevisiae flera microarray studier visar att de mRNA nivåerna av hundratals gener ändra svar till hypoxi 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. nyligen, RNA-seq användes att karakterisera gen uttryck förändringar över tid under hypoxi 13. Här, de experimentella detaljerna presenteras och diskuteras.
Hypoxi kan uppnås på olika sätt, varje producerar en annan nivå av O2. Här, hypoxi fastställdes genom att kontinuerligt flöda ultra-hög-renhet N-2 kolvar, vilket sänker [O2] upplöst omedelbart med reproducerbara kinetik 10. Det är möjligt att det finns vissa O2 molekyler närvarande som bidrar till ämnesomsättningen och genuttryck men denna miljö anses mycket nära anaeroba. I avsaknad av O2inte jästceller biosynthesize heme, ergosterol och omättade fettsyror 4,12,14. Således, tidigare studier har inkluderat dessa metaboliter när växer jäst utan syre 5,10,15. Men många hypoxisk svar medieras av utarmning av dessa metaboliter och således påfyllning dem vänder de hypoxiska gen uttryck Svaren 12,16. För att efterlikna naturliga hypoxi, har dessa metaboliter inte lagts till media. Under den korta tid att celler utsattes för hypoxi utan närvaro av dessa viktiga metaboliter, fanns det ingen märkbar ökning av celldöd (inga data anges) eller en långvarig stress svar 13.
Svaret är också beroende av belastningen och dess genotyp. Särskilt viktigt är allelerna av kända tillsynsmyndigheterna för hypoxisk Svaren 2. S288C stam bakgrunden är mycket önskvärt så att resultaten kan jämföras med de andra genetiska studier som utförts med denna stam. S288C innehåller emellertid en partiell förlust-av-funktion-allelen av HAP1 gen 17, en transkriptionell regulator som är kritiska för hypoxisk svar. Denna allel reparerades i S288C kopia från Σ1278b använda en vildtyp och sila bakgrunden 11.
Genuttryck är starkt beroende av den cellulära miljön. Därför, när du utför genome-wide mRNA analys, är det viktigt att upprätthålla en konstant miljö samtidigt varierande en annan parameter som tid, stimulans eller genotyp. För att uppnå mycket reproducerbara resultat, anser dessa tre metoder för att studera och alla dess biologiska eller tekniska replikat. Den samma experimenter(s) bör först, genomföra av studien, eftersom tekniska praxis kan variera över praktiker. För det andra, samma parti av ingredienser bör användas i tillväxt medier som varje parti har en något annorlunda sammansättning som kan påverka genuttryck. För det tredje, för att minimera cellcykeln effekter, varje tidpunkt bör bestå av asynkrona celler i mitten av log fas av tillväxt (1-2 x 107 celler/mL).
När karaktärisera en komplex reaktion som gen uttryck svaret till hypoxi, är en tid kurs fördelaktiga för fastställande av kineticsen av olika händelser. Specifika tidpunkter bör väljas som kommer att fånga de stora förändringarna av svar. I denna studie observerades tidpunkter mellan 0 och 4 h, eftersom tidigare experiment visade utbredda förändringar i genuttryck under denna period 13.
För att mäta globala genuttryck, var RNA-seq används 18,19. Denna metod använder nästa generations sekvensering för att avgöra det relativa överflödet av varje genens transkription. RNA-seq jämfört DNA microarray-analys, och uppvisar högre känslighet (för att upptäcka mindre riklig avskrifter), ett större dynamiskt omfång (att mäta större vik förändringar) och överlägsen reproducerbarhet (att noggrant följa genuttryck över tid). Den cellulära RNA är vanligtvis ribosomalt RNA så många metoder har utvecklats för att berika för specifika RNA arter 20. Här, poly-T pärlor användes att rena poly-A-innehållande mRNA avskrifter, men de olika kommersiellt - tillgängliga rRNA utarmning Kit kan också vara effektiva i mRNA anrikning.
Här präglades S. cerevisiae gen uttryck svaret till hypoxi. Cellerna var utsatt för hypoxi och sedan provtas vid åtta tidpunkter (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 och 240 min). Att bekräfta reproducerbarhet och identifiera statistiskt ändrade avskrifter, utfördes tre biologiska replikat. RNA var extraheras av mekaniska störningar och kolumn rening och sedan bearbetas för RNA-seq analys. Rörledningen efter sekvensering beskrivs och programmering skript tillhandahålls som tillåter exakta replikering av analyserna som utförs. Specifikt, användes Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, R statistiska miljö 24och DESeq2 paketet 25 att bearbeta RNA-seq data och identifiera 607 gener som förändras avsevärt under hypoxi. Principalkomponentanalys (PCA) och genuttryck av replikerar den indikerade reproducerbarheten av tekniken. Kluster och heatmaps avslöjade omfattande uttryck kinetik, medan gen ontologi (gå) analysen visade att många cellulära processer, som aerob respiration, är berikad med uppsättningen syre-reglerade gener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. inducerande hypoxi
- En dag eller mer innan hypoxi tid kursen: förbereda inkubatorn, cell filtrering system, vakuum, bensintank, kolvar, proppar, glas slangar och rör, som i Material tabell.
