Summary
Aqui, apresentamos um protocolo altamente acessível para avaliar o movimento de célula em células do trofoblasto humana usando três ensaios in vitro: ensaio de zero, o ensaio de invasão transwell e o ensaio de proliferação celular.
Abstract
Movimento de célula é uma propriedade crítica de trophoblasts durante o desenvolvimento da placenta e gravidez precoce. O significado do trofoblasto adequada migração e invasão é demonstrado por distúrbios da gravidez, tais como restrição de crescimento intra-uterino e de pré-eclâmpsia, que são associados com a invasão do trofoblasto inadequada da vasculatura materna. Infelizmente, nossa compreensão dos mecanismos por que a placenta se desenvolve a partir de migração de trophoblasts é limitado. Análise in vitro da migração celular através de ensaio de risco é uma ferramenta útil na identificação de fatores que regulam a capacidade migratória trofoblasto. No entanto, este ensaio sozinho não define as alterações celulares que podem resultar em migração de célula alterada. Este protocolo descreve três diferentes ensaios in vitro são usados coletivamente para avaliar o movimento de células do trofoblasto: o risco do ensaio, o ensaio de invasão e o ensaio de proliferação. Os protocolos descritos aqui também podem ser modificados para uso em outras linhas de célula para quantificar o movimento de célula em resposta a estímulos. Estes métodos permitem que os investigadores identificar fatores individuais que contribuem para o movimento da célula e fornecem uma análise exaustiva dos potenciais mecanismos subjacentes alterações aparentes na migração celular.
Introduction
Desenvolvimento da placenta é um passo crucial no estabelecimento da gravidez, impactando a saúde materna e fetal. No entanto, a base mecanicista, pelo qual este processo ocorre não é totalmente compreendida. Migração celular é um importante processo biológico que contribui para a criação e funções da placenta durante a gravidez. Após a implantação do blastocisto, a trofectoderma diferencia em trophoblasts das vilosidades, que cobrem a superfície das vilosidades coriônica e estão envolvidos em gás e troca de nutrientes, e extravillous trophoblasts (eventos), que migram para fora das vilosidades e invadem a decídua e a vasculatura materna1. Migração dos eventos é essencial para a remodelação artérias espiral materna e o estabelecimento de circulação uteroplacentária para apoiar o crescimento fetal2. Invasão do trofoblasto inadequada durante a gravidez, resulta em um desenvolvimento anormal da placenta e pode contribuir para complicações da gravidez como pré-eclâmpsia, hipertensão gestacional, restrição de crescimento intra-uterino e parto prematuro3, 4. Portanto, compreender os fatores que afetam a motilidade do trofoblasto é essencial para determinar os caminhos necessários para placentação normal.
Migração do trofoblasto é controlada por uma complexa rede de sinalização moléculas, incluindo fatores de crescimento, citocinas, hormônios e fatores de angiogênico5. Devido às limitações do estudo in vivo da placenta, ensaios in vitro utilizando imortalizadas células do trofoblasto humano linhas foram cruciais para a identificação dos factores que contribuem para a mobilidade do trofoblasto. Zero e invasão de ensaios têm sido amplamente utilizados para avaliar quantitativamente o papel das moléculas individuais no trofoblasto celular migração6,7,8. No entanto, embora útil em tandem para investigar como mudanças na migração podem ser causadas por alterações na capacidade de invasão celular, estes dois ensaios não representam mecanismos adicionais que podem contribuir para as taxas alteradas de migração celular. Por exemplo, reduções para a taxa de proliferação celular podem resultar em menos células disponíveis para migrar.
Aqui, descrevemos quantitativos métodos in vitro para avaliar a migração do trofoblasto usando zero, proliferação celular e ensaios de invasão celular. No ensaio de zero, uma ferida uniforme é criada em uma monocamada de células, e a migração de células para preencher a lacuna é medida pela imagem automatizada, lapso de tempo do tamanho da ferida e densidade de células dentro da ferida. O ensaio de proliferação celular é baseado no cálculo do rácio de células em cada ponto de tempo em comparação com uma quantidade conhecida de partida de células. No ensaio de invasão celular, células são semeadas no topo de uma câmara de inserção de cultura celular revestido de matriz extracelular (por exemplo, Transwell), e o número de células que invadem através da matriz extracelular em resposta a quimioterapia-attractant é contado.
