Summary
Hier presenteren we een protocol voor de in vivo bepaling van naïeve CD4 T cel (T-cel) activering, proliferatie en differentiatie van de Th1 geïnduceerd door GM-CSF beenmerg (BM)-afgeleide dendritische cellen (DC's). Dit protocol beschrijft Daarnaast BM en T-cel isolatie, DC generatie en DC en T-cel adoptief overdracht.
Abstract
Kwantificering van naïeve CD4 T-cel activatie, proliferatie en differentiatie naar T-helper 1 (Th1) cellen is een handige manier om te beoordelen van de rol van T-cellen in een immuunrespons. Dit protocol beschrijft de in vitro differentiatie van het beenmerg (BM) progenitoren te verkrijgen granulocyt macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) afgeleid-dendritische cellen (DC's). Het protocol beschrijft ook de adoptief overdracht van ovoalbumine peptide (OVAp)-geladen GM-CSF-afgeleide DCs en naïef CD4 T-cellen van th transgene muizen om te analyseren de in vivo activering, proliferatie en Th1 differentiatie van de overgedragen CD4 T-cellen. Dit protocol omzeilt de beperking van zuiver in vivo methoden opgelegd door het onvermogen om specifiek manipuleren of selecteer de bestudeerde celpopulatie. Bovendien kan dit protocol studies in een in vivo omgeving, dus het vermijden van veranderingen aan functionele factoren die zich in vitro voordoen kunnen en met inbegrip van de invloed van celtypes en andere factoren die alleen gevonden in intact organen. Het protocol is een nuttig instrument voor het genereren van wijzigingen in DCs en T cellen die wijzigen van adaptieve immuunresponsen, mogelijk het verstrekken van belangrijke resultaten om te begrijpen van de oorsprong of de ontwikkeling van talloze immuun geassocieerde ziekten.
Introduction
CD4 T-cellen en antigeen presentatie van cellen (APCs) zoals DCs zijn vereist bemiddelaars van immuniteit aan microbiële ziekteverwekkers1,2. In perifere lymfoïde organen, worden CD4 T-cellen geactiveerd bij opname van specifieke antigenen gepresenteerd door APCs3,4,5. Geactiveerde CD4 T-cellen vermenigvuldigen en onderscheid maken in verschillende specifieke effector Th-cellen die nodig voor de ontwikkeling van een juiste adaptieve immuunrespons6,7 zijn. Controle van deze processen is cruciaal voor het produceren van een adequate adaptieve verdediging die het pathogene agens oplevert doodt zonder schadelijke weefsel schade8produceren. Th-cellen zijn gedefinieerd volgens de uitdrukking of de productie van oppervlakte moleculen, transcriptiefactoren en effector cytokines en essentieel en precieze functies vervullen in antwoord op ziekteverwekkers1. Cellen van de Th1 cel subset express de transcriptiefactor T-inzet en de cytokine interferon-γ (IFNγ) en host verdediging tegen intracellulaire pathogenen1deelnemen. Kwantificering van naïeve CD4 T-cel activatie, proliferatie en differentiatie van de Th1 is een nuttig instrument voor de beoordeling van de rol van T cellen spelen in een immuunrespons.
Dit protocol maakt het mogelijk in vivo analyse van de capaciteit van in vitro -gegenereerd BM afkomstige DCs aan het moduleren van de activering, proliferatie en differentiatie van de Th1 van naïeve CD4 T-cellen. Het protocol dient ook te beoordelen van de capaciteit van naïeve CD4 T-cellen worden geactiveerd, geïnduceerde te verspreiden, en Th1 gedifferentieerde (Figuur 1). Dit veelzijdige protocol omzeilt het onvermogen om te specifiek bewerken of selecteer de bestudeerde celpopulatie in zuiver in vivo protocollen. De effecten van verschillende moleculen en behandelingen op DCs kunnen bestudeerd worden met behulp van BM van genetisch gemodificeerde muizen5 of behandelen of geïsoleerde BM cellen9genetisch te manipuleren. T cel reacties kunnen ook worden onderzocht door het verkrijgen van T-cellen voor de overdracht van het adoptie van verschillende bronnen of na verschillende manipulaties3,-8,10.
