In Vivo Augmentation der Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Die entzündliche Darmerkrankung (IBD) ist eine entzündliche chronische Erkrankung im Magen-Darm-Trakt (GUT). In den Vereinigten Staaten gibt es etwa 1,4 Millionen IBD-Patienten. Es ist allgemein anerkannt, dass eine dysregulierte Immunantwort auf Darmbakterien die Krankheit auslöst und die Schleimhautepithelbarriere^1,2stört. Aus diesem Grund hemmen derzeit verfügbare, von der US Food and Drug Administration (FDA) zugelassene Medikamente die Funktionen von Entzündungsmediatoren oder blockieren die Homing von Immunzellen in den Darm. Die entzündungshemmenden Mediatoren und Immunzellen, die gezielt sind, sind jedoch auch für die Immunabwehr notwendig. Infolgedessen gefährden die Entzündungsmediatoren die systemische Immunabwehr und die Immunzellen-Homing-Blocker schwächen die Darmimmunabwehr, die beide zu schwerwiegenden Folgen führen können^3,4. Darüber hinaus können die Immunzellen-Homing-Blocker auch das Homing von regulatorischen T (Treg)-Zellen in den Darm blockieren und damit die bereits beeinträchtigte Darmimmuntoleranz bei IBD-Patienten verschlechtern. Darüber hinaus kann die Blockierung der Treg-Zelle, die in den Darm einfließt, auch zu einer systemischen Immunsuppression aufgrund der Ansammlung von Treg-Zellen im Blut führen⁵. Schließlich funktionieren Inhibitoren und Blocker vorübergehend und erfordern daher häufige Verabreichungen. Häufige Verabreichung dieser Inhibitoren und Blocker können die unerwünschten Nebenwirkungen weiter verschlimmern.

Kürzlich haben wir eine neue Strategie vorgeschlagen, die potenziell die Nebenwirkungen imZusammenhang mit aktuellen Medikamenten für die IBD-Behandlung 6 mildern oder sogar beseitigen kann. Diese Strategie verstärkt die Induktion von Darm-Homing-Treg-Zellen in peripheren Lymphgeweben⁶. Die Begründung dieser Strategie ist, dass Darm-Homing Treg Zellen speziell Heimat des Darms und wird daher nicht die systemische Immunabwehr gefährden. Da Treg-Zellen potenziell Gedächtnis^bildenkönnen 7^,8, Darm-Homing-Treg-Zellen können potenziell eine stabile Kontrolle der chronischen Darmentzündung bei IBD-Patienten bieten und damit sollte die Behandlung nicht so häufig verabreicht werden müssen. Da diese Strategie die Induktion von Darmhoming-Treg-Zellen in vivo verstärkt, hat sie nicht die Sorge der In-vivo-Instabilität in einer hochgradig proinflammatorischen Umgebung, die mit dem Adoptivtransfer von in vitro erzeugten Treg-Zellen^9,10verbunden ist. In dieser Hinsicht sind in vitro erzeugte Treg-Zellen eine der vorgeschlagenen Strategien zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen^11,12,13 und Transplantatabstoßung^14,15. Schließlich werden in dieser Strategie dendritische Zellen (DCs) entwickelt, um lokal hohe Konzentrationen von zwei Molekülen de novo zu produzieren: aktives Vitamin D (1,25-Dihydroxyvitamin D oder 1,25[OH]₂D) und aktives Vitamin A (Retinoinsäure oder RA). Wir haben uns für 1,25(OH)₂D und RA entschieden, weil 1,25(OH)₂D die Expression von regulatorischen Molekülen induzieren kann (z.B. Gabelstapler p3 [foxp3] und Interleukin-10 [IL-10])^16,17 und dass RA die Expression von Darmhoming-Rezeptoren in T-Zellen stimulieren kann¹⁸. Da sowohl 1,25(OH)₂D als auch RA auch DCs^28,29tolerisieren können, gehen wir davon aus, dass die konstruierten DCs stabil in einem tolerogenen Status in vivo gehalten werden und damit die In-vivo-Instabilitätsbedenken umgehen, die mit in vitro erzeugten tolerogenen DCs (TolDCs)^19,20,21verbunden sind. In dieser Hinsicht sind TolDCs auch eine der vorgeschlagenen Strategien für die In-vivo-Augmentation der Treg-Zellfunktionen^19,20,21. Um unsere Argumentation zu unterstützen, haben wir gezeigt, dass die entwickelten DCs, nach in vivo Lieferung, die Induktion von Darm-homing Treg-Zellen in peripheren^lymphoidenGeweben 6 erhöhen können.

