Summary
In vitro modeller af koronar angiogenese kan udnyttes til opdagelsen af de cellulære og molekylære mekanismer koronar angiogenese. In vitro explant kulturer af sinus venosus og endokardiet væv viser robust vækst som reaktion på VEGF-A og vise et lignende mønster af COUP-TFII udtryk som in vivo.
Abstract
Her beskriver vi en in vitro kultur assay at studere koronar angiogenese. Koronar fartøjer fodre hjertemusklen og er af klinisk betydning. Defekter i disse fartøjer udgør alvorlige sundhedsrisici såsom åreforkalkning, hvilket kan føre til myokardieinfarkter og hjertesvigt hos patienter. Derfor, koronararteriesygdom er en af de førende dødsårsager på verdensplan. På trods af sin kliniske betydning, relativt lidt fremskridt er blevet gjort på, hvordan man regenerere beskadigede kranspulsårer. Ikke desto mindre er der gjort nylige fremskridt med hensyn til at forstå den cellulære oprindelse og differentieringsveje for udvikling af koronarfartøjer. Fremkomsten af værktøjer og teknologier, der giver forskerne mulighed for at fluorescerende mærke progenitor celler, følge deres skæbne, og visualisere afkom in vivo har været medvirkende til at forstå koronar fartøj udvikling. In vivo-undersøgelser er værdifulde, men har begrænsninger med hensyn til hastighed, tilgængelighed og fleksibilitet i forsøgsdesign. Alternativt, nøjagtige in vitro modeller af koronar angiogenese kan omgå disse begrænsninger og give forskerne mulighed for at afhøre vigtige biologiske spørgsmål med hastighed og fleksibilitet. Manglen på passende in vitro model systemer kan have hindret fremskridt i forståelsen af cellulære og molekylære mekanismer koronar fartøj vækst. Her beskriver vi et in vitro kultursystem til dyrkning af koronarfartøjer fra sinus venosus (SV) og endocardium (Endo), de to progenitorvæv, hvorfra mange af koronarfartøjerne opstår. Vi bekræftede også, at kulturerne nøjagtigt opsummerer nogle af de kendte in vivo-mekanismer. For eksempel viser vi, at de angiogene spirer i kultur fra SV downregulate COUP-TFII udtryk svarende til, hvad der er observeret in vivo. Derudover viser vi, at VEGF-A, en velkendt angiogenic faktor in vivo, robust stimulerer angiogenese fra både SV og Endo kulturer. Kollektivt har vi udtænkt en nøjagtig in vitro kultur model til at studere koronar angiogenese.
Introduction
Blodkar i hjertet er almindeligvis kaldes koronar fartøjer. Disse fartøjer består af arterier, vener og kapillærer. Under udviklingen, stærkt forgrenede kapillærer er etableret først, som derefter omforme stil kranspulsårerne og vener1,2,3,4,5. Disse indledende kapillærer er bygget af endotel progenitor celler findes i proepicardium, sinus venosus (SV), og endocardium (Endo) væv1,6,7,8. SV er inflow organ af embryonale hjerte og Endo er den indvendige foring af hjertet lumen. Endotel stamphændede celler findes i SV og Endo opbygge størstedelen af koronar vaskulatur, mens proepicardium bidrager til en relativt lille del af det2. Den proces, hvorved kapillær netværk af koronar fartøjer vokser i hjertet fra sin allerede eksisterende prækursor celler kaldes koronar angiogenese. Koronararteriesygdom er en af de førende dødsårsager på verdensplan, og alligevel mangler en effektiv behandling for denne sygdom. Forståelse af detaljerede cellulære og molekylære mekanismer koronar angiogenese kan være nyttige i udformningen af nye og effektive behandlinger til at reparere og regenerere beskadigede kranspulsårer.
For nylig er en kraftig stigning i vores forståelse af, hvordan koronar fartøjer udvikler sig, til dels opnået gennem udvikling af nye værktøjer og teknologier. Navnlig har mærkning af in vivo-afstamning og avancerede billeddannelsesteknologier været meget nyttige til at afdække koronarfartøjernes celleoprindelse og differentieringsveje9,10,11,12. På trods af fordelene ved disse in vivo-værktøjer er der begrænsninger med hensyn til hastighed, fleksibilitet og tilgængelighed. Derfor kan robuste in vitro-modelsystemer supplere in vivo-systemer for at belyse de cellulære og molekylære mekanismer i koronar angiogenese på en måde med høj overførselsdrift.
Her beskriver vi en in vitro model af koronar angiogenese. Vi har udviklet et in vitro explant kultursystem til at dyrke koronarfartøjer fra to progenitorvæv, SV og Endo. Med denne model viser vi, at in vitro-vævseksplantens kulturer vokser koronarspirer, når de stimuleres af vækstmedium. Derudover, explant kulturer vokser hurtigt i forhold til kontrol, når stimuleret af vaskulære endotel vækstfaktor A (VEGF-A), en meget potent angiogenic protein. Desuden fandt vi, at de angiogene spirer fra SV-kulturen gennemgår venøs dedifferentiering (tab af COUP-TFII udtryk), en mekanisme svarende til SV angiogenese in vivo1. Disse data tyder på, at in vitro explant kultur system trofast genindfører angiogene hændelser, der opstår in vivo. Kollektivt, in vitro modeller af angiogenese, der er beskrevet her er ideelle til sondering cellulære og molekylære mekanismer koronar angiogenese i en høj-throughput og tilgængelig måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Brugen af alle dyrene i denne protokol fulgte Ball State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) retningslinjer.
