Summary
우리는 뮤린 대뇌 골혈구의 추출을위한 프로토콜을 제시한다. 항생제 없는 농축 지향 pericyte 추출에 따라, 이 프로토콜은 높은 순도와 높은 수율을 제공 하는 생체 외에서 연구에 대 한 귀중 한 도구, 따라서 사용 하는 실험 동물의 수를 감소.
Abstract
최근 몇 년 동안, 대뇌 후혈구는 혈관 생물학 및 병리학에서 광범위한 연구의 초점이되었습니다. 혈액 뇌 장벽 형성 및 생리학에 있는 pericytes의 중요성은 지금 설명됩니다 그러나 그것의 분자 기초는 크게 알려지지 않은 남아 있습니다. 신경 장애에서 대뇌 주구의 병리생리학적 역할이 흥미롭고 매우 중요하기 때문에 시험관 내 모델은 충분히 적절할 뿐만 아니라 이러한 연구에 다른 기술을 통합할 수 있습니다. 높은 출력을 가진 항생제 없는 프로토콜이 바람직하지만, 대뇌 후핵구의 추출을 위한 시험관내 모델로서 몇몇 방법이 제안되었다. 가장 중요한 것은 추출당 출력이 증가하여 더 많은 동물의 사용을 감소시킨다는 것입니다.
여기에서는 충분히 높은 출력으로 대뇌 중구를 추출하기위한 간단하고 효율적인 방법을 제안합니다. 마우스 뇌 조직 균질화는 조직 파편 및 미세 혈관 펠릿의 분리를 위한 BSA-dextran 용액과 혼합된다. 우리는 미세 용기 풍부한 여과액을 얻기 위해 여과 에 이어 3 단계 분리를 제안한다. 이 방법을 사용하면, 10개의 마우스로부터 수득된 미세혈관 단편의 양은 6웰 플레이트의 9웰(9.6cm2 각)을 시드하기에 충분하다. 가장 흥미롭게도 이 프로토콜을 통해 사용자는 2절기에서 27개의 상구량 리치 웰(9.6cm2 각)을 얻을 수 있다. PERICYTE 배양의 순도는 고전적인 pericyte 마커의 발현으로 확인된다: NG2, PDGFR-β 및 CD146. 이 방법은 pericytes에 생리학 및 병리생리학 연구를 위한 능률적이고 실행 가능한 시험관 내 공구를 보여줍니다.
Introduction
대뇌 후혈구는 뇌 뇌 장벽(BBB), 신경교 세포, 세포외 매트릭스 및 뉴런의 대뇌 내피 세포를 가진 기능적 단위를 포함하는 신경혈관 단위(NVU)의 필수 구성 요소이다. Pericytes는 중추 신경계의 조절 기능에 있는 중요한 부분입니다 (CNS) 그들은 분자와 세포 정보의 교환을 위한 인터페이스의 한으로 봉사하기 때문에.
대뇌 후혈구는 뇌 미세 혈관의 abluminal 측에 내장되어 있으며,1을 확립하고2 BBB 생리학을 유지하는 데 필수적입니다. 최근 몇 가지 연구는 혈관 신생3 및 혈관 성숙4,내피 형태 형성 5 및 생존6, 뇌콜레스테롤 대사를 제어하는 뇌 성 구체의 역할을 강조했다7. 중요한 것은, 이러한 과정의 dysregulation는 신경 퇴행성 질환의 병인학적 특징이다.
실제로, pericytes는 몇몇 신경학상 질병의 진행에 대하여 일반적인 BBB 기능 그리고 그것의 보호를 위한 기능적인 필수품입니다. 퇴화 생리학 및 충혈의 상실은알츠하이머병8의 진행에 있어 공통분모이며, 백색물질 기능 장애9,다발성 경화증10,패혈증11,급성기 허혈성 뇌졸중12 및 기타 신경 질환이다. Pericytes는 또한 종양 전이13에서중요한 역할을 합니다. 흥미롭게도, pericytes는 또한 신경 외상 및 무질서 후에 구조적인 역할을 전시하기 위하여 보였습니다: 뇌에 있는 remyelination에서1,허혈성 치기, 척수 상해14 및 혈관 신생을 승진시키는15. 신경 외상 및 장애의 병리생리학적 증상을 강화하는 pericytes의 감수성은 그들에게 잠재적 인 치료 대상16을만든다.