O risco é uma ferramenta simples e eficaz que pode ser usada para determinar como diferentes condições ambientais afetam a migração celular. Os ensaios de proliferação e invasão posteriormente podem ser usados para determinar a contribuição da proliferação celular e invasividade para mudanças globais na migração celular. Coletivamente, estes ensaios fornecem medidas robustas de processos biológicos que podem contribuir para a motilidade celular. Duas linhas de célula imortalizado primeiro trimestre trofoblasto foram utilizadas nos ensaios descritos, Swan.71 (Sw.71) e HTR-8/SVneo9,10. No entanto, estes ensaios também podem ser otimizados para uso em outros tipos de células para identificar a chaves moduladores de migração celular e invasão.
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Protocol
1. preparação da pilha
- Manter as células em frascos de T-75 em meios de crescimento padrão em 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade.
Nota: As células utilizadas nesses experimentos foram o imortalizado linhas de células do trofoblasto primeiro trimestre Swan.71 (Sw.71) e HTR-8/SVneo9,10. As células de Sw.71 foram mantidas em DMEM/F-12, suplementado com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS), piruvato de sódio 1,0 mM, 10 mM HEPES, 0,10 mM MEM não aminoácidos essenciais, 100 unidades/mL penicilina e 100 estreptomicina µ g/mL. As HTR-8/SVneo células foram mantidas em RPMI-1640 suplementado com 5% inactivadas pelo calor FBS. - Permitir que as células replicar até atingirem a confluência de 90-100%. Usando um capuz de fluxo de cultura de tecidos estéreis, Aspire os meios de comunicação de pilhas do balão e lavagem com 10 mL de estéril 1x tampão fosfato salino (PBS).
- Aspire a PBS e adicionar 5 mL de 1x (0.05%) tripsina-EDTA para o balão, certificando-se que as células estão cobertas por tripsina. Coloque o frasco na incubadora laboratório mantida a 37 ° C, umidade de 95% e 5% CO2até que todas as células têm destacado do fundo do frasco (aproximadamente 5-10 min).
- Adicione 10 mL de mídia de crescimento previamente aquecido no balão para desativar o tripsina-EDTA.
2. Raspe ensaio
- A seguir passo 1.4, semente o número adequado de células em uma placa de 24 para alcançar a confluência de 100% em 48 h.
Nota: É possível realizar o ensaio de risco com uma variedade de layouts de placa diferente. O número máximo de permitido pela ferramenta criador de ferida de poços é um formato de 96 poços. - No dia seguinte (dia antes do ensaio zero), mudar de mídia para mídia livre-vermelho de fenol complementada, se necessário, incluindo inactivados por calor, carvão FBS dextran-despojado.
Nota: Outros estudos têm recomendado o uso de mídia com baixa concentração FBS (por exemplo, 1%) para minimizar a proliferação celular, que pode ser usada como uma alternativa no presente protocolo11. - No dia do ensaio do zero, pré-tratamento células por 30 min, adicionando o tratamento desejado para a mídia em cada poço. As experiências descritas utilizaram veículo (1X PBS) e 100 nM dexametasona, que diluído em 1X PBS.
-
Para criar feridas uniformes, coloque estéril 10 pontas de pipetas µ l nos pinos da ferramenta do fabricante a ferida. Abaixar as dicas para a primeira linha de poços e mova a placa ao longo da trilha do maker ferida até que as pontas de pipeta chegar ao outro lado do poço.
- Mova a placa de volta para a posição inicial, permitindo que as pontas de pipeta continuamente tocar o fundo do prato para garantir uma constante ferida através do diâmetro do poço. Remover e substituir as pontas de pipeta estéril 10 µ l e abaixar as pontas para a próxima linha de poços.