- Plats N2 tank, inkubator, vakuum och filtreringssystem i närheten, möjliggöra snabb bearbetning av celler.
- Förbereda sterila flytande YPD-media (1% jästextrakt, 2% pepton, 2% glukos) genom att blanda komponenterna i en glasflaska och autoklavering.
- Planera layout mätkolvar i inkubatorn.
Obs: Från N2 tank, första kolven kommer att ett vattenlås, andra kolven kommer att vara den sista tidpunkten, tredje kolven kommer att vara den näst sista tidpunkten och så vidare tills sista kolven som är ett sista vattenlås. Figur 1 visar ordningen och anslutningar mellan kolvar. - Dagen innan kursen tid Inokulera en jäst koloni till en kultur av 5 mL vätska YPD inom ett sterilt provrör. Specifikt, plocka upp en full koloni från en tallrik med en steril applikatorpinne. Placera stickan till den flytande YPD och skaka stickan tills de flesta av cellerna är i suspension.
- Rotera rören vid 30 ° C över natten (~ 16 h).
Obs: Efter 16 h, vildtyp celler kommer att uppnå mättnad (~ 2 x 108 celler/mL), indikeras av en mycket grumlig kultur. Andra stammar kan ta längre tid att nå mättnad och bör testas genom att mäta cell koncentration med en spektrofotometer, som anges i steg 1.9.4. - Dag tid kursen efter 16 h för inkubation, späd den mättade kulturen övernattning 1:50 med hjälp av en 5 mL Pipettera för att placera 4 mL kultur i 196 mL flytande YPD inom en steril 500 mL kolv. Växa med skakningar vid ~ 200 rpm under 4 timmar vid 30 ° C.
Obs: Efter 4 h, en vildtyp kultur når mitten av log koncentrationen ~ 1-2 x 107 celler/mL. - Under 4 h ruvning, etikett kolvar (för hypoxi och vatten fällor) och de 50 mL samling rör. Om inkubatorn i steg 1,7 ovan används för hypoxi tid kursen, slå på andra inkubatorn och inställd på 30 ° C.
-
Strax före att utsätta celler för hypoxi:
- Tillsätt ~ 50 mL vatten till två av de sterila 250 mL-kolvar som skall tjäna som vatten fällor.
- Fyll 1/3 av en is hink med flytande kväve och dränka en polystyrenskum rack som rymmer 50 mL centrifugrör.
- Ställa in filtersystemet för insamling av celler. Lägga till en steril filter skiva på botten enheten av filtreringssystemet med steril pincett, vara noga med att bara röra kanterna på skivan filter. Placera filtret översta enheten på botten filterenheten och säkra med klämmorna medföljer systemet. Se till att enheterna som botten och toppen är justerade så att det finns en tät förslutning och inget läckage.
- Mäta cellkoncentrationen med en spektrofotometer. Späd cellerna så att de kan mätas i det linjära området spektrofotometerns – OD600 mellan ~0.2 - 0,6, beroende på spektrofotometern.
Obs: En OD600 enhet är ~ 3 x 107 celler/mL, beroende på cellmorfologi och spektrofotometer. En koncentration av ~ 1-2 x 107 celler/mL förväntas, motsvarar OD600 av ~0.33 - 0,66. -
Snabbt få tid 0 provet.
- Anslut filtersystemet till en stark (~ 10 mbar) vakuum via vakuum slangar och en 1 000 mL mätkolv fälla. Slå på vakuum. Häll kulturen (vanligtvis ~ 20 mL) i den övre enheten och vänta tills vätskan dras genom filtret (~ 10 s, beroende på styrkan i vakuum).
- Försiktigt bort av förfilter med ren pincett och placera i en 50 mL centrifugrör. Placera omedelbart centrifugröret i racket nedsänkt i flytande kväve. Ännu viktigare, inte pre chill rören innan du sätter in filtret som rören kommer att explodera.
- Efter > 30 s, plats röret till-80 ° C frys för senare RNA-extraktion. Efter varje filtrering, rengöra och sätta ihop filtersystemet. Skölj systemet genom att dra vatten för 10 s utan ett förfilter. Slutligen, torka torrt med en pappershandduk.
- Späd den 4 h kulturen i olika kolvar för olika tidpunkter, så att varje kolv når mitten av log koncentration (~ 1-2 x 107 celler/mL) vid den angivna tidpunkten av hypoxi.
Obs: Tabell 1 visar utspädningar som användes för vildtyp S288C HAP1+ haploida stammen. Det är rekommenderat att testa varje stam i dessa hypoxisk odlingsbetingelser och justera spädningarna. - När celler och media läggs till kolvar, ersätta aluminiumfolie som täcker kolven öppna med propp innehållande två glasrör införas.
