Summary
Här presenterar vi ett mycket lättillgänglig protokoll för att utvärdera cell rörelsen i mänskliga trofoblaster celler med tre in vitro-analyser: scratch analysen, transwell invasion analysen och den cell proliferation assay.
Abstract
Cellers rörelser är en viktig egenskap för trofoblaster under placenta utveckling och tidig graviditet. Betydelsen av korrekt trofoblaster migration och invasion framgår av graviditet störningar såsom preeklampsi och intrauterin tillväxt begränsning, som är förknippade med otillräcklig trofoblaster invasion av den maternella kärlsystemet. Tyvärr, vår förståelse av mekanismerna som moderkakan utvecklas från att migrera trofoblaster är begränsad. In vitro-analys av cellmigration via scratch analysen är ett användbart verktyg för att identifiera faktorer som reglerar trofoblaster flyttande kapacitet. Denna analys ensam definierar dock inte de cellförändringar som kan leda till förändrad cellmigration. Det här protokollet beskriver tre olika in vitro-analyser som används gemensamt utvärdera trofoblaster cell rörelse: scratch analysen, invasion analysen och spridningen analysen. De protokoll som beskrivs här kan också ändras för användning i andra cellinjer att kvantifiera cellers rörelser som svar på stimuli. Dessa metoder kan utredarna att identifiera individuella faktorer som bidrar till den cell rörligheten och ger en grundlig undersökning av potentiella mekanismerna bakom synbara förändringar i cellmigration.
Introduction
Placenta utveckling är ett avgörande steg i etableringen av graviditet, påverkar både moderns och fostrets hälsa. Den mekanistiska grunden genom vilket detta sker är dock inte helt klarlagt. Cellmigration är en viktig biologisk process som bidrar till upprättande och funktioner av moderkakan under graviditet. Efter blastocysten implantation, trophectoderm gör åtskillnad mellan in i villösa trofoblaster, som täcka ytan av de chorionic tarmludd och är involverade i gas och näringsämnen exchange, och extravillous trofoblaster (vilket), som vandrar ut från villina och invadera maternell decidua och kärlsystemet1. Migrering av vilket är viktigt för remodeling maternell spiral artärer och upprätta uteroplacentalt omsättning för att stödja fostrets tillväxt2. Otillräcklig trofoblaster invasionen under graviditeten resulterar i onormal placenta utveckling och kan bidra till graviditetskomplikationer som havandeskapsförgiftning, graviditetsdiabetes hypertoni, intrauterin tillväxt begränsning och prematur förlossning3, 4. Det är därför nödvändigt att fastställa de vägar som krävs för normal placentation förstå de faktorer som påverkar trofoblaster motilitet.
Trofoblaster migration styrs av ett komplext nätverk av signalmolekyler, inklusive angiogena faktorer5, hormoner, tillväxtfaktorer och cytokiner. På grund av begränsningarna av att studera moderkakan i vivo, förevigade in vitro-analyser utnyttja mänskliga trofoblaster cell linjer har varit avgörande att identifiera faktorer som bidrar till trofoblaster motilitet. Skrapa och invasion analyser har använts i stor utsträckning att kvantitativt bedöma rollen av enskilda molekyler på trofoblaster cell migration6,7,8. Men medan användbar tillsammans för att undersöka hur förändringar i migration kan orsakas av förändringar i cell invasivitet, dessa två analyser inte hänsyn till ytterligare mekanismer som kan bidra till förändrad priser av cellmigration. Minskningar av andelen cellproliferation kan exempelvis resultera i färre celler tillgängliga för migrering.
Här beskriver vi kvantitativa in vitro-metoder för att bedöma trofoblaster migrering med scratch, cellproliferation och cell invasion analyser. Ett enhetligt sår skapas i en cell enskiktslager i scratch-analysen, och migration av celler för att fylla gapet mäts genom automatiserad, time-lapse avbildning av såret storlek och täthet av celler i såret. Cell spridning analysen baseras på beräkning av förhållandet mellan celler vid varje tidpunkt jämfört med en känd start mängd celler. Celler är seedade ovanpå en extracellulär matrix-belagd cell kultur infoga kammare (e.g. Transwell) i cell invasion analysen, och antalet celler som invaderar genom den extracellular matrisen svar på kemo-lockmedel räknas.