BBB에 있는 pericytes의 시험관 내 연구 모형은 광대한 연구 결과를 실행하기 위하여 중요한 공구입니다. 이러한 모델은 BBB 등의 작업 모델을 대표하여 보다 정교한 연구를 위한 플랫폼을 제공합니다. 예를 들면, 이 모형은 NVU의 그밖 세포 모형 중 pericytes 내의 세포 생리학을 이해하기 위하여 이용될 수 있습니다. 또한, 시험관 내 모델은 pericytes에 새로운 약과 분자의 약리학적인 영향을 시험하기위한 직접 조사 도구입니다. 이 모형은 또한 신경장애와 관련하여 pericytes의 병리생리학적 역할을 이해하는 것을 이용될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 시험관 내 모델의 개발은 실험의 자유를 가능하게하기 위해 증가 된 출력을 필요로한다. 이러한 모델은 쉽고 빠르며 사용되는 실험 동물의 수를 줄여야합니다. 또한, 이러한 모델을 이중 및 삼중 세포 배양 모델로 개발하는 능력이 바람직하다.
개발된 많은 프로토콜이 있습니다. Tigges et al.17,첸 외18,톰슨 외19,야마자키 외20,크라우치와 Doetsch21에 의해 제안 된 프로토콜은 필수품의 대부분을 만족시키는 훌륭한 접근 방식입니다. 이러한 모든 방법은 효과적인 결과를 산출하지만, 많은 수의 실험 동물에 대한 의존성은 이러한 프로토콜에 대한 공통 분모로 남아 있다. 따라서 가능한 한 효율을 극대화하여 pericytes를 분리하고 정화 할 수있는 고출력 방법을 개발하는 것이 필수적입니다. 이 프로토콜에서, 제2 항계 후 얻어진 세포의 순도는 여러 pericytes 마커로 검증된다. 혈소판 유래 성장 인자 수용체-β(PDGFR-β)를, 이는후구체(17)의고전 마커로서 사용되고, NG2(뉴런-신경교항원 2)는 후혈구 매개 혈관형태형성(22)과 혈관형성의마커이다. 우리는 또한 분화(146)의 클러스터를 확인하였으며, 이는17,18, 18에서발현된 분자 중 하나로 보고되었다.
여기서, 우리는 높은 출력을 가진 전술한 모든 요구 사항을 만족시킬 마우스 (야생 형 또는 형질전환)로부터 1 차 pericytes의 추출을 위한 프로토콜을 제시한다. 우리는 1 차적인 대뇌 pericytes를 위한 증식의 항생제와 면역 패닝 자유로운 선택 기지를 둔 방법 채택합니다, 이는 시험관 내 연구를 수행하기 위한 능률적인 모형을 증명할 것입니다.
Protocol
모든 실험은 동물 사용 및 취급에 대한 연구소의 지침에 따라 수행되었다. 프랑스 법률에 따라, 아르투아 대학의 동물 시설은 지방 당국에 의해 승인되었습니다 (참조: B62-498-5). 유럽 연합 법규(지침 2010/63/EU)에 따라 모든 절차는 현지 동물 관리 및 사용 위원회(Comité d'Ethique en Expériment animale du Nord-Pas-De-Calais, 참조: C2EA 75) 및 프랑스 연구부(참조: 2015090111512)에 의해 승인되었습니다.
1. 솔루션 준비
- 세척 버퍼 A (WBA)의 500 mL준비: 행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)에서 10 mM HEPES 솔루션을 준비하십시오. 4 °C에서 보관하십시오.
- 세척 버퍼 B (WBB)의 500 mL준비: 0.1% 소 세럼 알부민 (BSA) HBSS에서 10 mM HEPES 용액. 4 °C에서 보관하십시오.
- 실온에서 밤새 용액을 혼합하여 WBA에서 30% 덱스텐 용액300 mL을 준비합니다. 사용 전에 30 분 동안 110 °C에서 용액을 오토클레이브하십시오. 오토클레이브 후, 용액을 실온에서 2-3 시간 동안 쉬게하십시오.
- 차가운 덱스트렌 용액에 0.1% BSA 용액 100mL를 준비합니다. 3-4 분 동안 힘차게 흔들고 4 °C에서 보관하십시오.
- 20% 송아지 혈청, 2 mM 글루타민, 50 μg/mL 겐타마이신, 1% 비타민, 2% 아미노산 기저 M Eagle (BME)을 기저 DMEM 배지에 용해시켜 완전한 덜베코의 변형 된 독수리 배지 (DMEM) 배양 배지를 기징 DMEM 배지에 4 °C에 저장하십시오. 사용하기 전에 1 ng/mL 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 추가하십시오.