Ein weiterer Vorteil unserer vorgeschlagenen Strategie ist, dass 1,25(OH)₂D auch andere Funktionen hat, die IBD-Patienten potenziell zugute kommen können. Zu diesen anderen Funktionen gehört die Fähigkeit von 1,25(OH)₂D, die Sekretion antimikrobieller Mittel zu stimulieren²² und die Karzinogenese²³zu unterdrücken. Infektionen und Krebserkrankungen werden häufig mit IBD^24,25assoziiert.

Um die DCs zu erzeugen, die lokal hohe Konzentrationen von 1,25(OH)₂D und RA de novo erzeugen können, verwenden wir einen lentiviralen Vektor, um DCs zu entwickeln, um zwei Gene zu überexprimieren. Ein Gen ist das Cytochrom P450-Unterfamilie 27-Unterfamilie B-Mitglied 1 (CYP27B1), das 25-Hydroxyvitamin D 1-Hydroxylase (1-Hydroxylase) kodiert, das physiologisch die Synthese von 1,25(OH)₂D katalysiert. Das andere Gen ist die Aldehyddehydrogenase 1 Familienmitglied A2 (ALDH1a2), die Retinaldehyddehydrogenase 2 (RALDH2) kodiert, die physiologisch die Synthese von RA⁶katalysiert.

Da die In-vivo-Augmentation der Darmhoming-Treg-Zellinduktion für die Behandlung von IBD potenziell wichtig ist, werden wir im folgenden Protokoll die Verfahren zur Erzeugung der 1-Hydroxylase-RALDH2-overexzierenden DCs (DC-CYP-ALDH-Zellen) kann für die zukünftige Untersuchung von Darm-Homing-Treg-Zellen in vivo verwendet werden.

Alle In-vivo-Tierstudienprotokolle wurden vom Loma Linda University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) sowie dem Animal Care and Use Review Office (ACURO) der US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC) des Verteidigungsministerium.

