Summary
Intraluminal filament okklusjon av arterien cerebri er det mest brukte i vivo modellen av eksperimentelle slag i gnagere. En alternativ kirurgisk tilnærming å tillate vanlige arteria carotis reparasjon utføres her, som tillater reperfusion av carotis og en full reperfusion til arteria cerebri territorium.
Abstract
Den iskemiske hjerneslag er en viktig årsak til voksen langsiktige uførhet og død over hele verden. Gjeldende behandlinger tilgjengelig er begrenset, og bare vev plasminogen aktivator (tPA) som en godkjent behandling å målrette iskemiske hjerneslag. Nåværende forskning innen iskemiske hjerneslag fokuserer på bedre forståelse for Patofysiologien ved slag, utvikle og undersøke novel farmasøytiske mål. Pålitelig eksperimentelle slag modeller er avgjørende for utviklingen av mulige behandlinger. Arteria cerebri okklusjon (MCAO) modellen er klinisk relevant og de mest brukte kirurgisk modell av iskemiske hjerneslag i gnagere. Men er resultatene av denne modellen, som lesjon volum, forbundet med høye nivåer av variasjon, spesielt i mus. Alternativ MCAO modellen beskrevet her kan reperfusion av carotis communis (CCA) og den økte perfusjonen av arteria cerebri (MCA) territorium, bruke en vev pad med fibrinogen-baserte tetningsmasse for å reparere skipet og en forbedret velferd av mus ved å unngå eksterne arteria carotis (ECA) hemorroider. Dette reduserer avhengigheten av sirkelen Willis, som er kjent for å være svært anatomisk variabel i mus. Representant data viser at med denne alternative kirurgisk tilnærming reduserer variasjon i lesjon volumer mellom den tradisjonelle tilnærmingen for MCAO og den alternative fremgangsmåten beskrevet her.
Introduction
En viktig årsak til et hjerneslag er fokal iskemi i territoriet til arterien cerebri. Vev plasminogen aktivator (tPA) er bare farmakologisk behandling tilgjengelig med påvist effekt, til tross for mange kliniske studier av narkotika rettet mot iskemiske hjerneslag1,2. Imidlertid sikkerhet bekymringer og et smalt terapeutiske vindu (< 4.5 h), bare ~ 15% av alle slagpasienter, få tPA og recanalization priser kan være < 50%3,4.
Reproduserbar og klinisk relevant dyremodeller av hjerneslag anses viktig å informere utviklingen av nye og potensielle slag terapeutiske behandlinger. På grunn av bekymringer om konsistens og variasjon i resultatene med dyr modeller er det imidlertid viktig å avgrense eksisterende i vivo modeller for å forbedre oversettelsen fra prekliniske studier til klinikken. Mangel på oversettelse fra prekliniske eksperimentelle effekten av potensielle behandlinger klinisk bruk er en pågående bekymring for hjerneslag forskning5. Årsaker til svikt i oversettelse vil være flere kan være relatert til, for eksempel prøve design, behandling forsinkelser, klinisk slag heterogenitet, og begrensningene for dyremodeller6. En viktig utfordring for Neuroscience fortsatt utvikling av sikker og effektiv behandling.
Arteria cerebri okklusjon (MCAO) ved intraluminal filament innsetting er den mest brukte i vivo gnager modellen av eksperimentelle strøk. Denne modellen gjør restaurering av blodstrøm etter en iskemi induksjon, etterligne hendelser som oppstår i menneskelige slag7. Spesielt i mus oppstår heterogene lesjon volumer med variert standardavvik imidlertid selv om definert kirurgisk protokoller er anvendt8,9,10. Det er vanlig å se en bimodale fordeling av små striatal og store striato-kortikale lesjon volumer11. For å indusere iskemi, settes filament vanligvis gjennom et snitt CCA eller ECA som forblir permanent samskrevet12. Den permanente ligation av CCA forhindrer av blodgjennomstrømningen i den interne arteria carotis (ICA) og, senere, MCA territoriet. Dette fører reperfusion å være avhengig av sivile tilbudet i sirkelen av Willis (kua). Ku strukturen har anatomiske variasjoner mellom enkelte dyr, spesielt i C57BL/6 mus-en belastning brukes vanligvis i i vivo slag forskning13. En alternativ metode for filament innsetting gjennom ECA, tillater den fortsatte perfusjonen gjennom CCA, men denne metoden kompromisser arterial tilførsel til ECA territorium, som har vist, i rotter, å ha en skadelig effekt på dyr velvære14.
Avhengigheten av kua for sikkerhetsstillelse forsyning og reperfusion i etablerte MCAO modellen kan delvis utgjør lesjon volum variasjon etter okklusjon. Vi beskriver en alternativ murine kirurgisk prosedyre der ECA ligation unngås og CCA innsnitt er reparert, og tillater reperfusion gjennom CCA, uavhengig av kua. Reparasjon av CCA innsnitt har vist tidligere i rotter å føre en vellykket reperfusion gjennom CCA15. Vi har brukt denne tilnærmingen i mus11 og rapportere her protokollen som resulterer i en redusert variasjon i lesjon volum, viktigste utfallet tiltaket brukt i eksperimentell slag studier.
I denne protokollen viser vi hvordan å gjennomføre MCAO gjennom CCA fartøyet filament innsetting etterfulgt av CCA fartøyet reparasjon, som innebærer en vev pad og tetningsmasse søknad å tillate reperfusion.
Protocol
Denne protokollen og dataene rapportert ble utført i henhold til UK dyr (vitenskapelig prosedyrer) Act, 1986 (Project license 60/4315) og etter institusjonelle etiske godkjenning. Alle eksperimenter er rapportert i samsvar med dyr forskning: rapportering I Vivo eksperimenter (ANKOMME) retningslinjer16.
