Summary
Здесь мы описываем пошаговый протокол хирургического деформирования аорты в хорошо зарекомендовавшей себя мышиной модели сужения аорты. Эта процедура не только позволяет изучить механизмы, лежащие в основе обратного ремоделирования и регрессии гипертрофии левого желудочка, но и протестировать новые терапевтические варианты, которые могут ускорить восстановление миокарда.
Abstract
Чтобы лучше понять обратное ремоделирование левого желудочка (LV), мы описываем модель грызунов, в которой после ремоделирования ЛЖ, вызванного полосаткой аорты, мыши подвергаются ОР при удалении сужения аорты. В этой статье мы описываем пошаговую процедуру для выполнения минимально инвазивной хирургической деформирования аорты у мышей. Эхокардиография впоследствии использовалась для оценки степени гипертрофии и дисфункции сердца при ремоделировании ЛЖ и ОР и для определения наилучших сроков деформирования аорты. В конце протокола была проведена терминальная гемодинамическая оценка сердечной функции, а также собраны образцы для гистологических исследований. Мы показали, что дебандинг связан с хирургической выживаемостью 70-80%. Более того, через две недели после дебандирования значительное снижение желудочковой после нагрузки запускает регрессию желудочковой гипертрофии (~20%) и фиброз (~26%), восстановление диастолической дисфункции, оцениваемой нормализацией наполнения левого желудочка и концевого диастолического давления (E/e' и LVEDP). Деформирование аорты является полезной экспериментальной моделью для изучения РН ЛЖ у грызунов. Степень восстановления миокарда варьируется между субъектами, поэтому имитирует разнообразие ОР, которое происходит в клиническом контексте, например, замена аортального клапана. Мы пришли к выводу, что модель полосирования/де-де-полосатки аорты представляет собой ценный инструмент для разгадывания новых идей о механизмах ОР, а именно регрессии сердечной гипертрофии и восстановлении диастолической дисфункции.
Introduction
Сужение поперечной или восходящей аорты у мыши является широко используемой экспериментальной моделью для гипертрофии сердца, вызванной перегрузкой давления, диастолической и систолической дисфункции и сердечной недостаточности1,2,3,4. Сужение аорты первоначально приводит к компенсированной концентрической гипертрофии левого желудочка (LV) для нормализации напряжениястенки 1. Однако при определенных обстоятельствах, таких как длительная сердечная перегрузка, эта гипертрофия недостаточна для уменьшения напряжения стенки, вызывая диастолическую и систолическую дисфункцию (патологическую гипертрофию)5. Параллельно изменения во внеклеточном матриксе (ECM) приводят к отложению коллагена и сшиванию в процессе, известном как фиброз, который можно подразделить на замещающий фиброз и реактивный фиброз. Фиброз в большинстве случаев необратим и ставит под угрозу восстановление миокарда после перегрузки6,7. Тем не менее, недавние исследования магнитно-резонансной томографии сердца показали, что реактивный фиброз способен регрессировать в долгосрочной перспективе8. В целом, фиброз, гипертрофия и сердечная дисфункция являются частью процесса, известного как ремоделирование миокарда, который быстро прогрессирует в сторону сердечной недостаточности (HF).
Понимание особенностей ремоделирования миокарда стало основной целью для ограничения или обращения вспять его прогрессирования, последнее известно как обратное ремоделирование (RR). Термин RR включает любое изменение миокарда, хронически обращенное вспять данным вмешательством, такую фармакологическую терапию (например, антигипертензивные препараты), хирургию клапанов (например, стеноз аорты) или желудочковые вспомогательные устройства (например, хронический HF). Тем не менее, ОР часто является неполным из-за преобладающей гипертрофии или систолической / диастолической дисфункции. Таким образом, уточнение механизмов, лежащих в основе ОР, и новых терапевтических стратегий по-прежнему отсутствует, что в основном связано с невозможностью доступа и изучения ткани миокарда человека во время ОР у большинства из этих пациентов.
Чтобы преодолеть это ограничение, модели грызунов сыграли значительную роль в продвижении нашего понимания сигнальных путей, участвующих в прогрессировании ВЧ. В частности, де-полосирование аорты мышей с сужением аорты представляет собой полезную модель для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе неблагоприятного ремоделирования ЛЖ 9 иRR 10,11, поскольку оно позволяет сбор образцов миокарда в разные моментывремени в этих двух фазах. Кроме того, он обеспечивает отличную экспериментальную установку для тестирования потенциальных новых целей, которые могут способствовать / ускорять RR. Например, в контексте аортального стеноза эта модель может предоставить информацию о молекулярных механизмах, участвующих в огромном разнообразии реакции миокарда, лежащей в основе (не)полноты RR6,12,а также об оптимальных таймингах для замены клапана, что представляет собой серьезный недостаток современных знаний. Действительно, оптимальное время для этого вмешательства является предметом споров, главным образом потому, что оно определяется на основе величины градиентов аорты. Несколько исследований говорят о том, что этот момент времени может быть слишком поздним для восстановления миокарда, поскольку фиброз и диастолическая дисфункция часто уже присутствуют12.
Насколько нам известно, это единственная животная модель, которая резюмирует процесс как ремоделирования миокарда, так и ОР, происходящий в таких состояниях, как стеноз аорты или гипертония до и после замены клапана или начала антигипертензивных препаратов, соответственно.
