Summary
Her beskriver vi en metode til at vurdere lunge udtryk af miRNAs, der er forudsagt til at regulere inflammatoriske gener ved hjælp af mus udsættes for ozon eller filtreret luft på forskellige stadier af estrous cyklus.
Abstract
MikroRNA (miRNA) profilering er blevet af interesse for forskere, der arbejder i forskellige områder af biologi og medicin. Aktuelle undersøgelser viser en lovende fremtid ved hjælp af miRNAs i diagnosticering og behandling af lungesygdomme. Her, definerer vi en protokol for miRNA profilering for at måle den relative forekomst af en gruppe af miRNAs forudsagt for at regulere inflammatoriske gener i lungevæv fra af en ozon-induceret luftvejs inflammation musemodel. Fordi det har vist sig at cirkulerende sex hormonniveauer kan påvirke reguleringen af lunge medfødt immunitet hos kvinder, er formålet med denne metode at beskrive en inflammatorisk miRNA profilering protokol i hunmus, under hensyntagen til estrous cyklus fase af hvert dyr på tidspunktet for ozon eksponering. Vi også behandle gældende Bioinformatik tilgange til miRNA opdagelse og målet identifikationsmetoder ved hjælp af limma, en R/Bioconductor software, og funktionel analyse software til at forstå de biologiske kontekst og veje i forbindelse med differential miRNA udtryk.
Introduction
MicroRNA (miRNAs) er korte (19-25 nukleotider), naturligt forekommende, ikke-kodende RNA molekyler. Sekvenser af miRNAs er evolutionær bevaret på tværs af arter, hvilket tyder på betydningen af miRNAs i reguleringen af fysiologiske funktioner1. microRNA expression profilering har vist sig for at være nyttigt til at identificere miRNAs, der er vigtige i reguleringen af en række processer, herunder immunrespons, Celledifferentiering, udviklingsprocesser og apoptose2. Mere nylig, miRNAs er blevet anerkendt for deres potentielle anvendelse i sygdom diagnostik og terapi. For forskere at studere mekanismer af genregulering, kan måle miRNA udtryk oplyse systemer-niveau modeller af regulerende processer, især når miRNA oplysninger flettes med mRNA profilering og andre genom-skala data3. På den anden side miRNAs har også vist sig at være mere stabil end mRNAs i en vifte af modellen typer og er også målbare med større følsomhed end proteiner4. Dette har ført til betydelig interesse i udviklingen af miRNAs som biomarkører for forskellige molekylære diagnostiske programmer, herunder lungesygdomme.
I lungen spiller miRNAs vigtige roller i udviklingsprocesser og opretholdelsen af homøostase. Derudover har deres unormale udtryk været forbundet med udvikling og progression af forskellige lungesygdomme5. Inflammatorisk lungesygdom forårsaget af luftforurening har vist større sværhedsgrad og dårligere prognose hos kvinder, der angiver, at hormoner og estrous cyklus kan regulere lunge medfødt immunitet og miRNA udtryk som reaktion på miljømæssige udfordringer 6. i denne protokol, vi bruger ozon eksponering, som er en vigtig del af luftforureningen, for at fremkalde en form for lungebetændelse i hunmus, der opstår i mangel af adaptive immunitet. Ved hjælp af ozon, vi inducerende udviklingen af luftvejene hyperresponsivitet, der er forbundet med luftvejene epitelcelle skader og en stigning i neutrofile og inflammatoriske mediatorer i proksimale airways7. Der er i øjeblikket ikke velbeskrevet protokoller til at karakterisere og analysere miRNAs på tværs af estrous cyklus i ozon-eksponerede mus.
Nedenfor beskriver vi en simpel metode til at identificere estrous cyklus faser og miRNA udtryk i lungevæv af hunmus udsat for ozon. Vi tager også fat effektiv Bioinformatik tilgange til miRNA opdagelse og målet identifikation, med en vægt på computational biologi. Vi analyserer microarray data ved hjælp af limma, en R/Bioconductor software, der giver en integreret løsning til at analysere data fra gen expression eksperimenter8. Analyse af PCR array data fra limma har en fordel i forhold til magten over t-test baseret procedurer, når du bruger små antal arrays/prøver for at sammenligne udtryk. For at forstå biologiske forbindelse med miRNA udtryk resultater, brugte vi så funktionel analyse software. For at forstå de mekanismer, der regulerer transcriptional ændringer og forudsige sandsynlige udfald kombinerer softwaren miRNA-udtryk datasæt og viden fra litteratur9. Det er en fordel sammenlignet med software, bare kigge efter statistiske berigelse i overlappende sæt miRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Penn State University.