De belangrijkste voordelen van dit protocol zijn tweeledig. T-cel activatie, proliferatie en differentiatie van de Th1 worden geanalyseerd met een stroom cytometry benadering; en dit wordt gecombineerd met in vivo studies, dus het afwenden van wijzigingen die in vitro kunnen optreden en met inbegrip van celtypes en andere factoren die alleen gevonden in intact organen11.
Het gebruik van vitale kleurstoffen is een veel gebruikte techniek voor het bijhouden van celproliferatie terwijl het vermijden van het gebruik van radioactiviteit. De meting van de proliferatie met deze reagentia is gebaseerd op de kleurstof verdunning na de celdeling. Bovendien, deze kleurstoffen op meerdere golflengten gedetecteerd kunnen worden en gemakkelijk worden geanalyseerd door stroom cytometry in combinatie met meerdere fluorescerende antilichamen of markeringen. Wij wijzen op het nut van dit protocol door aan te tonen hoe T-cel activatie, proliferatie en differentiatie van de Th1 door stroom cytometry kunnen worden geanalyseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimentele procedures werden goedgekeurd door de Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) en de Comunidad Autónoma de Madrid overeenkomstig de Spaanse en Europese richtsnoeren. Muizen werden gefokt in specifieke pathogene vrije (SPF) voorwaarden en werden euthanized kooldioxide (CO2) inademing.
1. isolatie van muis beenmergcellen van zijn verbeend en dijbeen
Opmerking: De C57BL/6 congenisch muis stam draagt de differentiële leukocyte markering Ptprceen, algemeen erkend als CD45.1 of Ly5.1, overwegende dat wild-type C57BL stammen de Ptprcb -allel dragen, bekend als CD45.2 of Ly5.2. CD45.1 en CD45.2 varianten kunnen worden onderscheiden door stroom cytometry met antilichamen. CD45.1, CD45.2 en CD45.1/CD45.2 kunnen voor muizen worden gebruikt als bronnen van de cel of als ontvangers adoptief overdracht, tracering van de bevolkingen van de afzonderlijke cel door stroom cytometry toelaat. Leeftijd bij voorkeur te gebruiken- en sex-matched mannelijk of vrouwelijk muizen onder de leeftijd van 12 weken.
-
Voorbereiding van het dijbeen en zijn verbeend
- Euthanaseren muizen met behulp van het protocol door de verzorging van de dieren van de institutionele Commissie goedgekeurd.
- Desinfecteer de hind ledematen door te besproeien het dierlijke oppervlak met 70% ethanol.
- Het gebruik van steriele schaar, pincet en scalpels. Met een scalpel, maken een snee in de huid en verwijder de huid van het distale deel van de muis met inbegrip van de huid die betrekking hebben op de achterste ledematen. Schil de huid rond de lagere kuitspier en de huid van de benen geheel verwijderen (figuur 2A, 2B).
- Het scheiden van de quadriceps spier van het dijbeen met behulp van een scalpel. Disarticulate het heupgewricht zonder verbreking van de kop van het dijbeen. Verwijder de spieren van het onderbeen met behulp van een scalpel (figuur 2C, 2D). Het dijbeen van het scheenbeen scheiden zonder verbreking van de uiteinden van het bot.
- Houd de botten in een petrischaal met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine in ijskoude 1 x Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640 medium.
-
Cel isolatie
Opmerking: Alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd onder de motorkap van een cultuur en met steriel materiaal om verontreiniging te voorkomen.- In een steriele petrischaal, zorgvuldig de proximale en distale uiteinden van elk bot met een scalpel afgesneden.
- Spoel de botten herhaaldelijk met een totaal volume van 10 mL warme volledige RPMI voedingsbodem (RPMI + 10% FBS, 2 mM EDTA, 1% penicilline/streptomycine, 20 mM HEPES, 55 µM 2-mercaptoethanol, 1 mM natrium pyruvaat en 2 mM L-glutamine). Spoel de botten aan beide kanten met behulp van een naald van de 25 G gekoppeld aan een 1 mL spuit.
- De effluate overbrengen in een conische tube van 50 mL, uitgerust met een 70 µm nylon webfilter. Zorgvuldig verjagen puin en cel conglomeraten door zachte roeren en pipetteren.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 250 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Resuspendeer de cel pellet in 1 mL koude rode bloedcellen lysis-buffermengsel (0,15 M NH4Cl + 1 mM KHCO3 + 0,1 mM EDTA, aangepaste pH 7,2 met 1 N HCl, 0.4 µm steriele gefilterd en opgeslagen bij 4 ° C). Onderhouden op ijs voor 5 min met de handleiding schudden.