- Repita a etapa 2.4 até que todos os poços estão arranhados.
Nota: Se não houver uma ferramenta de fabricante de ferida, feridas podem ser criadas manualmente raspando o centro dos poços com uma ponta de pipeta de 10 µ l. - Aspire cuidadosamente com mídia e lave suavemente células duas vezes com 1X PBS. Após uma lavagem final, adicione complementado-vermelho de fenol livre, despojado ou baixa-FBS mídia com tratamento desejado ou veículo (conforme indicado no passo 2.3).
Nota: HTR-8/SVneo células devem ser lavadas com mídia de vermelho de fenol completadas, como lavar com 1X PBS fará com que as células desanexar. - Coloque a placa de 24 poços riscados contendo no tonalizador automatizado, lapso de tempo (veja a Tabela de materiais) alojados numa incubadora laboratório mantida a 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade. Poços de imagem a intervalos regulares, conforme necessário para permitir que as células completar a cicatrização de feridas (por exemplo, cada 2h para 72 h).
- Calcular a densidade de ferida e largura pelo software associado com o tonalizador automatizado, lapso de tempo (veja a Tabela de materiais). Para calcular o tamanho da ferida em relação ao tamanho do ferimento inicial de variação percentual, defina a largura de ferida ao tempo 0 igual a 100%. Divida o tamanho da ferida em cada commit subsequente pelo tamanho do ferimento no tempo 0 e multiplicar por 100 para obter o percentual (Figura 1).
3. invasão ensaio
- Etapa seguinte 1.4, semente o número adequado de células em placas de 6 boas para permitir que as células alcançar a confluência de 90% em 48 h. manter as células em uma incubadora de laboratório conjunto para 37 ° C, umidade de 95% e 5% CO2.
- No dia seguinte, mude de mídia para mídia livre-vermelho de fenol complementada, se necessário, incluindo inactivados por calor, carvão FBS dextran-despojado.
Nota: As células podem ser pré-tratados neste momento dependendo do delineamento experimental. - Neste momento, coloque o frasco da matriz extracelular de 10 mg/mL (ver Tabela de materiais) em gelo e deixe-a descongelar no frigorífico durante a noite.
- No dia seguinte, ensaio pre-cool invasão fontes colocando placas de 24 poços, cultura de célula insere, microcentrifuga tubos e pontas de pipetas no frigorífico (4 ° C) pelo menos 2 h antes de trabalhar com a matriz extracelular.
- Uso de fontes de refrigerados do capuz de cultura de tecidos, matriz extracelular de 10 mg/mL diluído 1:1 com mídia fenol-vermelho-livre, livre de soro a uma concentração final de 5 mg/mL.
Nota: Sempre manter o estoque e a matriz extracelular diluída no gelo. A relação da matriz extracelular, a mídia pode ser ajustada com base nas propriedades da linha celular utilizada no ensaio. - Uso de fontes de refrigerados do capuz de cultura de tecidos, adicione 100 μL de matriz extracelular diluída para as inserções (ver Tabela de materiais) que tenham sido colocadas na placa de 24. Certifique-se que a matriz é nível sem quaisquer bolhas. Coloque a placa de 24 poços contendo inserções matriz revestidos em incubação a 37 ° C, para permitir que a matriz a endurecer.
- Para preparar células para o ensaio da invasão, lavam-se células com 1 mL de 1X PBS, Aspire a PBS e adicione 500 µ l de tripsina-EDTA de 1x a cada poço. Coloque a placa de 6 na incubadora laboratório mantida a 37 ° C, umidade de 95% e 5% CO2até que todas as células têm destacado da parte inferior da placa.
- Uma vez que as células têm destacado, adicione 500 µ l de mídia fenol-vermelho-livre, livre de soro a cada poço das células trypsinized.
- Transferência de 1.000 µ l de células desanexadas microcentrifuga tubo e spin-down por 5 min a 400 x g a 4 ° C.
