Summary
Здесь мы описываем метод, чтобы оценить выражение легких адаптивной, прогнозируются регулировать воспалительные гены с помощью мыши воздействию озона или отфильтрованным воздухом на разных стадиях эстрального цикла.
Abstract
МикроРНК (miRNA) профилирование стал интерес для исследователей, работающих в различных областях исследований в биологии и медицины. Текущие исследования показывают, многообещающего будущего использования адаптивной диагностики и ухода за легочных заболеваний. Здесь мы определить протокол для Мирна, профилирование для измерения относительного изобилия группы интерферирующим предсказал регулировать воспалительные гены в легочной ткани от модели мыши воспаление озона индуцированной дыхательных путей. Потому что было показано, что циркулирующие уровни полового гормона может повлиять на регулирование легких врожденного иммунитета у самок, этот метод предназначен для описания воспалительных Мирна, профилирование протокол в самок мышей, принимая во внимание эстральный цикл стадии каждого животного во время воздействия озона. Мы также рассмотреть применимые биоинформатики подходы к Мирна обнаружения и целевых методов идентификации с помощью Лимма, R/Bioconductor программного обеспечения, и программное обеспечение функционального анализа для понимания биологических контекст и пути, связанные с Дифференциальный Мирна выражение.
Introduction
микроРНК (интерферирующим) являются короткие (19-25 нуклеотидов), естественным, некодирующих молекул РНК. Последовательности адаптивной эволюционных сохранение видов, предлагая важность интерферирующим в регулировании физиологические функции1. микроРНК выражение профилирование было доказано быть полезны для выявления адаптивной, которые имеют важное значение в регуляции различных процессов, в том числе иммунного ответа, дифференцировки клеток, процессов развития и апоптоз2. Совсем недавно адаптивной были признаны за их потенциального использования в терапии и диагностики заболеваний. Для исследователей, изучение механизмов регуляции генов измерения Мирна выражение может просветить модели уровне систем регулирования процессов, особенно когда Мирна информации объединяется с мРНК профилирования и другие геном масштаба данных3. С другой стороны адаптивной также было показано, быть более стабильным, чем mRNAs в широкий спектр типов образцов и также поддаются измерению с большей чувствительностью, чем белки4. Это привело к большой интерес в развитии интерферирующим качестве биомаркеров для различных молекулярных диагностических приложений, включая легочных заболеваний.
В легких адаптивной играют важную роль в процессах развития и поддержания гомеостаза. Кроме того их аномальные выражения был связан с развития и прогрессирования различных легочных заболеваний5. Воспалительные легочных заболеваний, вызванных загрязнением воздуха продемонстрировала большую серьезность и бедных прогнозом у самок, указав, что гормоны и эстральный цикл может регулировать легких врожденный иммунитет и Мирна выражение в ответ на экологические проблемы 6. в настоящем Протоколе, мы используем воздействия озона, который является одним из основных компонентов загрязнения воздуха, чтобы побудить форму воспаления легких в самок мышей, что происходит в отсутствие адаптивного иммунитета. С помощью озона, мы вызывая развитие сократимость hyperresponsiveness, который связан с повреждения эпителиальных клеток дыхательных путей и увеличение числа нейтрофилов и воспалительных медиаторов в проксимальном airways7. В настоящее время есть не хорошо описанные протоколы охарактеризовать и проанализировать интерферирующим эстрального цикла в подвергшихся воздействию озона мышей.
Ниже мы опишем простой метод для определения этапов эстрального цикла и Мирна выражение в легочной ткани самок мышей, воздействию озона. Мы также рассмотреть эффективные биоинформатики подходы к обнаружения и целевой идентификации Мирна, с акцентом на вычислительной биологии. Мы анализируем microarray данные с помощью Лимма, R/Bioconductor программное обеспечение, которое обеспечивает интегрированное решение для анализа данных из выражения гена эксперименты8. Анализ ПЦР массива данных от Лимма имеет преимущество с точки зрения власти над t теста на основе процедур при использовании небольшое количество массивов/образцы для сравнения выражений. Чтобы понять биологические контексте Мирна выражение результатов, затем мы использовали программное обеспечение функционального анализа. Для того чтобы понять механизмы, регулирующие transcriptional изменений и прогнозирования вероятных результатов, программное обеспечение сочетает в себе Мирна выражения наборов данных и знаний из литературы9. Это преимущество по сравнению с программным обеспечением, просто искать статистических обогащения в перекрывающимися наборами адаптивной.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета штата Пенсильвания.