- Voeg 10 mL koude buffer (1 x 2 mM EDTA, fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 2% bovien serumalbumine (BSA)) inactivering te wassen de rode bloedcel lysis-buffermengsel.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 250 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Wassen van cellen met 25 mL van volledige RPMI medium en centrifugeer bij 250 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer de cellen in 5 mL van volledige RPMI medium. Mix-50 µL van de celsuspensie van 1:1 met blauwe trypan. Het bepalen van het aantal cellen in een tellen kamer onder een microscoop. Het nummer van de cel met de formule berekenen: cellen/mL = [(niet-gekleurde cel tellen/4) x 2 x 10.000]12.
Opmerking: Deze methode opbrengsten 40 x 106 tot en met 60 x 106 bone marrow cellen per niet-geïnfecteerde 8 tot 12 weken oude C57BL/6 muis. - Centrifugeer de celsuspensie bij 250 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
2. DC differentiatie, rijping en antigeen laden
-
BM cel oogsten
- Het zaad van de volledige cultuur op 6-well ultra-laag-gehechtheid Vlakplaten op 106 cellen per mL van medium, meestal in 5 mL per putje. Gedifferentieerde macrofagen zal hechten aan de cultuur-platen. Na 12 h, overdracht van het supernatant, waarin voornamelijk monocyten, schoon 6-Wells-platen, teruggooi van de oude 6-Wells-platen met het zelfklevend macrofagen.
- Cultuur ter bevordering van celdifferentiatie, de cellen van de niet-aanhanger op 5 x 105 cellen per mL in meestal 5 mL per putje van volledige RPMI medium met 20 ng/mL commercieel verkregen recombinante lymfkliertest GM-CSF bij 37 ° C en 5% kooldioxide (CO2) en dagelijks observeren.
- Om de 3 dagen, spin down zwevende cellen en verzamelen de Adherente cellen met 5 mM EDTA in PBS en spin naar beneden. Combineer en resuspendeer bij 5 x 105 cellen/mL op vers medium met 20 ng/mL rm-GM-CSF.
- Op dag 8 verzamelen aanhangend en vrijstaande cellen als hierboven en resuspendeer op 5 x 10,5 cellen/mL in medium met 20 ng/mL GM-CSF en 20 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) gedurende 24 uur in een niet-weefselkweek-behandelde steriele petrischaal, voor het opwekken van hoge MHC-II , CD80 en CD86 expressie.
- Selectievakje DC differentiatie door stroom cytometry zoals aangegeven in stap 2.2.
-
Stroom Cytometry differentiatie en rijping analyse.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 250 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Herhaal deze stap tweemaal.
- Blok Fc receptoren door het broeden van de cel van de geresuspendeerde pellet in muis Fc receptor blocker (gezuiverd anti muis CD16/CD32 IgG2b antilichaam) gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C volgens de instructies van de fabrikant.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 250 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Voor elke sonde, resuspendeer 250.000 cellen in 300 µL van stroom cytometry buffer (1 x 2 mM EDTA, PBS + 2% BSA) bij 4 ° C.
- 30 µL van cell oplossing per putje overbrengen in een 96-well-plate.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 250 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en Voeg 30 µL van het antilichaam-bevattende buffer om elke goed volgen de aanwijzingen van de fabrikant. Incubeer de cellen met antilichamen voor 20 min bij 4 ° C.
Opmerking: Meestal in dienst markeringen DCs, monocyten en macrofagen CD11b, CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 en CD86 zijn (Figuur 3). - Centrifugeer de monsters bij 250 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en resuspendeer in 200 µL per putje van koude stroom cytometry buffer met een marker om uit te sluiten van de dode cellen (bijvoorbeeld propidium jodide, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) of een amine-reactieve kleurstof ) bij de fabrikant aanbevolen concentratie13.
- Monitor celdifferentiatie door overdracht van de monsters naar stroom cytometry buizen en het uitvoeren van de stroom cytometry analyse met uitzondering van dode cellen op dag 0, 3, 6 en 9.
-
DC antigeen laden.
- Op dag 8, centrifugeer de monsters bij 250 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en resuspendeer de pellets in 200 µL medium (RPMI + 10% FBS zonder antibiotica). Herhaal deze stap tweemaal.