1. Oprettelse af Mus Opdrættere og detektering Vaginal Stik til tidsforrettede graviditeter
- Opret en mus avl bur med vilde type mandlige og kvindelige mus. Sørg for, at avlsmusenes alder er mellem 6-8 uger. Opret enten et par (1 han og 1 hun) eller som en trio (1 han og 2 hunner) til avl.
- Kontroller for en vaginal stik den følgende morgen. Brug en vinklet metalsonde til at detektere et dybt stik ved at indsætte den i vaginalåbningen. Angiv morgenen for en positiv vaginal stik til at være embryonale dag 0,5 (e0.5).
BEMÆRK: Et vaginalt stik kan enten være overfladisk (som er let synligt, se figur 1)eller dybt (som ikke er let synligt). Tilstedeværelsen af et dybt stik vil blokere fuld indsættelse af sonden, mens fraværet af et stik vil tillade fuld indsættelse uden modstand. - Hold tidsfordret graviditet, indtil embryonerne når e11.5, hvor de vil blive høstet. For at bekræfte graviditeten før høst af embryoner registreres vægten af hunmus mellem e7.5 og e11.5.
BEMÆRK: Daglig stigning i moderens vægt vil indikere en vellykket graviditet, mens ingen ændring i vægt vil indikere en mislykket graviditet.
2. Høst embryoner fra gravide mus
BEMÆRK: Før du begynder, skal du sørge for at have følgende udstyr og reagenser: et CO 2-dødsblodskammer, 70% ethanol, papirhåndklæder, regelmæssige pincet, fine pincet, saks, 1x sterilt fosfat-buffered saltvand (PBS), 10 cm sterile petriskåle, beholder med is, perforeret ske, dissektionstereomikroskop.
- Placer en e11.5 gravid mus i en ren CO2 eutanasi kammer til at ofre det. Luk låget af kammeret for at forhindre musen i at slippe ud.
- Når musen er sikret i eutanasikammeret, skal du tænde FOR CO2. Sørg for at regulere strømningshastigheden af CO2 pr. IACUC-anbefalinger (dvs. 10-30 % forskydning pr. minut). Efter musen er helt aflivet, udføre cervikal dislokation for at sikre døden.
- Spray musen med 70% ethanol. Løft huden over maven ved hjælp af pincet, lave et lille snit ved hjælp af en saks og udvide snittet sideværts. Forstørre snitter anteriorly op til mellemgulvet og udsætte livmoderhorn indeholder embryoner (Figur 2).
- Træk rækken af embryoner (livmoderhorn + embryoner) ud ved at gribe om livmoderen og skære den fri. Sæt fosterstrengen i iskold steril 1x PBS.
- Dissekere de enkelte embryoner fra livmoderhornet ved at skrælle livmodermusklen, blommesækken og fostervanden e én efter én (Figur 3A-F) under et stereomikroskop. De rensede embryoner overføres med en perforeret ske til en petriskål, der indeholder steril 1x PBS på is. Sørg for at holde embryonerne kolde.
3. Isolering af hjerter fra e11.5 Embryoner
BEMÆRK: Før du begynder, skal du sørge for at have følgende udstyr og reagenser: regelmæssig pincet, fine pincet, 1x steril PBS, 10 cm steril petriskål, 6 cm steril petriskål, beholder med is, perforeret ske, dissektion stereomikroskop.
- Opret en ny petriskål med iskold steril 1x PBS under et stereomikroskop. Overfør et foster fra trin 2.5 til petriskålen for at dissekere hjertet.
- Fjern fosterets hoved ved hjælp af pincet. Først skal du klemme hovedet mellem pincet med den ene hånd og derefter fjerne hovedet ved at skrabe det væk med den anden hånd ved hjælp af lukkede pincet(Figur 4A-C).
- Når hovedet er fjernet, skal fosteret vendes med dets ventrale side op ved at holde fosteret med pincet i maven med den ene hånd (figur 4D).
- Med den anden side, åbne brystvæggen af fosteret ved først at gøre et lille snit i brystet lidt over mellemgulvet ved hjælp af fine pincet. Derefter forstørre snittet meget omhyggeligt ved at indsætte lukkede pincet og rive brystvæggen ved at åbne pincet. Sørg for ikke at stikke for dybt, hvilket kan beskadige hjertet. Ved hjælp af pincet, holde brystvæggen på vid gab for at udsætte hjertet og lungerne i brysthulen (Figur 4E).
- Brug fine pincet, forsigtigt flytte hjertet anteriorly (90°) og udsætte dorsale aorta / vene. Træk hjerte/lunger foran ved at indfange rygaorta/venen i bunden af hjertet (figur 4F-H).
BEMÆRK: Vær skånsom, mens du trækker hjertet/lungerne ud for at undgå at rive SV'en, som er placeret på hjertets rygside. - Skyl hjertet/lungerne med kold 1x PBS for at fjerne blodlegemer.