Стремясь решить проблемы, кратко изложенные выше, мы описываем хирургическую модель животных, которая может быть реализована как на мышах, так и на крысах, обращаясь к различиям между этими двумя видами. Мы описываем основные шаги и детали, связанные с проведением этих операций. Наконец, мы сообщаем о наиболее значительных изменениях, происходящих в РН непосредственно перед и на протяжении всего РР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных соответствуют Руководству по уходу за лабораторными животными и их использованию (публикация NIH No 85–23, пересмотрено в 2011 году) и португальскому закону о благополучии животных (DL 129/92, DL 197/96; С. 1131/97). Компетентные местные органы власти утвердили этот экспериментальный протокол (018833). Семинедельные самцы мышей C57B1/J6 содержались в соответствующих клетках, с регулярной средой 12/12 ч светло-темного цикла, температурой 22 °C и влажностью 60% с доступом к воде и стандартной диетой ad libitum.
1. Подготовка хирургического поля
- Продезинфицируйте место операции 70% спиртом и поместите одноразовое покрытие операционного стола над областью операции.
- Стерилизуйте все инструменты перед операцией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой процедуры требуются микрохирургические ножницы, 2 тонких изогнутых щипца, 3 тонких прямых щипца, скальпель, небольшие щипцы, угловой ножницы рассекателя, держатель иглы, ультратонкое средство лигирования, 2 гемостата и, наконец, система втягивания магнитного фиксатора(рисунок 1A). - Изогнут кончик притупленной иглы 26 г до 90° для более легкого приближения к аорте. Игла 26 G создаст сужение аорты диаметром 0,45 мм(рисунок 1B).
- Отрегулируйте температуру грелки до 37 ± 0,1 °C.
2. Подготовка и интубация мышей
- Обезболивают молодых мышей C57B1/J6 (20-25 г) путем вдыхания 8% севофлурана с 0,5 - 1,0 л/мин 100%O2 в конусной трубке.
- Проверьте глубину анестезии с помощью рефлекса снятия щипа на ноготь.
- Поместите мышь в спинное лежание на наклонную пластину и приступайте к оротрахеальной интубации.
- Переместите мышь на грелку и быстро подключите оротрахеальную трубку к вентилятору, чтобы инициировать механическую вентиляцию.
- Отрегулируйте параметры вентилятора до частоты 160 вдохов/мин и приливного объема 10 мл/кг.
3. Подготовка к операции (как для бандажирования, так и для операций по дебандингу)
- Побрейте и нанесите крем для депиляции от декольте до середины грудной клетки мышей.
- Нанесите офтальмологический гель на глаза животных, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
- Поместите ректальный зонд и оксиметр на лапу или хвост для мониторинга температуры и оксигенации крови, а также частоты сердечных сокращений соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анестезия вызывает значительное переохлаждение, поэтому важно поддерживать нормальную температуру тела во время операции, чтобы избежать быстрого снижения частоты сердечных сокращений. - Поддерживаю анестезию с севофлураном (2,0 - 3,0%). Проверьте правильный уровень анестезии по отсутствию рефлекса защемления.
- Поместите мышей в право-боковой пролежне на грелку и закрепите конечности к магнитной фиксаторной системе втягивания лентой, чтобы удерживать животное в правильном положении во время операции(Рисунок 2, Рисунок 3А).
- Продезинфицируйте грудную клетку мыши 70% спиртом с последующим раствором провидона-йода.
4. Бандажирование восходящей аорты
ПРИМЕЧАНИЕ: Для подробного описания протокола обратитесь к 2,3,4,13.
- Одноразовым лезвием выполните небольшой (~0,5 см) разрез кожи с левой стороны непосредственно ниже уровня впысь и рассекли кожу.
- Осторожно рассекните и отделите грудную мышцу и другие мышечные слои, пока ребра не станут видимыми. Используйте тонкие щипцы и избегайте разрезания мышц.
- Под микроскопом определите межребра и вскройте небольшой разрез между2-м и3-м межребрюшным пространством тонкими щипцами.
- Втягиваем ребра, размещая грудной втягиватель(рисунок 2А).
- Используйте небольшие щипцы, чтобы аккуратно рассекать и отделить доли тимика до тех пор, пока не станет видна восходящая аорта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хлопковые аппликаторы должны быть удобны в случае кровотечения. Теплый стерильный физиологический раствор следует давать подкожно в случае значительного кровотечения (например, молочной артерии). - Используйте небольшие щипцы, чтобы аккуратно рассекать аорту.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аорта считается рассеченной, когда вокруг нее нет жира или других спаек и можно легко окружить сосуд небольшими кривыми щипцами. - После расслоения аорты поместите полипропиленовую лигатуру 7-0 вокруг аорты, используя средство перевязки и изогнутые щипцы(рисунок 2B).
- Расположите притупленную иглу 26 G параллельно аорте (кончик направлен в сторону головы мышей)(рисунок 2B). Для мышей весом 20-25 г эта игла вызывает воспроизводимое сужение аорты на 65-70%.
- Сделайте 2 свободных узла вокруг аорты и иглу 26 G с помощью 2 щипцов(рисунок 2B).