1. Herstellung des Lentivirus, das sowohl 1-Hydroxylase als auch RALDH2 (Lenti-CYP-ALDH-Virus) ausdrückt

1. Tag 0: Am frühen Morgen 5 x 10⁵ Zellen/ml von 293T Zellen im CM-10-D-Zellkulturmedium vorbereiten.
2. Samen 20 ml/Platte in 150 mm x 25 mm Kulturgerichte. Kultur die Zellen bei 37 °C und 5%_CO2 für 24 h. Konfluenz erreicht 80–90% nach 24 h.
3. Tag 1: Machen Sie 2x HBS (50 mM HEPES, 280 mM NaCl und 1,5 mM Na₂HPO₄, pH 7.1). Aliquot und lagern bei -20 °C.
4. 2 M CaCl₂ machen und bei Raumtemperatur lagern.
5. Für jede Kulturschale von 150 mm x 25 mm eine DNA-Fällungsmischung in einem sterilen 50 ml Kulturrohr zubereiten. Fügen Sie zunächst 1.620 l 2x HBS, 9,5 g PMD2G (VSVG), 17,5 g pCMVR8,74 (Capsid), 27 g Lenti-CYP-ALDH-Plasmid (ein Lentiviral-Vektor, der sowohl CYP27B1 als auch ALDH1a2 trägt) hinzu. Zweitens fügen Sie H₂O zu einem Endvolumen von 3.037,5 l hinzu.
6. In der letzten, fügen Sie 202,5 l von 2 M CaCl₂ tropfenweise beim Mischen der Lösung auf enddauernde Konzentrationen von 1x HBS und 125 mM CaCl₂. CaCl₂ muss der letzte sein, der hinzugefügt wird. Lassen Sie die Transfektionsmischungen bei Raumtemperatur 20 min bei gelegentlichem Mischen. Für mehrere 150 mm x 25 mm Kulturgerichte entsprechend skalieren.
7. Fügen Sie die 3.240 l DNA-Fällungsmischung tropfenweise zu einer 150 mm x 25 mm Kulturschale hinzu, die die 293T-Zellen enthält. Wirbeln Sie die Kulturschale vorsichtig nebeneinander, während Sie die DNA-Fällungsmischung hinzufügen. Inkubieren Sie die Schale bei 37 °C und 5% CO₂ für 24 h.
8. Tag 2: Entfernen Sie die Calciumphosphat-Transfektionslösung, waschen Sie vorsichtig mit 1x PBS und speisen Sie die Zellkultur mit CM-4-D-Zellkulturmedium wieder ein. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5%_CO2 für 24 h.
9. Tag 3: Die Überstande in sterilen Lagerflaschen ernten und bei 4–8 °C lagern. Füllen Sie die Zellkultur mit einem frischen CM-4-D-Zellkulturmedium auf. Die Zellen bei 37 °C und 5%_CO2 für weitere 24 h skulturen.
10. Tag 4: Ernte die Überstande in sterile Lagerflaschen. Filtern Sie die Überräube ab Tag 3 und Tag 4 durch einen 0,45 m Filter. Um das VSVG-Pseudotypvirus zu konzentrieren, übertragen Sie die Überwälten in Zentrifugenröhren und drehen Sie bei 4.780 x g für 24 h bei 4 °C.
11. Tag 5: Gießen Sie die Überräube von den Pellets (das Pellet ist oft sichtbar) und lassen Sie die Rohre auf einem Papiertuch in einem sterilen Biosicherheitsschrank für mehrere Minuten abfließen.
12. Die Pellets durch Pipettieren mit sterilem PBS mit 5 % Glycerin wieder aufhängen. Das Volumen für die Resuspension beträgt 33,3 l pro 150 mm x 25 mm Kulturschale.
13. Aliquot 200 l/Tube und lagern bei -80 °C. Machen Sie ein separates Aliquot von 50 l/Fläfürstigkeitszwecke. Titer sollten im Bereich von 10⁸–10⁹ Messeinheiten (TUs)/ml liegen.
14. Bleichmittel in die Kulturgerichte geben und entsorgen.
    HINWEIS: Diese transfizierten Zellen sind das größte Sicherheitsproblem im Protokoll, da alle lentiviralen Elemente in den Zellen exprimiert werden.