- Første trin 3.1-3.6 gentages for at fjerne hjertet/lungerne fra de resterende embryoner. Sørg for at holde det isolerede hjerte/lunger på is.
4. Isolering af sVs og ventrikler fra e11.5 Embryonale Mouse Hearts
- Placer petriskålen med hjerte/lunger fra trin 3.7 under et stereomikroskop for at isolere svs og hele ventrikler. Skræl de vedlagte lapper af lungerne én efter én fra deres rod ved hjælp af fine pincet.
- Orienter hjertet på sin rygside og fjern atria og det tilstødende væv, der omgiver SV anteriorly uden at rive SV. Fjern venstre og højre atria fra hjertet ved at holde på sin base og skrabe det ud ved hjælp af fine pincet (Figur 5B). Fjern det tilstødende væv omkring SV ved hjælp af en lignende teknik (Figur 5C).
BEMÆRK: Husk, at det rigtige atrium er fastgjort til SV' en, så pas på kun at fjerne atriummet. - For at isolere SV, først orientere hjertet med sin rygside opad (fordi SV er på rygsiden) og holde hjertet stadig i denne position ved forsigtigt at holde hjertet på sine hjertekamre med pincet.
BEMÆRK: SV er et indløbsorgan af et embryonalt hjerte, der ligger mellem atriaen på hjertets rygside. - Fjern SV ved forsigtigt at skrælle den af hjertet, hvor den er fastgjort, eller ved at holde SV'en i bunden af dens fastgørelse med fine pincet og skrabe den af med lukkede pincet(Figur 5D,E).
- Den isolerede SV overføres til en ny 6 cm petriskål med iskold steril 1x PBS på is ved hjælp af en steril overførselspipette, og petriskålen mærkes som SV.
- For at isolere hele hjertekamrene skal udstrømningskanalen (aorta og lungestammen) fjernes fra hjertet, efter at SV er fjernet (Figur 5F,G).
- Hele hjertekamrene overføres til en ny 6 cm petriskål indeholdende steril 1x PBS på is ved hjælp af en steril overførselspipette, og petriskålen mærkes som ventrikler. Hold den isolerede SV og hjertekamrene på is.
- Gentag trin 4.1-4.7 for at isolere svs og hjertekamre fra de resterende hjerter.
5. Opsætning af vævskulturplader med skær og ekstracellulær matrixbelægning
BEMÆRK: Før du begynder, skal du sørge for at have følgende udstyr og reagenser: kommerciel ekstracellulær matrixopløsning (ECM, f.eks. Matrigel), 8,0 μM polyethylenterephthalatkulturindsatser(PET),24 brøndplader, 37 °C, 5% CO 2-inkubator.
- Lad ECM-løsningen tø op på isen. Hold ECM-løsningen på isen for at undgå størkning.
- PET-membrankulturindsatserne (porestørrelse = 8,0 μm, filtreringsområde = 0,3 cm2, filterdiameter = 6,5 mm) anbringes i brøndene for ikke-vævskultur behandlet 24 brøndplader. Mærk pladerne som SV eller hjertekamre for SV eller endocardial angiogenese assays, henholdsvis.
BEMÆRK: Sæt indsatserne op i separate plader til SV og hjertekamrene, når begge kulturer udføres samtidigt. Sørg for at sætte nok brønde op til alle forsøgsprøver og -kontroller. - Når ECM-opløsningen er optøet, fortyndes ECM 1:2 straks i forkølet basalmedium (dvs. EBM-2 basalmedium, se Materialetabel) til et tilstrækkeligt volumen (100 μL/skær x antal skær).
BEMÆRK: Hvis der for eksempel er seks skær, vil det samlede volumen være 100 μL x 6 = 600 μL. Tilsættes 200 μL ECM til 400 μL basalt medium. - Coat indsatserne med 100 μL frisk fortyndet ECM ved at tilføje det direkte på toppen af membranen. Pladen inkuberes ved 37 °C i mindst 30 minutter, så ECM'en kan størkne.
BEMÆRK: Dette skal udføres under en laminar flow væv kultur hætte for at undgå forurening.
6. Suv'er og hele ventrikler Kulturer
BEMÆRK: Før du begynder, skal du sørge for at have følgende udstyr ogreagenser:70% ethanol, overførsel pipette, stereomikroskop, pincet, laminar flow væv kultur hætte, mikrovaskulære endotel celle supplement kit ( Tabel af materialer ), basal medium, 1x sterile PBS). Figur 6 viser arbejdsgangen for SV og ventrikelkultur.
- Tø indholdet af tillægget op på is. Forbered hele mediet ved at tilføje alt indholdet af supplementsættet til 500 ml basalmedium under en certificeret laminar flowvævskulturhætte. Bland mediet godt og fordel i 50 ml aliquots.
- Steriliser bunden af stereomikroskopet og det omgivende arbejdsområde med 70% ethanol.
- Fremsk af vævskulturpladerne fra trin 5.4. Ved hjælp af en overførselspipette overføres eksplanterne forsigtigt fra trin 4.7 oven på skærmembranen. Under et stereomikroskop og ved hjælp af rene pincet, placere explants i midten af skær for at sikre, at de ikke sidder fast i hjørnet af indsatserne eller fastgjort til sidevæggene.