1. forberedelse
- Bli voksne mannlige C57BL/6 mus postoperativ behandling (f.eks, miljø, sengetøy, utvinning mat) minst 48 timer før operasjonen.
Merk: Post-MCAO dyr ofte har problemer med mat og drikke etter operasjonen.- For å hindre overdreven vekttap etter operasjonen, acclimatize dyr til enhver stolpe-MCAO diett, for eksempel å plassere rehydrering gel, gel mat og gjennomvåt/våt normale kosthold pellets direkte på bur gulvet.
- Endre bur sengetøy til postoperativ sengetøy, for eksempel hvitt papir chip.
- Sterilisere alle kirurgiske verktøy før du begynner kirurgisk oppsett eller prosedyrer.
- Gjøre dette ved autoklavering verktøy (med minimum 121 ° C, 15 psi, i 15 min) eller ved hjelp av etylenoksid (etter riktig produsentens instruksjoner, 8-10 h).
- Desinfiser alle overflater før sette opp prosedyren. Dekke alle flater med sterilt kirurgisk gardiner eller autoklaveres folie for elementer som krever håndtering under operasjonen. Bruk steril teknikk for varigheten av prosedyren.
Merk: Autoklaveres folie kan brukes til å dekke instrumenter eller utstyr som skal holdes under operasjonen. Bruke sterilt hansker og teknikker, folien kan brukes og deretter varen kan plasseres i det sterile feltet. Etter vil en sterile hansken endring være nødvendig.
2. arteria cerebri okklusjon kirurgi
- Bruk voksne mannlige C57BL/6 mus veiing 24 – 31 g ved kirurgi. Indusere anestesi bruker 5% isoflurane i 2 L/min O2, i en rød plast anestesi kammer.
- Etter innledningen, redusere isoflurane å opprettholde et tilstrekkelig anestesi dybde for operasjonen (f.eks, 1,5-2% i 70% N2O2/30% O2) levert av ansiktsmaske kombinert med en renovasjonsarbeider å senke kirurgens eksponering for isoflurane.
Merk: lystgass (N2O2) kan brukes i kombinasjon med oksygen (O2) å redusere den nødvendige mengden av isoflurane for en tilstrekkelig anestesi dybde. - Administrere systemisk analgesi pre-operatively [carprofen, 10 mg/kg subcutaneous (sc.)] og lokal anestesi innsnitt (bupivacaine, 2 mg/kg sc., fortynnes 1:10 i 0,9% saltvann) peri-operativt.
- Administrere væsker ved intraperitoneal (ip.) injeksjoner av 200 µL av sterile prewarmed 0,9% NaCl løsning pre-operatively.
- Barbere pelsen til høyre timelige regionen og ventrale nakken regionen bruker små hårklippere for å utsette huden. Desinfiser kirurgiske huden området, bruker en 5% chlorhexidine løsning for 3 min. Bruk okulær smøremiddel på begge øynene, hindre dem i å tørke under operasjonen.
Merk: Hvis nødvendig for puls oximetry opplesninger skjermen blod oksygenmetning, hjertefrekvens og pustefrekvens, bruke hår fjerning krem fjerne det bakben ben av hår. Påføring av kremen med ren bomull knopper og etter hårfjerning, vaske området med fortynnet chlorhexidine løsningen. Utføre dette trinnet i et pre-operative å minimere risikoen for løs pels forurensende sterilt kirurgiske feltet. Forskere kanskje foretrekke å bruke andre kirurgiske forberedelser i henhold til lokal praksis. - Overføre musen til det kirurgiske området og plasser den i liggende stilling på en homeothermic varme mat dekket av et sterilt drapere. Opprettholde anestesi via en nesen kjegle. Sette inn en endetarms probe for å overvåke musen er kroppstemperatur og opprettholde den på 37.0 ± 0,6 ° C.
- Før noen kirurgiske snitt, sjekk det bakben pote uttak refleks og blinker refleks for å bekrefte anestesi dybden.
- Knytte en laser Doppler flowmetry (LDF) probe for å registrere blodstrømmen til MCA territorium.
- Bruke en disseksjon stereoscope, lage et snitt på < 1 cm midt mellom høyre øye og øre på utsatte timelige huden med nei 15 skalpell. Rett ut dissekere underliggende vev som dekker skallen, forsiktig skrape dette fra benet og tørking overflaten med steril bomull vattpinner.
Merk: Omsorg må tas ikke å skade temporalis muskelen. - Ta tak i de 0,7 mm, fleksibel enkelt fiberoptisk sonde knyttet LDF skjermen kuttet sin ende med en skarp skalpell å få en flat kant, presse dette gjennom smultring-formet sonde holderen og plassere en liten mengde optisk samsvarende gel på slutten av fiber.
- Plassere en liten mengde vanntett super selvklebende lim rundt kanten av sonden holderen; kan dette delvis tørke og bli tacky.
- Tørr skallen over temporal benet og plassere en liten mengde aktuell vev limet i en sirkel til benet, bare nok for innehaveren av sonden.
- Plassere sonde innehaveren, med fiber optisk proben allerede på plass, på dette området (6 mm lateral og 2 mm distale fra bregma).
- Gi tid for limet tørke; Når tørr og festet, begynne innspillingen LDF dataene.
- Bruke en disseksjon stereoscope, lage et snitt på < 1 cm midt mellom høyre øye og øre på utsatte timelige huden med nei 15 skalpell. Rett ut dissekere underliggende vev som dekker skallen, forsiktig skrape dette fra benet og tørking overflaten med steril bomull vattpinner.
- Forsiktig snu dyret til supine posisjon, ta vare å støtte laser Doppler sonden og hindre dens avdeling. Forsiktig bånd de to forepaws ned med mikroporøs legeundersøkelse tape, skyve et par bomull knopper (eller noe lignende, for eksempel stengt tang) under halsen for å løfte området og skape spenning. Dekk musen med en bakteriefri drapere å opprettholde aseptiske dekning.