- Incubeer de DCs met 10 µg/mL OVAp (323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) per 1 x 107 DCs in 1 mL medium (RMPI + 1% FBS) in een plastic buis gedurende ten minste 30 minuten bij 37 ° C. Gebruik niet OVAp-geladen DCs als een voorwaarde van de negatieve controle.
- Centrifugeer de monsters bij 250 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en resuspendeer de pellets in 200 µL volledige RPMI medium. Herhaal deze stap tweemaal.
- Centrifugeer de monsters bij 250 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en resuspendeer de pellets in 200 µL medium (RPMI + 10% FBS) 2 x 106 cellen/ml.
3. isolatie van naïeve CD4 T-cellen van th muizen
Opmerking: Deze methode levert ongeveer 100 x 106 spleenocytes per niet-geïnfecteerde 8 tot 12 weken oude C57BL/6 muis. Zowel mannen als vrouwen kunnen worden gebruikt. CD4 T-cellen kunnen worden geïsoleerd van de milt of lymfklieren; CD4 T-cellen zijn goed voor ongeveer 25% en 50% van de cellen in deze organen, respectievelijk. Voer de volgende stappen uit onder steriele omstandigheden.
- Isoleren inguïnale, axillaire brachialis, cervicale en mesenterische lymfklieren en de milt van th transgene muizen (Figuur 4) en deze overbrengen naar een plastic petrischaal met 10 mL van volledige RPMI medium.
- Spoel de cel zeef met 2 mL van volledige RPMI medium en verwijder het uit de tube van 50 mL. Overdracht lymfklieren en de milt aan een 70 µm cel zeef geplaatst in een tube van 50 mL. Meng met behulp van een zuiger van de spuit (Figuur 5) en het toevoegen van medium tot 15 mL.
- Centrifugeer de monsters bij 250 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en resuspendeer de pellet in 15 mL van volledige RPMI medium. Herhaal deze stap tweemaal.
- Voor de milt celsuspensie, resuspendeer de pellet cel en lyse van de rode bloedcellen, zoals aangegeven in stap 1.2.5.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 250 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Wassen van cellen met 25 mL van volledige RPMI medium en centrifugeer bij 250 x g gedurende 5 min op RT.
- Resuspendeer de cellen in 5 mL medium. Meng 50 µL van de celsuspensie van 1:1 met Trypan blauw. Het nummer van de cel met behulp van een tellen kamer onder een microscoop te bepalen. Het nummer van de cel met de formule berekenen: cellen/mL = [(niet-gekleurde cel tellen/4) x 2 x 10.000]12.
- Herhaal stap 2.2.2.
- Incubeer de cellen met 1:800 verdunningen van biotinyleerd antilichamen tegen CD8α, IgM, B220, CD19, MHCII (I-Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25 en DX5 gedurende 30 minuten op het ijs voor later negatieve selectie van CD4 T-cellen na de aanwijzingen van de fabrikant.
- Volgens de instructies van de fabrikant en gebaseerd op het aantal cellen en de capaciteit van de parels, berekenen het normbedrag van magnetische microbeads daar beklede en isoleren van CD4 T-cellen met behulp van een scheidingsteken magnetische cel en de passende scheiding de kolommen.
- Resuspendeer de cellen in 5 mL van volledige RPMI medium en houd ze op het ijs terwijl het tellen van levende cellen, zoals beschreven in stap 3.7.
- Pak van 2 x 105 cellen en controleer de zuiverheid van de verzamelde cellen met anti-CD4, CD3, B220 en CD8 fluorescerende antilichamen in een cytometer van de stroom met behulp van fabrikant-aanbevelen antilichaam verdunningen.
- Om de vlek geïsoleerde naïef CD4/th T-cellen, resuspendeer 106 cellen in 500 µL buffer (1 x 2 mM EDTA, PBS + 2% BSA). Bereiden van 500 µL buffer (1 x 2 mM EDTA, PBS + 2% BSA) bevattende verdubbelen de eindconcentratie van vitale cel tracer kleurstof om fabrikant-aanbevolen. Meng beide oplossingen door de cel tracer oplossing aan de celsuspensie langzaam toe te voegen. Incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
- Wassen van de cellen met 5 mL van volledige RPMI medium en centrifugeer bij 250 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Herhaal deze stap tweemaal. Resuspendeer de cellen in 1 mL van volledige RPMI medium 1 x 107cellen/ml.