- Затяните1-й узел и, быстро после этого,2-й узел. Кратко подтвердите правильное позиционирование сужения и быстро извлеките иглу для восстановления аортального кровотока. Наконец, сделайте3-й узел (группа БА).
- Переместите тимус и мышцы в исходное положение.
- Выполните фиктивную процедуру, идентичную процедуре сужения, но сохраняя шов свободным вокруг аорты (группа SHAM).
- Обрежьте концы шва и удалите грудной втягиватель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Короткие концы шва могут увеличить вероятность ослабления узлов при аортальном давлении, в то время как длинные концы делают процедуру расвязки более рисковитой, поскольку между швом и левым предсердием могут возникать спайки. - Закройте грудную стенку с помощью полипропиленовой шва 6-0 простым прерываемым или непрерывным швом, используя наименьшее количество швов. Затяните последний грудной узел с легкими, раздутыми в конце вдувания, защемляя отток вентилятора на 2 с, чтобы повторно надуть легкие.
- Закройте кожу шовным швом из шелка/полипропилена 6-0 непрерывным швом.
ПРИМЕЧАНИЯ: Если используется более поздний вентилятор, его можно запрограммировать на паузу в вдохновении (Setup-Advanced-Pause-Inspiration)
5. Послеоперационный уход
- Нанесите провидон-йодный раствор на участок шва кожи.
- Для правильного обезболивания вводят бупренорфин подкожно по 0,1 мг/кг два раза в день, пока животное полностью не восстановится (обычно через 2-3 дня после операции).
- Вводят стерильный физиологический раствор внутрибрюшинно для предотвращения обезвоживания в случае значительного кровотечения во время операции.
- Выключите анестезию (не деинтубируя мышь) и подождите, пока животное восстановит рефлексы (движения усов являются пробуждающим сигналом) и начнет дышать спонтанно.
- Удалите канюлю трахеи.
- Дайте животному восстановиться в инкубаторе при 37 °C.
- Верните животное в 12-часовую комнату светло-темного цикла после полного выздоровления.
6. Операция по дебандированию аорты
- Семь недель спустя выполните де-деминг аорты у половины животных БА и удалите свободный шов с половины мышей SHAM, что приведет к появлению 2 новых групп - дебангирование (DEB) и де-демирование SHAMA (DESHAM) соответственно. DESHAM представляет собой элемент управления для группы DEB(рисунок 4).
- Повторите все шаги с 2.1 по 3.6, упомянутые выше.
- Осторожно рассекаете ткани, спайки и фиброз вокруг аорты, пока ее сужение не станет видимым.
- Тщательно рассеките аорту и отделите шов от аорты. Отрежьте шов угловыми однозондовыми пружинными ножницами(рисунок 3Б).
- Закройте грудную стенку с помощью полипропиленовой шва 6-0 простым прерванным или непрерывным швом, используя минимально возможное количество швов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Попробуйте подтянуть последний грудной шов, когда легкие надуты, чтобы избежать пневмоторакса. - Закройте кожу шовным швом из шелка/полипропилена 6-0 непрерывным швом.
- Выполните все процедуры послеоперационного ухода, как указано в пункте 5.
- Приносите животных в жертву через 2 недели.
7. Эхокардиография для оценки сердечной функции и гипертрофии левого желудочка in vivo
- Выполняйте эхокардиографическое исследование каждые 2-3 недели, чтобы проследить прогрессирование гипертрофии и сердечной функции.
- Обезболивание животных, как описано, путем вдыхания 5% севофлурана с носовым конусом. Отрегулируйте уровень анестезии, снизив его до 2,5%.
- Побрейте и нанесите крем для депиляции от декольте до середины груди.
- Поместите животное на грелку и поместите электроды ЭКГ. Обеспечьте хороший след ЭКГ и поддерживайте частоту сердечных сокращений от 300 до 350 ударов в минуту.
- Следите за температурой (~37 °C).
- Нанесите эхо-гель и расположите животное в левом боковом продольном продольном.
- Запустите эхокардиограф и отрегулируйте настройки.
- Поместите ультразвуковой зонд над грудной клеткой.
- Оцените градиент давления через полосу через 7 и 2 недели после операции по полосам и дебандингу соответственно. Поместите зонд на длинную ось LV и поместите пучок над аортой. Нажмите кнопку PW для активации импульсно-волновой допплеровской эхокардиографии. После семи недель полосирования градиенты аорты будут >25 мм рт.ст. у полосатых животных.
- Записывайте двумерные управляемые изображения аорты, показывающие наличие или отсутствие восходящего сужения аорты, чтобы анатомически визуализировать эффективность полосирования и де-полосирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно визуализировать турбулентный поток на уровне сужения, если доступен цветовой режим. - Оцените гипертрофию, расположив зонд на короткой оси LV, на уровне сосочковых мышц, и нажмите трассировку M-режима, чтобы визуализировать переднюю стенку LV (LVAW), диаметр LV (LVD) и заднюю стенку LV (LVPW) в диастоле (D) и систоле (S)(рисунок 5).
- Оцените систолическую функцию, рассчитайте фракцию выброса и дробное укорочение, как описаноранее 14,15.
- Оценить диастолическую функцию путем 1) определения пика импульсно-волновой допплеровской скорости раннего и позднего митрального потока (волны Е и А соответственно) с помощью апикального 4-камерного апикального вида чуть выше митральных листочков; 2) запись боковых митральных кольцевых миокарда раннедиастолических (E') и пиковых систолических (S') скоростей с использованием импульсно-TDI и апикального 4-камерного апикального вида(рисунок 5).
