Summary
Aqui, um protocolo é apresentado para a seleção não-destrutiva rápida de genótipos do algodão para a resistência do nematóide do reniformes. O protocolo envolve o exame visual das raízes de mudas de algodoeiro infectadas com nematoides para determinar a resposta da infecção. O disparo vegetativo de cada planta é então propagado para recuperar plantas para a produção de sementes.
Abstract
Um rápido não-destrutivo reniformes nematódeo (Rotylenchulus reniformis) triagem protocolo é necessário para o desenvolvimento de algodão resistente (Gossypium hirsutum) variedades para melhorar a gestão de nematódeos. A maioria dos protocolos envolve a extração de nematoides Vermiformes ou ovos do sistema radicular do algodão ou do solo de potting para determinar a densidade populacional ou a taxa de reprodução. Essas abordagens são geralmente demoradas com um pequeno número de genótipos avaliados. Uma aproximação alternativa é descrita aqui em que o sistema da raiz é examinado visualmente para a infecção do nematoide. O protocolo envolve a inoculação de plântulas de algodão 7 dias após o plantio com nematoides Vermiformes e a determinação do número de fêmeas presas ao sistema radicular 28 dias após a inoculação. Os dados são expressos como o número de fêmeas por grama de peso de raiz fresca para ajustar para a variação no crescimento radicular. O protocolo fornece um método excelente para avaliar a resistência do hospedeiro-planta associada com a habilidade do nematoide de estabelecer um local da infecção; Entretanto, a resistência que dificulta a reprodução do nematoide não é avaliada. Assim como outros protocolos de triagem, a variação é comumente observada na infecção por nematoides entre genótipos individuais dentro e entre experimentos. Os dados são apresentados para ilustrar o intervalo de variação observado com o protocolo. Para ajustar essa variação, os genótipos de controle são incluídos em experimentos. No entanto, o protocolo fornece um método simples e rápido para avaliar a resistência da planta hospedeira. O protocolo foi usado com sucesso para identificar acessos resistentes do G. coleta de germoplasma arboreum e avalia populações Segregantes de mais de 300 indivíduos para determinar a genética da resistência. Também foi desenvolvido um método de propagação vegetativa para recuperação de plantas para melhoramento de resistência. Após a remoção do sistema radicular para a avaliação do nematoide, o disparo vegetativo é replantado para permitir o desenvolvimento de um novo sistema radicular. Mais de 95% dos brotos tipicamente desenvolvem um novo sistema radicular com plantas atingindo maturidade.
Introduction
Rotylenchulus reniformis (Linford e Oliveira), comumente referida como o nematoide reniforme, é uma das principais espécies de nematódeos parasitárias presentes nos solos do sudeste dos Estados Unidos1,2,3. O nematoide é um semi-endoparasita obrigatório e sedentário, exigindo que uma planta hospedeira Complete seu ciclo de vida2,4. Os nematoides fêmeas pré-adultos Vermiformes penetram no sistema radicular do hospedeiro para estabelecer um local de alimentação no estele2,3. À medida que o nematódeo alimenta e amadurece, a porção posterior remanescente fora da raiz hospedeira irá inchar sobre a produção de ovos, formando uma forma característica do rim (Figura 1). Rotylenchulus reniformis é capaz de alimentar o sistema radicular de mais de 300 espécies de plantas, incluindo o algodão4. O algodão de Upland (Gossypium hirsutum L.) é amplamente cultivado no sudeste dos Estados Unidos, mas a falta de R. as variedades resistentes de reniformis impedem a gerência2,3do nematóide. Estratégias de manejo como o tratamento de nematicida e a rotação com espécies de culturas não hospedeiras têm sido utilizadas para reduzir o solo R. densidades populacionais de reniformis 5,6, mas as perdas de rendimento de algodão de semente podem geralmente variar de 1 a 5%2. Sintomas de R. a infecção por reniformis pode incluir atordoamento de plantas, crescimento de raízes suprimidos, deficiências nutricionais, aborto de frutos e maturidade tardia2. No entanto, os sintomas podem não ser evidentes devido à uniformidade dos sintomas em todo o campo; Portanto, abordagens para avaliar R. a infecção de reniformis é necessária para identificar e desenvolver variedades resistentes do algodão do Upland. Avaliação de R. a resistência de reniformis no algodão é considerada difícil7, porque o sistema de raiz contaminado pode parecer normal mesmo que a planta possa mostrar sintomas da infecção8.
Um protocolo eficaz da seleção do nematoide é exigido para a identificação de R. reniformis adesões resistentes da coleção do germoplasma do algodão, e para a determinação da genética da resistência para estes acessos. Tal protocolo auxiliará na transferência de genes de resistência para o algodão de terras altas. Vários métodos de bioensaio têm sido utilizados para avaliar R. infecção por reniformis em algodoeiro8,9,10,11,12,13,14,15. Em geral, duas abordagens principais têm sido utilizadas para a identificação de R. genótipos de algodão resistentes ao reniformis . A abordagem mais freqüentemente utilizada envolve a extração de ovos e/ou nematoides Vermiformes de plantas infectadas ou do solo8,11,12,14,15. A metodologia geral para essa abordagem envolve o plantio de sementes para os genótipos de algodão individuais em vasos separados, permitindo que as mudas se desenvolvam por 7 a 14 dias, inoculando as mudas adicionando uma mistura de estádios Vermiformes de R. reniformis ao solo, e permitindo que os nematóides infectem o sistema de raiz para 30 a 60 dias. Em seguida, os nematoides Vermiformes e/ou os ovos são extraídos do sistema radicular infectado de cada planta ou do solo potting. O número de nematoides extraídos ou ovos é então determinado para estimar a densidade populacional e a taxa de reprodução, que são comparadas com os genótipos de controle, a fim de identificar genótipos resistentes.
