Summary
大脑中动脉腔内丝闭塞是啮齿类动物实验性脑卒中体内最常用的模型。另一种手术方法, 允许颈动脉修复在这里进行, 这使得颈总动脉再灌注和充分再灌注到大脑中动脉区域。
Abstract
缺血性中风是全世界成人长期残疾和死亡的主要原因。目前可用的治疗方法是有限的, 只有组织纤溶酶原激活剂 (tpa) 作为一种经批准的药物治疗, 以针对缺血性中风。目前缺血性脑卒中领域的研究主要集中在更好地了解脑卒中的病理生理学, 开发和研究新型药物靶点。可靠的实验中风模型是潜在治疗进展的关键。大脑中动脉闭塞模型 (mcao) 是相关的临床和最常用的手术模型缺血性脑卒中的啮齿类动物。然而, 这种模型的结果, 如病变体积, 与高度的变异性, 特别是在小鼠。这里描述的替代 mcao 模型允许颈总动脉 (cca) 再灌注和增加大脑中动脉 (mca) 区域的灌注, 使用带有纤维基因密封胶的组织垫修复血管, 并进行改进通过避免颈外动脉结扎 (eca) 小鼠的福利。这减少了对威利斯圆环的依赖, 这是众所周知的高度解剖变化的小鼠。代表性数据表明, 使用这种替代手术方法可以减少传统 mcao 方法与此处描述的替代方法之间的病变体积的变异性。
Introduction
脑卒中的一个主要原因是大脑中动脉区域的局灶性缺血。组织纤溶酶原激活剂 (tpa) 是唯一的药物治疗, 已被证明有效, 尽管许多临床药物试验针对缺血性中风1,2。然而, 出于安全考虑和狭窄的治疗窗口 (< 4.5 h), 只有 ~ 15% 的中风患者有资格获得 tpa, 再合成率可以 < 50% 3,4。
可重复和临床相关的中风动物模型被认为是至关重要的发展新的和潜在的中风治疗。然而, 由于担心动物模型结果的一致性和可变性, 完善现有的体内模型以改进从临床前研究到临床的翻译仍然很重要。从潜在治疗的临床前实验疗效到临床应用缺乏转化, 是脑卒中研究持续关注的问题.翻译失败的原因可能是多方面的, 可能与试验设计、治疗延迟、临床中风异质性以及所使用的动物模型的局限性有关。中风研究的一个关键挑战仍然是发展安全和有效的治疗方法。
腔内长丝置入大脑中动脉闭塞 (mcao) 是实验性脑卒中最常用的椎体模型。这个模型允许在缺血诱导后恢复血液流动, 模仿人类中风7中发生的事件.然而, 特别是在小鼠中, 尽管采用了定义的手术方案 8,9, 10,但也会出现不同标准偏差的异质性病变量。它是典型的看到小纹状体和大纹状皮质病变体积11的双模分布。为了诱发缺血, 灯丝通常是通过 cca 或 eca 的切口插入的, 然后保持永久结扎12。cca 的永久结扎阻止血液流入颈内动脉 (ica), 随后又阻止 mca 区域。这导致再灌注依赖于威利斯圆环 (cow) 内的附带供应。cow 结构具有个别动物之间的解剖变异性, 特别是在 c57bl6 mice-a 菌株通常用于体内冲程研究13。另一种方法, 即通过非洲经委会插入长丝, 确实允许通过共同评估继续灌注, 但这种方法损害了对非洲经委会领土的动脉供应, 而老鼠已经证明, 动脉供应对动物的幸福性 14。
在建立的 mcao 模型中, 依赖 cow 进行侧支供应和再灌注, 在一定程度上可以解释闭塞后病变体积的变异性。我们描述了另一种小鼠外科手术, 避免了 eca 结扎和 cca 切口修复, 从而允许通过 cca 再灌注, 独立于 cow。此前, 大鼠对 cca 切口的修复已被证明能通过 cca15成功地进行再灌注。我们已经成功地将这种方法应用于小鼠 11只, 并在这里报告的方案, 导致减少病变体积的变异性, 主要的结果措施用于实验中风研究。
在本协议中, 我们演示了如何通过 cca 血管长丝插入进行 mcao, 然后进行 cca 血管修复, 其中包括组织垫和密封胶的应用, 以允许再灌注。
Protocol
该议定书和所报告的数据是根据1986年《联合王国动物 (科学程序) 法》 (项目许可证 60/4315) 进行的, 并经过机构道德认证。所有实验都是根据动物研究:活体实验 (arrive) 指南16 报告的。
1. 准备工作