- Запишите не менее трех последовательных сердечных сокращений для каждой оценки параметров. Эти значения будут впоследствии усреднены.
8. Гемодинамическая оценка
- В конце протокола(рисунок 4)выполняют окончательную эхокардиографию, как описано в 7, перед терминальной гемодинамической оценкой.
- Повторите шаги 2.1–3.6.
- Канюлюлировать правую яремную вену и перфузировать стерильный физиологический раствор при 64 мл/кг/ч.
- Слегка поверните животное в левую сторону и сделайте разрез кожи на уровне кипочного аппендикса.
- Отделите кожу от мышцы щипцами или ножницами.
- Сделайте боковой разрез между левыми ребрами на уровне квисотого аппендикса.
- Выполните левую боковую торакотомию, чтобы полностью обнажить сердце.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать кровотечения и повреждения легких, вставьте ватный тампон в грудную полость и осторожно надавите на легкое, вставив два гемостата с правой и левой стороны места для разреза. - Предварительно нагрейте катетеры P-V loop в водяной бане при 37 °C.
- Откалибруйте катетер (настройка, настройка канала, выбор правильного канала по давлению и объему, единицы измерения).
- Вставьте катетер в РН и убедитесь, что датчики объема расположены между аортальным клапаном и вершиной. Объемы можно оценить с помощью эхокардиографии(рисунок 5). Визуализация напорно-объемных петель помогает подтвердить правильное позиционирование катетера(рисунок 6).
- Дайте животному стабилизироваться через 20-30 мин без существенных изменений формы напор-объемных петель.
- Когда вентиляция приостановлена по истечении срока действия, приобретите базовые записи(рисунок 6). Непрерывно получать данные с частотой 1000 Гц для последующего анализа в режиме онлайн с помощью соответствующего программного обеспечения.
- Вычислить параллельную проводимость после гипертонического соляного болюса (10%, 10 мкл).
- Во время обезболивания принесите животное в жертву путем экссангинации, соберите и центрифугировать кровь.
- Наконец, иссейте и соберите сердце. Взвешивайте сердце, левый и правый желудочек отдельно и немедленно храните образцы в жидком азоте или формалине для последующих молекулярных или гистологических исследований соответственно.
9. Процедура полосирования/де-полосирования аорты у крыс
- Выполняют бандажирование аорты у молодого Вистар (70-90 г) с использованием иглы 22 г и полипропилено-0 лигатуры для сужения аорты.
- Обеспечьте надлежащую анестезию и обезболивающий процедуры с 3-4% севофлурана и 0,05 мг/кг бупренорфина соответственно.
- Во время эхокардиографии убедитесь, что частота сердечных сокращений всегда выше 300 / мин (в идеале между 300 и 350).
- Перед шагом 8.9 аккуратно рассекте аорту крысы, поместите вокруг нее протоковый зонд для измерения сердечного выброса. Использование зонда аортального потока является золотым стандартом для крыс.
- Для гемодинамической оценки канюлюгируют яремную или бедренную вену для введения жидкости (32 мл /кг /ч).
- Замените напорный объемный катетер SPR-1035 на SPR-847 или SPR-838, размеры которых лучше соответствуют размерам желудочков крысы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Послеоперационное и позднее выживание
Периоперационная выживаемость при процедуре бандажировки составляет 80%, а смертность в течение первого месяца обычно составляет <20%. Как упоминалось ранее, успех операции по дебандированию сильно зависит от того, насколько инвазивной была предыдущая операция. После кривой обучения уровень смертности во время процедур дебандинга составляет около 25%. Для этого смертность приходится в основном на смертельные случаи во время хирургической процедуры, включая разрыв аорты или левого предсердия (у крыс выживаемость выше в обеих хирургических процедурах).
Бандажирование аорты и ремоделирование миокарда
Успешность сужения аорты была подтверждена повышенным конечным систолическим давлением РН (LVESP) и доплеровскими скоростями аортального течения >2,5 м/с, что соответствует градиенту давления 25 мм рт.ст. с использованием модифицированного уравнения Бернулли(рисунок 5). По сравнению с мышами SHAM, полосатая индуцированная гипертрофия ЛЖ, оцениваемая по увеличению массы ЛЖ(Таблица 1 и Рисунок 5)и нарушению диастолической функции, проявляющейся более высоким давлением наполнения (отношение митральной пиковой скорости раннего наполнения (E) к ранней диастолической митральной кольцевой скорости (E'), (E/e'), а также левого желудочкового конечного диастолического давления (LVEDP) и длительной релаксации (t, Таблица 1, Рисунок 5и Рисунок 6)в течение 7 недель. Фракция выброса еще сохранялась на этой стадии заболевания.
Гистологически семь недель полосирования аорты индуцировали значительную гипертрофию кардиомиоцитов и фиброз(рисунок 7).
Деформирование аорты и обратное ремоделирование миокарда
У мышей, подвергшихся дебандингу, успешное удаление аортального стеноза было подтверждено эходоплеровскими скоростями(таблица 1 и рисунок 5). В целом, деформирование способствовало значительному снижению послегрузки (снижение LVESP) и гипертрофии ЛЖ (оцениваемой с помощью морфометрии, эхокардиографии и гистологии). Кроме того, мы наблюдали нормализацию диастолической функции и скоростей аорты(таблица 1, рисунок 5, рисунок 6и рисунок 7).