Scratch analysen är ett enkelt och effektivt verktyg som kan användas för att avgöra hur olika miljöförhållanden påverka cellmigration. Spridning och invasion analyserna kan därefter användas för att bestämma cellproliferation och invasivitet till övergripande förändringar i cellmigration bidrag. Tillsammans, ger dessa analyser robust mätningar av biologiska processer som kan bidra till cell motilitet. Två förevigade första trimestern trofoblaster cellinjer användes i beskrivs analyser, Swan.71 (Sw.71) och HTR-8/SVneo9,10. Dessa analyser kan dock också vara optimerad för användning i andra celltyper att identifiera viktiga modulatorer av cellmigration och invasion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cell förberedelse
- Upprätthålla celler i T-75 kolvar i standard tillväxt medier vid 37 ° C, 5% CO2och 95% luftfuktighet.
Obs: Cellerna som används i dessa experiment var den förevigade första trimestern trofoblaster cell fodrar Swan.71 (Sw.71) och HTR-8/SVneo9,10. Sw.71 cellerna bibehölls DMEM/F-12 kompletteras med 10% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum (FBS), 1,0 mM natrium Pyruvat, 10 mM HEPES, 0,10 mM MEM icke-essentiella aminosyror, 100 enheter/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin. HTR-8/SVneo cellerna bibehölls i RPMI-1640 kompletteras med 5% Värmeinaktiverade FBS. - Tillåta att cellerna replikera tills de når 90-100% sammanflödet. Med hjälp av en steril vävnad-kultur flöde huva, aspirera media från kolven och tvätta cellerna med 10 mL steril 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Aspirera PBS och tillsätt 5 mL av 1 x (0,05%) trypsin-EDTA till kolven, att se till att celler omfattas av trypsin. Placera kolven i laboratoriet inkubatorn hålls vid 37 ° C, 5% CO2och 95% luftfuktighet tills alla celler har lösgjort från botten av kolven (cirka 5-10 min).
- Tillsätt 10 mL av pre värmde tillväxtmassmedia till kolven att avaktivera den trypsin-EDTA.
2. skrapa Assay
- Följande steg 1.4, utsäde lämpligt antal celler till en 24-bra platta att uppnå 100% sammanflödet i 48 h.
Obs: Det är möjligt att utföra scratch analysen med en mängd olika plattan layouter. Det maximala antalet brunnar tillåts av verktyget såret maker är en 96-väl format. - Nästa dag (dag före scratch assay), ändra media till fenolrött gratis media kompletteras som krävs, inklusive Värmeinaktiverade, träkol dextran-skrapat FBS.
Obs: Andra studier har rekommenderat användning av media med låg koncentration FBS (t.ex. 1%) att minimera cellproliferation, som kan användas som ett alternativ i detta protokoll11. - Dagen scratch analysens, förbehandla celler för 30 min genom att lägga till önskad behandling till medierna i varje brunn. Konturerad experimenten utnyttjade fordon (1 x PBS) och 100 nM dexametason utspätt i 1 x PBS.
-
För att skapa enhetliga sår, placera sterila 10 µL pipettspetsar på stiften av såret maker verktyget. Sänka tips i den första raden av brunnar och flytta plattan längs spåret av såret tills pipettspetsarna når den andra sidan av brunnen.
- Flytta plattan tillbaka till utgångsläget, så att pipettspetsarna kontinuerligt röra botten av plattan att säkerställa ett konstant sår över diametern på borrhålet. Ta bort och ersätta de sterila pipettspetsarna för 10 µL och sänk tips på nästa rad av brunnar.
- Upprepa steg 2,4 tills alla brunnar är repig.