- 在手术前至少 48小时, 让成年男性 c57bl·老鼠熟悉术后护理 (如环境、床上用品、恢复食品)。
注: mcao 后的动物往往有困难的饮食后手术。- 为了防止手术后过度减肥, 使动物适应任何 mcao 后的饮食, 例如, 将补液凝胶, 凝胶食品, 和浸泡/湿湿正常饮食颗粒直接到笼子地板。
- 将笼子床上用品改为手术后床上用品, 如白纸芯片。
- 在开始手术设置或手术前, 对所有手术工具进行消毒。
- 为此, 请对工具进行高压灭菌 (最少121°c、15psi、15分钟) 或使用环氧乙烷 (按照正确的制造商说明, 使用 8-10小时)。
- 在设置过程之前对所有表面进行消毒。覆盖所有表面的无菌手术窗帘或蒸压箔的项目, 需要处理在手术过程中。在手术期间使用无菌技术。
注: 高压灭菌箔可用于覆盖手术期间需要携带的仪器或设备。使用无菌手套和技术, 可以应用箔, 然后, 该项目可以放置到无菌领域。之后, 将需要更换无菌手套。
2. 中脑动脉闭塞手术
- 使用成年雄性 c57bl"小鼠在手术时体重24-31 克。在 o 2 l/min 中, 在红色塑料麻醉室中, 使用 5%异氟醚进行麻醉。
- 诱导后, 减少异氟烷, 以保持足够的麻醉深度的手术 (例如, 1.5-2% 在 70% n22/30% o2, 通过面膜结合清除剂系统, 以降低外科医生的暴露于异氟醚中。
注: 一氧化二氮 (n2o2) 可与氧气 (o2) 结合使用, 以减少所需的异氟烷量, 从而获得足够的麻醉深度. - 术前进行全身镇痛 [carprofen, 10 mgkg 皮下皮下 (sc.)] 和局部麻醉到切口部位 (布比卡因, 2 mg sc., 稀释 1:10 在0.9% 盐水) 围手术期。
- 术前通过腹腔内 (ip.) 注射200μl 的无菌预热0.9% 氯化钠溶液进行输液。
- 用小剪羊毛来暴露皮肤, 将右颞叶和腹侧颈部区域的毛弄掉。用5% 的氯己定溶液3分钟对手术皮肤区域进行消毒, 将眼部润滑剂涂在两只眼睛上, 防止它们在手术过程中干燥。
注: 如果需要脉搏血氧仪读数来监测血氧饱和度、心率和呼吸速率, 请使用脱毛霜清除后腿头发。使用干净的棉芽使用奶油, 脱毛后, 用稀释氯己定溶液清洗该区域。在术前区域执行此步骤, 以最大限度地降低松散毛皮污染无菌手术场的风险。研究人员可能更喜欢根据当地的做法使用其他手术部位的手术部位的手术。 - 将鼠标转移到手术区域, 并将其放置在无菌悬垂覆盖的恒温热垫上的俯卧位置。通过鼻锥保持麻醉。插入直肠探头以监测鼠标的体温, 并将其保持在37.7±0.6°c。
- 在任何手术切口之前, 检查后爪撤退反射和眨眼反射, 以确认麻醉深度。
- 连接激光多普勒流量测量 (ldf) 探针, 记录流向 mca 地区的血液流动情况。
- 使用解剖立体镜, 用15刀在暴露在外的颞叶皮肤上, 在右眼和耳朵之间的中点做一个 < 1 厘米的切口。模糊地解剖覆盖头骨的底层组织, 轻轻地将其从骨骼中刮掉, 并用无菌棉签干燥表面。
注意: 必须注意不要损坏颞肌。 - 抓住连接到 ldf 显示器上的 0.7 mm、柔性单光纤探头, 使用锋利的手术刀切割其末端以获得平坦的边缘, 将其推入圆环形状的探头支架, 并在光纤末端放置少量的光学匹配凝胶。
- 在探头支架的底部边缘放置少量防水超胶;让这部分干燥, 变得俗气。
- 擦干头骨以上的骨, 并将少量的局部组织粘合剂放在一个圆圈的骨头, 刚刚足够的探针持有人。
- 将光纤探头已就位的探头放在该区域 (侧面6毫米, 距布雷格玛的远端2毫米)。
- 留出时间使胶水干燥;一旦干燥并连接, 开始记录 ldf 数据。
- 使用解剖立体镜, 用15刀在暴露在外的颞叶皮肤上, 在右眼和耳朵之间的中点做一个 < 1 厘米的切口。模糊地解剖覆盖头骨的底层组织, 轻轻地将其从骨骼中刮掉, 并用无菌棉签干燥表面。
- 轻轻地把动物到仰卧位, 注意支持激光多普勒探针, 防止其脱离。用微孔医带轻轻地将两个前爪贴在下面, 将一对棉芽 (或类似的东西, 如闭合钳) 滑到脖子下, 以提升该区域并产生张力。用无菌悬垂覆盖老鼠, 以保持无菌覆盖。