- Starte disseksjon og eksponering av CCA.
- Gjøre en 1,5 cm midtlinjen snitt på utsatte ventrale halsen med et nei 15 skalpell blad.
- Bruke skånsom sløv disseksjon teknikker, forsiktig trekke spyttkjertler til sidene, utsette luftrøret.
- Bruker sløv disseksjon, dissekere CCA fri fra omkringliggende vev og vagal nerve.
Merk: Unngå å berøre vagal nerve direkte, som skade vagal nerve kan svekke mobilitet, fôring, og puste.
- Passere to små (2 cm) deler av et ikke-dissolvable 6-0 Sutur under CCA, dorsal fartøyet og ventrale til vagal nerve. Trekke en silke slips nærmere kirurgen og binde den hardt rundt CCA (proksimale tie). Løst tie andre silke slips (distale tie) mot bifurkasjonen av ICA/ECA.
- For å begynne å isolere en del av CCA, bruke en mikrovaskulær klipp like over den distale knytte men ikke hindrer bifurkasjonen. Bruke micro Vannas saks, lage et lite hull i CCA.
Merk: ECA må være patent til alle tider. CCA innsnitt må være mer enn 40% av bredden av fartøyet og en lett tilgjengelig ventrale posisjon; Dette vil spille en viktig rolle i fartøyet reparasjon scenen innlegg-MCAO. - En 7-0 silikon-belagt monofilament inn CCA, fremme mot mikrovaskulær klippet.
Merk: Filament størrelsen må opprettes basert på musen er vekt før operasjonen; Se produsentens retningslinjer.- Stram distale slips, nok til å feste filament på plass uten å skade den. Fjerne mikrovaskulær klippet bruker klipp holdere.
Merk: Ingen blodtap bør bli sett på dette punktet. Hvis det er en tilbakestrømming av blod, er tie holder filament ikke tett.
- Stram distale slips, nok til å feste filament på plass uten å skade den. Fjerne mikrovaskulær klippet bruker klipp holdere.
- Gå til filament i ICA.
- Sikre filament forblir i ICA og går ikke til arteria pterygopalatine (PPA). Gjør dette ved å løfte litt og trekke CCA, bruke en av silke båndene, til av dyrets kroppen, og styre filament bøye forbi internt mot åpningen av PPA.
Merk: Når avansert til MCA gren opprinnelsen, vil en nedgang i relativ blodstrømmen til angitte territorium være synlig på LDF verdier. Dette bekrefter filament plasseringen.
- Sikre filament forblir i ICA og går ikke til arteria pterygopalatine (PPA). Gjør dette ved å løfte litt og trekke CCA, bruke en av silke båndene, til av dyrets kroppen, og styre filament bøye forbi internt mot åpningen av PPA.
- Sikre filament i sted med det distale silke slipset, knytte denne strammere. La det for varigheten av okklusjon tidsperiode.
Bemerk: Avhengig på enkelte protokoller, dyret kan flyttes til en utvinning bur, følgende sår suturing, for å gjenopprette, eller forbli under anestesi for varigheten av okklusjon perioden. I sistnevnte tilfelle at såret ikke tørker ut ved hjelp av sterile prewarmed 0,9% NaCl saltvann.
3. etter okklusjon
- På slutten av MCAO periode, umiddelbart trekke filament til hvit filament hodet er klart synlig.
- Deretter løsne den distale CCA tie akkurat nok til å fjerne filament hodet mesteparten av veien ut av fartøyet.
Merk: Filament kan fjernes fullstendig på dette punktet hvis kirurgen er trygg med hastigheten å binde den distale slipset for å hindre blodtap av. - Plass ett mikrovaskulær klipp i vannrett stilling mot CCA bifurkasjonen ved distale slipset. Løsne den distale slipset og fjerne filament fullt. Legge til en annen mikrovaskulær hefte neden den proksimale CCA uavgjort mot kirurgen.
Merk: Kontroller fartøyet er langt ned utstikkerne klemmen å hindre noen glidning. Plassering av klippene er avgjørende for å sikre klipp removers enkel tilgang under senere trinn. Utklippene kan brukes til å løfte skipet for å tillate en bedre klarering og plassering av vev oppdateringen, plassere klipp vannrett over de omkringliggende musklene. - Nøye fjerne begge silke slips Dumont #5 tang eller mikro Vannas saks og tørr området bruker steril bomull knopper.
Merk: Omsorg må tas ikke å skjære gjennom/fartøyet. - Legg fibrinogen trombin fugemasse løsninger og 1 og 2 (se Tabell for materiale), sikre de to stoffene blir separate, klar for å blande senere i et sterilt Petriskål.
Merk: Bare svært små mengder agenter er nødvendig (< 0,25 mL hver). Holde løsningene separat hindrer en forhastet reaksjon mellom to bestanddeler. Sikre lokket erstattes på samme måte som det ble fjernet for å forhindre kryss-kontaminering av to sprøyter, som kan forårsake agent til å reagere og ligger i sprøyten. Før bruk må lagre løsninger på 20 ° C. Ved behov for første inngrepet, tine tetningsmasse til romtemperatur. Ikke refreeze tetningsmasse; Det må være ved romtemperatur og kan lagres på denne måten. Sprøyten kan brukes på tvers av flere operasjoner gjør det kostnadseffektiv; Vi anbefaler å ikke bruke samme ampullen lenger enn en uke for å hindre forurensning. - Bruke sløv disseksjon langs muskler med Dumont nr 5 tang og mikro Vannas saks for å få en tynn ventrale skive sternocleidomastoid-muskelen bruke vev puten, sikre stykket er mer enn 1 mm tykk og går langs øverste fiber av muskelen.