1. vurdering af Estrous cyklus scene
- Korrekt begrænse en kvindelig C57BL/6 mus (8 – 9 uger gammel) bruger en egenmægtig mus tilbageholdenhed teknik beskrevet i Machholz et al.10.
- Fyld den sterile plastik pipette med 10 μL af ultra rent vand.
- Indføre spidsen af plast pipette i skeden.
- Forsigtigt tømme væsken 4 – 5 gange at indsamle prøven.
- Placer den endelige flush indeholdende vaginal væske på et glas dias.
- Observere unstained vaginal flush under et lysmikroskop med en 20 x mål.
Bemærk: Dyr, der ikke viser regelmæssige cykler på grund af pseudopregnancy eller andre årsager skal udelukkes fra forsøget. Det anbefales at udføre daglige vaginalsekret for mindst tre på hinanden følgende cyklusser at bekræfte tidsrækkemodeller.
2. udsættelse for ozon
- Placer højst 4 mus i to 1,2 L glasbeholdere med wire mesh låg og vand ad libitum.
- Sætte en glasbeholder i ozon kammeret og den anden i den filtrerede luft eksponering kammer.
- Justere ozonkoncentration for 2 ppm og overvåge ozonniveauer regelmæssigt.
Bemærk: Apparatet ozon leverer en reguleret luftstrøm (> 30 luft ændringer/h) med kontrolleret temperatur (25 ° C) og den relative luftfugtighed (50%). Systemet genererer ozon ved en elektrisk udladning ozonizer, som er overvåget og kontrolleret af en ultraviolet ozon analyzer og massestrøm controllere, som tidligere beskrevet11. - Fjerne glasbeholdere efter 3 h af ozon/filtreret luft eksponering. Vende dyr til bur med sengetøj, mad og vand ad libitum.
3. lunge samling
- 4 timer efter eksponering, bedøver dyr med en intraperitoneal injektion af en ketamin/xylazin cocktail (90 mg/kg ketamin, 10 mg/kg xylazin).
Bemærk: For at bekræfte et passende niveau af anæstesi, tjek mus nemlig en pedal refleks (fast tå knivspids) og justere narkose efter behov. - Dæmpe mus huden med 70% ethanol.
- Lave en 2 cm midterlinjen snit ved hjælp af en drift saks og kirurgisk pincet til at eksponere vena cava.
- Ofre mus ved transection af vena cava og aorta. Hvis det er nødvendigt, skal du indsætte en 21 G gauge kanyle ind i vena cava over de renale vener til at indsamle blod før exsanguination. Alternativt, indsamle blod gennem hjertet punktering efter standardprotokoller.
- Brug en kirurgisk saks til at skære åbne bughulen og fjerne hud/øverste muskel, bevæger sig opad mod ribbenene.
- Brug en kirurgisk saks til at punktere mellemgulvet.
Bemærk: Lungerne vil kollapse fra mellemgulvet. - Skåret væk brystkassen ved hjælp af en kirurgisk saks til at eksponere hjerte og lunger.
- Bruge pincet, tage en 1,5 mL RNase-fri microcentrifuge tube og nedsænkes i flydende kvælstof til at fylde røret.
Bemærk: Brug beskyttelsesbriller og beskyttelseshandsker til at håndtere flydende kvælstof. - Fjerne lungerne, placere dem i de RNase-fri microcentrifuge 1,5 mL rør fyldt med flydende nitrogen til snap-freeze væv, og vent et par sekunder, indtil væsken fordamper.
- Luk røret låget og gemme væv ved-80 ° C indtil brug.
4. RNA forberedelse
- Male hele lungerne ved hjælp af en rustfrit stål væv knuser.
Bemærk: Væv knuser skal placeres i flydende nitrogen før anvendelsen. Ren knuser efter hver brug med RNAse løsning. - Split pulveriseret lungerne og placere i to 1,5 mL rør (halv lunge).
- Tilsæt 500 µL af guanidinium kaliumthiocyanat pr. prøveglas og bland. Omrystes hver prøve 18 G, 21 G og 23 G nåle, henholdsvis.
Bemærk: Prøver kan være tilsat 5.6 x 108 eksemplarer af en lille RNA spike-objektet (fra en anden art), før du fortsætter med udpakningen. - Tilføje 500 µL af ethanol til hver prøve og vortex for 15 s.
- Belastning blandingen i en spin kolonne i en collection tube og centrifugeres ved 12.000 x g i 1 min. kassere gennemstrømnings.
-
For DNase jeg behandling (i-kolonne);
- Tilføj 400 µL af RNA Wash Buffer, og der centrifugeres ved 12.000 x g i 1 min.