- 开始对共同国家评估进行解剖和曝光。
- 用15刀刀片在暴露的腹侧颈部做一个1.5 厘米的中线切口。
- 使用温和的钝器解剖技术, 轻轻地将唾液腺缩回两侧, 露出气管。
- 使用钝性解剖, 解剖 cca 从周围的组织和迷走神经的自由。
注意: 避免直接接触迷走神经, 因为对迷走神经的任何损害都会损害活动能力、喂养和呼吸。
- 通过两个小 (2 厘米) 部分的一个不可溶解的6-0 缝合下的 cca, 背侧到血管和腹侧的迷走神经。把一条丝质领带拉近外科医生的距离, 把它紧紧地绑在 cca (近端领带) 周围。松散地将第二条丝线 (远端领带) 绑在 ica/eca 的分叉上。
- 要开始分离 cca 的一部分, 请在远端领带上方应用微血管夹, 但不妨碍分叉。使用微型万纳斯剪刀, 使一个小孔到 cca。
注: eca 必须始终保持专利。cca 切口不得超过血管宽度的 40%, 并处于容易进入的腹侧位置;这将在 mcao 后的船舶维修阶段发挥重要作用。 - 将7-0 有机硅涂层单丝插入 cca, 向微血管夹方向推进。
注: 手术前必须根据小鼠的体重确定灯丝尺寸;请参考制造商的准则。- 拧紧远端领带, 足以将灯丝固定到位, 而不会损坏。使用夹子支架卸下微血管夹。
注意: 此时不应看到失血。如果有血液回流, 拿着长丝的领带不够紧。
- 拧紧远端领带, 足以将灯丝固定到位, 而不会损坏。使用夹子支架卸下微血管夹。
- 将灯丝推进 ica。
- 确保灯丝保持在 ica 内, 不会进入翼翼动脉 (ppa)。要做到这一点, 通过稍微提升和拉动 cca, 使用其中一个丝质领带, 到动物的身体的外侧, 并引导长丝弯曲过去的内部面开放的 ppa。
注意: 一旦前进到 mca 分支原点, 在 ldf 值上可以看到流向所提供区域的相对血液流量下降;这证实了灯丝的位置。
- 确保灯丝保持在 ica 内, 不会进入翼翼动脉 (ppa)。要做到这一点, 通过稍微提升和拉动 cca, 使用其中一个丝质领带, 到动物的身体的外侧, 并引导长丝弯曲过去的内部面开放的 ppa。
- 用远端丝质领带将灯丝固定在适当的位置, 将其绑紧。在遮挡时间段内将其保留在适当的位置。
注: 根据个别协议的不同, 动物可以在伤口缝合后转移到恢复笼中, 以便在闭塞期间恢复或保持麻醉状态。在后一种情况下, 使用无菌预热0.9% 氯化钠, 确保伤口防止干燥。
3. 遮挡后
- 在 mcao 周期结束时, 立即收回灯丝, 直到白色长丝头清晰可见。
- 然后, 松开远端 cca 领带, 刚好足以将灯丝头移出血管的大部分通道。
注: 在这一点上, 如果外科医生有信心与速度绑远端领带, 以防止失血的灯丝可以完全去除。 - 将一个微血管夹放置在水平位置, 朝向远端领带旁边的 cca 分叉。松开远端领带, 充分取出长丝。在近端 cca 与外科医生的关系下方添加另一个微血管夹。
注: 确保容器足够远进入夹具的尖头, 以防止任何滑移。剪辑的位置对于确保剪辑清除器在以后的步骤中易于访问是必不可少的。夹子可用于帮助提升容器, 以便更好地清除和放置组织贴片, 将夹子水平放置在周围的肌肉上。 - 使用 dumont #5 钳子或微型 vannas 剪刀小心地取出两个丝绸领带, 并使用无菌棉芽擦干该区域。
注: 必须注意不要切断通过/进入容器。 - 在无菌培养皿中, 加入纤维蛋白原和凝血酶 (见材料表), 确保这两种物质保持分离, 可供以后混合。
注: 只需要非常小的代理卷 (< 每个介质0.25 毫升)。将溶液分开可防止两种成分之间的过早反应。确保更换瓶盖的方式与取出的方式相同, 以防止两个注射器交叉污染, 这将导致代理在注射器内发生反应和设置。使用前, 将溶液存放在-20°c。当第一次手术需要时, 将密封胶解冻至室温。不要重新冻结密封胶;它必须保持在室温下, 并可以这样储存。注射器可用于多个手术, 使其具有成本效益;但是, 我们建议不要使用相同的小瓶超过 1周, 以防止污染。 - 使用直接解剖沿肌肉与 dumont 没有5钳子和微型 vannas 剪刀, 以获得一个薄薄的腹片胸锁乳突肌用于组织垫, 确保切片不超过1毫米厚, 并沿着肌肉的顶部纤维运行。