- pericyte 성장 보조제(pericyte media와 함께 제공)와 20% 태아 송아지 혈청(FCS)을 pericyte 배양 기저 배지에 첨가하여 완전한 pericyte 배지를 준비하고 4°C에 저장합니다.
2. 뇌 조직 회복 및 수막 제거
- 일관성을 위해 추출의 모든 배치에서 비슷한 연령과 성별의 마우스를 사용하십시오. 병원균이 없는 동물 보호소를 이용하고 물에 대한 광고 리비텀 액세스를 제공합니다. 동물의 효율성과 최소한의 사용을 보장하기 위해 조직 물질의 손실을 피하십시오.
- 안락사 C57BL/6J, 4-6주 령, 수컷 마우스 (얀비에 연구소, 르 제네스트 생아일, 프랑스).
- 신속하게 멸균 조건에서 뇌 조직을 절제, 조직에 손상을 피하십시오. 조심스럽게 차가운 인산완 충충식염 (PBS)의 40 mL에 조직을 배치합니다.
- 차가운 PBS의 뇌 조직을 페트리 접시 (100 mm x 15mm)로 옮니다.
- 뇌 조직을 멸균 된 마른 보풀이없는 닦음과 구부러진 팁 집게에 놓고 소뇌, 줄무늬 및 후두 신경을 제거하십시오.
- 면봉으로 눈에 보이는 수막을 모두 제거합니다. 뇌 조직을 거꾸로 놓고 바깥쪽 빛 스트로크를 사용하여 면봉으로 로브를 엽니다. 눈에 보이는 혈관을 모두 제거하십시오.
- 수막이 없는 뇌 조직을 15 mL의 차가운 WBB와 함께 페트리 접시(100 mm x 15mm)에 놓습니다.
3. 균질화
- 조직을 Dounce 조직 분쇄기 모르타르 튜브로 옮기고 집게로 WBB 3-4 mL를 추가합니다.
- '느슨한'배봉으로 조직을 55 번 다듬습니다. WBB로 '느슨한' 유봉을 헹굽니다. 이제 "단단한"배봉으로 슬러리를 25 번 다듬습니다.
- 슬러리를 두 개의 50 mL 튜브로 동등하게 나누고 1.5 배의 차가운 30 % BSA-dextran을 추가하고 튜브를 적극적으로 흔들어 슬러리를 혼합합니다.
4. 혈관 분획의 격리
- 튜브를 힘차게 흔들어 낸 후, 3,000 x g 및 4°C에서 25분 동안 튜브를 원심분리합니다.
- 상층부(상단 미엘린 층과 함께)를 2개의 새로운 튜브로 옮기고, 3,000 x g 및 4°C에서 25분 동안 튜브를 원심분리합니다. 차가운 WBB 3 mL을 추가하여 첫 번째 원심 분리에서 펠릿을 보존하십시오 (펠렛을 4 °C로 유지하십시오).
- 4.2 단계를 반복하고 2nd 원심분리에서 펠릿을 조심스럽게 보존하십시오.
- 4.3 단계에서 튜브에서 조직 파편으로 덱스렌과 미엘린을 버립니다. 차가운 WBB에서 펠릿을 보존하십시오.
- 4.1 단계에서 튜브 1 및 튜브 2의 내용량을 풀고 차가운 WBB로 최종 부피를 10 mL까지 구성합니다.
- 4.2단계와 4.3단계에서 튜브에 대해 이 단계를 반복합니다.
참고 : 마지막으로, 3 원심 분리에서 3 튜브가 있습니다. - 펠릿의 눈에 보이는 덩어리가 남아 있지 않은 때까지 10 mL 파이펫을 사용하여 6 위 아래 스트로크로 펠릿을 해리하십시오.
- 진공 필터 어셈블리와 나일론 메쉬 필터의 도움으로 각 튜브의 셀 현탁액을 필터링하십시오.
참고: 이 여과 단계는 메쉬 필터를 통해 더 길고 큰 용기를 제거하기 위해 중요합니다. - 평평한 팁 집게 또는 실온에서 WBB의 스크레이퍼를 통해 필터를 긁어 모세 혈관을 복구하고 다시 중단하십시오. 새로운 필터로 서스펜션을 걸터 더 많은 모세혈관을 회수합니다.
- 여과액을 2개의 튜브와 원심분리기를 1,000 x g 및 RT에서 7분 동안 균등하게 나눕니다.