- Placera kolvarna i inkubatorn i layouten bestäms tidigare.
- Anslut säkert slangen som visas i figur 1.
- Kontrollera att alla proppar är ordentligt intryckta i kolven öppningar.
- Vid tidpunkt 0, öppna ventilen regulator. Sedan in flödesmätaren på 3 L/min.
Obs: Bubblande kommer att iakttas i båda vatten kolvar, som anger korrekt gasflödet. Om detta inte är fallet, kontrollera att alla proppar är snäva och slangar är korrekt ansluten. - Stäng inkubatorn och som skakar hastigheten till ~ 200 rpm. Starta en timer.
- Innan varje tidpunkt, ställa in filtersystemet som beskriver ovan i steg 1.9.3.
-
Vid varje tidpunkt (t.ex., 5 min, 10 min, etc.), har två personer snabbt bearbeta cellerna enligt följande:
- Första person: ta bort lämpliga kolven från innehavaren och ta ut proppen (med glas slangen ansluten).
Obs: Detta kommer inte att bryta flödet av N2 till någon av de återstående kultur kolvarna men kommer att tillfälligt bryta flödet till sista vattenlåset. - Andra person: Pipettera 1 mL av kulturen och fördela i en kyvetten. Anslut slangen från kultur kolven som är nu i slutet av raden till sista vattenlås (en tub och en propp kommer att tas bort i processen.). Mät sedan, cell koncentration i kyvetten, som beskrivs ovan i steg 1.9.4.
- Första person: häll resten av kulturen i vakuum filtreringssystemet, och då utföra filtrering och frysning som beskrivs ovan i steg 1.9.5.
- Första person: ta bort lämpliga kolven från innehavaren och ta ut proppen (med glas slangen ansluten).
- När du är klar med alla punkter, stänga av N2 gasen. Först stänga regulatorn och vänta för trycket att släppa, och sedan stänga av flödesmätaren. Slutligen, demontera systemet och rengöra allt material med vatten och sedan 70% etanol.
2. RNA-extraktion
- Förbereda RLT buffert RNA kolumn rening, som beskrivs i Material tabell.
- Förbereda en fungerande lösning av DNAS genom att lägga till 10 µL av DNAS stamlösning 70 µL buffert RDD per prov (se Material tabell).
- Ta bort de 50 mL rör som innehåller filter och celler från frysen-80 ° C och placera på is Tina (~ 15 min). Utför följande steg med rör på is.
- Märka 2 mL skruvlock rören och placera dem på isen, en tub för varje prov. Tillsätt ~0.6 mL Syramättad pärlor till varje rör, använder ett 1,5 mL mikrocentrifug rör att ösa och mäta pärlorna.
- Lägga till 0,6 mL kall RLT buffert 50 mL tuberna.
- Pipettera upp och ner att ta bort celler från filter och frysa in i lösning. Undvik att låta filtret förblir i lösning som filtret kommer att suga upp lösningen. Ta bort alla lösningen absorberas i filtret genom att använda Pipettera tipset för att pressa filtret mot väggen på röret.
- Överföra all vätska från 50 mL röret till skruvlock rören som innehåller pärlor.
- Placera skruvkork rören i en pärla kvarn Homogenisatorer och kör för en min.
Placera omedelbart rören på is under tre minuter. Igen, placera rören i homogenisatorn och kör för en min. - Ta bort rören från Homogenisatorer och plats på is för 5 min. Pärlorna kvittar till botten av rören.
- Utför resten av stegen i rumstemperatur.
- Med en Pipettera, överföra endast den lysate (~ 350 µL), undvika pärlor, för att en ny 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Mikrocentrifug för 2 min vid max hastighet och sedan överför supernatanten till ett nytt 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Tillsätt 1 volym 70% etanol (tillverkad av 200 bevis molekylärbiologi-grade etanol). Blanda väl genom pipettering.
- Överför lösningen och någon fällning till en RNA-kolumn som har placerats i en 2 mL collection tube.
- Centrifugera i 15 s vid ≥12, 000 x g och kassera genomströmmande (vätskan i röret).
- Tillsätt 350 µL buffert RW1 i kolumnen. Centrifugera i 15 s vid ≥12, 000 x g och kassera genomflöde.
- Tillsätt 80 µL DNAS jag inkubation mix till kolumn membranet (får inte på sidor av röret) och låt sitta i 15 min.
- Tillsätt 350 µL buffert RW1 i kolumnen. Mikrocentrifug för 15 s vid ≥12, 000 x g och kassera genomflöde.
- Tillsätt 500 µL buffert RPE i kolumnen. Mikrocentrifug för 15 s vid ≥12, 000 x g och kassera genomflöde.
- Tillsätt 500 µL buffert RPE i kolumnen. Mikrocentrifug för 2 min på ≥12, 000 x g.
- Försiktigt ta bort kolumnen och placera i en ny 2 mL samling tub. Mikrocentrifug i full fart för 1 min (för att helt torka membranet).