注: 不要穿过肌肉, 因为这会严重损害其功能。组织必须足够大, 以覆盖 cca 切口舒适。 - 使用 dumont #5 钳, 采取组织垫和混合组织均匀地在两个纤维蛋白原和凝血酶密封剂溶液, 形成两个试剂之间的通道。凝血会很快发生;一旦凝血开始, 取出组织垫到 cca 切口。用中等牢固的压力和打开的钳子将组织垫平放。
- 快速取出远端微血管夹, 同时仍轻轻地将组织垫固定在适当的位置。
注意: 这允许一些血液回流进一步激活纤维蛋白原和凝血酶密封剂。仅仅需要足够的压力来保持垫子的位置, 但不能完全堵塞容器。 - 慢慢缓解组织垫的压力 , 让血液在切口区域动。现在, 慢慢地, 轻轻地释放压力从近端微血管夹, 并完全删除。
- 注: 为了确保血管成为完全专利, 组织垫的放置和微血管夹的去除必须迅速进行, 以防止组织垫密封到 cca 的内部。然而, 如果有少量的血液泄漏, 重新将一些光压重新放置到组织垫上, 以便有更多的时间形成血块和密封。如果漏血量大或组织垫似乎没有密封, 保持压力, 以防止失血, 并更换两个 cca 微血管夹, 以隔离切口, 防止进一步失血。
- 快速取出远端微血管夹, 同时仍轻轻地将组织垫固定在适当的位置。
- 如果组织垫没有密封到容器, 可以按照步骤 3.3-3.7.3 进行第二次尝试。
- 容器密封后, 使用可溶解的6-0 缝合伤口。如果在整个手术过程中继续记录 ldf, 则使用可溶解的6-0 缝合从颅骨和缝合伤口中取出 ldf。
4. 术后护理
- 将动物放入预热的恢复笼 (位于35°c 的加热壳垫上或加热的室内)。
注: 研究人员可能更喜欢根据当地的做法使用其他温度和持续时间。 - 术后立即为所有动物提供200μl 预热0.9% 氯化钠盐水 sc, 术后 4小时, 每日 2倍, 72小时。
注: 预热0.9% 氯化钠的给药是动物主导的。如果需要更多的液体, 可以使用更多的液体, 以确保良好的恢复。 - 在恢复笼中, 让动物不受限制地获得湿透的饮食颗粒、干性饮食颗粒、补液凝胶和凝胶食物, 以及进入水的食物。
- 术后24小时重复卡洛芬注射 (见步骤 2.3)。
注: 所有动物都服用相同剂量的 carprofen;任何神经保护作用都可能可以忽略不计 - 定期 48小时, 执行术后老鼠格栅得分17 , 以评估疼痛程度, 以帮助决定进一步镇痛。
- 在手术前, 然后每天在手术后称量动物的重量。进行日常观察, 完成福利单, 监测他们的食物和水的摄入和临床症状。
- 在运行后24小时和48小时进行功能观察。评估小鼠的焦点赤字规模。评估他们的身体对称性, 强制盘旋, 步态, 45°网格攀爬, 盘旋行为, 前肢不对称, 和胡须触摸反应18,19, 20。
5. 磁共振成像与图像处理
- 使用结构磁共振成像 (mri) 测量病变体积 (lv)。
注: 以前使用过其他方法, 如用三苯基四唑 (ttc) 进行组织学染色, 并与结构 mri 数据相关。然而, 这种方法只能在研究的终点使用, 而不能纵向使用。使用纵向 mri 扫描将减少研究所需的动物数量。- 48小时后, 在诱导 mcao 后, 用异氟醚麻醉小鼠 (在 o2的 1 l/min 中麻醉5% 异氟烷, 将1.5-2% 异氟烷用于维护)。
- 将鼠标转移到 mri 支架, 将其放置在呼吸传感器上以监测其呼吸速率, 并植入直肠温度探头, 以便在扫描过程中监测其温度。将2通道鼠标脑 rf 接收线圈放在大脑上进行信号, 并将底座放置在 9.4 t 水平孔扫描仪中。
注: 这里使用了内径 72 mm 的卷线圈进行射频传输。 - 使用快速自旋回波序列获取 t2 加权扫描。将重复时间 (tr) 设置为 3, 000 毫秒, 将回波时间 (te) 设置为40毫秒. 使用18毫米 x 18 毫米作为视场 (fov), 并在大约10分钟内获得一个256x256 采集矩阵, 切片为18毫米 x 0.8 mm, 平均为3个信号。