Merk: Ikke klippe gjennom/over muskler, som dette vil betydelig svekke dens funksjon. Vevet må være stor nok til å dekke CCA innsnitt komfortabelt. - Bruker Dumont #5 tang, ta vev puten og bland vevet jevnt over de to fibrinogen og trombin fugemasse løsninger, danner en kanal mellom de to reagensene. Koagulering vil skje fort; så snart koagulering begynner, fjerne vev puten å CCA innsnitt. Plass vev puten flat med en middels fast trykk og åpne tang.
- Raskt fjerne distale mikrovaskulær klippet mens fortsatt forsiktig holder vev puten på plass.
Merk: Dette gjør noen tilbakestrømming av blod å aktivere fibrinogen og trombin fugemasse reagensene videre. Akkurat nok press er nødvendig å holde puten på plass, men ikke å fullstendig blokkere fartøyet. - Sakte lette trykket fra vev pad, slik at blodet kan strømme under området snitt. Nå, sakte og forsiktig slipp trykket fra proksimale mikrovaskulær klippet og helt fjerne.
- Merk: For å sikre fartøyet blir fullt patent, plassering av vev puten og fjerning av mikrovaskulær klippene må skje raskt for å hindre at vev puten tetting på innsiden av CCA. Men hvis det er en liten mengde blod lekkasje, nytt sted noen lett trykk på vev puten å tillate mer tid til blodpropp dannelse og tetting oppstår. Hvis blod lekkasje er betydelig eller vev puten synes ikke å være tetting, opprettholde trykket for å hindre blodtap av og erstatte både CCA mikrovaskulær hefte å isolere innsnitt og hindre ytterligere blodtap.
- Raskt fjerne distale mikrovaskulær klippet mens fortsatt forsiktig holder vev puten på plass.
- I tilfelle vev puten ikke lenger til fartøyet, gjøres et nytt forsøk, etter trinn 3.3-3.7.3.
- Når fartøyet er forseglet, Sutur såret bruker dissolvable 6-0 suturer. Hvis LDF innspillingen ble videreført gjennom kirurgi, fjerne LDF fra skallen og Sutur såret bruker dissolvable 6-0 Sutur.
4. postoperativ pleie
- Plassere dyret i prewarmed utvinning bur (plassert på en oppvarmet sokkel/mat på 35 ° C eller i en oppvarmet kammer).
Merk: Forskere kanskje foretrekke å bruke andre temperaturer og varighet i henhold til lokal praksis. - Gi alle dyr med 200 µL av prewarmed 0,9% NaCl saltvann sc. umiddelbart etter operasjon, 4 h etter operasjon, og 2 x daglig 72 h.
Merk: Av prewarmed 0,9% NaCl er dyr ledet. Hvis flere kreves, kan mer væske gis for å sikre en god utvinning. - I utvinning buret, gi dyr ubegrenset tilgang til våt kosthold pellets, diett pellets, rehydrering gel og gel mat, sammen med annonsen libitum tilgang til vann.
- Gjenta sc. carprofen injeksjon på 24 timer etter operasjon (se trinn 2.3).
Merk: Alle dyrene fikk den samme dosen av carprofen; noen neuroprotective effekten er sannsynlig å være ubetydelig. - Regelmessig 48 h, utføre post-op musen grimase scoret17 for å vurdere smerte nivåer for å hjelpe beslutningen om å administrere ytterligere analgesi.
- Veie dyrene like før kirurgi og deretter daglig følge fremgangsmåten. Utføre daglige observasjoner og complete velferd ark å overvåke deres mat og vanninntak og klinisk underskriver.
- Foreta funksjonelle observasjoner på 24 timer og 48 timer etter operasjon. Vurdere musene i fokal underskudd skala. Evaluere deres kropp symmetri, obligatorisk sirkle, gangart, 45° rutenettet klatring, sirkle atferd, foran lem asymmetri og whisker touch svar18,19,20.
5. magnetisk resonans Imaging og bildebehandling
- Måle lesjon volumet (LV) bruker strukturelle magnetisk resonans imaging (MRI).
Merk: Alternative metoder, for eksempel histologiske flekker med triphenyltetrazolium chloride (TTC), har tidligere blitt brukt og relateres til strukturelle MRI data. Men kan denne metoden bare brukes ved endepunktet av en studie og ikke langs. Bruke langsgående MRI-skanning vil redusere antall dyr kreves for en studie.- Etter 48 timer, etter induksjon av MCAO, bedøve musen med isoflurane (5% isoflurane i 1 L/min O2 for induksjon), 1,5-2% isoflurane for vedlikehold.
- Overføre musen til Mr holderen, plassere den på åndedrett sensoren for overvåking dens pustefrekvens og implantat endetarms temperatur probe for å overvåke sin temperatur under skanningen. Sted 2-kanals mus-hjerne RF motta coil over hjernen for et signal og place vugge en 9,4 T horisontal bar skanner.
Merk: Her en volum coil med 72 mm indre diameter ble brukt for RF-overføringen. - Erverve T2-vektet skanner med en rask spinn-echo sekvens. Angi repetisjon tiden (TR) til 3000 ms og ekko tid (TE) til 40 ms. bruk 18 mm x 18 mm som synsfelt (FOV), og få en 256 x 256 oppkjøpet matrise med skiver av 18 x 0,8 mm og tre signal gjennomsnitt ca 10 min.
- Hente diffusjon tensoren bilder (DTI) bruker en rask spinn-echo sekvens. Angi TR til 1,730 ms, TE til 35 ms, FOV 20 mm x 20 mm, og få en 128 x 128 oppkjøpet matrise med skiver av 16 mm x 1 mm, to signal gjennomsnitt, 14 diffusjon koding retninger og en maksimal b-verdien 1024 s/mm2.