- Kassera samling röret och placera kolumnen i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör. Tillsätt 30 µL RNase-fritt vatten i kolumnen membranet.
- Eluera RNA från kolumnen av microcentrifuging för 1 min på ≥12, 000 x g. När du laddar kolumnerna i mikrocentrifug, kontrollera att locken på samling röret vänd i riktning centrifugen snurrar, för att förhindra locken att bryta bort.
- Lägga till en annan 30 µL RNase-fritt vatten i kolumnen membranet, samtidigt hålla kolumnen i samma mikrocentrifug rör.
- Mikrocentrifug för 1 min på ≥12, 000 x g, så att den slutliga eluat volymen är 60 µL.
- Lagra varje 1,5 mL tub som innehåller 60 µL av RNA i-80 ° C frysen.
3. fastställande av RNA-koncentrationen och kvalitet
- Mätning av koncentrationen av RNA och DNA i varje RNA-prov, med hjälp a en fluorometer, (b) DNA - och RNA-specifika fluorescerande färgämnen och (c) analys rör, som i Material tabell. Följ instruktionerna av fluorometer och färgämnena.
- Alternativt Mät nukleinsyra koncentrationen med en UV-spektrofotometer vid 260 nm.
Obs: En A260 läsning av 1,0 motsvarar ~ 40 µg/mL enkelsträngat RNA. - Testa RNA kvalitet genom att köra RNA på en kommersiell nukleinsyra analyzer (se Material tabell) eller på en standard formaldehyd/agaros gel 26.
4. RNA-seq analys
- Från det totala RNA lagret, göra upp 21 µL av 100 ng/µL RNA i RNase-gratis vatten. Använd 1 µL här 21 µL för att testa den RNA-koncentrationen som ovan. Lämna in de återstående 20 µL (2 µg) total-RNA till en extern sekvensering center för mRNA berikning, strand-specifika bibliotek förberedelse (med åtta eller fler streckkoder för multiplexing) och sekvensering (se Material tabell). Alternativt lokalt utföra mRNA anrikning och bibliotek förberedelser, och sedan skicka biblioteket för sekvensering.
- Pool åtta eller mer multiplexade prover och sekvens i ett körfält av en nästa generations sequencer.
- Hämta filen FASTQ som innehåller alla den sekvens läser och den motsvarande index läser. Också, Ladda ner textfilen som innehåller multiplex streckkoderna.
Obs: Den index läser kan finnas i en separat FASTQ-fil. Placera alla filerna i en katalog. - Placera shell script som ges här, ”fastq_pipeline.sh”, i samma katalog. Redigera skriptet för experimentet och dator kataloger.
Obs: Detta skript innehåller omfattande kommentarer som förklarar stegen. I korthet den script kvaliteten trimmar läser kartor läser att genomet och genererar en tabbavgränsad fil som innehåller antalet läsningar per genen för varje prov. - Sätta in FASTQ filer och raw Läs räkna data på NCBI'S Gene Expression Omnibus innan publicering 27. Följ instruktionerna för ”skicka high-throughput sequence data till GEO”: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
- Importera Läs räkna data i R statistiska miljön och utföra statistisk analys, med R-skriptet som anges här, ”time_course_script. R ”. Redigera skriptet för experimentet och dator kataloger.
Obs: Detta skript innehåller omfattande kommentarer som förklarar stegen. I korthet här skriptet importerar Läs data, normaliserar läser, identifierar gener som förändras avsevärt under kursens gång, utför PCA-analysen och grafer uttrycket av valda gener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RNA-seq analys och hypoxi tidsförlopp utfördes självständigt tre gånger. För att undersöka reproducerbarheten hos de tre replikat, var gen uttryck data för alla gener analyseras med Principal Component Analysis (PCA). Figur 2 visar hur proverna förändras över de första två huvudsakliga komponenter, som tillsammans representerar 58,9% av variabiliteten. Denna analys visade att varje tid kurs uppvisar liknande förändringar (som skildras av liknande formen på varje kurva). Dessutom var de sista två replikat mer liknar varandra än första replikera. Detta är förenligt med det faktum att de sista två replikat utfördes av samma person med samma partier av media-komponenter, medan första replikera utfördes av en annan person och partier. Detta konstaterande belyser det faktum att konsekvens av teknik och kemikalier är en viktig faktor för att erhålla hög reproducerbarhet. PCA-analysen är slutligen bedömningen av om de valda tidpunkterna fånga de stora förändringar som sker under tiden. Fokusera på en replikera kurva, finns det större avstånd mellan de tidiga prover, som visar stora förändringar i genuttryck och mindre avstånd mellan de sena prover, som visar mindre ändringar och möjligen i slutet av övergången från aerobic till hypoxisk genuttryck.