Таблица 1: Морфофункционные изменения левого желудочка оцениваются с помощью эхокардиографии и гемодинамики.
| Критические шаги | совет |
| Инвазивность бандажной хирургии |
Важно избегать: ● длительная окклюзия восходящей аорты во время лигирования, что может привести к отеку легких и активации воспалительных путей, способных влиять на фенотип и тяжесть заболевания15 ● кровотечение молочной артерии, которое, если его своевременно не обойти, может привести к снижению артериального давления и способствовать увеличению количества фиброза при повторном вскрытии грудной клетки (де-лифтинг); ● повреждение плевры и легких мышей; Мини-левая боковая торакотомия для полосирования и дебандирования (то же место; настоящее исследование) против левой боковой торакотомии для бандажу и стернотомии для операции по дебандингу11: ● первые менее инвазивны и имеют короткое время восстановления, что улучшает успешность гемодинамики открытой грудной клетки, выполненной через две недели. Тем не менее, использование того же положения для повторного открытия грудной клетки может увеличить количество осложнений из-за спаек (вокруг левого предсердия, легочной артерии и т. Д.). Преодолейте эту проблему, имея дополнительный уход во время процедуры бандагаирования. |
| Интернализация швов |
Можно предотвратить, используя: ● два бандажных шва бок о бок16; ● шелк вместо полипропилена11; ● титановые зажимы или уплотнители вокруг аорты, чтобы вызвать ее сужение21; ● двойная петля-зажим thecnique15; ● надувная манжета для проведения надкоронарных аортальных бандажей22. |
| Физиологические параметры |
Во время операции важно контролировать: ● частота сердечных сокращений; ● оксигенация крови, поддержание ее выше 90% (особенно во время мануплиляции аорты); ● анестезия, держащая его в минимально возможной дозе, не причиняя дискомфорта животному. |
Таблица 2: Важнейшие этапы протокола.
Рисунок 1:Ультратонкие хирургические инструменты, используемые для процедур бандажирования и дебандинга. (А)2 держателя игл и лезвие скальпеля; 2 катетера для интубации мышей и ножницы; скальпель, 2 изогнутых щипца, средство перевязки, микрохирургический ножницы, 3 прямых щипца; (B)и 26G-игла и притупленная 26G-игла изогнуты, чтобы правильно соответствовать небольшому грудному отверстию мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Процедура полосирования аорты. (А) Грудной подход к восходящей аорте выполняется с помощью магнитной системы втягивания фиксатора (видны 3 втягивающих). (B) Восходящая аорта четко рассечена и видна. Притупленная игла и полипропиленовый шов 6-0 помещаются в нужное положение для выполнения бандажирования аорты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Процедура деформирования аорты. (A) Мышь помещается в систему магнитного втягивания, представляющую собой удобный инструмент для втягивания мышц и тканей. Мышь интубируется для механической вентиляции. Ректальный зонд контролирует температуру, а оксиметр помещается на правую лапу мыши для мониторинга оксигенации крови во время операции. Фиброз и адгезивная ткань аккуратно удаляются вокруг аорты и шва, чтобы иметь возможность разрезать шов(B)и(C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Экспериментальный дизайн протокола для мышей. Ремоделирование миокарда (красный) и обратное ремоделирование (зеленый) показаны внизу вместе со всеми задачами оценки. Следует отметить, что операция по дебандированию может привести к появлению двух групп животных с различными степенями обратного ремоделирования. Таким образом, мы получили мышь DEB с полным (DEB-COMP) и неполным (DEB-INCOM) восстановлением миокарда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Эхокардиографическая оценка структуры и функции сердца. (А)Скорости течения аорты; (B)Масса НН; (C)Размеры желудочков (диаметр LV, LVD) и толщина стенки (задняя стенка LV, LVPW и передняя стенка LV, LVAW); (D)Передающий поток (пик пульсовой доплеровской волны поздней митральной скорости потока, A, и пик импульсной доплеровской волны ранней митральной скорости потока, E) и(E)скорости миокарда (поздняя диастолическая скорость митральной кольцевой ткани, A'; скорость раннедиастолической митральной кольцевой ткани, E' и систолическая скорость митральной кольцевой ткани, S'). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:Репрезентативные контуры давления-объема для групп SHAM, BA и DEB. Данные непрерывно собирались при частоте 1000 Гц и впоследствии анализировались в режиме off-line программным обеспечением PVAN. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7:Гипертрофия миокарда и фиброз оцениваются гистологически. (A) Гипертрофия левого желудочка оценивается по кардиомиоцитам секционной области гематоксилин-эозин(HE)-окрашенных срезов (5 мкм) из SHAM (n = 17), BA (n = 14) и DEB группы (n = 12). (B) Интерстициальный фиброз левого желудочка и репрезентативные изображения красных окрашенных Сириусом участков (5 мкм) из SHAM (n = 17), BA (n = 13) и DEB (n = 12). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Предложенная здесь модель имитирует процесс ремоделирования РН и РР после полосирования и дебандирования аорты соответственно. Таким образом, он представляет собой отличную экспериментальную модель для продвижения наших знаний о молекулярных механизмах, участвующих в неблагоприятном ремоделировании ЛЖ, и для тестирования новых терапевтических стратегий, способных вызвать восстановление миокарда у этих пациентов. В этом протоколе подробно описываются шаги по созданию животной модели аортального бандажа и де-демандирования грызунов с минимально инвазивной и очень консервативной хирургической техникой для уменьшения хирургической травмы.