참고 :이 원심 분리 단계에서 효소 용액을 준비하십시오. 사용되는 동물 수에 따라 필요한 WBB의 부피를 결정합니다(재료 표참조). DNase 1및 토실-릴-클로로메탄 염화물(TLCK) 1x를 WBB에 넣고 37°C로 미리 따뜻하게 합니다. - 효소와 미리 따뜻하게 WBB와 하나의 튜브에 단계 4.10에서 펠릿을 수집합니다. 미리 데운 1x 콜라게나제/디스파스를 추가합니다. 튜브를 37°C의 수조에 놓고 정확하게 33분 동안 놓습니다.
- 차가운 WBB 30 mL를 추가하여 효소 반응을 멈춥시다. 1,000 x g 및 RT에서 7 분 동안 현탁액을 원심 분리합니다.
- 상급자를 조심스럽게 버리고 10 mL 파이펫을 사용하여 6 개의 상하 스트로크로 WBB의 펠릿을 해리하십시오. 이 단계는 덜 엄격하고 비교적 빠릅니다.
- 1,000 x g 및 RT에서 7 분 동안 현탁액을 원심 분리합니다.
참고 : 이 단계에서, 배양 접시에서 코팅을 폐기하고 실온에서 DMEM으로 한 번 헹구십시오. RT에서 적어도 1 시간 동안 세포 배양 접시를 코팅하십시오. - 4.14단계에서 얻어진 튜브로부터 상판을 버리고, 펠렛을 새로운 완전한 DMEM 매체로 해리시키고, 세포(Day 0, P0)를 6웰 플레이트 9웰(각각 9.6cm2의 1웰)에 플레이트한다.
5. 대뇌 골수의 증식
- 멸균 인큐베이터에서 37°C 및 5%CO2에서 세포 배양을 유지한다. 배양 배지를 24시간(1일째) 도금 한 후 이물질을 조심스럽게 제거하여 교체한다. 1일 후, 48시간마다 문화 매체를 변경합니다.
- 적어도 7-8 일 동안 세포 배양을 관찰하십시오. 이 시간까지, 내피 단층의 상단에 세포 성장은 관찰 할 수 있어야합니다.
- 8-10일째에 세포를 통과(동조에 따라 다름)를 골라틴 코팅 배양판상에 1(P1)으로 통로로 배양 배지에 투과한다. 2일마다 문화 미디어를 변경합니다. 6-7 일 동안 세포를 관찰하십시오. 세포는 17일째에 2(P2)를 연속적으로 분할[필요한 경우에만 24일째에 3(P3)], 젤라틴 코팅 플레이트에서 pericyte 배지에서 성장한다.
참고 : 세포는 거의 80-90 % 동률에서 실험 / 관찰을위한 준비가되어 있어야합니다.
Representative Results
이프로토콜(그림 1)은P0에서 시드시 9웰(6웰 플레이트)을 효율적으로 산출합니다(그림 2 A(P0: 1일차)).
P0에서 P2까지, 내피 세포 (흰색 화살표로 표시) 및 pericytes (검은 색 화살표로 표시)의 점진적 증가를 관찰 할 수있는 특정 형태학적 특성이 있습니다. P0에서, 마이크로 혈관에서 발전하는 길쭉한 내피 세포는 풍부하다(그림 2A,P0 : 3 일째), 이러한 길쭉한 세포의 풍부는 P1에서 감소하고 P2에 결석. 반대로, 회세포는 P2에 풍부한 사분면 세포로나타난다(도 2A,P2: 18일째).
P2에서 pericyte 배양의 순도를 확인하기 위해, 우리는 양적 PCR(도 2B),면역 세포 화학(도 2C),및 서쪽 얼룩(그림 3)을사용하여 pericyte 마커로 NG2, CD146 및 PDGFR 베타의 발현을 확인하였다. P2에서의 Pericytes는 총 마우스 뇌(Ms Br) 추출물에서발현과 비교했을 때 CD146, NG2 및 PDGFR-β의 상부를 나타낸다. 대조군으로서, 내피 마커 옥슬러딘 및 CD31의 발현, 성상세포 마커 인 교안 섬유성 산성 단백질(GFAP) 및 마이크로글리아 마커 CD11b는 또한 P2에서 결석을 관찰하였다.