- Måle LV på T2-vektet bilder via en bilde og måle programvarepakke. Måle lesioned området, sortere verdiene for å beregne totalt lesjon volumet mens hensyntatt MRI skive tykkelsen (satt under MRI-skanning).
- Ta hensyn noen hevelse og andelen av området lesjon volumer mens å måle full kontralateral og ipsilateral halvkuler. Riktig for noen hjernen hevelse på grunn av ødem bruker en indirekte metode for å måle lesjon volumet som beskrevet tidligere21,22. Bare inkludere skiver som inneholder cortex vev og ikke frontallappen eller lillehjernen vev etter en standardmus hjernen atlas å unngå overcorrection.
- Måle parameterne lesjon diffusjon og få kjernen og penumbra områdene rundt.
- Generere tilsynelatende diffusjon koeffisient (ADC) og fractional anisotropy (FA) kart fra diffusjon tensoren bilder med riktig MRI analyseprogramvare.
- Justere DTI bildene med T2-vektet bilder ved hjelp av aktuelle bildet analyseprogramvare som kan utføre en lineær registrering av bilder. Etter registreringen, trekke diffusion-vektet lesjon masker (iskemisk kjernen) fra T2-vektet lesjon maskene iskemisk kjernen og penumbra anslå regionen penumbra. Bruke resulterende masker (kjernen og penumbra) ADC og FA kartene å kvantifisere diffusjon parameterne i kjernen og penumbra.
- Oversette ipsilateral kjernen og penumbra maskene om hjernen midtlinjen for å få kontralateral ADC og FA verdier for sammenligning.
Representative Results
Totalt 24 voksne mannlige C57BL/6 mus, veier mellom 24 – 31 g ved kirurgi, ble brukt i studien. En dyr døde etter arteria cerebri okklusjon (MCAO) og en var utelukket fordi kirurgiske komplikasjoner. Dataene som presenteres her er Hentet fra en tidligere publiserte arbeider av forfatterne. Disse ble brukt til å illustrere effekten av fartøyet reparasjon på MCAO resultater11. Alle data uttrykkes som thr gjennomsnittlig ± standardavvik. Dataene var statistisk vurdert for normalitet bruker D'Agostino-Pearson omnibus normalitet testen. Parametrisk data ble sammenlignet med Student t-test (for to gjennomsnitt) og veis VARIANSANALYSE med Sidak test (flere betyr). Ikke-parametriske data ble sammenlignet med Mann-Whitney U testen. Variasjon av parametrisk dataene ble vurdert ved hjelp av en F-test, og ikke-parametriske data variasjon ble vurdert bruker Levene's test.
Vanligvis i MCAO prosedyrer, den occluding filament settes inn i CCA og ECA er samskrevet for å forhindre dette fra bestått til ECA i stedet for ICA. En unngåelse av ECA ligatur og tillegg av analgesi viste en trend mot redusert vekttap på 48t post-MCAO, i forhold til data fra tidligere studier gjennomført ved den samme kirurgen for MCAO samtidig med ingen analgesi, ECA ligation mens LV dukket opp upåvirket, se figur 1.
Mus gjennomgikk en 60 min MCAO-indusert iskemi etterfulgt av reperfusion CCA fartøyet reparasjon eller den typiske ligation av CCA tilnærming. En skjematisk av samskrevet og unligated reparerte CCA er vist i figur 2.
Laser Doppler flowmetry ble brukt til å bekrefte den blodet flyt perfusjonen i territorium av MCA på MCAO, før og etter CCA fartøyet reparasjon. Figur 3 viser at 5 min etter at filament, regionale cerebral blodstrøm (rCBF) betydelig økt i hjernen regionen MCA. Perfusjonen ble opprettholdt til fartøyet reparasjon, med en økning i perfusjon til MCA territorium vises etter CCA fartøyet reparasjon, antyder at CCA reparasjon tillatt en økt blodstrøm perfusjon til iskemiske territorium sammenlignet avhengighet på de sirkel av Willis alene.
T2-vektet MRI ble brukt til å bestemme den totale LV og DTI skanner ble brukt til å finne kjernen LV, 48 timer etter MCAO. Figur 4A viser ingen signifikant forskjell i totalt eller core LV mellom reparasjon og samskrevet prosedyren grupper. Imidlertid dataene variasjon både totalt og kjernen LV, som vurdert bruker Lavene's test for ikke-parametriske eller F-test parametrisk data, ble betydelig redusert i gruppen CCA reparasjon. Totalt LV var inndelt i kortikale og subkortikal LV, som vist i figur 4B. Delen kortikale var betydelig mindre variabel i gruppen CCA reparasjon mens den sub kortikale delen av lesjonen var upåvirket mellom de to fremgangsmåter for gruppene.
En makt analyse indikerte at færre dyr per behandlingsgruppe ville være nødvendig å demonstrere en 30% reduksjon i LV etter MCAO bruker CCA reparasjon versus typisk CCA-samskrevet prosedyren, se tabell 1. Overtar power 1-β = 0,8 og signifikansnivået α = 0,05 og en forutsigelse av 30% reduksjon i LV mellom hypotetisk kontroll og test grupper ble brukt for makt analyse. Videre ble det antatt en lik varians mellom gruppene. Tabell 1 viser antall dyr kreves for testen og kontroll grupper når enten den typiske CCA-samskrevet metoden brukes eller oppdatert CCA reparasjonsmetoden, som beskrevet her, brukes. Merk at testgruppen refererer til en hypotetisk behandlet gruppe dyr og kontrollgruppen refererer til en hypotetisk kontrollgruppe; begge grupper gjennomgå MCAO.