- Når eksplanterne er placeret og centreret på skærene, skal du forsigtigt fjerne eventuelle ekstra PBS fra skærene og lukke pladernes låg.
- Under en laminar flowvævskulturhætte tilsættes 100 μL af det forvarmede komplette medium oven på skærene og 200 μL i brøndene til dyrkning eksplanterne ved luftvæskegrænsefladen, således at skærets basale overflade er i kontakt med mediet , men den øverste overflade udsættes for luften.
BEMÆRK: Sørg for at justere lydstyrken for at opnå en luftvæskegrænseflade, hvis der anvendes indlæg i anden størrelse/brøndplader. - Der tilsættes 300 μL PBS i de ubrugte brønde på de 24 brøndplader og dækkes med låget. Inkuber pladen i en 37 °C, 5% CO2 inkubator, og vokse kulturer i 5 dage.
- I de følgende dage observeres rutinemæssigt kulturerne under et omvendt lysmikroskop for at vurdere explant-kulturernes status. Sørg for, at explants udviser kontraktile slå, og at alle explants er knyttet til bunden af membranen indlejret med ECM. Vær opmærksom på eventuelle flydende explants.
BEMÆRK: Den periodiske sammentrækning af explants indikerer, at de er i live. Flydende eksplanter bør udelades fra analysen. - Efter at have vurderet kulturstatus, sætte kulturpladen tilbage i kuvøsen og fortsætte med at vokse kulturen i op til 5 dage.
7. Behandling af kulturer med VEGF-A (positiv kontrol)
BEMÆRK: Før du begynder, skal du sørge for at have følgende udstyr og reagenser: laminar flow væv kultur hætte, 1x PBS, basal medium + 1% føtal kvæg serum (FBS), basal medium + VEGF-A, pipetter, og pipette spidser.
- Klargør det basale medium + 1% FBS og det basale medium + VEGF-A.
- For at forberede det basale medium + 1% FBS, først bestemme antallet af nødvendige kontrolbrønde. Hvis der for eksempel er tre kontrolbrønde, er 300 μL/brønd x 3 = 900 μL det samlede nødvendige volumen. Der tilsættes 9 μL FBS i 891 μL basalmedium for at gøre det basale medium + 1% FBS.
- For at forberede det basale medium + VEGF-A, først bestemme det samlede antal brønde har brug for VEGF-A medium. Hvis der er tre brønde, er 300 μL/well x 3 = 900 μL det samlede volumen og 50 ng/well x 3 = 150 NG VEGF-A. Der tilsættes 150 ng VEGF-A i 900 μL basalmedium for at gøre det basale medium + VEGF-A.
BEMÆRK: Denne opløsning samles ved et større volumen end beregnet for at sikre et tilstrækkeligt antal mindre aliquots for hvert forsøg.
- Fjern mediet fra begge kamre (indsatserne og brøndene) på dag 2. Kulturer vaskes med 300 μL 1x PBS ved at tilsætte 100 μL til indsatserne og 200 μL i brøndene. Svirpladerne kraftigt et par gange, og tag PBS'en.
- Der tilsættes 300 μL basalmedium + 1% FBS (100 μL i indsatsen og 200 μL i brøndene) for at sulte kulturerne i 24 timer.
- På dag 3, efter sult, tilsættes 300 μL basalmedium + 1% FBS (100 μL i indsatsen og 200 μL i brøndene) i kontrolbrøndene og det basale medium + VEGF-A (50 ng/well) i behandlingsbrøndene.
- Efter behandling, fortsætte med at vokse kulturer i kuvøsen.
8. Fiksering og immunfarvning
BEMÆRK: Før du begynder, skal du sørge for at have følgende udstyr og reagenser: 4% paraformaldehyd (PFA), 1x PBS, primære og sekundære antistoffer, en shaker, 0,5% nonionic overfladeaktivt stof i PBS (PBT).
- På den sjette dag i dyrkning, fjerne medium og vask kulturer med 1x PBS ved stuetemperatur (RT).
- Kulturerne indrettes ved at tilsætte 200 μL 4% PFA-opløsning i brøndene og 100 μL i skærene. Der fastsættes kulturer i 4 °C i 20 min. under gyngende.
- Efter 20 min fiksering fjernes PFA fra kulturerne i en røghætte og kulturerne vaskes med 1x PBS ved at tilsætte 200 μL i brøndene og 100 μL i skærene.
- Gentag vasker 3x, 10 min hver, mens vuggende. Fortsæt derefter med at udføre immunfarvning.
BEMÆRK: Alle vasketrinnene udføres på en bordplade på RT.
- Fortyndede primære antistoffer (anti-VE-Cadherin, anti-ERG 1/2/3) i blokerende opløsning (5% æselserum, 0,5% PBT). Der tilsættes 300 μL primær antistofopløsning (200 μL i bundbrøndene og 100 μL i indsatserne). Inkuberkulturer i primære antistoffer natten over ved 4 °C under rokkende stoffer.
BEMÆRK: Anti-VE-Cadherin anvendes til at mærke endotelcellemembranen, og anti-ERG 1/2/3 anvendes til at mærke endotelcellekernen for at visualisere de angiogene spirer i endotelceller. - Den næste dag, vask og rock kulturpladerne 10x i 0,5% PBT, skiftende PBT hver 10 min.