Obs: Om ett sår maker verktyget inte är tillgängligt, kan sår skapas genom att manuellt skrapa mitten av brunnarna med en 10 µL pipettspetsen. - Aspirera försiktigt media och försiktigt tvätta cellerna två gånger med 1 x PBS. Efter en sista tvätt, Lägg kompletterade fenol-röd gratis, stripad eller låg-FBS media med önskad behandling eller fordon (enligt anvisningarna i steg 2.3).
Obs: HTR-8/SVneo celler ska tvättas med kompletterade fenolrött media, eftersom tvättning med 1 x PBS kommer att orsaka celler lossna. - Placera 24-väl plattan som innehåller repad brunnar i den automatiserade, time-lapse imager (se Tabell för material) inrymt i ett laboratorium inkubator hålls vid 37 ° C, 5% CO2och 95% luftfuktighet. Bild brunnar med jämna mellanrum som behövs för att tillåta celler att slutföra sårläkning (t.ex. varje 2 h för 72 h).
- Beräkna såret densitet och bredd av den programvara som är associerad med automatiserad, time-lapse kameran (se Tabell för material). För att beräkna den procentuella förändringen i såret storlek i förhållande till start såret, ställa in såret bredden vid tidpunkt 0 motsvarar 100%. Dela upp storleken på såret i varje efterföljande tidpunkt av såret storleken vid tidpunkt 0 och multiplicera med 100 för att hämta procentandelen (figur 1).
3. invasion Assay
- Följande steg 1.4, utsäde lämpligt antal celler i 6-väl plattor att tillåta celler att nå 90% sammanflödet i 48 h. underhåll celler i ett laboratorium inkubator inställd på 37 ° C, 5% CO2och 95% luftfuktighet.
- Nästa dag, ändra media till fenolrött gratis media kompletteras som krävs, inklusive Värmeinaktiverade, träkol dextran-skrapat FBS.
Obs: Celler kan vara förbehandlade vid denna tid beroende på experimentell design. - Vid denna tid, placera injektionsflaskan med extracellulärmatrix 10 mg/mL (se Tabell för material) på isen, och låt den Tina i kylskåp över natten.
- Nästa dag, före cool invasion assay leveranser genom att placera 24 brunnar, cellkultur infogar, mikrocentrifugrör och pipettspetsar i kylskåp (4 ° C) för minst 2 h före arbetar med den extracellular matrisen.
- Använda kylda varor i vävnadsodling huven, späd 10 mg/mL extracellulärmatrix 1:1 med fenol-röd-fri, serum-fri media till en slutkoncentration på 5 mg/mL.
Obs: Alltid hålla lager och utspädda extracellulärmatrix på is. Förhållandet av extracellulär matrix till media kan justeras baserat på egenskaperna hos den cellinje som används i analysen. - Med kylda varor i vävnadsodling huven, tillsätt 100 μL av utspädda extracellulär matrix till skären (se Tabell för material) som har placerats i den 24-väl plattan. Kontrollera att matrisen är nivå utan att eventuella bubblor. Placera 24-väl plattan som innehåller matrix-belagda skär i inkubatorn vid 37 ° C så att matrisen att härda.
- För att prep celler för invasionen assay, tvätta cellerna med 1 mL 1 x PBS, aspirera PBS och tillsätt 500 µL 1 x trypsin-EDTA i varje brunn. Placera 6-väl plattan i laboratoriet inkubatorn hålls vid 37 ° C, 5% CO2och 95% luftfuktighet tills alla celler har lösgjort från botten av plattan.
- När cellerna har lossnat, tillsätt 500 µL av fenol-röd-fri, serum-fri media till varje brunn av trypsinized celler.
- Över 1000 µL av fristående celler i mikrocentrifug rör och spinn ner för 5 min vid 400 x g vid 4 ° C.
- Aspirera media och resuspendera cellerna i fenol-röd-fri, serum-fri media (volym beror på koncentrationen av celler). Räkna celler med en automatisk cell counter (se Tabell av material) och justera volymen av cellsuspensionen för en slutlig koncentration på 5 x 105 celler per mL.