4. in Vivo activering, proliferatie en Th1 differentiatie Assay
Opmerking: De vitale cel tracer kleurstof carboxyfluorescein DIACETAAT succinimidyl ester (CFSE) en andere succinimidyl ester gebaseerde kleurstoffen, die zijn enthousiast en fluorescentie bij verschillende golflengten uitstralen, worden veel gebruikt om te beoordelen van de lymfocyt proliferatie door stroom Cytometry vanwege hun hoge fluorescentie intensiteit, lange levensduur, lage variabiliteit en lage toxiciteit14.
- Adoptively overbrengen intraveneus (i.v.) 1 x 106 levende vitale cellen tracer kleurstof gebeitste naïef CD4/th T cellen in 100 µL van PBS per muis. Gelabelde T-cellen kunnen adoptively worden overgedragen door de staart ader of retro-orbitaal injectie15; in beide gevallen zal de cellen thuisbasis van lymfoïde organen (figuur 6A).
- Daag de ontvangende muizen een dag later door de adoptively de overdracht van 100.000 LPS-verviel OVAp-geladen DCs door subcutane injectie (s.i.) in het footpads (figuur 6B).
- Oogst popliteale lymfeklieren van geadresseerden muizen en verwerken deze tot de aanschaf van eencellige schorsingen na de zelfde stappen zoals eerder beschreven in 3.1 en 3.2. Doe dit op dag 2 na immunisatie te meten CD4/th T cel activatie, en op dag 5 voor het meten van proliferatie plus Th1 differentiatie.
- Voor het analyseren van T cel activatie op dag 2, vlek cellen met fluorescerende antilichamen tegen CD4, CD69 en CD25 (optioneel CD45.1 en CD45.2) en het bepalen van het percentage van C69+CD25+ T cellen in de CD4-bevolking. Analyseren met stroom cytometry (Figuur 7).
- Als u wilt controleren T-celproliferatie op dag 5, vlek cellen met behulp van passende fluorescerende antilichamen tegen CD4 en optioneel CD45.1 en CD45.2. Analyseer het verval van het vitaal belang cel tracer kleurstof signaal in de CD4-bevolking door stroom cytometry (Figuur 8). Verschillende parameters kunnen worden bepaald in deze studies, zoals het aantal celdelingen ondergaan door cellen geëtiketteerd met de vitale cel tracer kleurstof, het percentage van de scheidingslijn cellen in elke fluorescentie-piek en het percentage cellen van de scheidingslijn in de cel Totaal bevolking.
- Om te bepalen Th1 differentiatie op dag 5, plaat 400.000 cellen per putje van een 96-wells-plaat in 200 µL van volledige RPMI medium met 1 µM ionomycin en 10 ng/mL phorbol 12 myristaat 13 acetaat (PMA) gedurende 6 uur bij 37 ° C in de incubator. Voeg voor de laatste 4 h, 3 – 10 µg/mL brefeldin A tot het blokkeren van de afscheiding van de cytokine op het medium.
- Centrifugeer de platen voor 5 min op 250 x g bij 4 ° C. Verwijder het supernatant door snelle omkering van de 96-wells-plaat.
- Herhaal stap 2.2.2.
- Vlek celmembranen door incubatie gedurende 15 minuten bij 4 ° C in 30 µL van buffer (1 x 2 mM EDTA, PBS + 2% BSA) met antilichamen CD4 en optioneel CD45.1 en CD45.2 in fabrikant-aanbevolen verdunningen. De cellen door toevoeging van 150 µL van buffer (1 x 2 mM EDTA, PBS + 2% BSA) wassen en centrifugeren van de platen gedurende 5 minuten bij 250 x g bij 4 ° C en weggeworpen.
- Bevestigen van de cellen door toevoeging van 100 µL van 2% paraformaldehyde/1% sacharose voor 20 min aan RT. Centrifuge de platen voor 5 min op 1000 x g - en 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Permeabilize van de cellen door 50 µL van intracellulaire permeabilization buffer (1 x PBS + 0,1% BSA, 0,01 M HEPES, 0,3% saponine) toe te voegen en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- 150 µL van PBS en Centrifugeer gedurende 5 min op 1000 x g bij RT. Discard het supernatant toevoegen.