그림 1: 프로토콜의 요약입니다. 이 개요는 유리 배트 그라인더와 조직 붕괴로 시작하는 pericyte 추출을위한 중요한 단계를 나타내고 dextran 및 여과에서 3 단계 분리가 뒤따릅니다. 이 프로토콜은 33분 효소 소화 단계를 사용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 세포 형태 및 마커 발현. (A)P0, P1 및 P2 단계의 퍼니시테의 위상 대비 이미지. P0에 있는 풍부한 내피 세포는 백색 화살표에 의해 표시됩니다. 그들의 수는 P1에서 감소하고 그들은 P2에서 사라졌다. pericytes는 검은 색 화살표로 표시됩니다. (B)P1 및 마우스 뇌(Ms Br) 샘플에서 pericytes를 사용하여 P2에서 PCR에 의한 CD146, NG2 및 PDGFR-β 발현분석. (C)CD146, PDGFR-β 및, NG2의 양성 면역염색을 나타내는 P2에서의 회음구의 대표적인 이미지. 스케일 막대: 50 μm(20배 배율) 및 20μm(40배 배율). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 세포 배양의 대표적인 순도. CD146, PDGFR-β, NG2, 옥클루딘, GFAP, CD31, CD11b 및 투불린 발현을 P2 및 마우스 뇌(Ms Br) 샘플에서 의한 서방 블로팅의 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 조직 붕괴, 정제, 농축 및 효소 소화의 다른 방법의 대표적인 비교. 게시된 각 프로토콜은 각 프로토콜에 사용되는 동물 수에 대한 표시로 요약됩니다. 출력은 또한 시드 시 얻은 웰의 수에 대하여 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
대뇌 후혈구는 NVU의 필수적인 부분이며 BBB24의유도 및 유지 보수에 적극적인 역할을합니다. 유사하게, 상이한 신경 퇴행성 질환 및 혈관 병리에서 이들 세포의 역할은 흥미롭다. 따라서, 효율적인 고출력 1차 pericyte 세포 모델은 시험관 내 연구를 위한 효율적인 플랫폼을 제공할 것이다.
1차 주혈구의 격리를 위해 제안된 다양한 프로토콜들이있다(도 4). Tigges 외17 수막과 피질 조직을 포함하는 방법을 제안했다. 이 접근법은 6 마우스 (파페인 /DNase 효소로 37 °C, 70 분 소화)에서 조직을 부드럽게 하고 21 G 및 18 G 바늘을 통해 분해 단계를 수행합니다. 이 프로토콜은 6웰 플레이트의 적어도 2개의 콜라겐 I 코팅 웰을 산출하는 1단계 분리(22% BSA/PBS 용액의 원심분리)를 제안한다. 세포는 내피 세포 성장 배지(ECGM)에서 대패 3까지 유지되며, 이후 pericyte 성장 배지(PGM)에서 pericyte 증식을 촉진하도록 세포를 통과시다. 또 다른 유사한 접근법에서, Chen등. 18 37°C에서 90분 동안 콜라게나제/DNase로 멸균된 면도날 및 조직 소화로 조직을 다이싱함으로써 조직 해리를 제안했다. 세포의 1 단계 분리 (22 % BSA에서 원심 분리)에 이어, 미엘린 층을 제거하고 펠릿을 ECGM에서 두 번 세척합니다. 마이크로혈관은 1개의 웰 플레이트를 코팅한 콜라겐의 3개의 웰로 도금된다. 합류에 도달한 후, 세포는 두 번 통과되고 나중에 PGM에서 유지된다. 결국, 세포가 3의 비율로 통과되면, 우리는 프로토콜의 시작 부분에서 10 마우스를 사용하는 경우에만 6 웰 플레이트의 27 웰을 얻을 수 있습니다.