- 使用快速自旋回波序列获取扩散张量图像 (dti)。将 tr 设置为 1, 730 毫秒, te 设置为35毫秒, fov 设置为20毫米 x 20 毫米, 并获得一个 128 x 128 采集矩阵, 其切片为16毫米 x 1 毫米, 两个信号平均值, 14个扩散编码方向, 最大b值为 1, 0242。
- 使用图像显示和测量软件包测量 t2 加权图像上的 lv。测量病变区域, 将值汇总在一起, 以计算病变总体积, 同时考虑 mri 切片厚度 (在 mri 扫描过程中设置)。
- 在测量完全对侧和同侧半球时, 请考虑任何肿胀和面积病变体积的百分比。正确的任何大脑肿胀, 由于水肿使用间接方法测量病变体积, 如前面所述 21,22。根据标准的小鼠大脑图集, 只包括包含皮层组织的切片, 而不是额叶或小脑组织, 以避免过度矫正。
- 测量病变扩散参数, 得到感兴趣的核心和半影区域。
- 利用适当的 mri 分析软件, 从扩散张量图像中生成表观扩散系数 (adc) 和分数各向异性 (fa) 图。
- 使用能够对图像执行线性配准的适当图像分析软件, 使 dti 图像与 t2 加权图像对齐。注册后, 从 t2 加权病变面膜 (缺血性核和半影) 中减去弥散加权病变面膜 (缺血性核心), 以估计半影区域。将生成的掩码 (核心和半影) 应用到 adc 和 fa 映射中, 以量化核心和半影内的扩散参数。
- 翻译同侧核和半影面膜左右的大脑中线, 以获得对侧 adc 和 fa 值进行比较。
Representative Results
本研究共使用了24只成年雄性 c57bl6 小鼠, 手术时体重在24-31 克之间。一只动物在大脑中动脉闭塞 (mcao) 后死亡, 一只动物因手术并发症而被排除在外。这里提供的数据来自作者以前发表的作品。这些被用来说明血管修复对 mcao 结果11的影响.所有数据均表示为均值±标准偏差。使用 d ' agostino-pearson 全能型正态性测试对数据进行了正常评估。参数数据比较使用学生的 t测试 (两种方式) 和单向方差分析与西达克测试 (多种方式)。使用曼恩-惠特尼 u 测试对非参数数据进行了比较。使用f-测试评估参数数据的可变性, 并使用 levene 测试评估非参数数据的可变性。
通常情况下 , 在 mcao 程序中 , 闭塞的长丝入 cca , 非洲经委会被连接 , 以防止这种长丝进入非洲经委会而不是 ica 。避免非洲经委会结扎和增加镇痛表明, 在 mcao 之后48小时内, 体重下降的趋势是减少, 而在 mcao 之后, 与以前的研究数据相比, 同一外科医生在相同的 mcao 时间内使用的是 eca 结扎, 没有镇痛, 而 lv 则是显示为未受影响, 请参见图 1。
小鼠接受了 60分钟 mcao 引起的缺血, 然后再灌注与 cca 血管修复或与典型的结扎的 cca 方法。图 2显示了结扎和未结扎修复 cca 的示意图。
采用激光多普勒血流法测定 mcao 内 mca 内的血流灌注情况, 并对 cca 血管修复前后进行了检测。图 3显示, 在纤维去除5分钟后, mca 的脑区脑血流 (rcbf) 显著增加。灌注一直维持到血管修复, 在 cca 血管修复后显示到对 mca 区域的灌注增加, 这表明与依赖血管修复相比, cca 修复使血液灌注到缺血性区域的人数增加。威利斯的圈子单独。
采用 t2 加权 mri 确定总 lv, 用 dti 扫描确定 mcao 后48小时的核心 lv。图 4 a显示修复和结扎程序组之间的总 lv 或核心 lv 没有显著差异。然而, 在 cca 修复组中, 使用 lavene 的非参数测试或 f-测试对参数数据进行评估的总 lv 和核心 lv 的数据变异性显著降低。总 lv 被分解为皮质和皮质下的 lv, 如图 4b所示。cca 修复组皮质部分变化明显较小, 而两个程序组的病变下皮质部分未受影响。