Obs: En hemocytometer och mikroskopet kan också användas för att räkna celler. - Lägga till 600 μL av komplett tillväxtmassmedia till brunnarna Skyltens 24 brunnar som ska användas för invasionen analysen.
Obs: Ytterligare chemoattractants eller behandlingar kan läggas till komplett odlingsmedium i brunnen (nedre kammaren). Konturerad experimenten till fordonet (1 x PBS) eller 100 nM dexametason utspätt i 1 x PBS till nedre kammaren. - Plats den pre belagda in varje brunn innehållande komplett odlingsmedium som kommer att användas för invasionen analysen. Lägg sedan till 200 μL av celler ovanpå varje pre belagda cell infoga (övre kammaren) för sammanlagt 1 x 105 celler.
Obs: Som en negativ kontroll för denna analys, kan en lika stor volym av fenol-röd-fri, serum-fri media (utan celler) läggas till den övre kammaren. - Placera plattan 24 brunnar i laboratoriet inkubatorn hålls vid 37 ° C, 5% CO2och 95% luftfuktighet för 24 h.
Obs: 24 h inkubationstiden var optimerad för förevigade första trimestern trofoblaster cellerna och ytterligare tester kan krävas för att fastställa nödvändiga inkubationstiden i andra cellinjer. - Efter natten inkubation, sug återstående media från övre och nedre kammaren utan att störa den extracellular matrisen. Sedan, ta försiktigt bort den extracellulära matrix och icke-invaderade celler från den övre delen av insatsen med en bomullspinne, badda så många gånger som behövs för att ta bort extracellulärmatrix.
- Tvätta varje infoga 3 x med 1 x PBS, lägga till PBS i både övre och nedre kamrarna i brunnen. Aspirera PBS efter varje tvätt.
- Fixa celler som bifogas skär genom att placera skär i 100% iskall metanol under 30 minuter vid 4 ° C. Tvätta infogar 3 x med 1 x PBS och ta bort PBS efter finalen tvätta. Färga celler bifogas skären i 10 min med 0,2% kristallviolett i 20% etanol.
- Skölj 3 x med avjoniserat vatten och aspirera avjoniserat vatten efter den sista tvättningen.
- Lufttorka skär för 1 h i rumstemperatur. Med hjälp av pincetten och ett rakblad, försiktigt skära botten membranet i skäret och montera på en glasskiva med undersidan uppåt. Möjliggöra montering media torka i rumstemperatur.
- Erhålla minst 4 unika bilder av invaderade celler per prov med ett ljusmikroskop med ett 20 x mål. Räkna det totala antalet celler i varje bild och normalisera antalet celler att kontrollprover och rita data (figur 2).
4. proliferation Assay
- Följande steg 1.4, räkna trypsinized celler från kolven med en automatisk cell räknare och utsäde i 6-väl plattor på en densitet på 2 x 105 celler per brunn i standard tillväxt medier.
- Placera celler i ett laboratorium inkubator hålls vid 37 ° C, 5% CO2och 95% luftfuktighet i 4 h eller tills cellerna har följt.
- Ändra media till fenol-röd gratis media kompletteras som krävs, inklusive Värmeinaktiverade, träkol dextran-skrapat FBS och lägga till önskad behandling. Konturerad experimenten till fordonet (1 x PBS) eller 100 nM dexametason utspätt i 1 x PBS. Placera 6-väl plattorna i ett laboratorium inkubator hålls vid 37 ° C, 5% CO2och 95% luftfuktighet.
- Ta bort media och ersätta med nya medier och behandling varje 48 h.
- Efter 24, 48 eller 72 h behandling, tvätta cellerna med 1 mL 1 x PBS och tillsätt 500 µL av trypsin-EDTA till varje brunn. Placera plattan 6-brunnar i inkubatorn tills celler har lösgjort från plattan.
- När cellerna har lossnat från plattan, tillsätt 500 µL av kompletterade fenolrött fria medier att avaktivera trypsin.