- De sekundære antistoffer (æsel anti-rotte Alexa Fluor 488 og æsel anti-kanin Alexa Fluor 555) fortyndes i blokerende opløsning. Der tilsættes 300 μL af det sekundære antistof som i trin 8.2, og kulturerne inkuberes natten over ved 4 °C under gyngende. Den næste dag, vaske de sekundære antistoffer 10x i PBT, skiftende PBT hver 10 min.
BEMÆRK: Vask mindst 10x, men flere vasker er bedre. Når vaskene er færdige, kan kulturerne opbevares med 1x PBS, indtil de er monteret på objektglas.
9. Montering af kulturer på slides, billedbehandling og analyse
BEMÆRK: Før du begynder, skal du sørge for at have følgende udstyr og reagenser: fine pincet, dias, montering medium med 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), coverslips, og konfokale mikroskop. Efter sekundær antistoffarvning monteres kulturerne på objektglas til billeddannelse ved hjælp af følgende trin.
- Fjern membranen forsigtigt fra indsatsen ved hjælp af fine pincet og overfør den på objektglassene ved at lægge membransiden nedad og placere eksplantens kulturer opad. Placer replikatprøverne i de samme objektglas, og mærk objektglassene som kontrol eller VEGF-A. Tilføj et par dråber monteringsmedium med DAPI direkte på membranen og dæk objektglassene med dæksel.
BEMÆRK: Sørg for at undgå luftbobler, mens du placerer dækslips. - Afseal kanterne af dias med klar neglelak og lad tørre.
BEMÆRK: Dias kan opbevares i -20 °C til langtidsopbevaring. - Billeddias ved hjælp af et konfokalt mikroskop.
- Udfør analyse for at måle længden af angiogene udvækst. Kvantificer den angiogene udvækstlængde ved at måle afstanden mellem endotelcellerne (Ve-Cadherin+/ERG 1/2/3+), der er strakt fra indergrænsen til ERG 1/2/3+ cellerne i ventrikelkulturerne og fra midten af SV-eksplanterne i SV-kulturerne.
- Hvis du vil udføre kvantificering ved hjælp af FIJI/ImageJ, skal du først downloade FIJI-software.
- Åbn billedfiler i FIJI: gå til Fil | Åben | Mappe | Filnavn | Åbn.
- Gå til Analysér | Angiv målinger | Vælg Perimeter.
- Vælg værktøjet Lige linje i hovedvinduet.
- Tegn en linje over længden af en spire som foreslået i trin 9.4.
- Gå til Analysér | Mål.
BEMÆRK: Længdemålinger vises i det nye vindue. - Udfør kvantificering i billeder, der repræsenterer mindst tre tilfældigt udvalgte visningsfelter. Gennemsnit af spirelængdemålingerne og rapporter dem som middel ± standardafvigelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et af de mest slående træk ved SV angiogenese in vivo er, at det følger en bestemt vej og indebærer celle dedifferentiering og redifferentiering begivenheder, der opstår på stereotype tidspunkter og positioner1. Som indledende SV-celler vokser på hjertet hjertekammer, de holder op med at producere venøse markører såsom COUP-TFII (Figur 7). Efterfølgende koronar spirer tage to migration stier, enten over overfladen af hjertet eller dybt inde i myokardiet. Overfladefartøjer bliver til sidst vener , mens invaderende fartøjer bliver arterier og kapillærer1,6,7. Denne skelnen bevares, efterhånden som hjertet vokser, og koronarvaskulaturen udvides.
For at lette opdagelsen af de molekylære fundament af koronar udvikling, har vi udtænkt en in vitro model af SV spiring, der kan udnyttes til tab-of-funktion og gain-of-funktion eksperimenter. SV væv fra embryonale mus hjerter er dissekeret, placeret på toppen af fortyndet ECM (som er kommercielt tilgængelige, se Tabel af materialer ), og vedligeholdespå luft-flydende interface i endotelcellevækst medium. SV myokardiet fortsætter med at slå i hele kulturperioden. Efter 2 dage i kultur, epikardieceller, linje vævet forlade explant og migrere ud på matrix. Efter 5 dage spirer SV endotelceller ud og vandrer ind på epikardievævet(Figur 8A, sorte pilespidser). Kollektivt, denne proces opsummerer angiogene aspekter af koronar udvikling.
Kulturformerede SV spirer også gennemgå venøse dedifferentiering. Som i fosteret reduceres COUP-TFII-udtrykket, efterhånden som fartøjerne vandrer væk fra SV (figur 8Bsammenlignet med figur 7). Kontrolfartøjer såsom navlestrengs- eller blommesækkearterier og vener kan producere spirende kar. Men de er færre i antal og kortere i længden og ændrer ikke deres arteriel eller venøs identitet (ikke vist). Således venøs omprogrammering er specifik for SV spiring og ikke et generelt træk ved angiogenese eller et svar på ECM komponenter. Disse data viser også, at de celletyper, der er indeholdt i selve sv'en, er nødvendige og tilstrækkelige til at fremkalde dedifferentiering.