Uma abordagem alternativa, como aqui descrita, envolve o exame microscopicamente do sistema radicular do algodoeiro que foi infectado com nematoides para determinar o número de nematoides femininos parasitando as raízes,10,16. Semelhante a outras abordagens, os genótipos de algodoeiro são plantados em vasos separados e inoculadas com nematoides Vermiformes aproximadamente 7 dias após o plantio. No prazo de 30 dias após a inoculação, o sistema radicular é retirado das plantas individuais e o solo é enxaguado das raízes. Em seguida, os nematoides anexados ao sistema radicular são manchados com corante alimentar vermelho17, e as raízes são examinadas microscopicamente para determinar o número de sítios de infecção com genótipos de algodão resistentes (identificados com base no número de nematoides por grama de raiz) em comparação com um controle suscetível16. Essa segunda abordagem tem a vantagem de aumentar a taxa de transferência, reduzindo o número de dias necessários para a avaliação e aumentando o número de genótipos individuais avaliados em um único experimento. As metodologias de triagem que avaliam a densidade populacional ou a taxa de reprodução são muitas vezes mais demoradas do que aquelas baseadas em observações visuais dos sinais de infecção7. Entretanto, uma limitação dessa abordagem é que a resistência da planta hospedeira que dificulta a reprodução do nematoide determinada pela produção de ovos não é avaliada13.
Protocolos de triagem para R. a resistência de reniformis destrói frequentemente o sistema da raiz durante a avaliação7 e envolve o tiro vegetativo que está sendo Descartado. Para superar essa limitação, foi desenvolvido um método de propagação vegetativa para permitir a recuperação de plantas para a produção de sementes18. Após a remoção do sistema radicular para a avaliação do nematoide, o disparo vegetativo é plantado em solo de potting para permitir que o sistema radicular se recupere. Este método tem amplas aplicações para a maioria R. protocolos de triagem de reniformis . Um método simples e rápido de propagação vegetativa é de importância crítica para a reprodução de R. as variedades resistentes do algodão do Upland de reniformis , onde a recuperação da progêia é exigida para avançar genótipos resistentes à geração seguinte.
Um protocolo é apresentado para a seleção em grande escala de genótipos do algodão para a resistência do nematóide do reniformes. O objetivo é desenvolver um método simples e rápido de triagem não destrutiva para avaliar populações de reprodutores de algodão para resistência a nematódeos, a fim de auxiliar na criação de variedades resistentes de algodão de terras altas. Utilizando este protocolo, os dados são tipicamente obtidos dentro de 35 dias, com mais de 300 genótipos avaliados em um único experimento. Os dados são apresentados para genótipos resistentes e suscetíveis para ilustrar a variação comumente observada com esses métodos.
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Protocol
1. manutenção de uma fonte de R. reniformis Inóculo
- Encha os potenciômetros da argila do terracota do Terra (15 cm no diâmetro, 13,5 cm na altura) com uma mistura pasteurizada vapor do Loam arenoso de 1 parte e da areia de 2 porções. Plante um tomate suscetível (Solanum Lycopersicon) variedade em cada potenciômetro e coloc os potenciômetros em uma estufa.
Nota: outras variedades de plantas suscetíveis, como o algodão, podem ser usadas em vez de tomate. - Inocular as plantas de tomate com nematoides Vermiformes reniformes (ver passo 3,3). Manter as plantas na estufa a uma temperatura de aproximadamente 28 ° c.
2. plantio de genótipos de algodão para R. reniformis Avaliação da resistência
- Prepare o solo combinando a areia fina de 2 porções com o Loam arenoso de 1 parte coletado do campo.
- O vapor pasteurizar a mistura do solo para assegurar-se de que o solo esteja livre dos nematóides e dos micróbios patogénicos solo-carregados da planta.
- Adicione a mistura do solo a potes de plástico cônicos (4 cm de diâmetro, 21 cm de altura). Antes de encher os potes, coloque uma bola de algodão na parte inferior do pote para evitar a perda de solo. Encha parcialmente os potenciômetros com o solo aproximadamente 2 cm da parte superior.
- Prepare uma estaca plástica para cada pote para designar o genótipo a ser plantado.
- Sementes de plantas de genótipos de algodoeiro selecionadas para avaliação.
- Plantar uma única semente em cada pote para a avaliação de populações Segregantes, em que cada semente representa um genótipo único.
- Para as variedades de algodão ou acessos de germoplasma, plantar 2 a 3 sementes em um único pote para garantir a germinação de pelo menos uma planta com as outras mudas removidas dos vasos antes da inoculação do nematódeo.