- Vlekken van intracellulaire cytokines door toe te voegen 30 µL van het fluorophore-geconjugeerde anti IFNγ antilichaam in buffer (PBS + 0,1% saponine) en incubeer gedurende 30 min op RT.
- Het wassen van de cellen door 150 µL van buffer (PBS + 0,1% saponine) toe te voegen. Centrifugeer de platen gedurende 5 minuten bij 1.000 x g bij RT en verwijder het supernatant. Herhaal deze stap tweemaal.
- Cel bevolking analyseren door stroom cytometry (Figuur 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 illustreert de stappen die worden beschreven in dit protocol. Figuur 2 illustreert de isolatie en de cultuur van muis BM cellen. De toevoeging van GM-CSF en LP's aan deze culturen maakt de in vitro generatie en rijping van DCs. Figuur 3 illustreert de stroom cytometry analyse van de differentiatie en rijping van de verkregen DCs. OVAp-geladen GM-CSF BM afkomstige DCs en geïsoleerde vitale cel trace kleurstof gebeitste CD4/th T cellen zijn adoptively overgedragen aan muizen. Figuur 4 toont de locatie van de lymfeknopen gebruikt voor de isolatie van CD4/th T-cellen. Figuur 5 toont een tube van 50 mL uitgerust met het 70 µm nylon filter en een zuiger van de spuit gewend Meng de lymfklieren en de milt. Figuur 6 toont i.v. injectie van de CD4/th T-cellen in de retro-orbitaal plexus en de injectie van de s.c. van de OVAp-geladen GM-CSF BM afkomstige DCs in de struikrover. CD4/th T cellen verspreiden naar de verschillende lymfoïde organen, overwegende dat GM-CSF DCs migreren naar de popliteale lymfeklieren waar GM-CSF DCs naïef CD4/th T-cellen door de presentatie van OVAp activeren. Naïef CD4/th T cellen vervolgens vermenigvuldigen en onderscheid maken naar de Th1 fenotype. Figuur 7 illustreert de kwantificering van naïeve CD4/th T cel activatie van de analyse van membraan CD69 en de CD25 expressie. Figuur 8 toont de kwantificering van CD4/th T celproliferatie. Figuur 9 illustreert de kwantificering van CD4/th T celdifferentiatie naar de Th1 fenotype.
Figuur 1: Protocol regeling. 1) isoleren BM cellen uit muis dijbeen en zijn verbeend. 2) cultuur BM cellen met GM-CSF voor het genereren van GM-CSF BM afgeleid-DCs. 3) selectievakje DC differentiatie en volwassen GM-CSF BM afgeleid-DCs met LP's. 4) controleren DC rijping. 5) laden DCs met OVAp. 6) isoleren CD4/th T-cellen vormen de milt van de muis. 7) vlek CD4/th T cellen met vitale cel tracer kleurstof. 8) controleren isolatie zuiverheid en vitale cel tracer kleurstof vlekken van geïsoleerde CD4/th T-cellen. 9) adoptively overbrengen in geïsoleerde CD4/th T cellen i.v. ontvangende muizen. 10). adoptively OVAp-geladen en gerijpte DCs-s.c. overbrengen in ontvangende muizen. 11) controleren CD4/th T cel activatie. 12) controleren CD4/th T-celproliferatie en differentiatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: beenmerg isolatie proces van muis dijbeen en zijn verbeend. (A) huid incisie met een schaar. (B) verwijdering van de huid van de ledematen. (C) incisie spier met een schaar. (D) opheffing van de spieren van de ledematen met een scalpel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: stroom cytometry analyse van de rijping van GM-CSF BM afkomstige DCs. Oppervlakte van expressie van CD86 LPS geactiveerd (+ LPS), MHCII en CD80- en niet-geactiveerde (-LPS) GM-CSF BM afkomstige DCs. getallen geven de gemiddelde fluorescentie-intensiteit in willekeurige eenheden (a.u.). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: locatie van de inguïnale, axillaire brachialis, cervicale en mesenterische lymfklieren en de milt in muizen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Experimental ingesteld voor lymfeklier en milt homogenisering. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: adoptief overdracht van CD4/th T-cellen en OVAp-geladen GM-CSF BM-afgeleid-DCs. (A) intraveneuze injectie van CD4/th T-cellen in de retro-orbitaal plexus. (B) subcutane injectie van GM-CSF BM afkomstige DCs OVAp-geladen in de struikrover. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: kwantificering van T cel activatie in vivo. Stroom cytometry Staanplaatsen en grafiek die de analyse en de kwantificering van de uitdrukking van de membraan van CD69 in CD4 T-cellen. CD45.1/CD45.2 muizen werden adoptively overgedragen i.v. met muis CD45.1/CD4/OTII en CD45.1/CD4/OTII cellen 24 h vóór de adoptieve overdracht van s.c. van OVAp-geladen GM-CSF BM-afgeleid-DCs. T cel activatie werd gemeten op 2 dagen post-DC overdracht door stroom cytometry na kleuring met TL-gelabelde antilichamen aan de aangegeven antigenen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: kwantificering van T-cel proliferatie in vivo. Stroom cytometry Staanplaatsen en grafieken tonen de analyse en de kwantificering van de daling van de vitale cel tracer kleurstof vlekken in delende CD4 T-cellen. CD45.2 muizen werden adoptively overgedragen i.v. met muis CD45.1/CD4/OTII cellen 24 h vóór de adoptieve overdracht van s.c. van OVAp-geladen GM-CSF BM-afgeleid-DCs. T-celproliferatie werd gemeten op 5 dagen post-DC overdracht door stroom cytometry na kleuring met de fluorescerende antilichamen aangegeven. T-celproliferatie kan worden bepaald door het meten van het percentage van de delende cellen, het percentage cellen in elke divisie piek, of door het tellen van het aantal divisie pieken zoals wordt weergegeven in de grafieken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9: kwantificering van T celdifferentiatie naar Th1 fenotype in vivo. Stroom cytometry Staanplaatsen en grafieken tonen de analyse en de kwantificering van het percentage van de IFNγ-uiten CD4 T-cellen. CD45.2 muizen werden adoptively overgedragen i.v. met muis CD45.1/CD4/OTII cellen 24 h vóór de adoptieve overdracht van s.c. van OVAp-geladen GM-CSF BM-afgeleid-DCs. T celdifferentiatie werd gemeten op dagen post-DC overdracht door stroom cytometry na kleuring met de fluorescerende antilichamen aangegeven. T celdifferentiatie naar het fenotype Th1 werd bepaald als uiting van IFNγ cellen als een percentage van het totaal aantal CD4 T-cellen en alleen de delende CD4 T-cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol zorgt voor de karakterisering van de capaciteit van BM afkomstige DCs aan het moduleren van de activering, proliferatie en differentiatie van naïeve CD4 T-cellen. Bovendien, het kan ook worden gebruikt om te beoordelen van de gevoeligheid van CD4 T-cellen voor modulatie door BM afkomstige DCs. Met dit protocol, kunnen veranderingen in deze gebeurtenissen worden gemeten in vivo.
Afhankelijk van de hypothese onderzochte, kunnen verschillende combinaties van T-cellen en DCs worden gebruikt. Bijvoorbeeld, kunt een analyseren de gevolgen van kloppen in of specifieke genen of de efficiëntie van een bepaalde prikkel van CD4 T-cel activatie, proliferatie of Th1 differentiatie uitsparen. Deze procedures kunnen worden uitgevoerd op DCs of CD4 T cellen of op beide soorten cellen. Dus, CD4 T-cellen van wild-type of genetisch gemodificeerde muizen kunnen worden gecombineerd met DCs afgeleid van wild-type muizen en vice versa.
Dit protocol kan worden aangepast aan de oorsprong van de verschillende cel populaties met behulp van stroom cytometry en antilichamen tegen CD45.1 en CD45.2 onderscheiden. Inderdaad, CD45.1/CD45.1 en CD45.2/CD45.2 muizen kunnen worden gebruikt als de bron van een van de celtypen gebruikt of als ontvangers voor adoptief overdracht in elke gewenste combinatie. CD4 T-cellen kunnen bijvoorbeeld worden verkregen bij CD45.1/CD45.1/OTII muizen, terwijl CD45.2/CD45.2 muizen kunnen de oorsprong van BM voor DC-generatie. In dit experiment, kunnen beide celtypen adoptively worden overgedragen aan CD45.1/CD45.2 muizen. Bovendien CD4/th T cellen van CD45.1/CD45.1 Typ een muizen en CD45.2/CD45.2 type twee muizen kunnen worden gecombineerd in dezelfde of verschillende CD45.1/CD45.2 type drie geadresseerden te vergelijken het gedrag van type één en typ twee CD4 T-cel populaties in concurrerende en niet-concurrerende voorwaarden, respectievelijk.