功率分析显示, 与典型的 cca 结扎程序相比, 每个治疗组使用 cca 修复后 lv 减少30% 所需的动物较少 , 见表 1。功率 1-β= 0.8 和显著性水平α= 0.05 的假设和假设控制组和试验组之间 lv 减少30% 的预测用于功率分析。此外, 假定各群体之间的方差相等。表 1显示了在使用典型的 cca 结扎方法或使用更新的 cca 修复方法 (如这里所述) 时测试和控制组所需的动物数量。请注意, 实验组是指一个假设的经过处理的动物组, 对照组是指一个假设的对照组;这两个群体都将接受 mcao。
图 1: 联合镇痛治疗和非洲经委会结扎术在 mcao 之后的结果遗漏.(a) 两组体重 (以 mcao 前体重的百分比) 均在 mcao 之后的前2d 下降。eca-未结扎组 (在 mcao 没有非洲经委会结扎的止痛药) 在 mcao 之后的第二天出现了减肥减少的趋势。(b) 该面板显示了在 mcao 之后48小时用标准三苯基四唑 (ttc) 染色测量的病变体积 (mm3)。所显示的数据是平均±标准偏差。eca 结扎: n = 17, eca 未结扎: n = 10。这一数字已从 trotman-lucas等人处修改。11.请点击此处查看此图的较大版本.
图 2: 示意图, 显示标准 cca 方法和 mcao 之后的替代 cca 修复方法.(a) 本示意图描述了使用适用于 cca 切口两侧的不可溶解缝合线的永久性结扎 cca, 从而导致正确的 cca 永久结扎。(b) 本示意图描述了替代的 cca 修复方法。用一个涂有纤维蛋白原和凝血酶密封剂的小组织垫覆盖 cca 切口, 将其密封, 以便完全灌注正确的 cca。这一数字已从 trotman-lucas等人处修改。11.请点击此处查看此图的较大版本.
图 3: mcao 后的区域脑血流 (rcbf) 参数.在 ccao 结扎组和 ccao 修复组 (mcao 后) 的 mcao 灯丝去除后 5分钟, rcbf 相对于 mcao 期间测量的 rcbf 发生了变化。该面板显示了 cca 容器修理前 (修理前) 和 cca 修理后 5分钟 (修复后) 的 rcbf 数据。两组的长丝摘除后 5分钟 (mcao 后) 显示 rcbf 显著增加。在 cca 修复组进行 cca 修复 (修复后) 之后, rcbf 的另一个增加。mcao 后5分钟与预修复之间的 rcbf 没有差异。所显示的数据是从所分析的时间过程数据报告关键时间点中压缩出来的, 这里是均值±标准偏差。cca 结扎: n = 10, cca 修复: n = 10;** p < 0.01, * ** p < 0.001, ns: 无显著性。这一数字已从 trotman-lucas等人处修改。11.请点击此处查看此图的较大版本.
图 4: 通过 mri 技术获得的病变体积分析.(a) 该面板显示 mcao 之后48小时处的病变体积 (lv; mm 3)、t2 加权 mri 图像 (total lv) 中提取的总 lv 以及 dti 扫描和分析 (核心 lv) 中提取的核心 lv。代表性图像显示了应用 dti 核心病变体积掩码的 t2 扫描切片图像的总病变体积。各组内的变异性显著降低, 总 lv (p = 0.015, cca 修复: n = 10, cca 结扎: n = 10, f-测试) 和核心 lv (p = 0.015, cca修复: n = 9, cca 结扎: n = 6, lavene 的测试), 使用f-测试的参数数据或 levene 测试的非参数数据进行评估。(b) 该面板显示 mcao 之后48小时的 lv, 该 lv 取自 t2 加权 mri 图像, 分为皮质和皮质下病变区域。cca 修复显著降低了病灶皮质部分的数据变异性 (p = 0.03, f-试验), 但对病变皮质下部分的数据变异性没有影响。cca 修复: n = 10, cca 结扎: n = 10。所显示的数据是平均±标准偏差。#p < 0.05 (f-试验), xp < 0.05 (拉文试验)。这一数字已从 trotman-lucas等人处修改。11.请点击此处查看此图的较大版本.