Nota: Alternativamente, as sementes podem ser germinadas por 24 a 72 h antes do plantio para minimizar o número de vasos com sementes não viáveis.
- Sementes de plantas de genótipos de controle resistentes e suscetíveis selecionados.
Nota: os genótipos de controle são replicados de 5 a 10 vezes para avaliar as variações naturais inerentes à metodologia de triagem. - Encha os potenciômetros com solo adicional para cobrir a semente em cada potenciômetro.
- Coloque os potes na câmara de crescimento. Manter uma temperatura constante de 28 ° c, uma temperatura do ar ambiente, para a câmara de crescimento. Fornecer iluminação artificial com uma mistura de lâmpadas fluorescentes e incandescentes com um fotoperíodo de 16 h.
- Coloc emissores de água em cada potenciômetro, e molhe os potenciômetros duas vezes por o dia usando um sistema molhando automático. Ajuste o sistema molhando para fornecer a água adicional enquanto a planta cresce.
3. inoculação de nematódeos de plantas de algodão e preparação de amostras de raízes
- Extrato de nematoides Vermiformes reniformes mantidos em plantas de tomate sensíveis (ver etapa 1) usando elutriation19 e flotação centrífuga20 metodologias no dia anterior à inoculação. Conservar os nematoides extraídos a 4 ° c.
Nota: a extração21 do funil de Baermann é um método alternativo para a extração do nematoide. - Determine o número de nematoides extraídos contando o número de nematoides em uma subamostra de 100 μl e prepare uma suspensão de 1.000 nematóides/ml em água da torneira para inoculações.
- Inocular as mudas de algodoeiro 7 d após o plantio com a suspensão de nematódeos. Crie uma pequena depressão no solo ao lado da planta, e Pipete 1 mL da suspensão do nematódeo reniforme para a depressão.
- Retire as plantas dos vasos 28 d após a inoculação para avaliação do nematoide.
Nota: nesta fase, as plantas têm aproximadamente 15 cm de altura com 4 a 6 folhas totalmente expandidas.- Remova a maioria das folhas inteiramente expandidas das plantas usando a tesoura antes de remover as plantas dos potenciômetros.
- Para remover plantas dos potenciômetros, esprema o potenciômetro e deslize o solo para fora na mão.
- Remova delicadamente o solo das raizes agitando o sistema da raiz na água da torneira em um recipiente de 10 litros. Enxague brevemente o sistema radicular em um recipiente de água da torneira limpa.
- Retire o sistema radicular da planta aproximadamente 1 cm abaixo da linha do solo usando tesouras.
- Coloque o sistema radicular em um recipiente de amostra descartável, não estéril e plástico de 120 mL, juntamente com a estaca plástica do pote usado para identificação.
Nota: várias amostras são processadas antes de prosseguir para a etapa 3,7. Prossiga para a etapa 4 para a propagação vegetativa da parte aérea da planta. - Prepare uma solução de 12,5% (v/v) de corante alimentar vermelho17 em água da torneira para manchar os nematóides anexados ao sistema radicular.
- Adicione aproximadamente 30 mL da solução de coloração de alimento vermelho à amostra de raiz no recipiente de amostra para cobrir completamente o sistema radicular.
- Coloque o recipiente do espécime em um forno de microondas e aqueça a amostra da raiz até que a solução de coloração comece a ferver. Retire a amostra do forno de microondas e deixe a amostra arrefecer à temperatura ambiente.
- Decantar a solução corante corante vermelho da amostra de raiz e adicionar aproximadamente 100 mL de água da torneira para o recipiente de amostra para remover o excesso de mancha. Coloque a tampa no recipiente de amostra e guarde a amostra num frigorífico a 4 ° c. Prossiga para a etapa 5 para avaliação da infecção radicular.
Nota: o protocolo pode ser pausado aqui antes de prosseguir para a etapa 5.
4. propagação vegetativa para recuperação de plantas para produção de sementes
- Coloc uma esfera do algodão na parte inferior de um potenciômetro plástico cônico (veja a etapa 2,3) e encha parcialmente o potenciômetro com os meios do potting do musgo de turfa. Em seguida, coloque o tiro vegetativo no pote e adicione firmemente o potting Media para encher o pote. Coloque uma nova estaca plástica rotulada em cada pote para designar o genótipo de algodão.
- Coloque a bandeja de potes em um recipiente de plástico (73,6 cm de comprimento x 45,7 cm de largura x 15,2 cm de altura) com água e, brevemente, molhe as plantas para umedecer os meios de potting. Coloque os potes em uma câmara de crescimento com uma temperatura constante de 28 ° c usando um fotoperíodo de 16 h. Adicione a água adicional ao recipiente plástico como necessário para manter a umidade do solo.
- Transplantar as plantas aos potenciômetros maiores para a produção da semente após aproximadamente 30 d. encha parcialmente um potenciômetro plástico de 6 litros com meios do potting (veja a etapa 4,1), remova a planta do potenciômetro pequeno, coloc a planta no potenciômetro de 6 litros, e adicione firmemente meios do potting para encher o potenciômetro.