Nästa, DESeq2 paketet i R25 användes för att identifiera gener som visar en betydande förändring jämfört med tid 0 (p-värden i kompletterande Tabell1). Dessa betydande gener, 607 förändrats mer än 4-fold (vik förändringar i kompletterande Tabell1). De uttrycksmönster av dessa gener var klustrade, så att på samma sätt-reglerade gener var grupperade tillsammans, och sedan visas i en heatmap (figur 3). Denna figur visar att uttrycket förändringar är mycket reproducerbara över replikat. Även uppvisar gener varierande kinetik med både ökningar och minskningar i uttryck. Många gener uppvisar en peak ökning eller minskning på 30 min, sannolikt på grund av en övergående stress svar 13.
Figur 4 illustrerar uttrycket av två nedreglerade och två uppreglerad gener tidigare befunnits vara O2-reglerade. Generna ändra uttrycket reproducibly, med liknande kurvor mellan replikerar den biologiska. Gen med minst variabiliteten mellan replikat är DAN1, med överlappande kurvor. Genen med mest variabilitet är CYC1, kanske eftersom uttryck för denna gen är naturligt varierande. Denna figur illustrerar också att stora vika förändringar (upp till 1,024-fold) upptäcktes.
Att identifiera de cellulära processer berikad i uppsättningen av 607 O2-reglerade gener, GO begreppet anrikning var utfört (kompletterande tabell2). Som förväntat, många O2-reglerade gener spelar en roll i cellandningen, andra aspekter av metabolism, och ribosomal processer 13.
| Prov # | Tid i hypoxi | mL kultur + mL YPD | ||
| 2 | 5 min | 20 mL + 0 mL | ||
| 3 | 10 min | 20 mL + 0 mL | ||
| 4 | 30 min | 20 mL + 0 mL | ||
| 5 | 60 min | 10 mL + 10 mL | ||
| 6 | 120 min | 10 mL + 10 mL | ||
| 7 | 180 min | 5 mL + 15 mL | ||
| 8 | 240 min | 4 mL + 16 mL | ||
Tabell 1. Cell utspädningar utförs vid tidpunkt 0.
Dessa utspädningar har bestämts experimentellt att resultera i mitten av log koncentration (1-2 × 107 celler/mL) efter den angivna tiden i N2.
Kompletterande tabell 1. Uttryck och statistiska Data för alla gener.
Den här tabellen innehåller det systematiska namnet, justerade p-värden för sju DESeq2 tester (dvs.5 min vs 0 min, 10 min vs 0 min, etc.), minst justerat p-värde och den log2 maximal-faldig förändringen. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande tabell 2. GÅ sikt anrikning resultat.
Den här tabellen visar GO processer, deras representation i uppsättningen 607 O2-reglerade gener och deras representation i genomet. Sedan användes testet chi-square för att identifiera GO termer som var betydligt över - eller underrepresenterade i uppsättningen 607 gener. GÅ anrikning analys utfördes med hjälp av GO smal Mapper SGD 28. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Figur 1. Hypoxi Set-up för tar tidpunkter utan att störa gasflödet till senare tidpunkter.
Det är viktigt att alla anslutningar är säkra, som beskrivs i protokollet. Anteckna platsen för den korta (9 cm) och lång (17 cm) glasrör. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Principal Komponentanalys (PCA) visar förhållandet mellan de tre biologiska replikat.
Varje kurva har av 0 min 240 min prov i ordning. Log2 normaliserade genuttrycket för alla gener användes i PCA. PC1 står för 34,7% av den totala variansen och PC2 står för 24,2%. Den svarta linjen är första replikera, den röda linjen är andra och den blå linjen är tredje. Observera att pilarna används för att peka ut de 240 min tidpunkt i olika prover. Principalkomponentanalys (PCA) genomfördes i R med hjälp av funktionen prcomp (Q-läge, eller Singulärvärdesuppdelning) på log2-omvandlad matrisen som innehåller gener i kolumner och tidpunkter i rader 29. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Heatmap visar uttryck för 607 gener identifierats som O2-reglerade.
Dessa gener var betydande i minst en av de DESeq2 testerna och förändrat uttryck av mer än 4-fold. Visas är log2(relativa uttryck). Röd = ökat uttryck. Grön = minskad uttryck. Färgintensiteten är proportionell mot graden av förändring. Innan du skapar heatmap i TreeView 30, genuttryck var k-means klustrade med k = 10 i klustret 3.0 31. Nyckeln under heatmap visar skalan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Relativa mRNA nivåer av fyra gener över tid i tre replikerar.