1. Оценка стадии эстрального цикла
- Должным образом сдерживать C57BL/6 мышь (8-9 недель) с помощью Одноручные мыши сдержанность метод, описанный в Махгольца et al.10женщин.
- Заполните стерильных пластиковых дозаторов с 10 мкл ультра-чистой воды.
- Кончик пластиковая Пипетка ввести во влагалище.
- Аккуратно промойте жидкости 4 – 5 раз собирать образца.
- Место окончательный флеш, содержащие вагинальной жидкости на стеклянное скольжение.
- Наблюдать за безупречный вагинальный скрытой под микроскопом света с целью 20 x.
Примечание: Животных, которые не показывают регулярные циклы pseudopregnancy или другими причинами, должны быть исключены из эксперимента. Рекомендуется для выполнения ежедневных влагалищные выделения по крайней мере три последовательных цикла для подтверждения цикличность.
2. воздействие озона
- Место максимум 4 мышей в двух контейнерах 1,2 Л стекло проволоки сетки крышками, и вода ad libitum.
- Положите один стеклянный контейнер в камере озона и другой в зале экспозиции отфильтрованного воздуха.
- Отрегулируйте концентрации озона в 2 ppm и мониторинга уровней озона регулярно.
Примечание: Озон аппарат обеспечивает регулируемый воздушный поток (> 30 воздуха изменения/ч) с управлением температурой (25 ° C) и относительной влажности (50%). Система генерирует озона, Озонатор электрического разряда, который отслеживается и контролируется анализатор ультрафиолетового озона и регуляторами массового расхода, как описано выше11. - После 3 h воздействия озона/фильтрации воздуха удалите стеклотары. Возвращение животных в клетке с постельным бельем, продовольствия и воды ad libitum.
3. легких Коллекция
- 4 ч после воздействия, анестезировать животных с внутрибрюшинного введения кетамин/Ксилазина коктейль (90 мг/кг кетамин, Ксилазина 10 мг/кг).
Примечание: Для подтверждения надлежащего уровня анестезии, Проверьте мышь для педали рефлекс (фирмы мыс пинча) и при необходимости измените анестетиков. - Смочите кожу мыши с 70% этиловом спирте.
- Сделайте надрез срединной 2 см, используя операционной ножницы и хирургические пинцеты подвергать верхней полой вены.
- Пожертвовать мышей, перерезка верхней полой вены и аорты. При необходимости вставьте иглой 21 G датчика в верхней полой вены выше почечных вен для сбора крови до обескровливания. Кроме того Соберите кровь через прокол сердца после стандартных протоколов.
- Используйте хирургические ножницы разрезали брюшной полости и удаление кожи/верхних мышц, движется вверх к ребер.
- Используйте хирургические ножницы для прокола диафрагмы.
Примечание: Легкие рухнет от диафрагмы. - Отрежьте грудную клетку, с помощью хирургического ножниц выставить сердца и легких.
- С помощью щипцов, взять 1,5 мл бесплатно РНКазы пробки microcentrifuge и погрузите его в жидком азоте заполнить трубу.
Примечание: Использовать защитные перчатки и очки для обработки жидкого азота. - Удаление легких, поместить их в свободных РНКазы microcentrifuge 1,5 мл труб заполненных жидким азотом для оснастки замораживание ткани и подождите несколько секунд, пока жидкость не испарится.
- Закройте крышку трубки и хранить ткани-80 ° c до использования.
4. РНК подготовка
- Распылить всю легких с использованием нержавеющей стали ткань мельница.
Примечание: Мельница ткани необходимо размещать в жидком азоте до использования. Очистите мельница после каждого использования РНКазы раствором. - Разделение вдувания легких и место в две пробирки 1,5 мл (половина легкого каждый).
- Добавьте 500 мкл Гуанидиновые тиоцианат за образец трубки и перемешать. Однородный каждого образца с помощью 18 G, 21 G и 23 G иглы, соответственно.
Примечание: Образцы могут быть шипами 5.6 x 108 копий небольшой РНК Спайк в управления (от разных видов) прежде чем приступить к добыче. - Добавьте 500 мкл этанола для каждого образца и вихрь для 15 s.
- Нагрузки в смесь в спин столбца в коллекции трубки и центрифуги на 12000 x g за 1 мин отбросить потока через.
-
Для DNase я лечение (в колонка);
- Добавьте 400 мкл буфера мытья РНК и центрифуги на 12000 x g за 1 мин.
- В пробирку, RNase бесплатно, добавить 5 мкл DNase I и 75 мкл 1 x ДНК пищеварение буфера и перемешать. Добавьте смесь непосредственно к матрице столбца.
- Инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин.