2. Erzeugung von Knochenmark-abgeleiteten DCs (BMDCs)

1. Ernte Tibias und Oberschenkelknochen von 4–5 Balb/c Mäusen in ein 50 ml steriles Polypropylenrohr, das das Kulturmedium⁶enthält.
2. Übertragen Sie die Tibias und Oberschenkel in ein 100 mm x 20 mm Kulturgericht, das das Kulturmedium enthält. Entfernen Sie Gewebe wie Muskeln von den Tibias und Oberschenkelknochen mit sezierender Schere und Zange.
3. Schneiden Sie beide Enden der Tibias und Oberschenkelknochen, um die Knochenmarkhöhle freizulegen.
4. Zeichnen Sie 10 ml Kulturmedium in einer 10 ml Spritze, die an einer 30 G Nadel befestigt ist.
5. Setzen Sie die Nadel vorsichtig in die Knochenmarkhöhle ein und spülen Sie das Knochenmark in ein sauberes 50 ml steriles Polypropylenrohr. Wiederholen Sie diesen Vorgang bei Bedarf, um sicherzustellen, dass das Knochenmark vollständig ausgespült wurde.
6. Pellet die Knochenmarkzellen durch Zentrifugation (400 x g) bei 2–8 °C für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand.
7. Das Pellet mit 5 ml 1x rotem Blutzelllysepuffer wieder aufhängen.
8. Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 4-5 min mit gelegentlichem Schütteln.
9. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 30 ml Kulturmedium hinzufügen.
10. Pellet die Zellen durch Zentrifugation (400 x g) bei 2–8 °C für 5 min. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml CM-10-R Zellkulturmedium. Bei Bedarf können die Zellen durch ein 40-m-Zellsieb geleitet werden, um Schmutz zu entfernen.
11. Führen Sie eine Zellanzahl aus, und passen Sie die Zellen mithilfe des CM-10-R-Zellkulturmediums auf 1 x 10⁶ Zellen/ml an.
12. Fügen Sie rekombinanten murinen Granulozyten/Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF, Endkonzentration = 100 U/ml) und murines Interleukin-4 (IL-4, Endkonzentration = 10 U/ml) hinzu.
    HINWEIS: Die Lagerlösungen von GM-CSF und IL-4 werden bei -80 °C bei 100.000 U/ml (1.000x) bzw. 10.000 U/ml (1.000x) gelagert.
13. Verteilen Sie die Zellen in 6 Brunnenkulturplatten bei 4 ml/Well und kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5%_CO2 für 48 h.
14. Entfernen Sie nicht haftende Zellen mit sanfter Pipettierung.
15. Fügen Sie frisches CM-10-R-Zellkulturmedium hinzu, das das GM-CSF (100 U/ml) und IL-4 (10 U/mL) enthält. Kultur die Zellen für weitere 48 h.
16. Ernte nicht haftende Zellen (BMDCs) zur Transduktion durch das lenti-CYP-ALDH-Virus.

3. Transduktion von DCs mit lenti-CYP-ALDH Virus zur Erzeugung von DC-CYP-ALDH-Zellen

1. Bereiten Sie 1 x 10⁶ DCs/Well in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml CM-10-R-Zellkulturmedium vor, das 50 l Virus und 8 g/ml Protamin in einer 6-Well-Kulturplatte enthält.
2. Kultur der Zellen bei 37 °C und 5%_CO2 für 24 h.
3. Ersetzen Sie das Medium durch frisches CM-10-R-Zellkulturmedium und kulturieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5%_CO2 für weitere 24 h. Zu diesem Zeitpunkt können die enzymatischen Aktivitäten von 1-Hydroxylase und RALDH2 ausgewertet werden (siehe Schritt 4). Wiederholen Sie ggf. die Schritte 3.1–3.3 für eine zweite Transduktion.
4. Fügen Sie Lipopolysaccharid (100 ng/ml) hinzu und kultiieren Sie die Zellen für 24 h.
5. Ernte der Zellen (DC-CYP-ALDH-Zellen) für Experimente.

4. Auswertung der überexprimierten 1-Hydroxylase und RALDH2 in DC-CYP-ALDH-Zellen

1. Auswertung der überexprimten 1-Hydroxylase in DC-CYP-ALDH-Zellen
   1. Samen 1,0 x 10⁶ DC-CYP-ALDH-Zellen/gut in 2 ml CM-10-R-Zellkulturmedium in 12 Brunnenkulturplatten.
   2. Fügen Sie 25(OH)D zur Endkonzentration von 2,5 m hinzu. Inkubieren Sie die DC-CYP-ALDH-Zellen für 24 h.
   3. Die Überräube ernten und bei -20 °C lagern.
   4. Assay für 1,25(OH)₂D Konzentrationen in den Überstandunterhaltsmitteln mit einem handelsüblichen Radioimmunoassay (RIA) (siehe Tabelle der Materialien).
   5. Bestimmen Sie die Expression von 1-Hydroxylase in DC-CYP-ALDH-Zellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) mit einem Anti-CYP27B1-Antikörper.
2. Auswertung der überexprimtralen RALDH2 in DC-CYP-ALDH-Zellen
   HINWEIS: Die Expression und Aktivität des überexprimierenden RALDH2 wird mit einem kommerziellen Aldehyddehydrogenase (ALDH)-Detektionskit bestimmt (siehe Materialtabelle).
   1. Samen 1 ml DC-CYP-ALDH oder Kontrollzellen (1 x 10⁵ Zellen/ml im Testpuffer) in je zwei 5 ml-Röhren (eine mit der Bezeichnung "Control" und die andere mit der Bezeichnung "Test") bezeichnet.
   2. In jedem der Steuerröhrchen 10 l Diethylaminobenzaldehyd (DEAB)-Lösung (1,5 mM in 95% Ethanol) hinzufügen und sofort mischen. DEAB ist ein RALDH2-Hemmer.
   3. Fügen Sie den Kontroll- und Reagenzröhrchen 5 l aktiviertes RALDH-Fluoreszenzsubstrat (300 m) hinzu und mischen Sie sie sofort.
   4. Inkubieren Sie die Rohre für 45 min.
   5. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 400 x g bei 2–8 °C für 5 min. Aspirieren Sie die Überwälten.
   6. Rekonstituieren Sie die Zellen in 200 L Assaypuffer.
   7. Halten Sie die Zellen auf Eis und gehen Sie für die Analyse durch FACS.