- I en RNase-fri rør, tilsæt 5 µL af DNase jeg og 75 µL 1 x DNA fordøjelsen buffer og bland. Tilføj blandingen direkte til matrixen kolonne.
- Inkuber ved stuetemperatur i 15 min.
- Tilføj 400 µL af RNA prewash løsning til kolonnen og centrifugeres ved 12.000 x g i 1 min. udsmid gennemstrømnings- og Gentag dette trin.
- Tilføje 700 µL af RNA wash buffer til kolonnen og centrifugeres ved 12.000 x g i 1 min. kassér gennemstrømnings.
- Der centrifugeres ved 12.000 x g i 2 min til at fjerne tilbageværende buffer. Overfør kolonnen til et RNase-fri rør.
- For at eluere RNA, tilføje 35 µL DNase/RNase-fri vand direkte til kolonne matrix og centrifugeres ved 12.000 x g i 1,5 min.
- Måle total RNA-koncentrationen (260 nm) og renhed ved hjælp af et spektrofotometer. Følg instruktionerne for at udføre RNA kvantificering i en 1,5 µL prøve alikvot. Tomme instrumentet med DNase/RNase-fri vand bruges til eluering.
Bemærk: En 260/280-forholdet af ~2.0 er generelt accepteret som "ren" til RNA. Typiske RNA-koncentrationen svinger normalt mellem 750 og 2.500 ng/µL. - Opbevares ved-80 ° C.
5. miRNA profilering
-
Til retro-transskribere små RNA'er, brug 200 ng af total RNA.
- Forberede reverse-transskription-mastermix på is (samlede volumen pr. reaktion er 20 µL). For hver reaktion, tilsættes 4 µL af 5 x buffer, 2 µL af 10 x nukleotider mix, 2 µL af reverse transkriptase og 2 µL af RNase-fri vand. Bland alle de komponenter og alikvot i 600 µL RNAse-fri plastrør (10 µL af mix pr. reaktion).
Bemærk: Reverse-transskription master mix indeholder alle komponenter, der kræves for første-streng cDNA syntese undtagen skabelon RNA.
Bemærk: Beregning af overskydende volumen (10%) ved udarbejdelsen af master mix. - Tilføje skabelonen RNA (200 ng i 10 µL) til hver tube indeholder reverse-transskription master mix. Mix, centrifugeres i 15 s på 1.000 x g, og gemme dem på køl indtil anbringelse i thermocycler eller tør blok.
- Inkuber i 60 minutter ved 37 ° C.
- Inkuber i 5 min. ved 95 ° C og Anbring rør på is.
- Fortyndes cDNA ved at tilføje 200 µL af RNase-fri vand til hver 20 µL reverse-transskription reaktion.
- Forberede reverse-transskription-mastermix på is (samlede volumen pr. reaktion er 20 µL). For hver reaktion, tilsættes 4 µL af 5 x buffer, 2 µL af 10 x nukleotider mix, 2 µL af reverse transkriptase og 2 µL af RNase-fri vand. Bland alle de komponenter og alikvot i 600 µL RNAse-fri plastrør (10 µL af mix pr. reaktion).
-
Udfør real-time PCR ved hjælp af musen inflammatorisk respons og autoimmunitet miRNA PCR Array.
- Forberede en mastermix (samlede volumen 1100 µL): For hver reaktion, tilføje 550 µL af 2 x PCR master mix, 110 µL af 10 x universal primer mix, 340 µL af RNase-fri vand og 340 µL af skabelon cDNA (fortyndet reaktion fra trin 5.1.5).
- Tilsæt 10 µL af mastermix til hver brønd af den pre-belæsset miRNA PCR Array ved hjælp af en mulitkanalpipette.
- Forsegle miRNA PCR Array plade med optisk selvklæbende film.
- Der centrifugeres plade for 1 min på 1.000 x g ved stuetemperatur til at fjerne boblerne.
- Programmere realtids cycler, PCR første aktivering trin i 15 min. ved 95 ° C, 3-trins cykling indeholdende denaturering for 15 s på 94 ° C, udglødning for 30 s på 55 ° C, og udvidelse til 30 s ved 70 ° C i 40 cykler nummer.
Bemærk: Følg producentens cykling betingelser instruktioner til at konfigurere de real-time cycler. Udføre trinnet dissociation kurve indbygget i softwaren, real-time cycler. - Udføre dataanalyse.
6. dataanalyse
- Uddrag Ct værdier fra realtid PCR software til hver prøve i en analyse software.