- 400 мкл РНК программ решения для столбца и центрифуги на 12000 x g за 1 мин отклонения потока через и повторите этот шаг.
- 700 мкл буфера мытья РНК в столбце и центрифуги на 12000 x g за 1 мин отбросить потока через.
- Центрифуга на 12000 x g за 2 мин удалить оставшиеся буфера. Перенести столбец в трубу, RNase бесплатно.
- Для элюировать РНК, мкл 35 DNase/РНКазы свободной воды непосредственно в столбец матрицы и центрифуги на 12000 x g для 1,5 мин.
- Измерение общей концентрации РНК (260 Нм) и чистоты, используя спектрофотометр. Следуйте инструкциям для выполнения количественного определения РНК в 1,5 мкл пример аликвота. Пустой документ с DNase/РНКазы свободной воды, используемой для элюции.
Примечание: Как «чистый» 260/280 отношение ~2.0 является общепринятым для РНК. Типичные концентрации РНК обычно колеблется между 750 и 2500 нг/мкл. - Хранить при температуре-80 ° C.
5. Мирна профилирования
-
Ретро-транскрибировать малых РНК, использования 200 ng всего РНК.
- Подготовьте смесь реверс транскрипция реакции на льду (общий объем в реакции составляет 20 мкл). Для каждой реакции мкл 4 5 x буфер, 2 мкл 10 x, которые смешивать нуклеотидов, 2 мкл обратной транскриптазы и 2 мкл РНКазы свободной воды. Смешайте все компоненты и Алиготе в 600 мкл РНКазы Бесплатные пластиковые трубы (10 мкл смесь реакции).
Примечание: Реверс транскрипция мастер смесь содержит все компоненты, необходимые для синтеза cDNA перв стренги за исключением шаблона РНК.
Примечание: Рассчитайте объем избыточного (10%), при подготовке основной микс. - Добавьте шаблон РНК (200 ng в 10 мкл) к каждой пробке, содержащий Мастер микс обратной транскрипции. Mix, центрифуги для 15 s на 1000 x gи хранить их на льду до размещения в Термоциклер или сухой блок.
- Инкубируйте 60 мин при 37 ° C.
- Инкубируйте 5 мин при 95 ° C и место трубы на льду.
- Разбавьте cDNA, добавив 200 мкл РНКазы свободной воды для каждой реакции 20 мкл обратной транскрипции.
- Подготовьте смесь реверс транскрипция реакции на льду (общий объем в реакции составляет 20 мкл). Для каждой реакции мкл 4 5 x буфер, 2 мкл 10 x, которые смешивать нуклеотидов, 2 мкл обратной транскриптазы и 2 мкл РНКазы свободной воды. Смешайте все компоненты и Алиготе в 600 мкл РНКазы Бесплатные пластиковые трубы (10 мкл смесь реакции).
-
Выполните с помощью мыши воспалительной реакции и аутоиммунные заболевания Мирна ПЦР массив ПЦР в реальном времени.
- Подготовка смесь реакции (общий объем 1100 мкл): для каждой реакции, добавить 550 мкл 2 x PCR мастер смеси, 110 мкл 10 x смесь универсальная грунтовка, 340 мкл РНКазы свободной воды и 340 мкл шаблон cDNA (разбавленным реакции от шага 5.1.5).
- Добавьте 10 мкл реакция смеси в каждой скважине поджатые Мирна ПЦР-массива с помощью многоканальных дозаторов.
- Уплотнение Мирна ПЦР массив пластины с оптическим самоклеющаяся пленка.
- Центрифуга пластину за 1 мин на 1000 x g при комнатной температуре для удаления пузырьков.
- Программа реального времени велосипедист, ПЦР первоначальной активации шаг 15 мин при температуре 95 ° C, 3-шаг Велоспорт содержащие денатурации 15 s на 94 ° C, отжиг для 30 сек при 55 ° C и расширения для 30 s при 70 ° C для 40 циклов номер.
Примечание: Следуйте производителя Велоспорт условия инструкции для настройки в реальном времени циклователь. Выполните шаг кривой диссоциации, встроенные в программное обеспечение реального времени cycler. - Выполните анализ данных.
6. анализ данных
- Извлечь значения Ct из программного обеспечения PCR реального времени для каждого образца в программное обеспечение для анализа.