- Aspirar a mídia e ressuspender as células em mídia fenol-vermelho-livre, sem soro (volume dependerá concentração de células). Contagem de células usando uma célula automatizada counter (consulte Tabela de materiais) e ajustar o volume da suspensão de células para uma concentração final de 5 x 105 células por mL.
Nota: Um hemocytometer e microscópio também podem ser usados para contar as células. - Adicione 600 μL de mídia completo crescimento aos poços da placa de 24 poços que será usado para o ensaio de invasão.
Nota: Quimioatraentes adicionais ou tratamentos podem ser adicionados ao meio de crescimento completo no poço (câmara baixa). As experiências descritas adicionado veículo (1X PBS) ou 100 dexametasona nM, diluído em 1X PBS para a câmara baixa. - Lugar do pré-revestida inserir em cada poço contendo meio de cultura completo que será usado para o ensaio de invasão. Em seguida, adicione 200 μL de células no topo de cada inserção de célula pré-revestidos (câmara superior) para um total de 1 x 105 células.
Nota: Como um controle negativo para este ensaio, um volume igual de mídia fenol-vermelho-livre, livre de soro (sem pilhas) pode ser adicionado para a câmara superior. - Coloque a placa de 24 na incubadora laboratório mantida a 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade por 24 h.
Nota: O período de incubação de 24 h foi otimizado para as células do trofoblasto imortalizado do primeiro trimestre e ainda mais testes podem ser necessária para determinar o período de incubação necessário em outras linhas de célula. - Após incubação durante a noite, sucção os restantes meios de comunicação da câmara superior e inferior sem perturbar a matriz extracelular. Em seguida, Retire cuidadosamente a matriz extracelular e células não-invadida de parte superior da inserção com um cotonete de algodão, esfregar-se tantas vezes quanto necessário para remover a matriz extracelular.
- Lavagem de cada inserir 3x com PBS 1x, adicionando PBS para ambas as câmaras superiores e inferiores do poço. Aspire PBS depois de cada lavagem.
- Consertar as células anexadas para as inserções, colocando inserções em 100% de metanol gelada por 30 min a 4 ° C. Lavagem insere 3x com 1X PBS e PBS remover depois de lavar o final. Manche as células anexadas para as inserções por 10 min com violeta de cristal de 0,2% em etanol a 20%.
- Lavar 3x com água desionizada e aspirar água desionizada após a lavagem final.
- Secar ao ar inserções por 1h à temperatura ambiente. Usando fórceps e uma lâmina de barbear, cuidadosamente, corte a membrana da parte inferior da inserção e montar sobre uma lâmina de vidro com o lado inferior voltada para cima. Permitir que a mídia de montagem secar à temperatura ambiente.
- Obter pelo menos 4 imagens únicas de células invadidas por amostra, usando um microscópio de luz com um objectivo de 20 x. Conte o número total de células em cada imagem e normalizar o número de células para amostras de controlo e plotar dados (Figura 2).
4. proliferação ensaio
- Passo seguinte 1.4, contar as células trypsinized do recipiente usando um contador de célula automatizada e sementes em placas de 6-poços em uma densidade de 2 x 105 células por poço em mídia padrão de crescimento.
- Colocar as células em uma incubadora de laboratório mantida a 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade por 4 h ou até células aderiram.
- Mídia de mudança para o vermelho de fenol mídia completada, se necessário, incluindo inactivados por calor, carvão dextran-despojado FBS livre e adiciona tratamento desejado. As experiências descritas adicionado veículo (1X PBS) ou 100 dexametasona nM, diluído em 1X PBS. Coloca as placas 6-poços em uma incubadora de laboratório mantida a 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade.
- Remova a mídia e substitua com tratamento e novas mídias cada 48 h.
- Após 24, 48 ou 72 h tratamento, as células com 1 mL de 1X PBS de lavagem e adicionar 500 µ l de tripsina-EDTA para cada poço. Coloque placa de 6 na incubadora até células tem separada da placa.