Bemærk: En Ct værdi af 34 betragtes som cutoff. Hvis prøver indeholder spike-objektet (f.eks., cel-mir-39), normalisere Ct værdier til spike i kontrol for hver prøve. Tærskelværdier kan skal indstilles manuelt. Baseline værdierne angives automatisk. - Normalisere Ct værdier til den gennemsnitlige Ct af seks miRNA husholdning objekter: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, ved hjælp af følgende ligning:
ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping) - Ændre beregninger for fold, beregne ΔΔCt værdier ved hjælp af en bestemt prøve som kontrol, ved hjælp af relative udtryk ligning12:
miRNA relative udtryk:
2-∆∆Ct, hvor - ∆∆Ct =-[∆Ct test - ∆Ct kontrol]
Bemærk: En fold ændring af 200 betragtes som cutoff. - Eksport fold ændre udtryk værdier til at udføre statistisk analyse på R ved hjælp af pakken limma i Bioconductor8.
- Korrigere for flere sammenligninger ved hjælp af Benjamini-Hochberg metode13.
Bemærk: En kopi af scriptet R er tilgængelig på: http://psilveyra.github.io/silveyralab/. Datasæt og analyserede data er også tilgængelige på gen Expression Omnibus under nummer GSE111667, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.
7. dataanalyse: Funktionel analyse Software
- Arrangere datasættet. Omfatte miRNAs med deres respektive udtryk log nøgletal og p-værdier. Se tabel 1 for specifikke datasæt formatering.
- Åben funktionel analyse software (version 01-10).
- Uploade det datasæt ved hjælp af følgende format: filformat: "Fleksible Format", indeholder kolonneoverskrift: "Ja", skal du vælge id type: "miRBase (modne)", Array platform anvendes til eksperimenter: vælge array platformen.
Bemærk: Accepteret filformater er .txt (tabulatorsepareret tekstfiler), .xls (excel-filer), og .diff (cuffdiff filer). - Vælg "Udlede observationer" og kontrollere, at den eksperimentelle gruppe mærkning er korrekte.
- Gå til "Datasæt Resumé" til at revidere den samlede kortlagt og unmapped miRNAs.
-
Klik på knappen "ny" øverst til venstre i programmet. Vælg "Ny mikroRNA Target Filter" og uploade et mikroRNA datasæt.
- Angiv kilden til: TarBase, opfindsomhed eksperter resultater, miRecords.
- Angive tillid til: eksperimentelt observerede eller høje (forventet).
- Vælg "Tilføj kolonner" til at omfatte en bred vifte af biologiske oplysninger om mål som arter, sygdomme, væv, veje og meget mere.
- For at fokusere på mål, der har ændret udtryk i eksperimentet, vælge "Tilføj / Erstat mRNA dataset". Brug "Udtryk parring" for at finde MicroRNA med de samme eller forskellige udtryk.
Bemærk: Filter analyse vil give mikroRNA navne og symboler, mRNA mål, den kilde, som beskriver relationen mål og konfidensniveau for de forudsagte forhold (figur 2).
- Klik på "Tilføj til min vej" for at sende den filtrerede datasæt til en pathway lærred og udforske flere biologiske relationer.
- Brug stien Designer til at oprette en publikation-kvalitet model af mikroRNA effekter.
-
En alternativ mulighed er at oprette en grundlæggende analyse.
- Core analysetype, Vælg "Udtryk analyse".
- Måling type, Vælg "Expr Log Ratio".
- Analyse Filter Resumé: Overvej kun molekyler og/eller relationer hvor: (arter = mus) og (tillid = eksperimentelt observerede) og (datakilder = "Opfindsomhed ekspert resultater", "Opfindsomhed ExpertAssist resultater", "miRecords", "TarBase", eller " TargetScan menneskelige").
- Vælg en cutoff for p-værdi = 0,05.
- Køre analysen.
Bemærk: Rapporten vil omfatte: kanoniske veje, opstrøms tilsynsmyndigheders analyse, sygdomme og funktioner, regulator virkninger, netværk, molekyler og meget mere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De forskellige celletyper observeret i udstrygningspræparater bruges til at identificere mus estrous cyklus scene (figur 1). Disse identificeres ved celle morfologi. Under proestrus er celler næsten udelukkende klynger af runde-formet, velformede nukleeret epitelceller (figur 1A). Når musen er i stadiet estrus, er celler cornified planocellulære epitelceller, til stede i tætpakkede klynger (figur 1B). Under metestrus, cornified epitelceller og polymorfnukleære leukocytter ses (figur 1 c). I diestrus er leukocytter (små celler) generelt mere udbredt (fig. 1 d).
Vi ekstraheret RNA fra fire mus lungerne efter protokollen tidligere beskrevet. Nukleinsyre koncentrationer (ng / µL) varierede mellem 1197.9 og 2178.1 med et gennemsnit på 1583.1 ± 215 (tabel 1). Gennemsnitlige A260/A280 ratio svingede fra 2,010 til 2.020 2.016 ± 0,002 i gennemsnit. På den anden side de observerede A260/A230 nøgletal svingede mellem 2.139 og 2.223 med et gennemsnit på 2.179 ± 0.018.