DC-CYP-ALDH-Zellen exprimiert signifikant erhöhte Menge an 1-Hydroxylase. Um festzustellen, ob DC-CYP-ALDH-Zellen, die aus BMDCs erzeugt wurden, eine signifikant erhöhte Menge an 1-Hydroxylase exprimierten, wurden BMDCs mit dem Lenti-CYP-ALDH-Virus zur Herstellung von knochen-marrow-abgeleiteten DC-CYP-ALDH-Zellen (BMDC-CYP-ALDH-Zellen) transduziert. Anschließend wurden die BMDC-CYP-ALDH-Zellen auf die Expression von 1-Hydroxylase durch FACS untersucht. Unsere Daten zeigten, dass die BMDC-CYP-ALDH-Zellen im Vergleich zu den elterlichen BMDCs eine verbesserte Expression der 1-Hydroxylase zeigten (Abbildung 1A). Wir haben auch die enzymatische Aktivität der 1-Hydroxylase in den BMDC-CYP-ALDH-Zellen bestimmt. Dazu wurden 1,0 x 106 BMDC-CYP-ALDH-Zellen in 2 ml CM-10-R-Zellkulturmedium in 12 Brunnenkulturplatten eingebracht. 25(OH)D wurde dann der Zellkultur bei der Endkonzentration von 2,5 m zugesetzt. Die Zellen wurden bei 37 °C und 5%CO2 für 24 h kultiviert und die Überräube wurden für die Messung von 1,25(OH)2D mittels eines Radioimmunoassays (RIA) geerntet. Unsere Daten zeigten, dass 1,25(OH)2D-Konzentrationen in den Kulturüberstanddern der BMDC-CYP-Zellen (BMDCs mit lenti-CYP-GFP-Virus transduziert) und der BMDC-CYP-ALDH-Zellen jeweils etwa 20-fach höher waren als die der elterlichen BMDCs und der BMDC-ALDH-Zellen (BMDCs, die mit lenti-ALDH-Virus transduziert wurden)(Abbildung 1B).

DC-CYP-ALDH-Zellen exprimiert signifikant erhöhte Menge an RALDH2. Um festzustellen, ob BMDC-CYP-ALDH-Zellen eine signifikant erhöhte Menge an RALDH2 exprimieren, wurde den Zellkulturen in Gegenwart oder Abwesenheit des RALDH2-Inhibitors Diethylaminobenzaldehyd (DEAB) (15 M) ein RALDH2-Substrat zugesetzt. Das in den Zellen zurückgehaltene fluoreszierende Produkt wurde von FACS analysiert. Unsere Daten zeigten, dass die mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFIs) der BMDC-CYP-ALDH-Zellen etwa 6-x höher waren als die der elterlichen BMDCs, was darauf hindeutet, dass die BMDC-CYP-ALDH-Zellen im Vergleich zu den elterlichen BMDCs eine signifikant verbesserte ralDH2-enzymatische Aktivität ausdrückten (Abbildung 2A,B).