- Tillsätt 5 µL av trypsinized celler till 5 µL av Trypan blå i ett separat rör och blanda genom pipettering.
- Räkna celler från varje brunn i två exemplar med en automatisk cell räknare.
- Genomsnittliga antalet celler per brunn vid varje tidpunkt och tomt som en funktion av tiden (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De förevigade mänskliga första trimestern trofoblaster cellinjer Sw.71 och HTR-8/SVneo användes i dessa experiment för att bestämma rollen av glukokortikoider i trofoblaster cell migration12. Glukokortikoider användes i dessa experiment som de har nyligen visat att förändra trofoblaster funktion, även om alternativa behandlingar kan vara begagnade12. Både cellinjer behandlades med fordon (1 x PBS) eller 100 nM den syntetisk glukokortikoid dexametason (Dex) för alla experiment. Sår täthet och storlek mättes varje 2 h för 72 h använder ett automatiserat, time-lapse imaging system. Figur 1 visar ett exempel på bilder och resultat från scratch analysen vid olika tidpunkter. Exempelbilder från 0, 8 och 18 h tidpunkter för båda behandlingarna har lämnats (figur 1A). Såret täthet och såret storlek är ett diagram över tid för prover behandlade med kontroll av fordon (Veh) eller 100 nM Dex (figur 1B). Dex behandling minskade frekvensen sårslutning som bestäms av både såret densitet och såret storlek, vilket indikerar att glukokortikoider hämmar cellmigration i första trimestern trofoblaster celler.
Figur 2 visar ett exempel på bilder tagna av cell kultur skäret efter invasionen analysen. Celler behandlades för 24 h med Veh eller 100 nM Dex. Invaderade cellerna räknades från fyra oberoende replikat per behandling med fyra unika synfält per replikat. Glukokortikoid behandling minskade cell invasivitet, vilket framgår av en 15% minskning av antalet celler som invaderade.
Figur 3 visar ett exempel på den cell proliferation assay. Cellerna räknades vid 24, 48 och 72 h efter behandling med Veh eller 100 nM Dex. Glukokortikoid behandling minskade cellproliferation, indikerat av färre celler vid varje tidpunkt. Dessa analyser visar sammantaget att glukokortikoid exponeringen minskar cell motilitet genom att hämma både cellproliferation och invasion.
Figur 1: Cell Scratch Assay. (A) representativa bilder av sår för Veh - och Dex-behandlade Sw.71 celler på 0, 8 och 18 h visas. Röda linjer visar såret storlek. (B) såret densitet och såret storlek mättes i Sw.71 och HTR-8/SVneo celler behandlas med fordon (Veh) eller 100 nM Dex. Bilderna togs varje 2 h för 72 h genom en automatiserad, time-lapse Mikroskop. Data representerar medelvärdet av fyra oberoende replikat ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: Cell Invasion Assay. Invasionen-analyser utfördes med Sw.71 och HTR-8/SVneo celler som behandlas för 24 h med fordon (Veh) eller 100 nM Dex. (A) representativa bilder från invasionen analysen för Veh - och Dex-behandlade celler efter 24 h inkubation. Infälld bild är negativ kontroll med inga celler som tillsätts den övre kammaren. Bilder tagna på 200 x förstoring. Skala barer är 120 µm. (B) invaderade cellerna räknades och stolpdiagram representerar det normaliserade medelvärdet av fyra oberoende replikat ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: Cell Proliferation Assay. SW.71 och HTR-8/SVneo celler behandlas med fordon (Veh) eller 100 nM Dex räknades varje 24 h med en automatisk cell räknare. Blodkroppar är ett diagram som det medelvärde ± SEM minst 11 oberoende replikerar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta förfarande bygger på användning av migration och invasion analyser att omfatta graden av cellproliferation som potentiella bidragsgivare att uppmätta skillnader i trofoblaster cellers rörelser. Används tillsammans, är dessa in vitro-testmetoder enkla och effektiva metoder som kan användas för att identifiera de cellulära vägar som reglerar trofoblaster migration. Som beskrivits ovan, kan trofoblaster celler behandlas med hormoner, cytokiner, tillväxtfaktorer eller andra molekyler att bestämma deras inverkan på trofoblaster rörelse. Alternativt kan vara uttömda målproteiner från celler att belysa deras funktionella roll i trofoblaster motilitet. Att identifiera viktiga modulatorer av trofoblaster migration kan ge en bättre förståelse av de grundläggande mekanismerna underliggande komplikationer av graviditet relaterade till placenta defekter, inklusive havandeskapsförgiftning, intrauterin tillväxt begränsning och prematur förlossning.