- Coloc as plantas em um Glasshouse e adicione a água para umedecer os meios do potting. Manter a temperatura na estufa a aproximadamente 28 ° c (a iluminação artificial não é necessária).
- As plantas de água à mão como necessário para aproximadamente 30 d.
- Quando aproximadamente 75% das plantas exigem molhar diário, plantas de água diárias usando um sistema molhando automático. Ajuste o sistema molhando automático à água mais freqüentemente como necessário para o crescimento de planta.
- Adicione aproximadamente 10 g de um fertilizante de liberação lenta a cada pote antes do início da iniciação floral.
- Colher plantas na maturidade e processar as amostras da semente do algodão para obter sementes para uma avaliação mais adicional.
- Para colher sementes de algodão, retire o algodão dos cápsulas abertos na planta com a mão e coloque-o em um saco de papel rotulado. As sementes são unidas às fibras do algodão, que são removidas nas seguintes etapas.
- Remova as fibras de fiapos das amostras de semente usando um gin de laboratório de 10 serras.
- Remover fibras de fuzz das amostras de sementes usando ácido sulfúrico concentrado. Neutralize amostras da semente em uma solução de 15% (v/v) do carbonato de sódio, enxague as amostras com água da torneira, e seque as amostras em um secador de ar forçado.
- Coloque as amostras de semente em envelopes rotulados para armazenamento.
5. avaliação de R. reniformis Infecção da raiz
- Remova a amostra de raiz do recipiente de amostra e conte o número de nematoides femininos anexados ao sistema radicular usando um estereomicroscópio (ampliação de 20X).
Nota: apenas os nematoides reniformes femininos são capazes de infectar raízes de plantas. - Coloque o sistema radicular em toalhas de papel por aproximadamente 10 min para remover o excesso de umidade. Pesar o sistema radicular para determinar o peso da raiz fresca.
- Entrar a contagem de nematódeos e dados de peso de raiz fresca em um programa de planilha de computador e calcular o número de fêmeas por grama de raiz.
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Representative Results
A infecção por Rotylenchulus reniformis do sistema radicular para duas variedades é apresentada na Figura 1. Relativamente menos nematóides reniformes fêmeas são capazes de estabelecer um local de alimentação para o genótipo de algodão resistente em comparação com o genótipo suscetível. A variação no crescimento radicular é comum entre os acessos, como ilustrado na Figura 2. Essa variação medida pelo peso da raiz fresca também pode ser observada entre as plantas do mesmo genótipo (tabela 1). Os genótipos de Gossypium arboreum freqüentemente apresentam taxas de crescimento radicular inferiores aos genótipos de algodão de terras altas. Para compensar essa variação, os dados são coletados em pesos de raízes frescas, que são usados para calcular o número de nematódeos fêmeas reniformes por grama de tecido radicular para cada genótipo. Os números de nematoides reniformes femininos por grama de raiz para genótipos resistentes são geralmente inferiores a 10, enquanto os genótipos suscetíveis têm tipicamente mais de 30 nematóides por grama de raiz.
Um desafio para a triagem de genótipos de algodão para R. a resistência de reniformis é a variação potencial que pode ocorrer dentro e entre experimentos. Para avaliar e ajustar para essa variação, genótipos de algodão resistentes e suscetíveis são incluídos como controles e replicados em cada experimento. A tabela 1 apresenta dados para dois genótipos utilizados como controles em dois experimentos distintos, utilizando o protocolo descrito acima. Os genótipos foram replicados 10 vezes e inoculados 7 dias após o plantio com 1.000 nematoides vermiformes, então os sistemas radiculares foram colhidos 28 dias após a inoculação para contagem de nematoides ligados às raízes. Como os experimentos foram conduzidos em diferentes épocas, a fonte dos nematoides utilizados para inoculações foi diferente; caso contrário, todos os outros parâmetros eram semelhantes. Esses dados ilustram a variação que pode ser observada nas avaliações de nematoides reniformes. As contagens de nematódeos femininos e os pesos radiculares foram maiores no experimento 1 para os dois controles comparados ao experimento 2, resultando em maior número de fêmeas por grama de raiz para experimento 1. Como as contagens femininas foram consideravelmente maiores para o experimento 1, os aumentos nos pesos radiculares não abaixaram o número de fêmeas por grama de raiz para os níveis observados para o experimento 2. Observou-se também considerável variação entre repetições de genótipos individuais. No entanto, o Gresistente. o genótipo PI 615699 do arboreum mostrou freqüentemente umas contagens fêmeas substancialmente mais baixas e uns mais baixos números de fêmeas por o grama da raiz do que o Gsuscetível. genótipo do hirsutum PI 529251. Os genótipos podem ser facilmente classificados como resistentes ou suscetíveis quando estes meios são utilizados para comparação. Os genótipos são classificados como resistentes quando o número de fêmeas por grama de raiz é de aproximadamente 10% do controle suscetível.