톰슨 외에서, 저자는 2 단계 효소 소화를 통해 대뇌 pericytes의 격리를건의합니다 19. 수막과 백색 물질이 제거되고 뇌 샘플이 작은 조각으로 절단됩니다. 조직 조각은 37°C에서 75분 동안 콜라게나아제/DNase I에서 첫 번째 효소 반응을 거치고, BSA 20%에서 한 단계의 분리를 이따른다. 펠릿을 37°C에서 50분 동안 콜라게나제/디스파제/DNase I에서 더 많이 수집하고 소화한다. 이 단계는 33% Percoll 구배에서 마이크로 혈관 분리에 이어 한 번 더 세척한다. 마이크로 혈관은 콜라겐 IV / 피브로넥틴 코팅 35mm 접시에 시드된다. pericytes의 확산은 10 일 동안 DMEM에서 10 % FCS 및 gentamicin 황산염에 의해 선호됩니다. 또 다른 2 단계 효소 소화 접근법에서, 야마자키 외는 차가운 DMEM20에서절제 된 조직의 다진을 제안합니다. 첫 번째 효소 반응에서, 샘플은 37 °C에서 75 분 동안 콜라게나제 / DNase I로 처리됩니다. 한 단계 원심 분리 후, 펠렛을 다시 한 번 세척하고 두 번째 효소 반응이 37 °C에서 60 분 동안 콜라게나제 / 디스파제에서 시작됩니다. 1단계 분리 후, 펠렛은 22% BSA 용액에서 재중단 및 원심분리된다. 마지막으로, 미세 혈관 펠릿은 재중단되고 6 웰 플레이트에 도금됩니다. 5 개의 마우스 뇌의 경우 6 웰 플레이트 중 1 개의 웰을 도금 할 수 있습니다. 회식기를 얻기 위해, 내피 배양은 마우스 뇌 내피 세포(mBEC) 배지 II에서 유지하면서 세 번 계관된다. 웅크리고 Doetsch20은 FACS에 의한 pericyte 정제 방법을 제안한다. 마우스 두뇌의 피질 및 심실-심실 영역에서 조직 샘플은 메스로 미세 해부되고 철저하게 다진다. 콜라게나제/디스파제 효소를 37°C에서 30분 동안 배양한 후, 소화된 조직은 22% v/v Percoll 용액으로 원심분리된 미엘린및 이물질을 분리한다. 세포 현탁액은 FACS 분석 및 분류를 위해 형광적으로 공액된 항체에서 인큐베이션됩니다. 정렬된 세포는 24개의 웰 플레이트의 콜라겐 코팅 웰로 도금된다. 그것은 하나의 피질24 웰 플레이트의 1 웰에 하나의 도금에 대한 충분한 세포를 산출하는 것이 좋습니다.
생산적이더라도 이러한 방법은 단일 배치 격리를 위한 많은 수의 동물 사용에서 매우 제한된 양의 출력에 이르기까지 몇 가지 제한사항이 있습니다.
이 제안된 프로토콜의 개발 동안, 우리는 높은 출력을 얻기에 성공했습니다: 10마리의 마우스에서 6웰 플레이트의 9웰. 이를 위해 수막 제거는 조직에서 큰 혈관을 한 단계 제거하는 것을 보장합니다. Dounce 조직 분쇄기는 두뇌와 같은 연약한 조직에 더 적합합니다. 또한 느슨한 유봉으로 샘플 감소를 보장하고, 단단한 유봉으로 균질화하고 불필요한 세포 손상을 방지합니다. 1 차적인 세포 배양 프로토콜에 있는 주요 목표의 한개는 조직의 최소한의 낭비 및 대뇌 혈관 구조의 확장한 회수입니다. 제시된 프로토콜에서, 이것은 덱스트렌-BSA 주입 조직 균질화의 반복적인 원심분리에 의해 달성된다. 3 단계 원심 분리 접근법은 조직 균질화에서 다량의 혈관을 회복하는 데 도움이됩니다. 이것은 마이크로 혈관의 3 배 향상된 복구를 제공합니다. 분리 후, 여과는 다음 필수 단계이며, 이는 넓은 혈관과 관련된 평활근 세포의 배제를 선호합니다. 다른 효소의 조합 전에 언급 한 바와 같이 효소 소화를 위해 제안되었습니다. DNase와 콜라게나제/디스파스는 세포의 덩어리를 줄이고 단일 세포를 각각 분리하는 데 사용되지만, 이러한 침습적 환경에서 세포 사멸을 방지하는 것이 매우 중요하며 TLCK에 의해 예방되어 최종 수율을 증가시킵니다. 처음에, 첫 번째 통로는 나중에 단일 층에 부착 된 pericytes의 성장을 지원하는 내피 단층을 성장시킬 수 있습니다. 1 차적인 내피 세포의 생존은 통과시 감소되기 때문에, 그것은 pericyte 검색에 대한 확률을 향상시킨다. 더욱이, 이 프로토콜은 내피 세포 오염의 회피를 보장하는 또 다른 통과를 채택합니다. P2에서 셀수가 많을수록 세포의 추가 전달에 대한 의존성이 감소한다는 점에 유의해야합니다. 또한, 그것은 평활근 세포에 의해 추월 되 고 pericyte 성장의 가능성을 감소, 훨씬 더 높은 속도로 증식.