Примечание: КТ значение 34 рассматривается как отсечки. Если образцы содержат Спайк в управления (например, чел мир-39), нормализовать значения Ct в копилку в элементе управления для каждого образца. Пороговые значения может потребоваться вручную установить. Базовые значения устанавливаются автоматически. - Нормализовать Ct значения в среднем Ct шести Мирна хозяйствования управления: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, используя следующее уравнение:
ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping) - Для свертки изменить вычисления, рассчитать значения ΔΔCt с помощью определенного образца как элемент управления, используя относительное выражение уравнения12:
Мирна относительное выражение:
2-∆∆КТ, где - ∆∆Ct =-[∆Ct тест - ∆Ct управления]
Примечание: Изменение раз 200 считается отсечки. - Экспорт раз изменить значения выражений для выполнения статистического анализа на R с помощью пакета Лимма в Bioconductor8.
- Исправление для нескольких сравнений с использованием метода Benjamini-Хёхберг13.
Примечание: Копия скрипта R доступна на: http://psilveyra.github.io/silveyralab/. Наборы данных и проанализированы данные также доступны в Омнибус выражения гена под номером GSE111667, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.
7. анализ данных: Функциональный анализ программного обеспечения
- Организовать набор данных. Включать интерферирующим с их соответствующих выражений журнала коэффициенты и p значения. Таблица 1 см для форматирования конкретного набора данных.
- Программное обеспечение открытого функционального анализа (версия 01-10).
- Загрузить набор данных, используя следующий формат: формат файла: «Гибкий формат», содержит заголовок столбца: «Да», выберите тип идентификатора: «miRBase (зрелые)», массив платформа, используемая для экспериментов: выбрать массив платформы.
Примечание: Принято, являются файлы форматов .txt (табуляцией текстовые файлы), .xls (файлы excel) и .diff (файлы cuffdiff). - Выберите «Выводить наблюдения» и проверьте правильность маркировки экспериментальной группы.
- Перейти к «Набора данных резюме» пересмотреть общее количество сопоставленных и несопоставленные адаптивной.
-
Нажмите на кнопку «Новый» в верхней левой части программы. Выберите «Новый фильтр микроРНК целевой» и загрузить набор микроРНК.
- Задание источника: TarBase, изобретательность экспертов выводы, miRecords.
- Установите доверие: экспериментально наблюдаемого или высокой (предсказал).
- Выберите «Добавить столбцы» включают в себя различные биологической информации о цели таких видов, заболеваний, тканей, пути и многое другое.
- Чтобы сосредоточиться на цели, которые изменили выражение в эксперименте, выберите «Добавить / заменить мРНК набор данных». Используйте «Выражение спаривания», чтобы найти микроРНК с уровнями одинаковые или разные выражения.
Примечание: Анализ фильтра будет предоставлять микроРНК имена и символы, мРНК-мишеней, источник, который описывает отношения целевой и уровень достоверности прогнозируемого отношений (рис. 2).
- Нажмите кнопку «Добавить в мой путь» для отправки фильтрованных данных путь холст и изучить более биологического отношения.
- Используйте конструктор путь для создания публикации качество модели микроРНК эффектов.
-
Альтернативный вариант заключается в создании основной анализ.
- Основной тип анализа выберите «Анализ выражения».
- Для тип измерения выберите «Expr соотношение журнала».
- Реферат анализ фильтра: рассмотреть только молекулы или отношения где: (видов = мыши) и (доверия = экспериментально наблюдаемого) и (источники данных = «Изобретательность экспертов выводы», «Изобретательности ExpertAssist выводы», «miRecords», «TarBase», или» TargetScan человека»).
- Выберите частоту среза p-значение = 0,05.
- Запустите анализ.
Примечание: Доклад будет включать в себя: канонические пути, вверх по течению регуляторы анализ, заболеваний и функций, регулятор эффекты, сетей, молекулы и многое другое.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Различных типов клеток в мазках используются для идентификации этапа эстрального цикла мыши (рис. 1). Они идентифицируются по морфологии клеток. Во время proestrus клетки являются почти исключительно кластеры-округлой формы, сформирован ядерных эпителиальных клеток (рис. 1A). Когда указатель мыши находится на стадии эструса, клетки являются ороговевшем Плоскоклеточный эпителиальных клеток, присутствующих в плотно упакованных кластеры (рис. 1B). Во время metestrus, видны ороговевшем эпителиальных клеток и полиморфноядерных лейкоцитов (рис. 1 c). В диэструса лейкоцитов (небольшие клетки), как правило, более распространены (рис. 1 d).
Мы извлекли РНК из четырех легких мыши после протокол, в описанный ранее. Нуклеиновые кислоты концентрации (нг / мкл) варьировались между 1197.9 и 2178.1 с в среднем по 1583.1 ± 215 (Таблица 1). Средний коэффициент A260/A280 варьировалась от 2,010 до 2.020 с в среднем 2.016 ± 0,002. С другой стороны наблюдаемое соотношение A260/A230 колебалась между 2,139 и 2.223 с в среднем 2.179 ± 0,018.