| 方法 | 病变量 (lv; mm3; 平均值± s. d.) |
权力 | 意义水平 | 抗环差 | 所需的组大小 |
| 联合评估 (传统方法) | 9008±53.79 | 0。8 | 0.05 | 30% | n = 58 |
| 共同国家评估修复 (新办法) | 51.73±22.78 | 0。8 | 0.05 | 30% | n = 35 |
表 1: 将传统的 cca 结扎与替代的 cca 修复方法进行比较的代表性功率分析.下表显示了为计算检测控制组、传统或替代 (新) 方法和测试组 (预测) 之间 lv 的显著差异所需的预期组大小而进行的功率分析。该表显示了所需的组大小, 如果假定功率为 0.8, 应用的显著性水平为 0.05, 如果预测的测试组显示 lv 与对照组相差30%。该表显示了两个 mcao 方法 (cca-lige 和 cca 修复) 的结果, 以确定在 lv 中获得30% 差异所需的动物数量是否有差异。对于这两种方法, 假定测试和控制组之间的方差相等。这一数字已从 trotman-lucas等人处修改。11个。
Discussion
在啮齿类动物中 , 小导瞬态 mcao 是最常用的实验中风模型 , 因为它允许再灌注到受影响的区域 , 模仿临床缺血性中风后事件的发生 7 。本文报道了一种替代的手术方法, 以传统的方法文件诱导的瞬态 mcao 小鼠。另一种方法, 包括镇痛治疗、eca 结扎避免和 cca 切口修复, 在使用 mri 和组织学染色方法11进行评估时, 可降低 lv 变异性。
传统的诱导 mcao 的方法在很大程度上依赖于 eca 的横截面, 或至少是结扎, 这已经在大鼠身上被证明会影响饮酒行为和 mcao14之后体重下降的增加。这里定义的协议, 在小鼠中, 避免了 eca 结扎和镇痛的增加, 建议在 mcao 之后减少体重下降, 对病变体积没有影响。在大多数实验中风研究中, 由于可能对实验结果产生混淆影响, 避免使用镇痛, 或至少不报告。然而, 完全避免镇痛并不总是有道理的, 有必要在动物的福利需求与实现科学目标之间取得平衡。
动物大小、应变和脑血管解剖的差异, 除了长丝大小和类型变化外, 都被认为会影响中风结果23,24。这里描述的替代方法避免了再灌注过程中对 cow 的依赖, 从而至少在一定程度上减少了动物之间在病变体积中的变异性。cow 解剖在小鼠中变化很大, 特别是在 C57BL/菌株中, 这在实验中风研究中经常使用。90% 的 c57bl"小鼠由于不同的后交通动脉 (pcoma) 通畅而具有不完全的 cow, 这可能会对 mca 区13以外结构的灌注不足而导致缺血损伤的体积产生影响,25. 如下所示, 修复小鼠的 cca, 导致通过cca 重建到缺血区的血液流动, 如前15只大鼠所述。这里的代表性数据显示, cca 的修复增加了再灌注, 尽管 cca 中的血液流动没有直接测量。然而, 外科医生有可能在血管修复后用血液想象 cca 再灌注, 因为它在修复部位的躯干、近端和远端都恢复到脉动和完全状态。这种视觉确认, 以及缺血区的激光多普勒血流读数, 可以用来确认成功修复血管。组织垫应用与从 cca 中取出血管夹之间的时间会对 cca 的通畅性产生影响, 因为减少组织垫应用与夹子去除之间的时间将阻止组织垫粘附在共同国家评估的对立面。虽然技术上具有挑战性, 但此处解释的替代 mcao 程序不需要任何额外的技能, 而不是在小鼠身上进行 mcao 手术诱导所需的技能。
传统上与结果测量的高变异性相关, 实验性中风研究可能有动力不足的倾向。道德和福利要求加上经济和实际问题可能会导致研究动力不足。通过减少结果的可变性, 从而在实验组中产生更一致的病变结果, 可以进行更有效的功率计算, 最终目的是为研究提供适当的动力。
总之, 这种替代的 cca 修复程序, 在小鼠身上, 导致实验中风后病变体积的变异性较小, 并使较小的实验组能够在适当的功率计算时测试治疗效果使用。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由国家研究中动物更换、提炼和减少中心 (NC3Rs) 资助;nc·m00011--至 cg)。提交人感谢莱斯特大学生物医学服务司的工作人员对实验动物的照顾, 并感谢玛丽亚·维斯卡杜拉基的统计建议。代表性结果在允许的情况下适应从疾病模型& 机制 11。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7 mm flexible single fibre optic probe | Moor Instruments, UK | P10d | Use with master probe code: VP10M200ST |
| 7-0 silicone coated monofilament | Doccol, USA | 701956PKRe | Item dependent on animal size and weight - use manufacteurer guidelines. Product code here was used for representative results shown in article. |
| 9.4T Preclinical MRI system | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | MY11520101 | Equipped with gradient and RF coils suitable for mouse brain imaging |
| Animal monitoring and gating equipment | SA Instruments, Stony Brook, New York, USA | 22124005 | MRI compatible temperature and respiration monitoring |
| Bupivacaine | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 512345 | Marcaine |
| C57BL/6 Mice | Charles River, Oxford, UK | B6JSIMA49D | |
| Carprofen | Norbrook Laboratories | 143658 | Carprieve 5% w/v Small animal solution for injection |
| Chlorhexidine 4% hand cleanser solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | MOLN10008780 | HibiScrub Antimicrobial hand cleanser, Molnlycke Health Care |
| Cotton buds | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 213512 | Any plastic body, cotton bud tip are suitable once made sterile by autoclaving. |