Figur 1: kombinert analgesi behandling og unnlatelse av ECA ligation på resultater etter MCAO. (A) kroppsvekt, vises som en prosent av pre-MCAO vekt, redusert første 2 d etter MCAO for begge grupper. Gruppen ECA-unligated (analgesi-behandlet med ingen ECA ligation på MCAO) viste en trend mot redusert vekttap på den andre dagen etter MCAO. (B) dette panelet viser lesjon volumet (mm3) målt ved standard triphenyltetrazolium chloride (TTC) flekker 48 timer etter MCAO. Dataene er gjennomsnittlig ± standardavviket. ECA samskrevet: n = 17, ECA unligated: n = 10. Dette tallet har blitt endret fra Trotman-Lucas et al. 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: skjematisk viser CCA standardmetoden og den alternative CCA reparere metoden etter MCAO. (A) dette skjematisk viser en permanent ligated CCA bruker ikke-dissolvable suturer på hver side av CCA snitt, noe som resulterer i den permanente ligation av den høyre CCA. (B) dette skjematisk viser alternative CCA reparasjonsmetoden. En liten vev pad belagt med fibrinogen og trombin fugemasse brukes til å dekke CCA snitt, tetting slik at den tillater full perfusjon av høyre CCA. Dette tallet har blitt endret fra Trotman-Lucas et al. 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: regionale hjerne blod flyte (rCBF) parametere følge MCAO. RCBF endret 5 min etter MCAO filament fjerning for begge CCA-samskrevet og CCA-reparert gruppene (post-MCAO), i forhold til rCBF målt under MCAO. Dette panelet viser rCBF data umiddelbart før CCA fartøyet reparasjon (før reparasjon) og 5 min etter CCA reparasjon (etter reparasjon). Betydelig økning i rCBF vises 5 min etter filament fjerning (post-MCAO) i begge gruppene. En ytterligere økning i rCBF vises følgende CCA reparasjon (etter reparasjon) i gruppen CCA reparasjon. Ingen forskjell i rCBF vises mellom 5 min post-MCAO og før reparasjon. Dataene er tatt fra den analyserte tid-retters data rapportering nøkkel tidspunkt, her som gjennomsnittlig ± standardavviket. CCA samskrevet: n = 10, CCA reparert: n = 10; P < 0,01, ***P < 0,001, ns: ikke betydning. Dette tallet har blitt endret fra Trotman-Lucas et al. 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: analyse av lesjon innhentet av Mr teknikker. (A) dette panelet viser lesjon volumet (LV, mm3) på 48 timer etter MCAO, totalt LV tatt fra T2-vektet MRI bilder (totalt LV) og kjernen LV tatt fra DTI skanner og analyse (kjernen LV). Representant bilder viser den totale lesjon volumet fra en T2 skanning del opp bilde med DTI kjernen lesjon volum maske brukt. Variasjon innenfor gruppene ble betydelig redusert for både totale LV (P = 0.015, CCA reparasjon: n = 10, CCA samskrevet: n = 10, F-test) og kjernen LV (P = 0.043, CCA reparasjon: n = 9, CCA samskrevet: n = 6, Lavene's test), vurdert ved hjelp av en F-test for parametrisk data eller Levene's test ikke-parametriske data. (B) dette panelet viser LV på 48 timer etter MCAO, fra T2-vektet MRI bilder og delt inn i kortikale og subkortikal lesjon områder. CCA reparasjon betydelig redusert data variasjon (P = 0,03, F-test) i kortikale delen av lesjonen, men ingen innvirkning på dataene variasjon i subkortikal delen av lesjonen ble vist. CCA reparasjon: n = 10, CCA samskrevet: n = 10. Dataene er gjennomsnittlig ± standardavviket. # P < 0,05 (F-test), xP < 0,05 (Lavene's test). Dette tallet har blitt endret fra Trotman-Lucas et al. 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Tilnærming | Lesjonen volum (LV, mm3, gjennomsnittlig ± SD) |
Strøm | Signifikansnivået | Anticiapted forskjellen | Gruppestørrelsen kreves |
| CCA samskrevet (tradisjonell tilnærming) | 94.08 ± 53.79 | 0,8 | 0,05 | 30% | n = 58 |
| CCA reparert (ny tilnærming) | 51.73 ± 22.78 | 0,8 | 0,05 | 30% | n = 35 |
Tabell 1: representant makt analyse sammenligne tradisjonelle CCA ligation med alternativ CCA reparere metoden forklart her. Denne tabellen viser makt analyse utført for å beregne forventede gruppestørrelsen kreves for å gjenkjenne en betydelig forskjell i LV mellom en kontrollgruppe, tradisjonell eller alternativ (ny) tilnærming og en testgruppe (spådd). Tabellen viser gruppen størrelser som kreves hvis en strøm av 0,8 antas, et signifikansnivå på 0,05 brukes, og hvis spådd testgruppen viser en 30% forskjell i LV sammenlignet med kontrollgruppen. Tabellen viser resultater for begge MCAO tilnærminger (CCA-samskrevet og CCA-repareres) å avgjøre om det er en forskjell i antall dyr nødvendig for å få en 30% aldersforskjell LV. For begge metodene antas en lik varians mellom testen og kontrollgruppen. Dette tallet har blitt endret fra Trotman-Lucas et al. 11.
Discussion
Filament induksjon av forbigående MCAO i gnagere er mest brukte eksperimentelle slag modellen, som det tillater reperfusion til det berørte området, etterligne forekomsten av hendelser etter klinisk iskemiske hjerneslag7. Rapporterte her er en alternativ kirurgisk tilnærming til den tradisjonelle metoden for filament-indusert forbigående MCAO i mus. Alternativ tilnærming, som involverer analgesi behandling, ECA ligation unngåelse og CCA snitt reparasjon, resulterer i en redusert LV variasjon når vurdert hjelp MRI og histologiske flekker metoder11.