- Uma vez que as células têm retirado a placa, adicione 500 µ l da mídia livre de vermelho de fenol complementada para desactivar a tripsina.
- Adicionar 5 µ l de células trypsinized a 5 µ l de Trypan azul em um tubo separado e misture por pipetagem.
- Contar as células de cada poço em duplicado usando um contador automatizado de células.
- Média do número de células por poço em cada ponto do tempo e a trama em função do tempo (Figura 3).
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Representative Results
As linhas de célula humana imortalizado primeiro trimestre trofoblasto Sw.71 e HTR-8/SVneo foram utilizadas nesses experimentos para determinar o papel de glicocorticoides no trofoblasto celular migração12. Os glicocorticoides foram utilizados nesses experimentos como eles recentemente foram mostrados para alterar funções de trofoblasto, embora tratamentos alternativos podem ser usados12. Ambas as linhas de célula foram tratadas com veículo (1X PBS) ou 100 nM da dexametasona glicocorticoide sintético (Dex) para todos os experimentos. Tamanho e densidade ferida foram medidos a cada 2 h para 72 h, usando um sistema de imagens automatizado, lapso de tempo. A Figura 1 mostra um exemplo de imagens e resultados obtidos com o ensaio zero em momentos diferentes. Imagens de amostra de 0, 8 e 18 h momentos para ambos os tratamentos foram fornecidas (figura 1A). A ferida de densidade e tamanho da ferida são graficamente ao longo do tempo para as amostras tratadas com o controle do veículo (Veh) ou 100 nM Dex (figura 1B). Tratamento de Dex reduziu a taxa de fechamento de ferida, conforme determinado pela ferida densidade e tamanho da ferida, indicando que os glicocorticoides inibem a migração celular em células do trofoblasto do primeiro trimestre.
A Figura 2 mostra um exemplo de imagens tiradas da inserção da cultura de célula após o ensaio de invasão. As células foram tratadas por 24 h com Veh ou 100 nM Dex. As células invadidas foram contadas de quatro repetições independentes por tratamento usando quatro campos de vista único por replicar. Tratamento glicocorticoide reduzida capacidade de invasão celular, como mostrado por uma redução de 15% no número de células invadidas.
A Figura 3 mostra um exemplo do ensaio de proliferação celular. As células foram contadas em 24, 48 e 72 h após o tratamento com Veh ou 100 nM Dex. Tratamento de glicocorticoide reduziu a proliferação celular, conforme indicado pelo menos células em cada ponto de tempo. Em geral, estes ensaios demonstram que a exposição de glicocorticoide reduz motilidade celular inibindo tanto a proliferação celular e a invasão.
Figura 1: célula de ensaio zero. (A) imagens representativas das feridas para Veh e Dex-tratados Sw.71 células em 0, 8 e 18 h são mostradas. Linhas vermelhas indicam o tamanho da ferida. (B) ferida tamanho densidade e ferida foram medidos nas células Sw.71 e HTR-8/SVneo tratadas com veículo (Veh) ou 100 nM Dex. Fotos foram tiradas a cada 2h para 72 h, usando um microscópio automatizado, lapso de tempo. Dados representam a média de quatro repetições independentes ± SEM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: ensaio de invasão de células. Invasão de ensaios foram realizados com células Sw.71 e HTR-8/SVneo tratadas por 24 h com veículo (Veh) ou 100 nM Dex. (A) imagens representativas do ensaio de invasão para Veh e Dex-tratados com células após incubação de 24h. Inserir imagem é controlo negativo com nenhuma célula adicionado para a câmara superior. Imagens tiradas na ampliação de x 200. Barras de escala são 120 µm. (B) invadiram as células foram contadas e os gráficos de barras representam a média normalizada de quatro repetições independentes ± SEM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: ensaio de proliferação de células. Células SW.71 e HTR-8/SVneo tratadocom com veículo (Veh) ou 100 nM Dex foram contados todos os 24 h, usando um contador automatizado de células. Contagem de células é graficamente como a média ± SEM pelo menos 11 independente Replica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este procedimento baseia-se na utilização de migração e invasão ensaios para incluir a taxa de proliferação celular, como um contribuinte potencial medidos diferenças no movimento de células do trofoblasto. Usados em conjunto, estes ensaios in vitro são métodos simples e eficazes que podem ser usados para identificar os caminhos celulares que regulam a migração do trofoblasto. Conforme descrito acima, as células do trofoblasto podem ser tratadas com hormonas, citocinas, fatores de crescimento ou outras moléculas para determinar seu impacto sobre o movimento do trofoblasto. Alternativamente, as proteínas alvo podem estar esgotadas de células para elucidar seu papel funcional na motilidade do trofoblasto. Identificação chaves moduladores da migração do trofoblasto pode fornecer um melhor entendimento dos mecanismos básicos subjacentes complicações da gravidez relacionadas a defeitos placentários, incluindo pré-eclâmpsia, restrição de crescimento intra-uterino e parto prematuro.