I området i närheten finns det flera kritiska steg i detta protokoll som krävs för att få korrekta resultat. Eftersom fenol-röd har östrogena aktivitet vid koncentrationer som används i cellen kultur media13, är det viktigt att fenolrött fria medier används för experimentell slutpunkter för att förhindra oönskad aktivering av östrogenreceptorn i celler. Under transwell invasion analysen är det viktigt att se till att den extracellular matrisen är homogen, nivå, och att kalla leveranser används för att förhindra för tidig polymerisering av matrisen. När dirigering cell spridning och invasion analyserna, är det viktigt att räkna prover omedelbart för att förhindra re-följsamhet av cellerna till vävnadsodling plattor. Det bör också tas under övervägande att celldöd på grund av experimentell behandling kan påverka resultaten av alla tre analyser. Därför, markörer för celldöd (t.ex. laktatdehydrogenas utgåva, fosfatidylserin externalisering eller DNA nedbrytning) svar på behandling bör utvärderas i den experimentella cellinje före utvärdering av migration, invasion, och spridning14. Vissa begränsningar finns för dessa analyser, till exempel processen att skapa ett sår i en cell enskiktslager inducerar en cell skada svar än kan blanda ihop cellen migreringsprocessen. Dessutom får manuell skrapning införa interexperiment variabilitet, trots att utnyttja ett sår-maker verktyg som skapar enhetliga såret bredder kan delvis mildra denna begränsning. Nackdelen med invasionen analysen är att det är en slutpunkt assay, och kineticsen av rörelsen inte enkelt uppnås. Trots dessa begränsningar, de analyser som beskrivs här ger reproducerbara kvantitativa data på relativt låg kostnad.
De analyser som beskrivs här kan också ändras för att mäta cellmigration i andra celltyper, även om dessa analyser inte skulle vara lämpliga för icke-anhängare celltyper. I scratch-analysen, kan imaging intervallen för time-lapse mikroskopi justeras för att fånga tillräckligt skillnader i graden av cellmigration. Automatiserade system för levande cell imaging kan fånga såret storlek bilder som vanligt eftersom varje 15 min. bilder tagna minst var 30 min kan vara ihopsydda för att skapa en film av sårläkning. Det totala antalet celler seedade i invasion analysen, koncentrationen av extracellulärmatrix, och längden på inkubering före fastställande och räknar celler kan justeras till konto för den specifika graden av invasionen i olika celltyper. I den cell proliferation assay, kan antalet celler seedade på plattorna och tidpunkter för cell inventering justeras till konto för olika skattesatser för celltillväxt. Sammantaget är dessa analyser flexibla och mycket tillgängliga verktyg som kan användas i en rad olika celltyper för att identifiera mekanismerna bakom cellmigration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Gil Mor för att tillhandahålla de Sw.71 cellerna. Denna forskning stöddes av en Albert McKern Scholar Award till S.V.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
| Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
| DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
| IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
| Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
| Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |
References
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia. Placenta. 21, S25-S30 (2000).
- Norwitz, E. R. Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications. Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).
- Ness, R. B., Sibai, B. M. Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).
- Knöfler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).
- Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Knöfler, M. TNFα-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells. Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).
- Nadeem, L., et al. Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).
- Onogi, A., et al. Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy. Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).
- Straszewski-Chavez, S. L., et al. The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71. Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).
- Graham, C. H., et al. Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan. Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71. American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 12, Unit 12 18 (2004).