Таблица 2 показывает дифференциальной выражение результаты, полученные с Лимма на р. Мы рассчитали Топ дифференциально выраженной интерферирующим между мышей воздействию озона или фильтруют воздух в proestrus (с помощью команды toptable)14. Первый столбец дает значение log2-раз раз изменения в выражении Мирна между озоном и очищенного воздуха подвергаются животные. T столбец представляет умеренный t статистики, рассчитывается для каждого микроРНК в сравнении. Столбцы p.value и adj.p.value представляют связанные p значения для каждого сравнения до и после нескольких испытаний перестройки, соответственно. Регулировка для нескольких сравнений было сделано с методом Benjamini и Хохберга контролировать уровень ложных обнаружения15. Представляет столбец B журнала коэффициенты, которые Мирна дифференциально выразил8.
Мы исполняли Мирна целевой фильтр и основной анализ, который включает в себя анализ пути обогащения. После загрузки списка 14 miRNAswith соотношение журнала значительное выражение и p значение, все из них были сопоставлены Мирна целевой фильтр (Таблица 3). Результаты были фильтрацию и сортировку добраться до некоторых путей, в данном случае «Клеточный иммунный ответ». Основной анализ представил информацию о канонических путей, заболеваний и функции, регуляторы и сетей (Таблица 4). Функциональный анализ программного обеспечения производится анализ сети, которая показывает взаимосвязь между интерферирующим интерес и других молекул (рис. 3).
Рисунок 1: определение этапов эстрального цикла. (A) Proestrus (преимущественно ядерных эпителиальных клеток); (B) эструса (преимущественно anucleated ороговевшем клетки); (C) metestrus (все три типа клеток); и (D) диэструса 2 (большинство лейкоциты). Шкалы бар = 100 µm. масштаб = 20 x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: представитель результаты функционального анализа программного обеспечения: Мирна целевой фильтр. Всеобъемлющий профиль интерферирующим на разных стадиях эстрального цикла. После выполнения фильтрации Мирна, программное обеспечение обеспечивает подробные списки генов и соединений, причастных к заболеваниям и другие фенотипы, которые можно фильтровать и сортировать добраться до некоторых путей, в данном случае «Клеточный иммунный ответ». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: представитель результаты функционального анализа программного обеспечения: сети. Сравнение сетей, затронутых отфильтрованного воздуха или озоном воздействия в женщин на различных этапах эстрального цикла. Диаграмма биологических сетей, связанных с адаптивной в легких самок мышей, подвергается фильтрации воздуха против озона в proestrus (A) или не proestrus стадий (B). Эта цифра была изменена от Фуэнтес et al.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| ID | Нуклеиновые кислоты (нг/мкл) | A260/A280 | A260/A230 |
| Пример 1 | 1197.930 | 2.015 | 2.192 |
| Пример 2 | 1355.703 | 2.018 | 2.223 |
| Пример 3 | 2178.104 | 2.020 | 2.163 |
| Пример 4 | 1600.837 | 2,010 | 2,139 |
| Среднее | 1583.144 ± 215 | 2.016 ± 0,002 | 2.179 ± 0,018 |
Таблица 1: пример концентрации РНК и коэффициенты поглощения на 260, 230 и 280 Нм от образцов ткани лёгких очищенных от четырех мышей. Концентрации были измерены с спектрофотометром.
| logFC | t | P.Value | ADJ. P.Val | B | |
| MMU мир-694 | 1.492 | 4.071 | 0.000153 | 0.009514 | 0,759 |
| MMU мир-9-5 p | 0.836 | 3.916 | 0.000254 | 0.009514 | 0.289 |
| MMU мир-221-3 p | 0.385 | 3.106 | 0.003014 | 0.075361 | -1.982 |
| MMU мир - 181d - 5p | 0,597 | 2.891 | 0.005516 | 0.103424 | -2.526 |
| MMU мир-98-5 p | 0.558 | 2.699 | 0.009243 | 0.138649 | -2.987 |
| MMU мир-712-5 p | 0.667 | 2.563 | 0.013169 | 0.164609 | -3.299 |
| MMU мир 106А - 5p | -0.528 | -2.412 | 0.019278 | 0.206547 | -3.632 |
Таблица 2: Лимма Анализ результатов для дифференциально выраженной интерферирующим в женщин, подвергающихся воздействию озона против . Фильтрация воздуха на стадии proestrus.