Det er velkendt, at vaskulær endotelvækstfaktor A (VEGF-A) er en potent inducer af angiogenese7,13,14,15,16,17,18. Tidligere undersøgelser har vist, at myokardie VEGF-A stimulerer endokardieangiogenese til at vokse koronar fartøjer7. Desuden har koronar endotelceller vist sig at udtrykke VEGF-A receptor, og SV-afledte koronar kar i myokardiet kan vokse som reaktion på VEGF-A in vivo2. For at vise, at vores in vitro model af koronar angiogenese trofast reagerer på VEGF-A, vi stimuleret SV og Endo kulturer med VEGF-A. Som forventet viste vores resultater, at både SV og Endo er meget lydhøre over for VEGF-A. Kulturer stimuleret med VEGF-A viser øget vækst af angiogene spirer både i tæthed og længde (Figur 9A,C). SV-kulturer stimuleret af VEGF-A viser en næsten 3 gange større stigning i spirelængden sammenlignet med kontrollen (figur 9B). Disse resultater tyder på, at endotelspirer fra SV og Endo reagerer på lignende signaler, der er kendt in vivo.
Samlet set tyder vores data på, at disse in vitro explant kulturer deler lignende cellulære og molekylære hændelser, der opstår under in vivo koronar udvikling, herunder venøs dedifferentiering og robust vækst som reaktion på VEGF-A stimulation. Derfor, vores data tyder på, at disse explant kultur modeller er nyttige for at studere koronar angiogenese in vitro.
Figur 1: Identifikation af vaginalt stik. (A) En vaginal stik (hvid plet). (B) Forstørret visning af boxed region, herunder vaginal stik (angivet med pil). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Adgang til embryostrengen i livmoderen på en gravid mus. En aflivet gravid mus er placeret med sin ventrale overflade op og sprøjtes med 70% ethanol til våd hud til dissektion. Huden er trukket op på bækkenregionen ved hjælp af pincet og et lille snit er lavet. Snittet forlænges sideværts. Et ekstra snit er lavet anteriorly op til mellemgulvet. I livmoderen er en række embryoner synlige (angivet med pilespidser). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Dissektion og fjernelse af embryoner fra livmoderen. (A) Billede, der viser livmoderen, der indeholder en række embryoner. Membranen på fostersiden af fosteret (modsat af den side, hvor moderkagen er placeret) er skrællet af. (B) Embryoet i blommesækken bliver synligt efter afskalning af livmodermembranen. (C,D) Embryo fastgjort til moderkagen med navlestrengen er synlig efter peeling off blommesækken. Amnion er skrællet af, hvis der stadig er til stede. (E) Billede, der viser et embryon, der er fastgjort til moderkagen ved navlestrengen. (F) Billede, der viser afledningen af embryonet fra moderkagen ved at trække i navlestrengen (Umb. ledning) ved hjælp af pincet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Fjernelse af hjerte/lunger plukke fra embryoner. (A,B) Hovedet fjernes fra fosteret ved at fange i nakken og skrabe det af. (C) Billede, der viser fjernelsen af hovedet fra kroppen. (D) Den korrekte placering af fosteret til hjertedissektion. Fosteret er placeret med ventrale side op for at have nem adgang til brysthulen til fjernelse af hjertet. Når embryonet er placeret som vist i D, åbnes brysthulen med pincet. (E) Billede, der viser det åbne brysthulrum med hjertet eksponeret på sin ventrale side. (F) For at fjerne hjertet uden at beskadige SV, hjertet er vendt anteriorly, og dorsal aorta bliver synlig. (G) Billede, der viser den position i bunden af hjertet/lungerne, hvor rygaorta/venen er fanget med pincet, og hjerte/lunger plukkes, trækkes foran. (H) Billedet viser e11.5 hjerte /lunger plukke fjernet fra fosteret. V. hjerte = ventralhjerte; d. hjerte = ryghjerte; d. aorta = rygaorta LA = venstre atrium; RA = højre atrium; LV = venstre ventrikel; RV = højre hjertekammer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Isolering af SV og ventrikler fra embryonale hjerter. (A) Billede, der viser rygudvisningen af det isolerede hjerte/lunger plukke fra e11.5 embryonet. Placering af SV i hjertet er angivet. (B) Billede af hjertet, efter at lungeknopperne er fjernet. (C) Atria og tilstødende væv omkring SV fjernes, afslører aorta. SV'ens placering er mærket. (D) Billede, der viser fjernelse af SV. Ved hjælp af pincet, er SV grebet på sin base og er skrabet ud fra hjertet. (E) SV fjernet fra hjertet er vist sammen med det resterende væv i hjertet. Aorta og pulmonal stammen (PT), kollektivt kaldet udstrømningskanalen (OFT), bliver synlige i hjertet efter SV er fjernet. SV'en vil blive anvendt til in vitro-kultur som beskrevet i figur 6 (venstre panel). (F) Placeringen af den OFT, der skal dissekeret, er markeret med en stiplet hvid streg. (G) Aorta/PT (udstrømningskanalen) fjernes fra hjertekamrene ved dissektion på den position, der er vist i panel F. De resterende ventrikler uden OFT anvendes til ventrikelkulturer som vist i figur 6 (højre panel). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Skematisk, der viser arbejdsgangen for SV og ventrikelkultur. Venstre: Procedure for SV kultur. For det første fjernes SV'en fra e11,5 hjerter og placeres på et kulturskær. Indsatsen indeholder porøs membran i bunden (8 μm pore) og er belagt med vækstfaktor reduceret ECM. Indsatser er placeret i brøndene på en 24 brøndplade. Medium tilsættes både i bunden og øverste kammer uden at dække explant. Kulturen dyrkes i 5 dage. Efter 5 dage fjernes membranen fra indsatsen og monteres på objektglassene til billeddannelse og analyse. Til højre: Procedure for ventrikelkultur. Ventrikler uden SV, atria, og OFT fjernes fra e11.5 hjerter og er dyrket som beskrevet ovenfor for SV. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: COUP-TFII-udtrykket går tabt i SV-spirerne in vivo. (A) Dorsal udsigt over e11.5 hjerter. Konfokal billede af endotelmarkør (rød), der mærker sinus venosus (SV), koronarspirer (cs, stiplet linje) og endokardiet (endo) foring hjertet lumen. (B) Den venøse maker COUP-TFII (grøn), en vene transskription faktor (trx), udtrykt i SV er gradvist tabt som spirer forlade SV og vokse på hjertekammer. Til højre: Højere forstørrelse af koronarspiret vist i det boxed område af panel A. Scale bar = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: In vitro-modeller af venøs identitet og omprogrammering. (A) Brightfield billede af kulturformerede SV væv. Vaskulære spirer (pilespidser) vokse ud fra den oprindelige explant (sort stiplet linje) over ECM substrat. (B) Immunfluorescens af SV-kulturer mærket med antistoffer, der markerer endotelcelleoverfladen (VE-Cadherin), endotelcellekerner (ERG 1/2/3) samt vene- og epikardiekerner (COUP-TFII). Kerner er positive for både ERG 1/2/3 og COUP-TFII ved SV, men ERG 1/2/3 kun i spirer, der migrerer over ECM. Skalabar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: SV og endocardium reagerer på VEGF-A in vitro. (A) Konfokal billede af den 5 dage gamle kontrol og VEGF-A behandlet SV explant kultur. Endotelceller er immunplettet med VE-cadherin (grøn), endotelcellekerner, der er plettet med ERG 1/2/3 (røde) antistoffer, og cellekerner med DAPI (blå). (B) Angiogene udvækst af endotelceller kvantificeres ved at måle længden af spireforlængelsen (den afstand, der migreres af ERG 1/2/3+ endotelceller fra den ydre plante, angivet med hvide faste linjer i bundpanelerne i (A). (C) Konfokal billede af en 5 dage gammel kultur af en kontrol og VEGF-A behandlede hjertekamre. Endotelceller er immunplettet med VE-cadherin (grøn) og endotelcellekerner farves med ERG 1/2/3 (blå) antistoffer. Prikker er individuelle målinger, og fejlstænger er gennemsnitlige ± SD. Skalabjælke = 200 μm (A,C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nogle af de mest kritiske skridt for en vellykket dyrkning koronar fartøjer fra SV og Endo progenitor væv er: 1) Korrekt identifikation og isolering af SV væv for SV kultur; 2) brug af hjertekamre fra embryoner i alderen e11−11.5 for nøjagtig Endo-kultur; 3) at opretholde sterile forhold i hele dissektionsperioden og holde vævet koldt på alle tidspunkter; og 4) holde explants knyttet til ECM belagt membran for at undgå væv flyder i mediet.
For det første kan isolering af SV-væv være udfordrende. Det er vigtigt at indse, at SV ligger på rygsiden af hjertet mellem venstre og højre atria skjult i lungelobules. Derfor er det vanskeligt at adskille og isolere. I stedet skal hele hjerte /lunger plukke udvindes først. SV er derefter isoleret fra plukke ved omhyggeligt at fjerne lunge lobules og rydde op i de tilstødende væv ved hjælp af fine pincet. Desuden skal man være meget forsigtig, mens oprydning de tilstødende væv til ikke at miste SV.
For det andet, for nøjagtig endokardieangiogenese, er det vigtigt at kultur hjertekamre fra embryoner ikke ældre end e11.5. I e12.5 og ældre embryoner, koronar fra SV vokse i en betydelig del af hjertekamrene. Derfor kan koronarkar, der vokser fra ældre ventrikler, bestå af både sv- og endoafledte koronarfartøjer1,2,10,19,20. Af denne grund, for præcist at assay koronar fartøjets vækst fra Endo, er det afgørende for kultur hjertekamrene (minus SV og udstrømning skanalen) fra e11.5 embryoner20. Desuden er SV relativt større og er lettere at isolere ved e11.5.
For det tredje, fordi protokollen indebærer en betydelig mængde arbejde uden for vævskultur hætte, er det afgørende at opretholde et sterilt arbejdsmiljø. Det er vigtigt at sterilisere dissektionsværktøjerne (pincet, saks osv.) og vævskulturpladerne og undgå kontakt med usterile områder på alle tidspunkter. Det er vigtigt at sprøjte arbejdsområdet og dissektion omfang med 70% ethanol. For at undgå forurening, er det vigtigt at udføre dissektion procedure hurtigt og minimere arbejde uden for vævkultur hætte.