Um subconjunto de dados de uma população de F2 segregante que foi avaliado usando o protocolo é apresentado na tabela 2. A população incluiu 300 plantas de F2 , e os dados para 50 plantas que representam a escala na variação são apresentados. Para a população de 300 plantas, o número de nematoides observados infectando os sistemas radiculares variou de 0 a 50, com média de 9,4. Os pesos radiculares variaram de 0,01-1,22 g, com média de 0,38 g. nematoides femininos por grama de raiz variaram de 0-400, com média de 33,6. Os pais foram replicados na avaliação. O pai resistente (PI 417895) apresentou média de 5,8 fêmeas por grama de raiz, com peso médio de raiz de 0,8 g; em contrapartida, o progenitor suscetível (PI 529729) mostrou uma média de 40,8 fêmeas por grama de raiz, com um peso médio de raiz de 0,35 g. vinte plantas não mostraram nenhuma infecção do nematoide e foram classificadas como resistentes, mas isto pode representar escapes. Estas plantas e plantas com crescimento pobre da raiz são removidas tipicamente da análise de dados. Esta escala na variação para o crescimento da raiz e a infecção do nematoide dos sistemas da raiz são observadas geralmente para avaliações do nematoide; assim, a capacidade de tela de um grande número de plantas em um único experimento pode minimizar essa variação e permitir a avaliação precisa da genética da resistência. A população apresentou variação quantitativa para a infecção do nematoide, e as plantas foram classificadas como resistentes com base nos dados do pai suscetível, o que sugeriu que a resistência foi conferida por dois genes recessivos para esta população. Adicionalmente, o protocolo de propagação vegetativa descrito acima foi usado com sucesso para recuperar plantas desta população. A classificação da progêia F3 derivada de plantas individuais de f2 freqüentemente correspondeu à classificação da planta f2 .
Figura 1: amostras de raízes infectadas por Rotylenchulus reniformis . A amostra de raiz de um genótipo de algodão resistente (inferior esquerdo) mostra um único nematódeo feminino anexado à raiz, enquanto o genótipo suscetível (superior direito) mostra múltiplas fêmeas presas à raiz. A barra preta representa uma escala de 0,1 milímetros. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Variação observada no crescimento radicular de dois genótipos de algodoeiro. Os sistemas radiculares para dois nematódeos reniformes resistentes G. os acessos arboreum são apresentados para ilustrar a variação que pode ser observada para o crescimento radicular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: variação observada na resposta da infecção do nematoide reniforme para dois genótipos de algodoeiro incluídos como controles. Esses dados ilustram a variação que pode ocorrer dentro e entre experimentos para o g. hirsutum genótipo PI 529251 e resistente g. genótipo arboreum PI 615699; Entretanto, os meios de dados foram significativamente diferentes, permitindo que os genótipos fossem facilmente classificados como resistentes ou suscetíveis.
| Designação do genótipo | Fêmeas | Peso da raiz (g) | Fêmeas/g root | Classificação |
| 88 | 0 | 0,67 | 0,0 | Resistente |
| 156 | 0 | 0,10 | 0,0 | Resistente |
| 75 | 2 | 1, 5 | 1,9 | Resistente |
| 298 | 2 | 0,58 | 3,4 | Resistente |
| 259 | 3 | 0,77 | 3,9 | Resistente |
| 208 | 1 | 0,21 | 4,8 | Resistente |
| 322 | 4 | 0,82 | 4,9 | Resistente |
| 189 | 2 | 0,35 | 5,7 | Resistente |
| 147 | 6 | 0,94 | 6,4 | Resistente |
| 267 | 2 | 0,18 | 11,1 | Moderadamente resistente |
| 198 | 5 | 0,43 | 11,6 | Moderadamente resistente |
| 251 | 2 | 0,17 | 11,8 | Moderadamente resistente |
| 95 | 6 | 0,46 | 13,0 | Moderadamente resistente |
| 248 | 3 | 0,23 | 13,0 | Moderadamente resistente |
| 79 | 11 | 0,84 | 13,1 | Moderadamente resistente |
| 340 | 4 | 0,29 | 13,8 | Moderadamente resistente |
| 114 | 9 | 0,64 | 14,1 | Moderadamente resistente |
| 168 | 6 | 0,40 | 15,0 | Moderadamente resistente |
| 117 | 7 | 0,44 | 15,9 | Moderadamente resistente |
| 77 | 10 | 0,57 | 17,5 | Moderadamente resistente |
| 277 | 9 | 0,44 | 20,5 | Moderadamente resistente |
| 47 | 8 | 0,34 | 23,5 | Moderadamente suscetível |
| 96 | 20 | 0,85 | 23,5 | Moderadamente suscetível |
| 139 | 15 | 0,60 | 25,0 | Moderadamente suscetível |
| 253 | 2 | 0, 8 | 25,0 | Moderadamente suscetível |
| 247 | 15 | 0,53 | 28,3 | Moderadamente suscetível |
| 308 | 8 | 0,28 | 28,6 | Moderadamente suscetível |
| 152 | 9 | 0,31 | 29,0 | Moderadamente suscetível |
| 123 | 8 | 0,26 | 30,8 | Moderadamente suscetível |
| 296 | 18 | 0,58 | 31,0 | Moderadamente suscetível |
| 138 | 10 | 0,31 | 32,3 | Moderadamente suscetível |
| 151 | 5 | 0,15 | 33,3 | Moderadamente suscetível |
| 102 | 31 | 0,77 | 40,3 | Moderadamente suscetível |
| 67 | 5 | 0,12 | 41,7 | Suscetíveis |
| 51 | 18 | 0,43 | 41,9 | Suscetíveis |
| 311 | 21 | 0,48 | 43,8 | Suscetíveis |
| 334 | 4 | 0, 9 | 44,4 | Suscetíveis |
| 266 | 33 | 0,74 | 44,6 | Suscetíveis |
| 260 | 7 | 0,14 | 50,0 | Suscetíveis |
| 49 | 16 | 0,32 | 50,0 | Suscetíveis |