Наиболее важный этап протокола связан со степенью хирургической агрессии при бандаже аорты. Успех последующей операции по дебандированию аорты в значительной степени зависит от минимально инвазивной процедуры бандажа, которая позволяет избежать тканевой агрессии и фиброза вокруг аорты и, следовательно, менее инвазивный подход является обязательным(таблица 2). Интернализация шва связана с меньшей гипертрофией ЛЖ и лучшей сердечной функцией16 (таблица 2)и делает процедуру распутывания невозможной, не вызывая разрыва аорты. В настоящем исследовании мы попытались использовать шелк, так как он создает больше рубцовой ткани в месте бандажа, вызывая более стабильную степень перегрузки давлением. Тем не менее, в наших руках операция по дебандингу была более требовательной, когда использовался шелк, поскольку это многофиламентная проволока, что затрудняет ее полное удаление из аорты. Тем не менее, это технические вопросы, которые в значительной степени зависят от протокола и оператора, и эти вариации, тип шва, не являются несовместимыми с надлежащей технической практикой и репродуктивными результатами. Мониторинг физиологических параметров во время полосирования и особенно при дебандинге является обязательным для успешной реализации модели(табл. 2).
В 1991 году Rockman et al. впервые описали поперечное сужение аорты (TAC) у мыши4. С тех пор вышло значительное количество работ, в которых представлены многочисленные версии этой процедуры с вариациями в отношении возраста /размера животного17,генетического фона мышей18,диаметра иглы / сужения19,материала, используемого для полосирования, расположения аорты полосы, продолжительности полосы19 и раскладывания11. Все эти методологические альтернативы действительны до тех пор, пока они соответствуют целям каждого исследования. Тем не менее, мы должны подчеркнуть, что прогрессирование заболевания в сторону сердечной недостаточности происходит быстрее, и, таким образом, ОР является более неполным при выборе: 1) более длительная продолжительность полосирования, 2) тяжелее / старше мышей20 и 3) меньший диаметр иглы, используемой для сужения аорты (более высокий процент сужения аорты)16.
Длительность бандажирования и де-расформирования существенно влияет на стадию заболевания и, следовательно, на восстановление во время ОР. Аналогичным образом, выбор правильного времени для де-демандирования является обязательным для адаптации к тяжести предполагаемого заболевания. Результаты, наблюдаемые в нашем исследовании, соответствуют предшествовавших животным11,21 и исследованиям на людях22,за исключением гипертрофии кардиомиоцитов, где некоторые исследования показали ее нормализацию10,21, а другие - частичную регрессию23. Более того, исследования показали, что регрессия фиброза может происходить в долгосрочной перспективе (70 месяцев для пациентов с человеческими пациентами)24. Результаты, по-видимому, зависят от метода, используемого для решения фиброза25. Недавно Treibel et al. смогли дифференцировать клеточные (миоциты, фибробласты, эндотелиальные, эритроциты) и внеклеточные (ECM, плазма крови) компартменты у пациентов со стенозом аорты после замены аортального клапана (AVR) с использованием сердечно-сосудистого магнитного резонанса с картированием Т122. Они описали, что регрессия массы ЛЖ после AVR может быть вызвана 1) матричной регрессией, где внеклеточный объем уменьшается; 2) только клеточная регрессия, при которой увеличивается внеклеточный объем; 3) или путем пропорциональной регрессии в клеточном и матричном компартментах, где внеклеточный объем неизменен22. Эти авторы пришли к выводу, что после AVR, в то время как диффузный фиброз и клеточная гипертрофия миокарда регрессируют, очаговый фиброз не разрешается. Таким образом, диффузный интерстициальный фиброз, оцениваемый по объему матрицы, является потенциальной терапевтической мишенью. В нашем исследовании снижение фиброза, по-видимому, происходит в течение 2 недель ОР и до нормализации гипертрофии кардиомиоцитов. Кроме того, принесение в жертву животных через 2 недели после деформирования было идеальным временем для получения желудочкового разнообразия среди группы DEB, а именно животных с персистенцией диастолической дисфункции (DEB-INCOM) и других с полным изменением массы ЛЖ и улучшением диастолической функции (DEB-COM). Более того, уже через 2 недели после дебандирования мы ранее показали значительные изменения правого желудочка в группе бандажирования, которые частично восстанавливаются после дебандирования26,в то время как Bjornstad et al. сообщили о нормализации экспрессии генов плода, что свидетельствует о ремоделировании миокарда в течение того же периодавремени 11.
Хирургическая процедура бандажирования/де-де-де-бэндуинга также может быть выполнена у крыс26,однако следует выделить некоторые различия. Из-за большего размера крысы имеют больше мышечных слоев, чем мыши, что уменьшает визуализацию аорты и препятствует позиционированию лигатуры вокруг аорты. С другой стороны, риск повреждения соседних тканей и органов, таких как предсердия или легкие, сведен к минимуму. Чтобы преодолеть проблему интернализации швов, мы использовали большую полипропиленовую лигатуру у крыс, чтобы плотно удерживать аорту (6,0 вместо полипропилена 7,0).