Tabel 2 viser differential udtryk resultater indhentet med limma på R. Vi beregnet top varierende udtrykt miRNAs mellem mus udsættes for ozon eller filtreret luft i proestrus (ved hjælp af kommandoen toptable)14. Den første kolonne giver værdien af log2-fold fold ændring i miRNA udtryk mellem ozon og filtreret luft udsatte dyr. Kolonne t repræsenterer den moderate t-statistik, beregnet for hver miRNA i sammenligningen. Kolonnerne p.value og adj.p.value repræsenterer tilhørende p-værdier for hver sammenligning før og efter flere test justering, henholdsvis. Justering for flere sammenligninger blev udført med Benjamini og Hochbergs metode til at kontrollere de falske opdagelse sats15. Kolonne B repræsenterer log-odds, som miRNA er varierende udtrykt8.
Vi udførte den miRNA target filter og core analyse, der omfatter berigelse pathway analyse. Efter at uploade en liste over 14 miRNAswith betydelig udtryk log ratio og p-værdi, var alle af dem kortlagt af miRNA target filter (tabel 3). Resultaterne var filtreres og sorteres for at komme til visse veje, i dette tilfælde "Cellulære immunrespons". Core analyse fremlagt oplysninger om kanoniske stier, sygdomme og funktion, lovgivere og netværk (tabel 4). Funktionel analyse software udarbejdet en netværksanalyse, der viser forholdet mellem miRNAs af interesse og andre molekyler (figur 3).
Figur 1: identifikation af estrous cyklus stadier. (A) Proestrus (overvejende nukleeret epitelceller); (B) estrus (overvejende anucleated cornified celler); (C) metestrus (alle tre typer af celler); og (D) diestrus 2 (flertal af leukocytter). Skalalinjen = 100 µm. forstørrelse = 20 x. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: funktionel analyse software repræsentative resultater: miRNA target filteret. Omfattende profil af miRNAs på forskellige stadier af estrous cyklus. Efter at have optrådt miRNA filter, leverer softwaren detaljerede oversigter over gener og forbindelser impliceret i sygdomme og andre fænotyper, der kan filtrere og sortere at komme til visse veje, i dette tilfælde "Cellulære immunrespons". Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: funktionel analyse software repræsentative resultater: netværk. Sammenligning af net ramt af filtreret luft eller ozon eksponering i hunner på forskellige stadier af estrous cyklus. Diagram over biologiske netværk tilknyttet miRNAs i lungerne af hunmus udsat for filtreret luft vs ozon i proestrus (A) eller ikke-proestrus faser (B). Dette tal er blevet ændret fra Fuentes et al.6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| ID | Nukleinsyre (ng/µL) | A260/A280 | A260/A230 |
| Prøve 1 | 1197.930 | 2.015 | 2.192 |
| Prøve 2 | 1355.703 | 2.018 | 2.223 |
| Prøve 3 | 2178.104 | 2.020 | 2.163 |
| Prøve 4 | 1600.837 | 2,010 | 2.139 |
| Gennemsnit | 1583.144 ± 215 | 2.016 ± 0,002 | 2.179 ± 0.018 |
Tabel 1: eksempel på RNA koncentrationer og absorbans nøgletal på 260, 230 og 280 nm fra renset lungerne vævsprøver fra fire mus. Koncentrationer blev målt med et spektrofotometer.
| logFC | t | P.Value | adj. P.Val | B | |
| MMU-miR-694 | 1.492 | 4.071 | 0.000153 | 0.009514 | 0.759 |
| MMU-miR-9-5 p | 0.836 | 3.916 | 0.000254 | 0.009514 | 0.289 |
| MMU-miR-221-3 p | 0.385 | 3.106 | 0.003014 | 0.075361 | -1.982 |
| MMU-miR - 181d - 5p | 0.597 | 2.891 | 0.005516 | 0.103424 | -2.526 |
| MMU-miR-98-5 p | 0.558 | 2.699 | 0.009243 | 0.138649 | -2.987 |
| MMU-miR-712-5 p | 0,667 | 2.563 | 0.013169 | 0.164609 | -3.299 |
| MMU-miR-106a - 5p | -0.528 | -2.412 | 0.019278 | 0.206547 | -3.632 |
Tabel 2: Limma analyseresultater for varierende udtrykt miRNAs hos kvinder udsat for ozon vs . filtreret luft i proestrus fase.