더 높은 출력을 얻으려면 몇 가지 단계가 중요하며 온도 및 시간과 관련하여 정확하게 수행해야 합니다. BSA-dextran으로 동질조직의 혼합은 빠를 것이다. 원심 분리 단계 후에 펠릿 해리는 세포 죽음을 방지하기 위하여 빠를 것입니다. 또한 효소 소화33분은 정밀하고 주의를 기울여 이루어져야 합니다. 이 프로토콜에 대한 제한 사항 중 하나는 내피 단층이 성장하고 더 pericytes의 성장을 용이하게 할 수있는 7-8 일 기간입니다. 분명히, 마이크로 혈관의 분리는 btter이며, 단층의 성장이 빠르며, 따라서 pericytes의 수가 증가합니다. 각 추출에서 10개 미만의 마우스를 사용하여 적절한 수의 미세 혈관 분획을 보장하여 pericyte 성장을 더 이상 지원하지 않는 것이 좋습니다. 전술한 점을 주의 깊게 따르는 경우에, 대뇌 후구 배양을 위한 원하는 세포 밀도는 쉽게 달성될 수 있다.
시험관내 모델은 신경장애 동안 NVU의 다른 세포들 간의 병리생리학적 관련성 및 통신에 대한 더 많은 정보를 얻기 위한 유도체 모델의 개발을 위한 실행 가능한 플랫폼을 제공한다. 단선 된 pericytes는 이중 세포 배양 (내피 또는 신경교 세포포함) 및 삼중 세포 배양 (내피 및 신경교 세포) 모델에서 통합 될 수 있다. 이러한 모델의 개발은 여기에서 논의되지 않았습니다. 결론, 이 프로토콜은 더 높은 출력을 가진 1 차적인 세포의 격리를 위한 1개의 접근 및 대뇌 pericyte 생물학과 관련있는 시험관 내 연구를 위한 더 나은 플랫폼을 제공합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
LT와 FG는 유럽 연합 (EU) 공동 프로그램 - 신경 퇴행성 질환 연구 (JPND)의 프레임 워크에서 기관 내셔널 드 라 Recherche (ANR, ANR-15-JPWG-0010)에 의해 부여되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino acids BME | Sigma | B-6766 | Store at 4 °C. |
| Basal DMEM media | Invitrogen | 316000083 | Store at 4 °C. |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma | F-0291 | Store at -20 °C. |
| BSA | Sigma | A-8412 | Store at 4 °C. |
| Collagenase dispase | Sigma | 10269638001 | Prepare a 10x stock solution in sterile PBS-CMF. Filter the solution with a 0.22 μm syringe filter and store at -20 °C. Note: For the enzyme digestion step of the protocol, for every set of 10 mice for extraction, 300 µL of 10x collagenase dispase is required. |
| Dextran | Sigma | 31398 | |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | Prepare a 1000X stock solution by dissolving 100 mg in 10 ml sterile water and store at -20°C. |
| Gelatin | Sigma | G-2500 | Prepare the working coating by making a 0.2% gelatin solution in sterile PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). Autoclave the solution for minimum 20 minutes at 120 °C and store at room temperature. Culture dishes to be coated for at least 4 hours at 4 °C. |
| Gentamycin | Biochrom AG | A-2712 | Store at 4 °C. |
| Glutamine | Merck | I.00289 | Store at -20 °C. |
| HBSS | Sigma | H-8264 | Store at 4 °C. |
| HEPES | Sigma | H-0887 | Store at 4 °C. |
| Matrigel | BD Biocoat | 354230 | Prepare a working coating solution of Matrigel by diluting stock in cold DMEM at 1:48 ratio with its final concentration to be 85 µg/cm2. Cell culture dishes should be coated at least for 1 hour at room temperature. |
| Pericyte Medium-mouse | Sciencell research laboratories | 1231 | Store at 4 °C. |
| Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone | Sigma | T-7254 | Prepare a 1000X stock solution in WBA by dissolving 16 mg in 10.88 mL of WBA to make a 4 mM solution and store at 4 °C. |
| Vitamins | Sigma | B-6891 | Store at -20 °C. |
| Equipment Requirements | |||
| Filtration tools | Sefar, Nylon mesh, 60-micron porosity | ||
| Laboratory equipment | Swing bucket rotor centrifuge | ||
| Water bath with agitator | |||
| Laminar Flow Hood : BSL2 | |||
| Glassware (all components to be heat sterilized) | Dounce Tissue Grinder With Glass Pestle | ||
| Pestle I: 0.0035 - 0.0065 inches | |||
| Pestle II: 0.0010 - 0.0030 inches | |||
| Vacuum filter assembly with coarse porosity fritted glass filter support base | |||
| Surgical dissection tools (all components to be heat sterilized) | Forceps, scissors, Bunsen burner, cotton swabs, gauge |
References
- Azevedo, P. O., et al. Pericytes modulate myelination in the central nervous system. Journal of Cellular Physiology. 233 (8), 5523-5529 (2018).