Tradisjonelle tilnærminger å indusere MCAO i stor grad stole på transection, eller på minst ligation, av ECA, som har vist, i rotter, å påvirke drikker atferd og en økning i kroppen vekttap etter MCAO14. Protokollen definert her, i mus, med unngåelse av ECA ligatur og analgesi tillegg foreslo en reduksjon i kroppen vekttap etter MCAO med nei bevirke på lesjon volumet. Bruk av analgesi er unngått, eller i det minste ikke rapportert, i fleste eksperimentelle slag studier, på grunn av mulige forvirrende effekter på eksperimentell utfallet. Men unngå analgesi helt ikke alltid rettferdiggjøres og det er behov for å balansere velferd behov dyrene av de vitenskapelige målsettingene.
Forskjeller i dyr størrelse, belastning og cerebrovascular anatomi, i tillegg til filament størrelse og type variasjoner, er alle foreslo for å påvirke slag resultater23,24. Den alternative fremgangsmåten beskrevet her unngår avhengigheten kua under reperfusion, dermed redusere, minst delvis variasjon sett mellom dyr i lesjon volum. Ku anatomi er svært variabel i mus, spesielt i C57BL /6 belastning, som ofte brukes i eksperimentell slag studier. 90% av C57BL/6 mus har en ufullstendig kua på grunn av en variert bakre kommuniserende arterie (PcomA) patency, som kan ha en effekt på volumet av iskemiske skader på grunn av utilstrekkelig perfusjon av strukturer utenfor den MCA territorium13, 25. reparasjon CCA i mus, som vist her, resultat av blod flyte via CCA iskemiske området, som tidligere beskrevet i rotter15. Representant data her viser at reparasjon av CCA øker reperfusion, selv om blodstrømmen i CCA ikke var direkte målt. Det er imidlertid mulig for kirurgen visualisere CCA reperfuse med blod etter reparasjon, er fartøy som returneres til en pulserende og full tilstand langs bagasjerommet, proksimale og distale til reparasjon stedet. Dette visuell bekreftelse, sammen med laser Doppler flowmetry målinger av iskemiske området, kan brukes til å bekrefte vellykket reparasjon av fartøyet. Tiden mellom vev pad søknaden og fjerning av fartøyet klippet fra CCA kan ha innvirkning på den resulterende patency av CCA, som reduserer tiden mellom vev pad programmet og klipp fjerning vil forhindre vev puten følge o pposite siden av CCA. Selv om teknisk utfordrende, krever ikke den alternative MCAO prosedyren forklart her noen flere ferdigheter enn de som kreves for å utføre kirurgisk induksjon av MCAO i mus.
Tradisjonelt blir assosiert med en høy variasjon i utfallsmål, kan eksperimentelle slag studier ha en tendens til å være underpowered. Etiske og velferd krav i kombinasjon med økonomisk og praktisk bekymringer kan bidra til studier er underpowered. Ved å redusere variasjon i utfallet, og derfor produserer mer konsekvent lesjon resultater over en forsøksgruppen, kan mer effektiv makt beregninger utføres med det endelige målet for studier å være hensiktsmessig drevet.
Avslutningsvis denne alternative CCA reparasjonsprosedyren, i mus, resulterer i mindre variasjon i lesjon volum etter eksperimentelle slag og gjør mindre eksperimentelle grupper behov for testing en behandlingseffekt når passende makt beregninger brukes.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av National Centre for erstatning, raffinement og reduksjon av dyr i forskning (NC3Rs; NC/M000117/1 til CG). Forfatterne takker hos divisjon i biomedisinsk Services, University of Leicester, til vedlikehold av forsøksdyr og Maria Viskaduraki for hennes statistiske råd. Representant resultatene er tilpasset med tillatelse fra Disease modeller & mekanismer11.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7 mm flexible single fibre optic probe | Moor Instruments, UK | P10d | Use with master probe code: VP10M200ST |
| 7-0 silicone coated monofilament | Doccol, USA | 701956PKRe | Item dependent on animal size and weight - use manufacteurer guidelines. Product code here was used for representative results shown in article. |
| 9.4T Preclinical MRI system | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | MY11520101 | Equipped with gradient and RF coils suitable for mouse brain imaging |
| Animal monitoring and gating equipment | SA Instruments, Stony Brook, New York, USA | 22124005 | MRI compatible temperature and respiration monitoring |
| Bupivacaine | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 512345 | Marcaine |
| C57BL/6 Mice | Charles River, Oxford, UK | B6JSIMA49D | |
| Carprofen | Norbrook Laboratories | 143658 | Carprieve 5% w/v Small animal solution for injection |
| Chlorhexidine 4% hand cleanser solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | MOLN10008780 | HibiScrub Antimicrobial hand cleanser, Molnlycke Health Care |
| Cotton buds | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 213512 | Any plastic body, cotton bud tip are suitable once made sterile by autoclaving. |
| Dissecting stereoscope | Carl Zeiss | OPMI99 | Resident piece of equipment. Any binocular dissecting stereoscope capable of x1-x5 magnification will be suitable. |
| dissolvable 6-0 sutures | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 9544 | Absorbable Sutures Ethicon Coated Vicryl 6/0 (Ethicon code: W9981) |
| Donut probe holder | Moor Instruments, UK | PHDO | Probe holder for mouse, required to be used with single fibre optic probe when used with laser doppler flowmtry machine. |
| dumont #5 forceps | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 500342 | |
| Fibrinogen and thrombin sealant | Baxter, Berkshire, UK | 1502243 | TISSEEL Ready to use solutions for Sealant 2 mL |
| Gel food | Datesand group, Manchester, UK | 72065022 | Diet Gel Recovery |
| Image display and measuring software package | 3D Slicer | https://www.slicer.org/ | Version 4.0 |
| Image display and measuring software package | NIH, Maryland, USA | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | NIH/ImageJ |
| LDF monitor | Moor Instruments, UK | moorVMS-LDF | |
| micro vannas scissors | InterFocus Ltd, Linton, UK | 15000-08 | Other microvannas spring scissors can be used as an alternative, although fine tips are required. |