Den svarta linjen är första replikera, den röda linjen är andra och den blå linjen är tredje. Common/systematisk gen namnen är CYC1/YJR048W, ERG5/YMR015C, DAN1/YJR150Coch NCE103/YNL036W. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande filer 1. fastq_pipeline.sh
Klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande filer 2. time_course_script. R
Klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie mättes mRNA nivåer för alla gener under hypoxi i jästen S. cerevisiae. Målet var att analysera hur globala gen uttryck förändringar på grund av tillväxt i en kontrollerad nära-anoxiska miljö. Flera åtgärder har vidtagits för att säkerställa att den metod som beskrivs här var noggrant kontrollerade och reproducerbara. Det första celler utsattes för en exakt definierade hypoxiska miljö: 99,999% N2 i rika medier (YPD). Andra studier av hypoxi har stängt den kolven eller tube till luft 32, används de hypoxi-mimetiska kobolt klorid 33eller anställd hypoxi-inducerande anaerob chambers eller väskor 34. Dessa metoder kan resultera i olika nivåer av hypoxi eller andra oavsiktliga miljöförändringar. Det skulle vara bra att studera genuttryck samtidigt systematiskt varierande gasblandningen (t.ex., 90% N2 och 10% O2), som jäst i vilt är benägna att uppleva mindre stränga hypoxisk villkor. För det andra, ergosterol och omättade fettsyror (t.ex., Tween 80) lades inte till kultur media, eftersom de påverkar genuttryck som diskuterats i inledningen. För det tredje, för att minimera gen uttryck förändringar orsakade av olika faser av tillväxt, empiriskt fastställda utspädningar utfördes så att när en kultur nått en tidpunkt, det var i mitten av log fas av tillväxt (~ 1-2 x 107 celler/mL). Fjärde, snabb filtrering och frysning (~ 15 s) celler som har tagits bort från hypoxi är kritisk, eftersom uttrycket genförändringar kan uppstå i < 5 min exponering för O2, som uppstår när celler samlas in genom centrifugering (inga data anges). När celler utsätts för O2 skulle kunna minskas genom att utföra tillväxt och skörd av celler i en anoxiska huva eller kammare. För det femte valdes ett lämpligt stam för denna studie; för att vara konsistent med andra genetiska studier, var gemensamma S288C lab stam bakgrunden anställd. Men de S288C stammarna innehåller en mutant hap1 allel och således var reparerade 11. Detta möjliggjorde studier av gener som CYC1 som svara på O2 nivåer via Hap1 transkription faktorn 11.
Tidpunkter valdes eftersom de utställda stora gen uttryck förändringar i tidigare hypoxi experiment. De resultat som visas här kan informera framtida experiment. Exempelvis vore det bra att använda en högre upplösning på tidpunkter under intervall som visar stora förändringar (t.ex., 0 till 30 min hypoxi) mer fint fånga olika kinetik. Dessutom kan senare tidpunkter, utöver den tidsperiod som analyseras här (dvs, 4 h av hypoxi) avslöja ytterligare uttryck förändringar.
RNA-seq användes för att mäta mRNA nivåer eftersom dess reproducerbarhet och brett dynamiskt omfång tillåter mätning av stora vika förändringar 18,35. RNA var extraheras av mekaniska avbrott i cellerna med hjälp av kraftigt skakas pärlor och renas i en kolumn. Andra RNA reningsmetoder kan användas, såsom heta fenol 36. Helst kommer att den RNA-koncentrationen vara i intervallet 200 ng/µL - 1000 ng/µL eftersom den RNA-koncentrationen kommer att spädas till 100 ng/µL för omvänd Transkription och bibliotek förberedelser. Den RNA-koncentrationen bör mätas med fluorometer och RNA-specifika färgämne; en UV-spektrofotometer är begränsad eftersom den mäter den totala koncentrationen av nukleinsyror, bestående av både RNA och DNA. Kvaliteten på RNA bestäms av gelelektrofores; ribosomalt RNA band bör vara väldefinierade på gel och smetar indikerar RNA nedbrytning. Här mRNA avskrifter berikades, men det finns olika metoder för att isolera olika RNA typer 20 som också kan vara viktiga i svaret.
Att spara resurser, mellan 8 och 12 prover var multiplexerade och sekvenserade tillsammans i ett körfält, vilket resulterar i genomsnitt minst 693 läsningar per genen för varje prov, räcker det att reproducibly bestämma antalet läsningar per genen. I själva verket kunde mer än 12 prover vara multiplexed i ett körfält, sannolikt resulterar i adekvat provtagning av de flesta gener. För att beräkna Genomsnittligt läser per gen, var det totala antalet läsningar som mappats till gener (i HTSeq utdatafilen) dividerat med antalet gener som HTSeq (i denna studie, 7140). Vid uppskattningen av det maximala antalet prover som kan vara multiplexed i ett körfält, överväga gener av intresse som uppvisar lägst uttrycket (dvs.lägsta normaliserade räknar), med hjälp av data från denna och andra RNA-seq studier. Om normaliserade Läs räkningarna för en gen varierar betydligt mellan replikerar, då antalet läsningar kan vara för låg, vilket tyder på att mindre prover bör vara multiplexed per sekvensering körfält.