| интерферирующим ID | Замечание 1 | Замечание 1 | Замечание 2 | Замечание 2 |
| Expr журнала соотношение | Значение P | Expr журнала соотношение | Значение P | |
| MMU мир-694 | 1.492 | 0.000153 | 0.543319208 | 0.0021385 |
| MMU мир-9-5 p | 0.836 | 0.000254 | 0.677595421 | 0.004997439 |
| MMU мир-221-3 p | 0.385 | 0.003014 | ||
| MMU мир - 181d - 5p | 0,597 | 0.005516 | 0.342276659 | 0.106467657 |
| MMU мир-98-5 p | 0.558 | 0.009243 | 0.455392799 | 0.034724699 |
| MMU мир-712-5 p | 0.667 | 0.013169 | ||
| MMU мир 106А - 5p | -0.528 | 0.019278 |
Таблица 3: пример формата для многолетних наблюдений загрузки наборов данных для функционального анализа программного обеспечения. Несколько экспериментальных дифференциального выражения могут быть сгруппированы в одну таблицу и загружены, и как многие замечания, при необходимости могут быть добавлены. Колонки: 1) интерферирующим ID; 2) наблюдения 1: Коэффициент Expr журнала; 3) наблюдения 1: Значение P; 4) наблюдение 2: Коэффициент Expr журнала; 5) наблюдение 2: Значение P.
| Non-proestrus | Proestrus | ||||
| A. генов мишенью дифференциально выразил адаптивной | |||||
| CAMK2N1 | PAFAH1B2 | SEC23A | ABCB9 | FGD4 | SLC25A27 |
| АВТОМОБИЛИ | PDE4B | SNX5 | APOO | FRMD4B | SLC38A1 |
| CYP24A1 | PDE7A | SYT4 | ARHGEF38 | GPR137B | TMCC1 |
| DBF4 | PGM3 | THAP12 | АВЕН | HMBS | TRIM71 |
| HMGN2 | PNP | TMED7 | CASP3 | METAP1 | XKR8 |
| KMT5A | REV. 1 | TNFAIP2 | CCNJ | MITF | ZCCHC11 |
| LRRC17 | RPS19BP1 | TNFRSF10C | CMTR2 | MYC | ZIM3 |
| MDH2 | RRAD | TP53 | CNMD | RGMB | ZNF181 |
| MIS18A | SEC62 | UBE2V2 | DSCR8 | SLC14A1 | |
| ZNF420 | |||||
| Б. различия в Топ болезней и biofunctions | |||||
| Болезни и расстройства | Значение P | Болезни и расстройства | Значение P | ||
| Воспалительные заболевания | 3.84E-02 - 3.84E-05 | Научные травмы и аномалии | 4.96E-02 - 2.77E-14 | ||
| Воспалительной реакции | 3.84E-02 - 3.84E-05 | Заболевания репродуктивной системы | 2.15E-02 - 2.77E-14 | ||
| Научные травмы и аномалии | 4.17E-02 - 4.17E-05 | Рак | 4.96E-02 - 1.27E-10 | ||
| C. Топ молекулярных и клеточных функций | |||||
| Молекулярная и клеточная функции | P Значение | Молекулярная и клеточная функции | P Значение | ||
| Сотовый развития | 2.05E-02 - 5.26E-07 | Клеточного движения | 3.77E-02 - 4.47E-07 | ||
| Сотовый компромисс | 3.75E-04 - 3.75E-04 | Клеточную смерть и выживания | 4.91E-02 - 5.61E-06 | ||
| Клеточный цикл | 2.62E-03 - 2.62E-03 | Сотовый развития | 4.97E-02 - 1.38E-06 | ||
| D. Топ физиологические системы развития и функции | |||||
| Развитие и функции | P Значение | Развитие и функции | P Значение | ||
| Научные разработки | 4.17E-02 - 1.31E-03 | Эмбриональное развитие | 3.30E-02 - 2.12E-05 | ||
| Эмбриональное развитие | 1.29E-02 - 1.29E-02 | Развития соединительной ткани и функции | 1.79E-02 - 6.10E-05 | ||
| Развития соединительной ткани и функции | 1.93E-02 - 1.93E-02 | Морфология ткани | 7.88E-05 - 7.88E-05 | ||
| E. Top связанные сетевых функций | |||||
| Связанные сетевых функций | Оценка | Связанные сетевых функций | Оценка | ||
| Сотовый развития, воспалительные заболевания, воспалительной реакции | Научные травмы и патологий, болезней репродуктивной системы, рак | ||||
| 6 | 19 | ||||
Таблица 4: функциональный анализ программного обеспечения резюме женщины подвергаются воздействию озона в не proestrus против proestrus этапов. Программное обеспечение функционального анализа позволяет анализ Топ канонические пути, вверх по течению регуляторов, заболеваний и функций, топ функций, регулятор эффект сетей и многое другое. Эта таблица была изменена от Фуэнтес et al.6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
МикроРНК профилирование является выгодным техника для диагностики заболеваний и механистические исследований. В этой рукописи мы определили протокол для оценки выражения интерферирующим прогнозам регулировать воспалительные гены в легких самок мышей, воздействию озона в различных эстрального цикла этапов. Методы определения эстральный цикл, например метод визуального обнаружения, были описаны16. Однако эти полагаться на одноразовые измерений и поэтому являются ненадежными. Чтобы точно определить все этапы эструс у самок, которые регулярно цикла, рекомендуется использовать метод, описанный здесь. Кроме того этот простой протокол может также использоваться для косвенно оценить ежедневные гормональные колебания в мышах. Чтобы избежать активации нежелательных воспалительных реакций вследствие вагинального раздражения, отбора проб должна быть выполнена только один раз ежедневно. Из-за изменчивости в длину цикла и жилищного влияний важно выполнять протокол за два-три полных цикла перед использованием животных в эксперименте, учитывая стадии цикла.