| 149 | 20 | 0,39 | 51,3 | Suscetíveis |
| 104 | 22 | 0,34 | 64,7 | Suscetíveis |
| 238 | 39 | 0,57 | 68,4 | Suscetíveis |
| 144 | 24 | 0,33 | 72,7 | Suscetíveis |
| 225 | 24 | 0,30 | 80,0 | Suscetíveis |
| 87 | 38 | 0,43 | 88,4 | Suscetíveis |
| 126 | 50 | 0,51 | 98,0 | Suscetíveis |
| 272 | 3 | 0, 3 | 100,0 | Suscetíveis |
| 154 | 24 | 0,12 | 200,0 | Suscetíveis |
| 286 | 3 | 0, 1 | 300,0 | Suscetíveis |
Tabela 2: resposta da infecção do nematoide reniforme observada em um subconjunto de 50 genótipos G. arboreum F2 população. Esses dados ilustram a amplitude de variação que pode ser observada para as populações Segregantes. Pesos radiculares, contagens de nematódeos e número de fêmeas por grama de raiz são apresentados para cada genótipo, com plantas classificadas como resistentes, moderadamente resistentes, moderadamente suscetíveis ou suscetíveis.
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Discussion
É necessário um protocolo de triagem eficaz para 1) a identificação de R. genótipos de algodão resistentes à reniformis , a fim de avaliar a genética da resistência e 2) a criação de variedades resistentes. A maioria dos protocolos avalia R. densidades populacionais de reniformis ou taxas de reprodução por extração de nematoides Vermiformes ou ovos do sistema radicular do algodão ou do solo potting8,11,12,14,15 . Essas abordagens são muitas vezes mais demoradas, e os resultados tendem a ser mais variados dentro e entre experimentos. Adicionalmente, os genótipos de algodoeiro podem ser mais freqüentemente classificados em experimentos de estufa não replicados usando esses protocolos11. No entanto, resultados semelhantes podem ser alcançados para os diversos protocolos ou parâmetros avaliados9,10.
Um protocolo de triagem alternativo é apresentado no qual a triagem de genótipos de algodoeiro é conduzida avaliando-se o número de nematoides reniformes femininos parasitando o sistema radicular. Genótipos de algodão resistentes e suscetíveis podem inicialmente mostrar um número semelhante de nematoides femininos penetrando os sistemas radiculares dentro de 16 horas após a inoculação, mas dentro de 36 horas, genótipos resistentes começam a mostrar significativamente menos mulheres anexadas o desenvolvimento do nematóides e do nematódeo é impedido9. Assim, este protocolo de triagem fornece uma medida mais direta da infecção do nematódeo do sistema radicular do algodão em comparação aos protocolos que dependem da extração de nematoides ou ovos do sistema radicular ou do solo potting. O método de inoculação de plântulas de algodão com nematoides Vermiformes é semelhante entre as abordagens. Os inoculations são conduzidos tipicamente 7 a 14 dias após o plantio, mas o sincronismo da inoculação é menos crítico, porque as sementes podem igualmente ser plantadas diretamente no solo reniformes do Nematode-infested. Os inoculações são conduzidos usando 1.000 nematóides vermiform, mas o protocolo pode ser modificado para aumentar ou diminuir o número usado para a inoculação, ou duas inoculações podem ser conduzidas em 7 e 14 dias após o plantio para segurar o suficiente nematóides fêmeas são presente para a infecção da raiz. Na soja, o número de nematoides utilizados para inoculação não teve efeito significativo nas classificações de massa de ovos 21 dias após o plantio; embora, as classificações mais elevadas fossem observadas tipicamente na densidade de população mais elevada do nematóide22. O protocolo pode ser otimizado para determinar a densidade mínima de nematódeos para inoculação.
A infecção do nematoide do sistema radicular é avaliada 28 dias após a inoculação para este protocolo, que é geralmente mais cedo do que em outros protocolos. Esta é uma etapa crítica no protocolo, como as avaliações são conduzidas antes da eclosão do ovo. Um atraso significativo na colheita de amostras de raízes pode resultar em uma segunda rodada de infecção. No entanto, essa avaliação anterior tem a vantagem de aumentar a taxa de transferência. Para o protocolo apresentado, os genótipos de algodão são plantados em uma mistura de areia e solo, o que é crítico para a remoção simples e rápida do sistema radicular do pote. O uso de um sistema molhando automático é essencial ao usar potenciômetros pequenos com uma mistura da areia e do solo a fim impedir que os potenciômetros SECem para fora. Corante alimentar vermelho é usado para manchar os nematóides ligados ao sistema radicular, que é um método simples e seguro17. Uma vez que os sistemas de raiz são manchados, eles podem ser armazenados em água da torneira a 4 ° c antes de contar o número de nematódeos anexados ao sistema radicular; assim, um maior número de genótipos de algodoeiro pode ser avaliado em um único experimento, pois não é necessário processamento adicional das amostras antes da avaliação das contagens de nematoides. Além disso, é vantajoso para armazenar as amostras de raiz em água da torneira por vários dias, o que permite que as raízes de-mancha, tornando a contagem mais fácil.