| miRNAs ID | Observation 1 | Observation 1 | Observation 2 | Observation 2 |
| Expr Log forholdet | P-værdi | Expr Log forholdet | P-værdi | |
| MMU-miR-694 | 1.492 | 0.000153 | 0.543319208 | 0.0021385 |
| MMU-miR-9-5 p | 0.836 | 0.000254 | 0.677595421 | 0.004997439 |
| MMU-miR-221-3 p | 0.385 | 0.003014 | ||
| MMU-miR - 181d - 5p | 0.597 | 0.005516 | 0.342276659 | 0.106467657 |
| MMU-miR-98-5 p | 0.558 | 0.009243 | 0.455392799 | 0.034724699 |
| MMU-miR-712-5 p | 0,667 | 0.013169 | ||
| MMU-miR-106a - 5p | -0.528 | 0.019278 |
Tabel 3: eksempel format for multi observation upload af datasæt til funktionel analyse software. Flere eksperimentelle differential udtryk kan være grupperet i et enkelt regneark og uploadet, og så mange observationer efter behov kan tilføjes. Kolonner: 1) miRNAs ID; 2) observation 1: Expr Log forholdet; 3) observation 1: P-værdi; 4) observation 2: Expr Log forholdet; 5) observation 2: P-værdi.
| Ikke-proestrus | Proestrus | ||||
| A. gener målrettet af varierende udtrykt miRNAs | |||||
| CAMK2N1 | PAFAH1B2 | SEC23A | ABCB9 | FGD4 | SLC25A27 |
| BILER | PDE4B | SNX5 | APOO | FRMD4B | SLC38A1 |
| CYP24A1 | PDE7A | SYT4 | ARHGEF38 | GPR137B | TMCC1 |
| DBF4 | PGM3 | THAP12 | AVEN | HMBS | TRIM71 |
| HMGN2 | PNP | TMED7 | CASP3 | METAP1 | XKR8 |
| KMT5A | REV1 | TNFAIP2 | CCNJ | MITF | ZCCHC11 |
| LRRC17 | RPS19BP1 | TNFRSF10C | CMTR2 | MYC | ZIM3 |
| MDH2 | RRAD | TP53 | CNMD | RGMB | ZNF181 |
| MIS18A | SEC62 | UBE2V2 | DSCR8 | SLC14A1 | |
| ZNF420 | |||||
| B. forskelle i top sygdomme og biofunctions | |||||
| Sygdomme og lidelser | P -værdi | Sygdomme og lidelser | P -værdi | ||
| Inflammatorisk sygdom | 3.84E-02 - 3.84E-05 | Kropsligt skade og abnormiteter | 4.96E-02 - 2.77E-14 | ||
| Inflammatorisk respons | 3.84E-02 - 3.84E-05 | Reproduktive system sygdom | 2.15E-02 - 2.77E-14 | ||
| Kropsligt skade og abnormiteter | 4.17E-02 - 4.17E-05 | Kræft | 4.96E-02 - 1.27E-10 | ||
| C. top molekylære og cellulære funktioner | |||||
| Molekylære og cellulære funktioner | P Værdi | Molekylære og cellulære funktioner | P Værdi | ||
| Cellulære udvikling | 2.05E-02 - 5.26E-07 | Cellulær bevægelse | 3.77E-02 - 4.47E-07 | ||
| Cellulære kompromis | 3.75E-04 - 3.75E-04 | Cellulære død og overlevelse | 4.91E-02 - 5.61E-06 | ||
| Celle cyklus | 2.62E-03 - 2.62E-03 | Cellulære udvikling | 4.97E-02 - 1.38E-06 | ||
| D. top fysiologiske systemudvikling og funktion | |||||
| Udvikling og funktion | P Værdi | Udvikling og funktion | P Værdi | ||
| Kropsligt udvikling | 4.17E-02 - 1.31E-03 | Embryonale udvikling | 3.30E-02 - 2.12E-05 | ||
| Embryonale udvikling | 1.29E-02 - 1.29E-02 | Bindevæv udvikling og funktion | 1.79E-02 - 6.10E-05 | ||
| Bindevæv udvikling og funktion | 1.93E-02 - 1.93E-02 | Væv morfologi | 7.88E-05 - 7.88E-05 | ||
| E. Top forbundet netværksfunktioner | |||||
| Forbundet netværksfunktioner | Score | Forbundet netværksfunktioner | Score | ||
| Udvikling af cellulære, inflammatorisk sygdom, inflammatorisk respons | Kropsligt skade og abnormiteter, reproduktive system sygdom, kræft | ||||
| 6 | 19 | ||||
Tabel 4: funktionel analyse software sammendrag af kvinder udsat for ozon i den ikke-proestrus vs proestrus stadier. Funktionel analyse software giver mulighed for analyse af top kanoniske veje, opstrøms regulatorer, sygdomme & funktioner, top funktioner, regulator effekt netværk og meget mere. Denne tabel er ændret fra Fuentes et al.6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MikroRNA profilering er en fordelagtig teknik til både klovesygediagnosticering og mekanistiske forskning. I dette manuskript definerede vi en protokol for at evaluere udtryk for miRNAs, der er forudsagt til at regulere inflammatoriske gener i lunger af hunmus udsat for ozon i forskellige estrous cyklus faser. Metoder til bestemmelse af estrous cyklus, som metoden visuel genkendelse har været beskrevet16. Men disse stole på engangs målinger, og derfor er upålidelige. Til præcist for at identificere alle estrous cyklus stadier i hunner at cykle regelmæssigt, anbefales metoden beskrevet her. Denne enkle protokol kan desuden også bruges til at indirekte anslå daglige hormonelle udsving i mus. At undgå aktivering af uønskede inflammatoriske respons på grund af vaginal irritation, prøvetagning skal udføres én gang dagligt. På grund af variationen i cyklus længde og boliger påvirkninger, er det vigtigt at udføre protokollen for to til tre fuldstændige cyklusser før du bruger dyr i et eksperiment, overvejer cyklus scene.