Из-за манипуляций с аортой операция по дебандированию может уменьшить сердечный выброс путем наложения дополнительной нагрузки на ЛЖ и, таким образом, ухудшить кровообращение и дыхательную систему. По сравнению с мышами, крысы, по-видимому, более устойчивы к более длительному анестезируемом периоду и, следовательно, легче контролируют физиологические дыхательные параметры во время длительной операции по дебандации. У крыс развитие гипертрофии ЛЖ происходит быстрее, чем у мышей, но для прогрессирования сердечной недостаточности требуется больше времени. Таким образом, операция по дебандингу может быть выполнена в течение 5-9 недель после процедуры бандажирования без ущерба для фракции выброса26.
Основным ограничением модели полосирования / де-де-де-бэндуирования животных являются требовательные микрохирургические навыки и техника оператора, обычно требующие длительной кривой обучения для выполнения операции по дебандингу. Еще одним ограничением является невозможность выполнения тесной грудной гемодинамики у мышей и крыс, которая будет более физиологична. Однако с помощью этого метода обязательно вставлять катетер из правой сонной артерии в ЛЖ, что в данном конкретном случае неосуществимо, так как у бандажных животных восходящая аорта сужается перед сонными ветвями. Более того, на мышах мы не смогли измерить независимую от нагрузки сократимость (ESPVR) и диастолические параметры (наклон EDPVR), выполнив маневр окклюзии полой вены, важный параметр для адекватной характеристики функции миокарда. Мы обнаружили, что этот маневр трудно выполнить у мышей с восходящим сужением аорты из-за их небольшого размера (20-25 г).
Будущее применение модели полосирования/де-де-полосирования животных включает разработку новых терапевтических подходов к заболеваниям миокарда и характеристику путей, лежащих в основе процесса ремоделирования ЛЖ и ОР.
В заключение, данная клинически значимой модель позволяет временно и механистически охарактеризовать прогрессирование в сторону СН, а также его восстановление, поскольку позволяет проводить сбор образцов миокарда на разных стадиях ремоделирования миокарда и ОР. Более того, он оказывается полезной экспериментальной моделью для тестирования терапевтических стратегий, направленных на восстановление неисправного сердца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят Португальский фонд науки и техники (FCT), Европейский союз, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) и Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) за финансирование исследовательского подразделения UNIC (UID/IC/00051/2013). Этот проект поддерживается FEDER через COMPETE 2020 – Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), проект DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), поддерживаемый региональной операционной программой Norte Portugal (NORTE 2020), в рамках соглашения о партнерстве с Португалией 2020 года, через Европейский фонд регионального развития (ERDF), проект NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), поддерживаемый Европейскими структурными и инвестиционными фондами, региональная операционная программа Лиссабона 2020 года. Даниэла Миранда-Сильва и Патрисия Родригес финансируются Фондом по области общения и технологий (FCT) за счет стипендий (SFRH/BD/87556/2012 и SFRH/BD/96026/2013 соответственно).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorption Spears | F.S.T | 18105-03 | To absorb fluids during the surgery |
| Blades | F.S.T | 10011-00 | To perform the skin incision |
| Buprenorphine | Buprelieve | Analgesia drug | |
| Catutery | F.S.T | 18010-00 | To prevent exsanguination |
| Catutery tips | F.S.T | 18010-01 | To prevent exsanguination |
| cotton swab | Johnson's | To absorb fluids during the surgery | |
| Depilatory cream | Veet | To delipate the animal | |
| Disposable operating room table cover | MEDKINE | DYND4030SB | To cover the surgical area |
| Echo probe | Siemens | Sequoia 15L8W | Ultrasound signal aquisition |
| Echocardiograph | Siemens | Acuson Sequoia C512 | Ultrasound signal aquisition |
| End-tidal CO2 monitor | Kent Scientific | CapnoStat | To control expiration gas saturation |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11255-20 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11272-30 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11151-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11152-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Gas system | Penlon Sigma Delta | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Hemostats | F.S.T | 13010-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Hemostats | F.S.T | 13011-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Ligation aids | F.S.T | 18062-12 | To place a suture around the aorta |
| Magnetic retractor | F.S.T | 18200-20 | To help keep the animal in a proper position |
| Needle holder | F.S.T | 12503-15 | To suture the animal |
| Needle 26G | B-BRAUN | 4665457 | To serve as a molde of aortic constriction diameter |
| Oxygen | Air Liquide | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Polipropilene suture | Vycril | W8304/W8597 | To suture the animal and to do the constriction |
| Povidone-iodine solution | Betadine® | Skin antiseptic | |
| PowerLab | Millar instruments | ML880 PowerLab 16/30 | PV loop Signal Aquisition |
| Pulse oximeter | Kent Scientific | MouseStat | To control heart rate and blood saturation |
| PVAN software | Millar Instruments | To analyse the haemodynamic data | |
| PV loop cathether | Millar instruments | SPR-1035. 1.4 F | PV loop Signal Aquisition |
| Retractor | F.S.T | 17000-01 | To provide a better overview of the aorta |
| Scalpet handle | F.S.T | 10003-12 | To perform the skin incision |
| Scissors | F.S.T | 15070-08 | To cut the suture in debanding surgery |
| Scissors | F.S.T | 14084-09 | To cut other material during the surgery e.g. suture, papper |
| Sevoflurane | Baxter | 533-CA2L9117 | |
| Temperature control module | Kent Scientific | RightTemp | To control animal corporal temperature |
| Ventilator | Kent Scientific | PhysioSuite | To ventilate the animal |
| Water-bath | Thermo Scientific™ | TSGP02 | To maintain water temperature adequate to heat the P-V loop catethers |
References
- Arany, Z., et al. Transverse aortic constriction leads to accelerated heart failure in mice lacking PPAR-gamma coactivator 1alpha. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (26), 10086-10091 (2006).