O protocolo descrito permite a triagem de populações maiores, a fim de reduzir a variação ambiental que ocorrerá entre experimentos. Usando uma câmara de crescimento da planta de 900 m2 equipada com um sistema molhando automático, as populações de 480 plantas individuais podem ser avaliadas. O protocolo tem sido utilizado com sucesso para avaliar populações Segregantes de 300 ou mais indivíduos para caracterizar a genética da resistência10,18. Estas populações mostraram que a variação quantitativa para a infecção do nematoide e a resistência em G. o arboreum pode ser mais frequentemente associado a múltiplos genes recessivos; assim, populações maiores são necessárias para estudos genéticos. Adicionalmente, observa-se variação quantitativa em populações Segregantes, independentemente do protocolo empregado, para avaliar a resposta da infecção por nematoides.
A resistência da planta hospedeira em algodão pode dificultar a capacidade do nematoide de infectar o sistema radicular e estabelecer um local de alimentação, mas também pode afetar a capacidade reprodutiva do nematoide. O protocolo de triagem descrito avalia o número de nematoides que são capazes de estabelecer um local de alimentação no sistema radicular do algodão. A reprodução de nematódeos medida pela produção de ovos não foi avaliada neste protocolo, o que é uma limitação importante. No entanto, o protocolo pode ser modificado para coletar esse tipo de dados. Alternativamente, outra metodologia pode ser usada para coletar esses dados após a identificação de genótipos resistentes, o que reduz a necessidade de se identificar um grande número de indivíduos.
Os dados das avaliações de nematódeos de genótipos individuais podem ser variáveis dentro e entre experimentos, o que é um problema comum com todos os protocolos de triagem utilizados para avaliar R. resistência de reniformis para genótipos do algodão. A utilização de um delineamento experimental com múltiplas repetições para a triagem de acessos de germoplasma auxiliará na avaliação dessa variação para a identificação de genótipos resistentes. Adicionalmente, incluindo os mesmos genótipos de controle resistentes e suscetíveis entre os experimentos, é útil para avaliar essa variação e comparar os resultados de múltiplos experimentos. Esses controles também são usados para monitorar o sucesso da inoculação de nematódeos. Adicionalmente, os meios de dados desses controles são utilizados para classificar genótipos como resistentes ou suscetíveis,10,16. Os genótipos de algodoeiro são tipicamente classificados como resistentes se mostrarem menos de 10% da infecção observada no controle suscetível16,23. O crescimento radicular é outro fator que contribui para a variação observada nos dados utilizando o protocolo, pois plantas com raiz de torneira com menos raízes laterais oferecem menos sítios para infecção, o que pode resultar em menos nematoides por grama de raiz.
A dificuldade em desenvolver novas variedades de algodão de terras altas usando outras espécies de algodoeiro como fonte de genes de resistência requer um protocolo de propagação vegetativa, a fim de avançar as linhas de reprodução para a próxima geração para maior seleção ou adicional Reprodução. Um protocolo simples da propagação vegetativa como descrito foi desenvolvido para recuperar plantas após a avaliação do nematoide. O protocolo foi usado com sucesso para recuperar plantas das grandes populações18. Normalmente, o sistema radicular é recuperado dentro de 30 dias após a plantação vegetativa é plantada. As taxas de sobrevida são freqüentemente maiores que 95%. As plantas que mostram o vigor pobre podem ser perdidas ao propagar um grande número plantas. Em geral, menos de 1% das plantas não conseguiram demonstrar o crescimento da raiz ou da parte aérea. O protocolo pode facilmente ser modificado e usado com outros protocolos da seleção do nematoide.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pelo departamento de agricultura dos Estados Unidos, serviço de pesquisa agrícola. Menção de nomes comerciais e produtos comerciais neste artigo são exclusivamente para fins de fornecer informações específicas e não implicam recomendações ou endossos pelo departamento de agricultura dos EUA. USDA é um provedor de oportunidades iguais e empregador. Os autores não têm conflito de interesse em declarar. A assistência técnica foi fornecida pela Kristi Jordan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ray Leach Cone-tainer | Stuewe and Sons Inc. | SC10U | |
| Cone-tainer tray | Stuewe and Sons Inc. | RL98 | |
| Sand | various | ||
| Cotton balls | various | ||
| Pylon 4 inch plant labels (4 in L x 5/8 in W) | Pylon Platics | L-4-W | Any brand or vendor is acceptible. |
| 4 oz. specimen containers | Fisher Scientific | 16-320-731 | Any brand or vendor is acceptible. |
| Red food coloring | McCormick & Co., Inc. | ||
| 1 mL Pipet tips | various | ||
| 10 L container | various | Inexpensive buckets work well. | |
| 6 L pots | Nursery Supplies Inc. | Poly-Tainer-Can No2A | Any brand or vendor is acceptible. Different size pots can be used |
| Potting media | Sun Gro Horticulture | Metro-Mix 360 | Any brand or vendor is acceptible. |
| Fertilizer | Everris NA Inc. | Osmocote Plus | Any brand or vendor is acceptible. |
| Plastic container (73.6 cm L x 45.7 cm W x 15.2 cm D) | Rubbermaid | 3O29 | Any brand or vendor is acceptible. |
References
- Heald, C. M., Robinson, A. F. Survey of current distribution of Rotylenchulus reniformis. in the United States. Journal of Nematology. 22 (4), 695-699 (1990).