DC-CYP-ALDH-Zellen verstärkten die Induktion von foxp3+CCR9+ Darm-Homing-Treg-Zellen in vitro. Um zu untersuchen, ob DC-CYP-ALDH-Zellen in der Lage waren, die Induktion von Darm-Homing-Treg-Zellen in vitro zu verstärken, transduzierten wir DC2.4-Zellen (eine Knochenmark-abgeleitete DC-Linie26,27,28,29), mit lenti-CYP-ALDH-Virus und erzeugten DC2.4-CYP-ALDH-Zellen. Anschließend stellten wir fest, ob die DC2.4-CYP-ALDH-Zellen in der Lage waren, die Induktion von Darmhoming Treg-Zellen in vitro zu verstärken. Dementsprechend wurden naive CD4+ T-Zellen von C57BL/6-Mäusen gereinigt. Gereinigte naive CD4+ T-Zellen bei 5 x 105 Zellen/Well wurden dann entweder mit den elternförmigen DC2.4-Zellen (1 x 105 Zellen/Well) oder den DC2.4-CYP-ALDH-Zellen (1 x 105 Zellen/Well) in 24 Brunnenkulturplatten in einem serumfreien Medium in Gegenwart eines monoklonalen Anti-CD3-Antikörpers (5 g/ml) und rekombinantem humanem IL-2 (50 U/ml). Darüber hinaus wurden 25(OH)D und Retinol in verschiedenen Konzentrationen in die Kulturen aufgenommen. Die Zellen wurden bei 37 °C und 5%CO2inkubiert. Fünf Tage später wurden die Zellen von FACS auf die Ausdrücke von Foxp3 und c-c Chemokin-Rezeptor Typ 9 (CCR9) analysiert. Unsere Daten zeigten, dass die DC2.4-Zellen in Gegenwart der Substrate die Häufigkeit von Foxp3+CCR9+ Zellen in den CD4+ T-Zellpopulationen nicht signifikant veränderten (Abbildung 3A,B). Im Gegensatz dazu haben die DC2.4-CYP-ALDH-Zellen die Häufigkeit von Foxp3+CCR9+ Zellen unter CD4+ T-Zellen signifikant verbessert. Darüber hinaus, je mehr 25(OH)D hinzugefügt, desto größer die Fähigkeit der DC2.4-CYP-ALDH-Zellen, die Fülle von foxp3+CCR9+ Zellen unter CD4+ T-Zellen zu erhöhen. Daher unterstützen unsere Daten, dass die DC-CYP-ALDH-Zellen die Induktion von Darmhoming Treg-Zellen in vitro verstärken können.

DC-CYP-ALDH-Zellen ergänzten die Induktion von foxp3+CCR9+ Darm-Homing-Treg-Zellen in vivo. Um festzustellen, ob DC-CYP-ALDH-Zellen die Induktion von Darm-Homing-Treg-Zellen in vivo verstärken könnten, verabreichten wir eine der folgenden Zellen intraperitoneal in Balb/c-Mäuse: die elterlichen DC2.4-Zellen, die DC2.4-CYP-Zellen (DC2.4-Zellen, die mit dem lenti-CYP-GFP-Virus transduziert wurden) und die DC-2.4-CYP-ALDH-Zellen. Vier Tage nach der Zellverabreichung wurden mesenterische Lymphknoten von FACS untersucht (Abbildung 4A). Unsere Daten zeigten, dass die DC2.4-CYP-ALDH-Zellen im Vergleich zu den Kontrollen die Häufigkeit von Foxp3+CCR9+ Zellen unter CD3+ T-Zellen signifikant erhöht haben (Abbildung 4B,C). Basierend auf diesen Ergebnissen kommen wir zu dem Schluss, dass die DC-CYP-ALDH-Zelladministration die Induktion von Foxp3+CCR9+ T-Zellen in peripheren Lymphgeweben signifikant erhöht.