For det fjerde, for at opnå sunde explant kulturer, er det vigtigt, at explants forblive knyttet til bunden af membranen på alle tidspunkter. Flydende explants i mediet skal undgås for at kunne dyrke explant kulturer. For at undgå flydende, er det afgørende at opretholde en luft-væske interface, hvor basal overflade af indsatsen er i kontakt med mediet, men den øverste overflade er udsat for luften. En sådan grænseflade opnås, når explanten er tilstrækkeligt dækket af mediet, men ikke er helt nedsænket. Det er vigtigt at overvåge mængden af mediet dagligt, da volumen kan gå tabt til fordampning. For at forhindre dette kan kulturpladen befugtes ved at tilsætte PBS i kulturpladernes ubrugte brønde.
Lignende explant kulturer SV og Endo er beskrevet andetsteds20. I disse metoder blev explanterne dyrket direkte ind i vævskulturpladernes brønde, hvilket begrænser konfokal billeddannelse med høj opløsning. De billeder, der er taget i denne indstilling, er relativt dårlige i kvalitet sammenlignet med den metode, der foreslås her, hvilket begrænser detaljerede mikroskopiske analyser. For at omgå dette udnyttede vi kulturindsatser, hvorfra membranerne, der indeholder kulturen, kan skrælles af og monteres på glasglasglassene til billeddannelse. Dette giver mulighed for konfokal billeddannelse med høj opløsning, hvor cellulære detaljer som udtryksmønstre og morfologi kan ses. Desuden kræver dyrkning direkte på pladerene en separat farvningsprotokol for DAPI eller anden panatommarkørfarvning. Denne protokol kræver ikke separate farvningstrin, fordi objektglassene kan monteres med monteringsmedium, der indeholder DAPI. Desuden giver montering på objektglas mulighed for langtidsopbevaring uden fluorescerende falmning, mens kulturer, der er lagret i brønde med flydende medium, vil resultere i hurtig falmning og ikke er modtagelige for langtidsopbevaring og billeddannelse.
In vitro kultur modeller, der er beskrevet her, er ideelle til at afhøre cellulære og molekylære mekanismer koronar angiogenese i en høj-throughput og tilgængelig måde. Dette in vitro-system kan bruges til at screene for potentielle lægemidler eller molekylære mål for at vurdere deres virkning på koronar angiogenese. Desuden kan dette system også bruges til at studere gain-of-funktion og tab-of-funktion af forskellige gener for deres autonome funktion i koronar angiogenese. Vi bemærkede, at koronar spirer fra SV fulgte epikardiemigrationen i vores in vitro-kulturer, hvilket tyder på et vigtigt samspil mellem koronar endotelceller og epikardieceller. Det er velkendt, at epikardiet er en rig kilde til vækstfaktorer for koronar angiogenese fra SV. For eksempel har epikardieafledte vækstfaktorer som VEGF-C og ELABELA tidligere vist sig at regulere SV-afledte koronar angiogenese2,19. Vi kan bruge denne SV kultur system til yderligere at undersøge samspillet mellem epikardiet og koronar endotelceller og identificere nye epikardie-afledte molekylære veje koronar angiogenese. Derudover, vores in vivo data tyder på, at myokardiehypoxi kan være involveret i endokardieangiogenese19. Vores in vitro kultur system tilbyder en fremragende model til at studere den rolle hypoxi i endokardieangiogenese ved at inkubere kulturer i hypoxiske eller normoxiske forhold. Disse er vanskelige eksperimenter at udføre in vivo, fordi det kræver en gravid mus, der skal placeres i en kontrolleret hypoxisk kammer. Fra vores egen erfaring er det meget udfordrende at opnå ensartede og pålidelige resultater fra in vivo eksperimenter. Sammenfattende giver vores in vitro-model af koronar angiogenese et pålideligt system til at afhøre en bred vifte af spørgsmål vedrørende den cellulære og molekylære biologi af koronar angiogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne takker medlemmerne af Sharma laboratorium for at give en støttende forskning miljø. Vi vil gerne rette en særlig tak til Diane (Dee) R. Hoffman, der vedligeholder og bekymrer sig om vores musekoloni. Vi vil også gerne takke Drs. Philip J. Smaldino og Carolyn Vann for grundigt korrekturlæsning af manuskriptet og give nyttige kommentarer. Dette arbejde blev støttet af midler fra Ball State University Provost Office og Institut for Biologi til BS, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant midler til BS, og NIH (RO1-HL128503) og The New York Stem Cell Foundation midler til KK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
| 24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
| Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
| Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
| Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
| CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
| Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
| ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
| Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
| Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |
References
- Red-Horse, K., et al. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).
- Volz, K. S., et al. Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle. Elife. 4, (2015).
- Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).
- Chang, A. H., et al. DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis. Genes and Development. , (2017).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).
- Das, S., Red-Horse, K. Cellular plasticity in cardiovascular development and disease. Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).
- Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways. Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).
- Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).
- Ruhrberg, C., et al. Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis. Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).
- Kikuchi, R., et al. An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease. Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).
- Folkman, J., et al. Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis. Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).
- Ferrara, N. The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis. Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).
- Ferrara, N., Bunting, S. Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).
- Sharma, B., et al. Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts. Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).
- Rhee, S., et al. Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease. Nature Communications. 9 (1), 368 (2018).