Deze methode beschrijft de generatie van GM-CSF BM afkomstige DCs. Alternatieve protocollen zijn echter beschikbaar voor DC rijping en differentiatie; papaïne kan bijvoorbeeld worden gebruikt in plaats van LPS of fms-gerelateerde tyrosine kinase 3 ligand (Flt3-L) in plaats van GM-CSF, waardoor de studie van de capaciteit van fenotypische verschillende DCs activeren CD4 T-cel adaptieve immuniteit. Met de dezelfde bedoeling, DCs voor antigeen laden en presentatie kunnen rechtstreeks geïsoleerd van muizen. Combinatie van dit protocol met anderen9 staat de manipulatie van naïeve CD4/th T cellen door virale infectie16 vóór hun adoptieve overdracht naar geadresseerden muizen. BM kan ook worden transduced met retrovirussen9 te bestuderen van het effect van wijzigingen van de gecontroleerde cel op DCs voor hun gebruik in het protocol.
Bovendien kan dit protocol worden aangepast voor intravital microscopie studies17 met behulp van fluorescerende cellen met eiwit-uiten. CD4/th muizen kunnen bijvoorbeeld worden gekruist met GFP - of cherry-uiting te verkrijgen GFP of Cherry/th CD4 muizen muizen. Deze muizen kunnen dan worden gebruikt als een bron van CD4 T-cellen en kunnen gecombineerd worden met BM afkomstige DCs van cherry - of GFP-uiting van muizen, zoals vereist, in vivo experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
Wij danken Dr. Simon Bartlett voor Engelse bewerken. Deze studie werd ondersteund door subsidies van het Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), de Miguel Servet programma- en Fundación Ramón Vicente Areces; met co-financiering van de Fondo Europeo de Desarrollo Regional (EFRO). De CNIC wordt ondersteund door het ministerie van economische zaken, industrie en concurrentievermogen (MEIC) en de Pro CNIC Foundation en kan een Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). RTF is opgericht door Fundación Ramón Vicente Areces en CNIC, VZG door ISCIII, BHF door Instituto de Investigación Sanitaria ziekenhuis 12 de Octubre (imas12) en JMG-G door de ISCIII Miguel Servet programma en imas12.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| Scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Scalpel | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | Box of 100 blades |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | |
| Penicillin/streptomycin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Sterile Petri dishes | Falcon | 353003 | |
| 25-gauge needle | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml syringe | Novico | N15663 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 70 μm nylon web filter | BD Falcon | 352350 | |
| Red blood lysis buffer | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Culture-plates | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodium pyruvate | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolysaccharide (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 anti-mouse CD11b antibody | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-mouse CD64 antibody | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-mouse CD115 antibody | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse CD11c antibody | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-mouse MHCII antibody | BioLegend | 125507 | |
| APC anti-mouse CD86 antibody | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-mouse CD80 antibody | BioLegend | 104713 | |
| Flow Cytometry tubes | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-mouse biotinylated CD8α antibody | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-mouse biotinylated IgM antibody | BioLegend | 406503 | |
| anti-mouse biotinylated B220 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD19 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody | BioLegend | 115302 | |
| anti-mouse biotinylated CD11b antibody | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD11c antibody | BioLegend | 117303 | |
| anti-mouse biotinylated CD44 antibody | BioLegend | 103003 | |
| anti-mouse biotinylated CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-mouse biotinylated DX5 antibody | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin-coated magnetic microbeads | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Magnetic cell separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separator |
| Separation columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100408 | |
| APC anti-mouse CD3 antibody | BioLegend | 100235 | |
| FITC anti-mouse CD8 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-mouse CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-mouse CD69 antibody | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-mouse CD45.2 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Intracellular permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-mouse IFNg antibody | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 mice | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Cell Analyzer | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
References
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
- Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
- Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7 (322), ra37 (2014).
- Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).
- Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).
- Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
- Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
- Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9 (1), 9 (2018).
- Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
- Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8 (1), 1591 (2017).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627 (2014).
- Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976 (2016).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).
- Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