- Hall, C. N., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
- Gianni-Barrera, R., et al. PDGF-BB regulates splitting angiogenesis in skeletal muscle by limiting VEGF-induced endothelial proliferation. Angiogenesis. 21 (4), 883-900 (2018).
- Teichert, M., et al. Pericyte-expressed Tie2 controls angiogenesis and vessel maturation. Nature Communications. 8, 16106 (2017).
- Dave, J. M., Mirabella, T., Weatherbee, S. D., Greif, D. M. Pericyte ALK5/TIMP3 Axis Contributes to Endothelial Morphogenesis in the Developing Brain. Developmental Cell. 44 (6), 665-678 (2018).
- Franco, M., Roswall, P., Cortez, E., Hanahan, D., Pietras, K. Pericytes promote endothelial cell survival through induction of autocrine VEGF-A signaling and Bcl-w expression. Blood. 118 (10), 2906-2917 (2011).
- Saint-Pol, J., et al. Brain Pericytes ABCA1 Expression Mediates Cholesterol Efflux but not Cellular Amyloid-beta Peptide Accumulation. Journal of Alzheimer's Disease. 30 (3), 489-503 (2012).
- Sagare, A. P., et al. Pericyte loss influences Alzheimer-like neurodegeneration in mice. Nature Communications. 4, 2932 (2013).
- Montagne, A., et al. Pericyte degeneration causes white matter dysfunction in the mouse central nervous system. Nature Medicine. 24 (3), 326-337 (2018).
- Claudio, L., Raine, C. S., Brosnan, C. F. Evidence of persistent blood-brain barrier abnormalities in chronic-progressive multiple sclerosis. Acta Neuropathologica. 90 (3), 228-238 (1995).
- Nishioku, T., et al. Detachment of brain pericytes from the basal lamina is involved in disruption of the blood-brain barrier caused by lipopolysaccharide-induced sepsis in mice. Cellular and Molecular Neurobiology. 29 (3), 309-316 (2009).
- Yang, S., et al. Diverse Functions and Mechanisms of Pericytes in Ischemic Stroke. Current Neuropharmacology. 15 (6), 892-905 (2017).
- Yang, Y., et al. The PDGF-BB-SOX7 axis-modulated IL-33 in pericytes and stromal cells promotes metastasis through tumour-associated macrophages. Nature Communications. 7, 11385 (2016).
- Hesp, Z. C., et al. Proliferating NG2-Cell-Dependent Angiogenesis and Scar Formation Alter Axon Growth and Functional Recovery After Spinal Cord Injury in Mice. Journal of Neuroscience. 38 (6), 1366-1382 (2018).
- Guo, P., et al. Platelet-derived growth factor-B enhances glioma angiogenesis by stimulating vascular endothelial growth factor expression in tumor endothelia and by promoting pericyte recruitment. American Journal of Pathology. 162 (4), 1083-1093 (2003).
- Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
- Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).
- Chen, J., et al. CD146 coordinates brain endothelial cell-pericyte communication for blood-brain barrier development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (36), 7622-7631 (2017).
- Thomsen, M. S., Birkelund, S., Burkhart, A., Stensballe, A., Moos, T. Synthesis and deposition of basement membrane proteins by primary brain capillary endothelial cells in a murine model of the blood-brain barrier. Journal of Neurochemistry. 140 (5), 741-754 (2017).
- Yamazaki, Y., et al. Vascular Cell Senescence Contributes to Blood-Brain Barrier Breakdown. Stroke. 47 (4), 1068-1077 (2016).
- Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
- Ozerdem, U., Grako, K. A., Dahlin-Huppe, K., Monosov, E., Stallcup, W. B. NG2 proteoglycan is expressed exclusively by mural cells during vascular morphogenesis. Developmental Dynamics. 222 (2), 218-227 (2001).
- Stallcup, W. B., You, W. K., Kucharova, K., Cejudo-Martin, P., Yotsumoto, F. NG2 Proteoglycan-Dependent Contributions of Pericytes and Macrophages to Brain Tumor Vascularization and Progression. Microcirculation. 23 (2), 122-133 (2016).
- Armulik, A., et al.