Nästa generations sekvensering kommer att generera FASTQ filer som innehåller läser och annan information. Om multiplexing utfördes, kan en streckkod-fil och en ytterligare FASTQ-fil skapas. Dessa filer kan laddas ner för lokala analys, som i detta protokoll. Alternativt finns det flera online nästa generations sekvens analysverktyg för dem som inte känner med kommandoradsfunktioner eller R. I detta sammanhang rekommenderar vi Galaxy (https://usegalaxy.org/) 37 och GenomeSpace (http://www.genomespace.org/). I detta protokoll används två skript som har skrivits av författarna för FASTQ bearbetning och uttryck analys. Skripten är väl kommenterad och kan redigeras för olika experimentella designer och dator uppställningar. Även ge de två skript och tabellen ”material” webbplatser för att hämta verktygen som används i dessa skript. Den första manus, ”fastq_pipeline.sh”, är ett shell-skript som ska köras vid kommandoraden i en UNIX/Linux terminal. Detta skript multiplexer de den ursprungliga FASTQ-fil som innehåller all den läser som erhållits från ett körfält av sequencer, vilket genererar en FASTQ fil för varje prov som är närvarande i denna lane. Nästa, läser i varje FASTQ fil är kvalitet trimmas med Trimmomatic med standard inställningar 21. Den trimmade läser mappas sedan till S. cerevisiae S288C referens genomet (SGD R64-1-1_20110203) med TopHat2 med standard inställningar 22. Skriptet använder slutligen HTSeq för att bestämma antalet läsningar att mappa varje kommenterad funktionen 19.
Den andra Skriften, ”time_course_script. R ”, har också skrivits av författarna och drivs inom den R statistiska miljö 24. Skriptet början import till är Läs räkna data som genereras av HTSeq. Varje prov antas vara en tidpunkt och därmed är organiserad i förhållande till andra punkter. Råa Läs räkningarna importeras sedan till R paketet, DESeq2 25, för att identifiera gener som uttrycks differentially på någon tidpunkter i förhållande till först (dvsaeroba, tid 0). På grund av dess flexibilitet, kan DESeq2 användas för att utföra andra statistiska tester, såsom huruvida uttryck förändras som en funktion av tid 13. Andra verktyg som sysselsätter parametriska och icke-parametrisk statistik för RNA-seq läsa alternativt räkna data kan vara begagnade 20. Skriptet sedan normaliserar Läs räkningarna till kontrollen för graden av sekvensering av varje prov och log2 förvandlar räkningarna. Dessa bearbetade läsningar används för att utföra PCA-analysen, att bestämma den maximala faldig förändringen för varje gen, och att skapa uttryck graferna i figur 4.
En viktig fråga är hur man bäst använder statistik för att identifiera gener som svarar betydligt till hypoxi. Minst tre biologiska replikat av tidsförloppet är nödvändiga för att beräkna den naturliga variationen av varje gen och därmed avgöra gener som svarar på hypoxi mer påtagligt än förväntat av en slump. Alternativt är det möjligt att framgångsrikt identifiera gener som svarar över tid, utan biologiska replikat 13,25,38,39. Den främsta nackdelen med dessa metoder är att de inte tar hänsyn till den biologiska variationen av varje gen. Dock om RNA-seq replikat inte utförs, kunde enskilda genförändringar uttryck verifieras genom att utföra RT-qPCR med flera biologiska replikerar 13.
Det finns två primära fördelar att bedöma flera tidpunkter svar. Först, som diskuterats tidigare (särskilt i figur 2), en dags kurs identifierar de intervall som uppvisar stora uttryck förändringar, att informera om ytterligare tidpunkter är obligatoriska att förbättra upplösning av kinetik eller att iaktta senare händelser av den svar. För det andra, en dags kurs tillåter differentiering av varje genens uttryck kinetik. Detta hjälper till med att identifiera unika signalvägar som agera vid bestämda tidpunkter under svaret och ger inblick i tidpunkten för inledande och avslutande av signalering. Specifikt resulterat den klustring av gener av uttryck mönster som utfördes här i uppsättningar av samtidig reglerade gener. Initiativtagarna till en gen-uppsättning kan dela en transkription faktorn bindningsställe, vilket tyder på att en transkriptionsfaktor blir aktiv när generna ändra uttryck.
När man studerar ett cellulärt svar, är den observerade variationen idealiskt på grund av stimulus (t.ex., hypoxi) och inte till andra experimentella variabler. Men som kan ses i figur 2, göra den enskilda forskaren eller partier av mediekomponenter stora bidrag till variationen i genuttryck. Således bör dessa parametrar övervägas för att uppnå hög reproducerbarhet och minimal experimentella variabilitet. Så lite tid som möjligt bör separat varje replikat, eftersom experimentella variabler är mer sannolikt att förändras med tiden.