Existem várias etapas críticas neste protocolo que são necessários para obter resultados precisos. Porque o vermelho de fenol tem atividade estrogênica em concentrações usadas em meios de cultura de célula13, é importante que essa mídia livre de vermelho de fenol é usada para pontos de extremidade experimentais para evitar indesejáveis a ativação do receptor de estrogênio nas células. Durante o ensaio de invasão transwell, é importante assegurar que a matriz extracelular é homogênea e plana, e que frio suprimentos são usados para evitar a polimerização prematura da matriz. Quando realizar os ensaios de proliferação e invasão de células, é importante contar amostras imediatamente para evitar a re-adesão das células às placas de cultura de tecidos. Isso também deve ser tomado em consideração que a morte celular devido a um tratamento experimental pode influenciar os resultados de todos os três ensaios. Portanto, marcadores de morte celular (por exemplo, liberação de lactato desidrogenase, fosfatidilserina exteriorização ou degradação de DNA) em resposta ao tratamento devem ser avaliadas na linha de célula experimental antes de avaliar a migração, invasão, e proliferação de14. Existem algumas limitações para estes ensaios, por exemplo, o processo de criação de uma ferida em uma monocamada celular induz uma resposta de lesão celular que pode confundir o processo de migração celular. Além disso, raspagem manual pode apresentar variabilidade interexperiment, embora utilizar uma ferramenta de ferida-fabricante que cria ferida uniforme larguras parcialmente pode atenuar essa limitação. A desvantagem do ensaio invasão é que é um ensaio de ponto de extremidade, e a cinética do movimento não são facilmente atingidos. Apesar dessas limitações, os ensaios descritos aqui fornecem dados quantitativos, pode ser reproduzidos no custo relativamente baixo.
Os ensaios descritos aqui também podem ser modificados para medir a migração de células em outros tipos de células, embora estes ensaios não seria apropriados para tipos de células não-aderentes. No ensaio de zero, os intervalos de imagem de microscopia de lapso de tempo podem ser ajustados para capturar suficientemente diferenças na taxa de migração celular. Sistemas automatizados para a imagem latente de célula viva podem capturar ferida tamanho imagens como frequentemente como cada 15 min. imagens tiradas pelo menos a cada 30 min podem ser costuradas juntos para criar um filme de cicatrização de feridas. No ensaio de invasão, a concentração da matriz extracelular, semeado o número total de células, e o período de incubação antes da fixação e contagem de células pode ser ajustado para conta para a taxa específica de invasão em diferentes tipos de células. No ensaio de proliferação celular, o número de células sem sementes para as placas e os pontos de tempo para a contagem de células pode ser ajustado para conta para diferentes taxas de crescimento celular. Em geral, estes ensaios são ferramentas flexíveis e altamente acessíveis que podem ser usadas em uma ampla gama de tipos de células, para identificar os mecanismos subjacentes a migração celular.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecer Dr. Gil Mor para fornecer as células Sw.71. Esta pesquisa foi apoiada por um Albert McKern Scholar Award para S.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
| Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
| DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
| IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
| Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
| Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |
References
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