Для успешного извлечения РНК из легочной ткани Точная процедура имеет решающее значение. Этот протокол описывает метод один день изолировать РНК из легочной ткани, что дает высокое качество РНК. Изменения в протокол изготовителя обязаны эффективно извлекать РНК из легких. Мы добавили дополнительные центрифугирования шаг после добавления мыть буфера, чтобы удалить столько буфера как можно скорее. Мы также этого eluted РНК с 35 мкл DNase/РНКазы свободной воды, центрифугирование столбце для 1,5 мин для обеспечения высокой концентрации. Spectrofluorometer результаты подтвердили эффективность нашей РНК добыча протокола. Коэффициент поглощения на 260 и 280 Нм (соотношение A260/280) часто используется для оценки чистоты препаратов РНК. Максимальная абсорбция для нуклеиновые кислоты составляет 260 и 280 Нм, соответственно. Он принимается как «чистый» для РНК, если соотношение составляет около 2.017. Аналогичным образом для A260/A230 загрязнение коэффициента поглощения, значения для чистоты находятся в диапазоне 2,0-2,218. В настоящем исследовании, средняя A260/A280 A260/A230 коэффициенты и наблюдается были 2.016 ± ± 0,002 и 2.179 0,018, соответственно (Таблица 1). Таким образом наш РНК добыча протокол был успешным. Еще одно преимущество используемого протокола является добавление DNAse лечения. Это важно, чтобы избежать загрязнения геномной ДНК19. Ограничение этого протокола изоляции РНК является использование столбцов очистки сбросить отходы через осадков с помощью алкоголя, потому что некоторые легких мусора могут препятствовать мембраны, частично или полностью, что приводит к низкой урожайностью. Кроме того если тщательно не выполняется шаг гомогенизации, большое количество легких РНК можно легко потеряли или деградации. Если получают низкие урожаи РНК, РНК может повторно очищается и этого eluted в меньший объем. Кроме того РНК может быть осажденный ночи следующие опубликованные протоколы20.
Технологии microarray Мирна профилирования являются перспективные инструменты во многих областях исследований. В нашем исследовании мы использовали ПЦР массивы, которые обеспечивают преимущество выше порога обнаружения и нормализация стратегий для обнаружения дифференциально выраженной интерферирующим против других технологий, таких, как на основе выборки Мирна массивов21. Ограничение этого протокола является, что она требует минимальное количество начиная РНК материал и наличие конкретных наборов праймеров для адаптивной интереса, в отличие от других имеющихся методов, таких как RNAseq. Еще одним преимуществом на основе ПЦР массивов является вариант с использованием не miRNA ссылку генов для нормализации ПЦР (например малые ядрышковые РНК или SNORDs) для вычисления дифференциальных выражение адаптивной. Наконец с помощью ПЦР массивы предоставляет несколько параметров для анализа данных, начиная от онлайн инструментов, предоставляемых производителями, для обычных методов выявления дифференциального выражение хотя Real-Time PCR. Статистический анализ с Лимма удобен для microarrays и массивы на основе ПЦР и использует эмпирических Байеса модератором f- статистики22. Здесь мы покажем, что как p- и q значения (с поправкой на несколько тестирования) могут быть получены с командой toptable, регулировка порога скорость ложных обнаружения и идентификации дифференциально выразил адаптивной.