Sammanfattningsvis kan denna metod användas att noggrant övervaka genome-wide förändringar i mRNA nivåer (eller andra händelser såsom Histon modifieringar eller proteinnivåer) under en hypoxi tid kurs. Metoden kan anpassas för andra organismer, särskilt mikrobiell arter som kan odlas i flytande kultur. Genome-wide tidsförlopp analyser kommer att komplettera studier av cellmorfologi, protein aktivitet och ämnesomsättning. Tillsammans, kommer att dessa uppgifter leda till större insikt i ett cellulärt svar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Lewis Sigler Institutet för integrativ genomik sekvensering Core Facility vid Princeton University för teknisk rådgivning och RNA bibliotek förberedelse och sekvensering. Detta arbete stöds av bidrag från Rowan University och NIH NIGMS R15GM113187 till M.J.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enclosed dry incubator | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | Set at 30 °C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures. |
| Micro-analysis Filter Holder | Millipore | XX1002530 | 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask |
| Strong vacuum | Edwards | E-LAB 2 | The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here. |
| 1,000 mL flask | To act as vacuum trap. | ||
| ~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in | Tygon | 38TT | Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system. |
| High-pressure N2 gas tank | 99.999% purity, >1,000 psi, with a regulator and gas flow controller | ||
| Autoclaved 500 mL flask | Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain. | ||
| Autoclaved 250 mL flasks | Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps. | ||
| Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter) | Sterilized with 70% ethanol. One for each flask. | ||
| Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm | Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes. | ||
| ~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm | Tygon | E-3603 | One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol. |
| Sterile filter discs | Millipore | HAWP02500 | 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point |
| Sterile dH2O (~100 mL) | |||
| 1 mL cuvettes | For measuring OD600 (i.e., cell concentration) | ||
| 50 mL sterile centrifuge tubes | One for each time point | ||
| Clean and sterile tweezers | |||
| liquid nitrogen | For freezing cells | ||
| acid-washed beads | Sigma | G8772 | Keep at 4 °C for lysing cells |
| Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA column purification |
| Qiagen RLT buffer | Prepare by adding 10 µL of β-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 °C. | ||
| 2 mL collection tubes | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RPE | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RW1 | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| DNase I stock and working solutions | Qiagen | 79254 | The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 °C) in single-use aliquots (80 µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen. |
| Buffer RDD | Qiagen | included in the Qiagen DNase Kit | |
| Ice cold 2 mL screw-cap tubes | For lysing cells during RNA extraction | ||
| bead mill homogenizer | Biospec Mini-Beadbeater-24 | 112011 | Keep in cold room |
| Bacto Peptone | BD | DF0118 | for liquid YPD media |
| Bacto Yeast Extract | BD | DF0886 | for liquid YPD media |
| glucose | Fisher | D16 | for liquid YPD media |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher | Q32856 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fisher | Q32853 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM RNA Assay Kit | Thermo Fisher | Q32855 | for measuring nucleic acid concentration |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | for measuring nucleic acid concentration |
| Commercial electrophoresis system | Agilent | Bioanalyzer 2100 | for measuring nucleic acid quality |
| Next-generation sequencer | Illumina | HiSeq 2500 | for sequencing libraries |
| automated liquid handling system | Wafergen | Apollo 324 | for creating sequencing libraries |
| PrepX PolyA mRNA Isolation Kit | Wafergen | 400047 | for isolating mRNA from total RNA |
| PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit | Wafergen | 400039 | for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA |
| Barcode Splitter | https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d | ||
| Samtools, which includes the gzip command | http://www.htslib.org/download/ | ||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Bowtie2 (installed before TopHat) | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | ||
| TopHat | https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml | ||
| HTSeq | http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html | ||
| R (installed before R Studio) | https://cran.rstudio.com | ||
| R Studio (free version) | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
References
- Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
- Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
- Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).
- Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
- Ter Linde, J. J., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).
- Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).
- Kwast, K. E., et al. Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response. J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).
- Becerra, M., et al. The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions. Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).
- Lai, L. -C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media. Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).
- Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae. Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).
- Hickman, M. J., Winston, F. Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor. Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).
- Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 188 (2), 325-338 (2011).
- Bendjilali, N., et al. Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response. G3. 7 (1), 221-231 (2017).
- Chellappa, R., et al. The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator. J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).
- Abramova, N. E., et al. Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (3), 1169-1177 (2001).
- Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast. Cell. 120 (6), 831-842 (2005).
- Gaisne, M., Bécam, A. M., Verdière, J., Herbert, C. J. A "natural" mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1). Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).
- Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11 (10), R106 (2010).
- Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 17 (1), 13 (2016).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--A Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna. Available from: https://www.R-project.org (2015).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Brown, T., Mackey, K., Du, T. Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization. Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).
- Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).
- Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).
- Hothorn, T., Everitt, B. S. A Handbook of Statistical Analyses using R. , 3rd ed, CRC Press: Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL. (2014).
- Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
- Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).
- Davies, B. S. J., Rine, J. A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 174 (1), 191-201 (2006).
- Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae. Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).
- Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -M. Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).
- Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains. Genetics. 200 (2), 505-521 (2015).
- Collart, M. A., Oliviero, S., et al.
- Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).
- Martini, P., et al. timeClip: pathway analysis for time course data without replicates. BMC Bioinf. 15, Suppl 5. (2014).
- Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach. BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).