For vellykket ekstraktion af RNA fra lungevæv er en nøjagtig procedure kritisk. Denne protokol beskriver en endags-metode til at isolere RNA fra lungevæv, der giver høj kvalitet RNA. Ændringer til producentens protokol var forpligtet til at effektivt uddrag RNA fra lungerne. Vi har tilføjet et ekstra centrifugering skridt efter tilsætning af wash buffer til at fjerne så meget buffer som muligt. Vi elueret også RNA med 35 µL DNase/RNase-fri vand, centrifugering kolonnen for 1,5 min at sikre høje koncentrationer. Spectrofluorometer resultater bekræftet effektiviteten af vores RNA udvinding protokol. Forholdet mellem absorbans ved 260 og 280 nm (A260/280 ratio) er ofte bruges til at vurdere renhedsgraden af RNA præparater. Den maksimale absorbans for nukleinsyrer er 260 og 280 nm, henholdsvis. Det er accepteret som "ren" for RNA, hvis forholdet er omkring 2,017. På samme måde for A260/A230 forurening absorbans ratio er værdier for renhed i rækken af 2,0-2,218. I denne undersøgelse, var de gennemsnitlige A260/A280 og A260/A230 nøgletal observeret 2.016 ± 0,002 og 2.179 ± 0.018, henholdsvis (tabel 1). Derfor var vores RNA udvinding protokol vellykket. En anden fordel ved den protokol, der anvendes, er tilføjelsen af DNAse behandling. Det er vigtigt at undgå genomisk DNA forurening19. En begrænsning af protokollens RNA isolering er brugen af rensning kolonner til at kassere affald gennem nedbør ved hjælp af alkohol, fordi nogle lunge vragrester kan hindre membranen, enten helt eller delvist, hvilket resulterer i lave udbytter. Hvis homogenisering trin ikke udføres omhyggeligt, kan store mængder af lunge RNA også mistet let eller forringet. Hvis lave RNA udbytter er opnået, kan RNA re renset og elueret i en mindre volumen. Alternativt, RNA kan blive udfældet overnight følgende publicerede protokoller20.
Microarray teknologi anvendes til miRNA profilering er lovende værktøjer i mange forskningsområder. I vores undersøgelse brugte vi PCR arrays, som giver fordelen af højere påvisningsgrænse, og normalisering strategier for påvisning af varierende udtrykt miRNAs vs andre teknologier såsom sonde-baserede miRNA arrays21. En begrænsning af denne protokol er, at det kræver et minimum af starter RNA materiale, og tilgængeligheden af bestemte sæt primere for miRNAs af interesse, i modsætning til andre tilgængelige teknikker som RNAseq. En anden fordel ved PCR-baserede arrays er mulighed for at bruge ikke-miRNA reference gener for qPCR normalisering (f.eks små nucleolar RNA'er eller SNORDs) til at beregne differentierede udtryk af miRNAs. Endelig, ved hjælp af PCR matrixer giver flere muligheder for dataanalyser, lige fra online-værktøjer fra fabrikanterne, at konventionelle metoder til at opdage differential udtryk selv Real-Time PCR. Statistisk analyse med limma er bekvemt for både microarrays og PCR-baserede arrays og bruger den empiriske Bayes modereret f- statistik22. Vi viser her, at både p- og q-værdier (justeret for flere test) kan fås med kommandoen toptable justere falsk opdagelse sats tærskel og at identificere varierende udtrykt miRNAs.