Функциональный анализ программного обеспечения является веб-приложение для анализа данных в контексте путь. Программное обеспечение дает исследователям мощный поиск возможностей, которые могут помочь наборы данных кадра или конкретных целевых показателей в контексте, в рамках более широкую картину биологическое значение. Хотя программная среда является гибким, для различных видов анализа (т.е. метаболомики, SNP, протеомики, микроРНК, токсикология и т.д.), наша цель здесь, чтобы подчеркнуть аспекты анализа Мирна. После загрузки списка 14 интерферирующим с значительным выражение лог коэффициенты и p значения, все были сопоставлены программного обеспечения. Мы провели Мирна целевой фильтр и основной анализ, который включает анализ путь обогащения. Однако такие анализы считают генов, для которых 14 интерферирующим прогнозируются цели и не адаптивной, сами. В разделе результаты перечислены мероприятия такие, как: канонические пути, заболевания и функции, гены, мишенью дифференциально выраженной адаптивной, физиологические системы развития, регуляторы и сетей (Таблица 4). Визуализация путь отображается на вкладке Сеть, где адаптивной и молекулы показываются как интерактивные узлы, которые связаны с информацией, связанной с гена интереса (рис. 3). Преимуществом программного обеспечения функционального анализа является высокое качество связанных с Мирна выводы, включая экспериментально проверяются и прогнозируемого взаимодействия. Базы данных программного обеспечения функционального анализа включают: экспериментально проверенных микроРНК мРНК взаимодействия баз данных23,24, предсказал микроРНК мРНК взаимодействие базы данных с низким доверием взаимодействий, исключаются (например, Целевые проверки)25, экспериментально проверенных человека, крыса и мышь микроРНК мРНК взаимодействия баз данных (например, miRecords)26и литературе выводов (например, связанных с микроРНК выводы вручную куратор из опубликованной литературы научные эксперты). Другие исследования, сравнивающие эффективность и удобство в использовании инструментов биоинформатики для анализа путей, связанное с выражением, Мирна подтверждают эффективность данного программного обеспечения27. В целом, вычислительные методы являются экономически эффективным, меньше времени и может быть легко проверен молекулярных методов. С постоянный рост и накопление биомедицинских данных Биоинформатика методы станут все более мощные в открытие Мирна опосредованного механизмов болезней и биологических процессов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они имеют не конкурирующие интересы.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантов из низ K01HL133520 (PS) и K12HD055882 (PS). Авторы благодарят д-р Джоанна Floros за помощь с озоном воздействия экспериментов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | 8 weeks old |
| UltraPure Water | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
| Sterile plastic pipette | Fisher Scientific | 13-711-25 | Capacity: 1.7 mL |
| Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 2951TS | |
| Light microscope | Microscope World | MW3-H5 | 10x and 20x objective |
| Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein Animal Health | 55853 | 90 mg/kg. Controlled drug. |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10 mg/kg. Controlled Drug. |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dilute to 70% ethanol with water. |
| 21 G gauge needle | BD Biosciences | 305165 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 329654 | 1 mL |
| Operating Scissors | World Precision Instruments | 501221, 504613 | 14 cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip |
| Tweezer Kit | World Precision Instruments | 504616 | |
| Spectrum Bessman Tissue Pulverizers | Fisher Scientific | 08-418-1 | Capacity: 10 to 50 mg |
| RNase-free Microfuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12400 | 1.5 mL |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
| Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
| Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | for 20 μL reactions |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
| R Software | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| Thermal cycler or chilling/heating block | General Lab Supplier | ||
| Microcentrifuge | General Lab Supplier | ||
| Real-time PCR cycler | General Lab Supplier | ||
| Multichannel pipettor | General Lab Supplier | ||
| RNA wash buffer | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
| DNA digestion buffer | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 mL |
| RNA pre-wash buffer | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
| Ultraviolet ozone analyzer | Teledyne API | Model T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
| Mass flow controllers | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |
References
- Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).
- Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression? Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).
- Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases. Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).
- Sessa, R., Hata, A. Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases. Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).
- Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation. Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).
- Aris, R. M., et al. Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy. American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
- Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. In vitro exposure of proteins to ozone. Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression. Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).
- Smyth, G. K., et al. Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide. Bioconductor. , (2002).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).
- Alves, M. G., et al. Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology. Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).
- Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Walker, S. E., Lorsch, J.
- Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
- Smyth, G. K. Limma: linear models for microarray data. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).
- Griffiths-Jones, S. miRBase: the microRNA sequence database. Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).
- Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets. RNA. 12 (2), 192-197 (2006).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions. Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).
- Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression. Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).