- Tavakoli, R., Nemska, S., Jamshidi, P., Gassmann, M., Frossard, N. Technique of Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice for Induction of Left Ventricular Hypertrophy. Journal of Visualized Experiment. (127), e56231 (2017).
- Zaw, A. M., Williams, C. M., Law, H. K., Chow, B. K. Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice. Journal of Visualized Experiment. (121), e55293 (2017).
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proceedings of the National Academy of Science. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- Koide, M., et al. Premorbid determinants of left ventricular dysfunction in a novel model of gradually induced pressure overload in the adult canine. Circulation. 95 (6), 1601-1610 (1997).
- Rodrigues, P. G., Leite-Moreira, A. F., Falcao-Pires, I. Myocardial reverse remodeling: how far can we rewind. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (11), 1402-1422 (2016).
- Weidemann, F., et al. Impact of myocardial fibrosis in patients with symptomatic severe aortic stenosis. Circulation. 120 (7), 577-584 (2009).
- Bing, R., et al. Imaging and Impact of Myocardial Fibrosis in Aortic Stenosis. JACC Cardiovascular Imaging. 12 (2), 283-296 (2019).
- Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
- Weinheimer, C. J., et al. Load-Dependent Changes in Left Ventricular Structure and Function in a Pathophysiologically Relevant Murine Model of Reversible Heart Failure. Circulation Heart Failure. 11 (5), 004351 (2018).
- Bjornstad, J. L., et al. A mouse model of reverse cardiac remodelling following banding-debanding of the ascending aorta. Acta Physiologica (Oxford). 205 (1), 92-102 (2012).
- Yarbrough, W. M., Mukherjee, R., Ikonomidis, J. S., Zile, M. R., Spinale, F. G. Myocardial remodeling with aortic stenosis and after aortic valve replacement: mechanisms and future prognostic implications. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 143 (3), 656-664 (2012).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H.
- Hamdani, N., et al. Myocardial titin hypophosphorylation importantly contributes to heart failure with preserved ejection fraction in a rat metabolic risk model. Circulation: Heart Failure. 6 (6), 1239-1249 (2013).
- Li, L., et al. Assessment of Cardiac Morphological and Functional Changes in Mouse Model of Transverse Aortic Constriction by Echocardiographic Imaging. Journal of Visualized Experiment. (112), e54101 (2016).
- Lygate, C. A., et al. Serial high resolution 3D-MRI after aortic banding in mice: band internalization is a source of variability in the hypertrophic response. Basic Research in Cardiology. 101 (1), 8-16 (2006).
- Platt, M. J., Huber, J. S., Romanova, N., Brunt, K. R., Simpson, J. A. Pathophysiological Mapping of Experimental Heart Failure: Left and Right Ventricular Remodeling in Transverse Aortic Constriction Is Temporally, Kinetically and Structurally Distinct. Frontiers in Physiology. 9, 472 (2018).
- Garcia-Menendez, L., Karamanlidis, G., Kolwicz, S., Tian, R. Substrain specific response to cardiac pressure overload in C57BL/6 mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 305 (3), 397-402 (2013).
- Melleby, A. O., et al. A novel method for high precision aortic constriction that allows for generation of specific cardiac phenotypes in mice. Cardiovascular Research. 114 (12), 1680-1690 (2018).
- Li, Y. H., et al. Effect of age on peripheral vascular response to transverse aortic banding in mice. The Journal of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 58 (10), 895-899 (2003).
- Ruppert, M., et al. Myocardial reverse remodeling after pressure unloading is associated with maintained cardiac mechanoenergetics in a rat model of left ventricular hypertrophy. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 311 (3), 592-603 (2016).
- Treibel, T. A., et al. Reverse Myocardial Remodeling Following Valve Replacement in Patients With Aortic Stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 860-871 (2018).
- Dadson, K., et al. Cellular, structural and functional cardiac remodelling following pressure overload and unloading. International Journal of Cardiology. 216, 32-42 (2016).
- Krayenbuehl, H. P., et al. Left ventricular myocardial structure in aortic valve disease before, intermediate, and late after aortic valve replacement. Circulation. 79 (4), 744-755 (1989).
- McCann, G. P., Singh, A. Revisiting Reverse Remodeling After Aortic Valve Replacement for Aortic Stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 872-874 (2018).
- Miranda-Silva, D., et al. Characterization of biventricular alterations in myocardial (reverse) remodelling in aortic banding-induced chronic pressure overload. Science Reports. 9 (1), 2956 (2019).