Funktionel analyse software er et web-baseret applikation til dataanalyse i pathway sammenhæng. Softwaren giver forskere effektiv søgning evner, der kan bidrage til at ramme datasæt eller specifikke mål i kontekst, inden for et større billede af biologiske betydning. Selvom Softwaremiljø er fleksibel til forskellige typer af analyse (dvs. metabolomics, SNPs, proteomics, mikroRNA, toksikologi, etc.), vores mål her er at fremhæve aspekter af miRNA analyse. Efter at uploade en liste over 14 miRNAs med betydelig udtryk log-nøgletal og p-værdier, blev alle kortlagt af softwaren. Vi udførte miRNA target filter og core analyse, som omfatter berigelse pathway analyse. Sådanne analyser mener dog gener som de 14 miRNAs er forudsagt til at målrette og ikke miRNAs, selv. Afsnittet resultater viser output som: kanoniske veje, sygdomme og funktion, gener målrettet med varierende udtrykt miRNAs, fysiologiske systemudvikling, lovgivere og netværk (tabel 4). Pathway visualisering er vist under Netværksfanen, hvor miRNAs og molekyler der vises som klikbart noder, der er forbundet med oplysninger knyttet til gen af interesse (figur 3). En fordel ved den funktionelle analyse software er høj kvalitet miRNA-relaterede resultater, herunder både eksperimentelt validerede og forudsete vekselvirkninger. Funktionel analyse software databaser omfatter: eksperimentelt validerede mikroRNA-mRNA interaktioner databaser23,24, forudsagt mikroRNA-mRNA interaktion database med lav-tillid interaktioner udelukket (f.eks. Target scanning)25, eksperimentelt validerede menneskelige, rotte, og musen mikroRNA-mRNA interaktioner databaser (f.eks. miRecords)26og litteratur resultater (f.eks., mikroRNA-relaterede resultater manuelt kurateret af offentliggjort litteratur videnskabelige eksperter). Andre undersøgelser sammenligning af effektiviteten og anvendeligheden af bioinformatik værktøjer til at analysere veje tilknyttet miRNA udtryk bekræfte effektiviteten af denne software27. Samlede, beregningsmæssige metoder er omkostningseffektiv, mindre tidskrævende, og nemt kan valideres af molekylære metoder. Med den konstante vækst og ophobning af biomedicinske data bliver Bioinformatik metoder mere og mere magtfulde i opdagelsen af miRNA-medierede mekanismer i biologiske og sygdom processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af tilskud fra NIH K01HL133520 (PS) og K12HD055882 (PS). Forfatterne takke Dr. Joanna Floros for assistance med ozon eksponering eksperimenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | 8 weeks old |
| UltraPure Water | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
| Sterile plastic pipette | Fisher Scientific | 13-711-25 | Capacity: 1.7 mL |
| Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 2951TS | |
| Light microscope | Microscope World | MW3-H5 | 10x and 20x objective |
| Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein Animal Health | 55853 | 90 mg/kg. Controlled drug. |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10 mg/kg. Controlled Drug. |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dilute to 70% ethanol with water. |
| 21 G gauge needle | BD Biosciences | 305165 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 329654 | 1 mL |
| Operating Scissors | World Precision Instruments | 501221, 504613 | 14 cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip |
| Tweezer Kit | World Precision Instruments | 504616 | |
| Spectrum Bessman Tissue Pulverizers | Fisher Scientific | 08-418-1 | Capacity: 10 to 50 mg |
| RNase-free Microfuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12400 | 1.5 mL |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
| Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
| Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | for 20 μL reactions |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
| R Software | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| Thermal cycler or chilling/heating block | General Lab Supplier | ||
| Microcentrifuge | General Lab Supplier | ||
| Real-time PCR cycler | General Lab Supplier | ||
| Multichannel pipettor | General Lab Supplier | ||
| RNA wash buffer | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
| DNA digestion buffer | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 mL |
| RNA pre-wash buffer | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
| Ultraviolet ozone analyzer | Teledyne API | Model T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
| Mass flow controllers | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |
References
- Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).
- Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression? Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).
- Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases. Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).
- Sessa, R., Hata, A. Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases. Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).
- Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation. Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).
- Aris, R. M., et al. Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy. American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
- Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. In vitro exposure of proteins to ozone. Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression. Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).
- Smyth, G. K., et al. Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide. Bioconductor. , (2002).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).
- Alves, M. G., et al. Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology. Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).
- Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Walker, S. E., Lorsch, J.
- Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
- Smyth, G. K. Limma: linear models for microarray data. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).
- Griffiths-Jones, S. miRBase: the microRNA sequence database. Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).
- Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets. RNA. 12 (2), 192-197 (2006).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions. Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).
- Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression. Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).