- Koenning, S. R., Wrather, J. A., Kirkpatrick, T. L., Walker, N. R., Starr, J. L., Mueller, J. D. Plant-parasitic nematodes attacking cotton in the United States: old and emerging production challenges. Plant Disease. 88 (2), 100-113 (2004).
- Robinson, A. F. Reniform in U.S. cotton: when, where, why, and some remedies. Annual Review of Phytopathology. 45, 263-288 (2007).
- Robinson, A. F., Inserra, R. N., Caswell-Chen, E. P., Vovlas, N., Troccoli, A. Rotylenchulus species: identification, distribution, host ranges, and crop plant resistance. Nematropica. 27 (2), 127-180 (1997).
- Davis, R. F., Koenning, S. R., Kemerait, R. C., Cummings, T. D., Hurley, W. D. Rotylenchulus reniformis management in cotton with crop rotation. Journal of Nematology. 35 (1), 58-64 (2003).
- Starr, J. L., Koenning, S. R., Kirkpatrick, T. L., Robinson, A. F., Roberts, P. A., Nichols, R. L. The future of nematode management in cotton. Journal of Nematology. 39 (4), 283-294 (2007).
- Weaver, D. B., Lawrence, K. S., van Santen, E. Reniform nematode resistance in upland cotton germplasm. Crop Science. 47 (1), 19-24 (2007).
- Robinson, A. F., Cook, C. G., Percival, A. E. Resistance to Rotylenchulus reniformis and Meloidogyne incognita race 3 in the major cotton cultivars planted since 1950. Crop Science. 39 (3), 850-858 (1999).
- Carter, W. W. Resistance and resistant reaction of Gossypium arboreum to the reniform nematode, Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 13 (3), 368-374 (1981).
- Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Genetics of reniform nematode resistance in Gossypium arboreum germplasm line PI 529728. World Journal of Agricultural Research. 1 (4), 48-53 (2013).
- Robinson, A. F., Bridges, A. C., Percival, A. E. New sources of resistance to the reniform (Rotylenchulus reniformis) and root-knot (Meloidogyne incognita) nematode in upland (Gossypium hirsutum L.) and sea island (G. barbadense L.) cotton. Journal of Cotton Science. 8 (3), 191-197 (2004).
- Robinson, A. F., Percival, A. E. Resistance to Meloidogyne incognita race 3 and Rotylenchulus reniformis in wild accessions of Gossypium hirsutum and G. barbadense from Mexico. Journal of Nematology. 29 (4), 746-755 (1997).
- Stetina, S. R., Young, L. D. Comparisons of female and egg assays to identify Rotylenchulus reniformis resistance in cotton. Journal of Nematology. 38 (3), 326-332 (2006).
- Usery, S. R. Jr, Lawrence, K. S., Lawrence, G. W., Burmester, C. H. Evaluation of cotton cultivars for resistance and tolerance to Rotylenchulus reniformis. Nematropica. 35 (2), 121-133 (2005).
- Yik, C. -P., Birchfield, W. Resistant germplasm in Gossypium species and related plants to Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 16 (2), 146-153 (1984).
- Stetina, S. R., Erpelding, J. E. Gossypium arboreum accessions resistant to Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 48 (4), 223-230 (2016).
- Thies, J. A., Merrill, S. B., Corley, E. L. Red food coloring stain: new, safer procedures for staining nematodes in roots and egg masses on root surfaces. Journal of Nematology. 34 (2), 179-181 (2002).
- Erpelding, J. E., Stetina, S. R. Genetic characterization of reniform nematode resistance for Gossypium arboreum accession PI 417895. Plant Breeding. 137 (1), 81-88 (2018).
- Byrd, D. W. Jr, et al. Two semi-automatic elutriators for extracting nematodes and certain fungi from soil. Journal of Nematology. 8 (3), 206-212 (1976).
- Jenkins, W. R. A rapid centrifugal-flotation technique for separating nematodes from soil. Plant Disease Reporter. 48 (9), 692 (1964).
- Robinson, A. F., Heald, C. M. Carbon dioxide and temperature gradients in Baermann funnel extraction of Rotylenchulus reniformis. Journal of Nematology. 23 (1), 28-38 (1991).
- Williams, C., Gilman, D. F., Fontenot, D. S., Birchfield, W. A rapid technique for screening soybeans for reniform nematode resistance. Plant Disease Reporter. 63 (10), 827-829 (1979).
- Schmitt, D. P., Shannon, G. Differentiating soybean responses to Heterodera glycines races. Crop Science. 32 (1), 275-277 (1992).