| Dissecting stereoscope | Carl Zeiss | OPMI99 | Resident piece of equipment. Any binocular dissecting stereoscope capable of x1-x5 magnification will be suitable. |
| dissolvable 6-0 sutures | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 9544 | Absorbable Sutures Ethicon Coated Vicryl 6/0 (Ethicon code: W9981) |
| Donut probe holder | Moor Instruments, UK | PHDO | Probe holder for mouse, required to be used with single fibre optic probe when used with laser doppler flowmtry machine. |
| dumont #5 forceps | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 500342 | |
| Fibrinogen and thrombin sealant | Baxter, Berkshire, UK | 1502243 | TISSEEL Ready to use solutions for Sealant 2 mL |
| Gel food | Datesand group, Manchester, UK | 72065022 | Diet Gel Recovery |
| Image display and measuring software package | 3D Slicer | https://www.slicer.org/ | Version 4.0 |
| Image display and measuring software package | NIH, Maryland, USA | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | NIH/ImageJ |
| LDF monitor | Moor Instruments, UK | moorVMS-LDF | |
| micro vannas scissors | InterFocus Ltd, Linton, UK | 15000-08 | Other microvannas spring scissors can be used as an alternative, although fine tips are required. |
| Microvascular clip | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 15911 | 10 G Vessel Clip |
| microvascular clip holders | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 14189 | |
| MRI acquisition and analysis software | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | VnmrJ Version 4.2 | Revision A |
| no. 15 scalpel | Scientific Laboratory Supplies, Nottingham, UK | INS4678 | Sterile No15 Scalpel - manufactuer number P305. Other suppliers are available. |
| Non-disolvable 6-0 suture | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | W529 | Ethicon Mersilk Sutures |
| Ocular lubricant | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 847288 | Lacrilube (5100G13) |
| Optical matching gel | Moor Instruments, UK | PMG | |
| Pulse Oximetry Reader | Starr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, USA | MouseOx | MouseOx - rat & mouse pulse oximeter & physiological monitor Use with mouse thigh sensor. |
| Rehydration gel | Datesand group, Manchester, UK | 70015022 | HydroGel |
| Small hair clippers | vetproductsuk.com | HS61 | Contura Cordless trimmer/clippers |
| Sterile 0.9 % NaCl Solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK |
LOCA3528286 | SODIUM CHLORIDE 0.9% W/V INTRAVENOUS INFUSION BP 500 ML IN ECOFLAC½ PLUS |
| sterile Petri dish | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 5168021 | 50 mm sterile Petri dish. Any brand is suitable. Minimum 50 mm diameter is required. |
| Topical tissue adhesive | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 503763 | GLUture topical Tissue Adhesive |
| Waterproof superglue | Loctite | Loctite Superglue Precision Max | Available at most hardware shops. |
| White paper chip | Datesand group, Manchester, UK | CS1BPB | Pure-O'Cel |
References
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