Abbildung 1: DC-CYP-ALDH-Zellen exprimieren signifikant erhöhte Menge an 1-Hydroxylase. (A) BMDC-CYP-ALDH-Zellen wurden von FACS erzeugt und analysiert. Ein repräsentatives FACS-Diagramm zeigt die Expression von 1-Hydroxylase in den elterlichen BMDCs und den BMDC-CYP-ALDH-Zellen (auf lebenden Zellen abgegrenzt). (B) 1-Hydroxylase-Substrat (d. h. 25(OH)D) wurde den DC-Kulturen zugesetzt. 24 H später wurden die Überstande gesammelt und 1,25(OH)2D Konzentrationen gemessen. Die Daten zeigen Konzentrationen von 1,25(OH)2D in den Kulturen der elterlichen BMDCs, der BMDC-CYP-Zellen, der BMDC-ALDH-Zellen und der BMDC-CYP-ALDH-Zellen. **p < 0,01. ANOVA-Test. n = 4. Diese Figur ist von Xu et al.6adaptiert. Copyright 2019. Die American Association of Immunologist, Inc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: DC-CYP-ALDH-Zellen exprimieren signifikant erhöhte Menge an RALDH2. (A) BMDC-CYP-ALDH-Zellen wurden wie im Protokoll beschrieben erzeugt und analysiert. Repräsentativ überlagerte FACS-Plots zeigen die BODIPY-Aminoacetatfluoreszenz in den BMDCs und den BMDC-CYP-ALDH-Zellen in Gegenwart (+DEAB) oder Abwesenheit (-DEAB) des RALHD2-Inhibitors Diethylaminobenzaldehyd (DEAB). (B) Mittlere Fluoreszenzintensitäten (MFI) von BODIPY-Aminoacetat in den BMDCs und den BMDC-CYP-ALDH-Zellen in Abwesenheit von DEAB. *p < 0,05; t-Test; n = 4. Diese Figur ist von Xu et al.6adaptiert. Copyright 2019. Die American Association of Immunologist, Inc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: DC-CYP-ALDH-Zellen verstärkten die Induktion von foxp3+CCR9+ Darm-Homing-Treg-Zellen in vitro. (A) CD4+ naive T-Zellen wurden aus C57BL/6 Mausmilen isoliert. Die CD4+ T-Zellen wurden dann in Kulturen durch ein Anti-CD3 mAb (5 g/ml) in Gegenwart entweder der elterlichen DC2.4-Zellen oder der DC2.4-CYP-ALDH-Zellen aktiviert. Zusätzlich wurden die Kulturen mit den angegebenen Konzentrationen von 25(OH)D und Retinol hinzugefügt. Fünf Tage später wurden die Zellen von FACS für die Ausdrücke von Foxp3 und CCR9 in CD3+CD4+ T Zellpopulation gesammelt und analysiert. Repräsentative FACS-Plots zeigen die Ausdrücke von foxp3 und CCR9 in den CD3+CD4+ T-Zellpopulationen. (B) Kumulierte Daten aus (A). *p < 0,05; ANOVA-Test; n = 4. Diese Figur ist von Xu et al.6adaptiert. Copyright 2019. Die American Association of Immunologist, Inc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: DC-CYP-ALDH-Zellen verstärkten die Induktion von foxp3+CCR9+ Darm-Homing-Treg-Zellen in vivo. (A) Balb/c-Mäuse intraperitoneal (i.p.) erhielten eine der folgenden DC-Übertragungen (Transfer): keine DC-Übertragung (keine Übertragung), elterliche DC2.4-Zellen, DC2.4-CYP-Zellen und DC2.4-CYP-ALDH-Zellen. Vier Tage später wurden mesenterische Lymphknoten (MLNs) von FACS analysiert. (B) Repräsentative FACS-Plots zeigen die Ausdrücke von foxp3 und CCR9 in cd3+ T Zellpopulation. (C) Die kumulativen Daten aus (B) zeigen den Prozentsatz der Foxp3+CCR9+ Zellen in der CD3+ T-Zellpopulation. Für alle Analysen wurden Zellen auf CD3+ T-Zellen abgegrenzt. Gegebenenfalls handelt es sich bei den dargestellten Daten um Mittel , die SEM. *p < 0,05; ANOVA-Test; n = 4–6. Diese Figur ist von Xu et al.6adaptiert. Copyright 2019. Die American Association of Immunologist, Inc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Drs. Xiaolei Tang und David J. Baylink sind Erfinder eines anhängigen Patents im Zusammenhang mit dieser Studie.