| Microvascular clip | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 15911 | 10 G Vessel Clip |
| microvascular clip holders | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 14189 | |
| MRI acquisition and analysis software | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | VnmrJ Version 4.2 | Revision A |
| no. 15 scalpel | Scientific Laboratory Supplies, Nottingham, UK | INS4678 | Sterile No15 Scalpel - manufactuer number P305. Other suppliers are available. |
| Non-disolvable 6-0 suture | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | W529 | Ethicon Mersilk Sutures |
| Ocular lubricant | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 847288 | Lacrilube (5100G13) |
| Optical matching gel | Moor Instruments, UK | PMG | |
| Pulse Oximetry Reader | Starr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, USA | MouseOx | MouseOx - rat & mouse pulse oximeter & physiological monitor Use with mouse thigh sensor. |
| Rehydration gel | Datesand group, Manchester, UK | 70015022 | HydroGel |
| Small hair clippers | vetproductsuk.com | HS61 | Contura Cordless trimmer/clippers |
| Sterile 0.9 % NaCl Solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK |
LOCA3528286 | SODIUM CHLORIDE 0.9% W/V INTRAVENOUS INFUSION BP 500 ML IN ECOFLAC½ PLUS |
| sterile Petri dish | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 5168021 | 50 mm sterile Petri dish. Any brand is suitable. Minimum 50 mm diameter is required. |
| Topical tissue adhesive | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 503763 | GLUture topical Tissue Adhesive |
| Waterproof superglue | Loctite | Loctite Superglue Precision Max | Available at most hardware shops. |
| White paper chip | Datesand group, Manchester, UK | CS1BPB | Pure-O'Cel |
References
- O'Collins, V. E., et al. 1,026 Experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
- Sutherland, B. A., et al. Neuroprotection for Ischaemic Stroke: Translation from the Bench to the Bedside. International Journal of Stroke. 7 (5), 407-418 (2012).
- Reeves, M. J., et al. Acute Stroke Care in the US: Results from 4 Pilot Prototypes of the Paul Coverdell National Acute Stroke Registry. Stroke. 36 (6), 1232-1240 (2005).
- Wardlaw, J. M., Murray, V., Berge, E., del Zoppo, G. J. Thrombolysis for acute ischaemic stroke. Cochrane Database of Systematic Reviews. (7), CD000213 (2014).
- Pangalos, M. N., Schechter, L. E., Hurko, O. Drug development for CNS disorders: strategies for balancing risk and reducing attrition. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (7), 521-532 (2007).
- Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathologica. 47 (3), 213-227 (2009).
- Ringelstein, E. B., et al. Type and extent of hemispheric brain infarctions and clinical outcome in early and delayed middle cerebral artery recanalization. Neurology. 42 (2), 289-289 (1992).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: Size, mechanism, and purpose. NeuroRX. 2 (3), 396-409 (2005).
- Dirnagl, U. Bench to Bedside: The Quest for Quality in Experimental Stroke Research. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 26 (12), 1465-1478 (2006).
- Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: a meta-analysis. Scientific Reports. 6, 21086 (2016).
- Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Fern, R., Gibson, C. L. An alternative surgical approach reduces variability following filament induction of experimental stroke in mice. Disease Models & Mechanisms. 10 (7), 931-938 (2017).
- Macrae, I. M. Preclinical stroke research - advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1062-1078 (2011).
- McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Research. 997 (1), 15-23 (2004).
- Trueman, R. C., et al. A Critical Re-Examination of the Intraluminal Filament MCAO Model: Impact of External Carotid Artery Transection. Translational Stroke Research. 2 (4), 651-661 (2011).
- Dittmar, M. S., et al. The role of ECA transection in the development of masticatory lesions in the MCAO filament model. Experimental Neurology. 195 (2), 372-378 (2005).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. Plos Biology. 8 (6), e1000412 (2010).
- Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-479 (2010).
- Orsini, F., et al. Targeting Mannose-Binding Lectin Confers Long-Lasting Protection With a Surprisingly Wide Therapeutic Window in Cerebral Ischemia. Circulation. 126 (12), 1484-1494 (2012).
- Simoni, M. G. D., et al. Neuroprotection by Complement (C1) Inhibitor in Mouse Transient Brain Ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 23 (2), 232-239 (2003).
- Clark, W., Gunion-Rinker, L., Lessov, N., Hazel, K. Citicoline Treatment for Experimental Intracerebral Hemorrhage in Mice. Stroke. 29 (10), 2136-2140 (1998).
- Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of Brain Edema on Infarct Volume in a Focal Cerebral-Ischemia Model in Rats. Stroke. 24 (1), 117-121 (1993).
- Loihl, A. K., Asensio, V., Campbell, I. L., Murphy, S. Expression of nitric oxide synthase (NOS)-2 following permanent focal ischemia and the role of nitric oxide in infarct generation in male, female and NOS-2 gene-deficient mice. Brain Research. 830 (1), 155-164 (1999).
- Connolly, E. S., Winfree, C. J., Stern, D. M., Solomon, R. A., Pinsky, D. J. Procedural and strain-related variables significantly affect outcome in a murine model of focal cerebral ischemia. Neurosurgery. 38 (3), 523-531 (1996).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse Strain Differences in Susceptibility to Cerebral Ischemia are Related to Cerebral Vascular Anatomy. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 13 (4), 683-692 (1993).
- Kitagawa, K., et al. Cerebral Ischemia after Bilateral Carotid Artery Occlusion and Intraluminal Suture Occlusion in Mice: Evaluation of the Patency of the Posterior Communicating Artery. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 18 (5), 570-579 (1998).
