Summary
ここでは、リボタグシステムを用いた成人男性マウス生殖細胞の選択集団からリボソームおよび関連RNAの免疫沈降について説明する。戦略的な繁殖と慎重な免疫沈降は、細菌細胞の翻訳を知らせ、変異型のメカニズムに関する洞察を提供するクリーンで再現可能な結果をもたらします。
Abstract
mRNAの存在量の違いを定量化することは、所定の遺伝子変異が細胞生理学に及ぼす影響を理解するための古典的なアプローチです。しかし、翻訳されたmRNA全体の特徴付けの違いは、RNAの調節または結合タンパク質の機能を理解しようとする際に特に有用な追加情報の層を提供します。リボソームプロファイリングやポリソーム分析など、これを達成するための多くの方法が開発されています。しかし、どちらの方法も技術的な課題が伴い、追加の並べ替え方法と組み合わせない限り、組織内の特定の細胞集団に適用することはできません。対照的に、RiboTag法は、適切な細胞特異的Creドライバが利用可能である限り、特定の細胞集団からリボソーム関連RNAを同定することを可能にする遺伝的ベース、効率的、技術的に簡単な代替手段である。この方法は、遺伝的モデル、サンプル採取、免疫沈降、および下流RNA分析を生成するための繁殖から成り立っています。ここでは、男性の生殖能力に必要なRNA結合タンパク質に対する成人男性マウス生殖細胞変異体におけるこのプロセスの概要を説明する。効率的なコロニー管理と正しい遺伝的背景の生成と、出力を最適化するために、正確な遺伝的背景と免疫沈降の生成に焦点を当てた繁殖のための考慮事項に特別な注意が払われています。トラブルシューティングオプション、追加の確認実験、および潜在的なダウンストリームアプリケーションについても説明します。提示された遺伝的ツールと分子プロトコルは、変異型表現型の分子ドライバーに知らせることを目標に、複雑な組織または異常なmRNA蓄積および翻訳を有するシステムにおける特定の細胞集団のリボソーム関連RNAを記述する強力な方法を表す。
Introduction
マイクロアレイまたはRNAシーケンシングによって調べられた細胞または組織のRNAの豊富さの分析は、変異表現型の分子的な要因を理解するための強力なツールであることが証明されています。しかし、これらの比較的不完全な分析ツールは、特に多くのmRNAが神経細胞や生殖細胞などの翻訳前に保存されているシステムでは、細胞の生理学またはプロテオームでは知らないかもしれません。これらのシステムでは、タンパク質、または細胞の翻訳体系に積極的に翻訳されるmRNAの集団を定義することは、細胞の実際の生理学的状態1、2のより良い指標であり得る。例えば、発達の様々な段階での生殖細胞は、後の翻訳のために記憶されるRNAを転写し、発生3またはシグナルキュー4のいずれかによって駆動される。このプロセスはプロタミンをコードするmRNAによって例示され、ここでmRNA転写物は、タンパク質が1、2、5、6になる前に検出可能な日である。同様に、神経細胞は、核内のRNAを転写し、それを軸索下に輸送する、βアクチン7の場合と同様である。これらの特殊な細胞システムに加えて、定常状態のトランスクリプトームは、RNA貯蔵、リボソーム生合成、またはmRNA翻訳に影響を与えるモデルでは有益である可能性は低い。また、複数の他の因子が細胞の定常状態RNAプールに影響を与える可能性があり、mRNA崩壊およびRNA結合タンパク質の活性が含まれる。これらの場合、アクティブな翻訳下でリボソーム関連RNAまたはmRNAを分析するための堅牢なツールは、生物学的に関連する結果をもたらす可能性が高くなります。
そのために、リボソーム関連または積極的に翻訳されたメッセージを識別するためのいくつかの方法が開発されました。ポリソームプロファイリングは、リボソーム関連の転写産物のスナップショットを提供し、リボソームサブユニットまたはモノ、di-、およびポリリボソーム複合体3のいずれかに関連する無傷のRNAを単離するために何十年も使用されてきた。簡単に言うと、収集された細胞ライセートは、線形スクロース勾配に適用され、高速として遠心分離され、リボソームサブユニット、インタクトリボソーム、およびポリソームをサイズによって分離する結果となる。従来、この技術は1つまたは数mRNAの研究に応用されてきましたが、最近ではこの方法をRNA-seq研究と組み合わせて、潜在的な翻訳調節因子の機能を解明するために8,9積極的に翻訳するmRNA10を区別する強力な方法ですが、ポリソームプロファイリングには時間のかかる方法(勾配分画分化および超遠心分離)が必要です。挑戦する人口。
トランスタンスオームを調べる別のアプローチは、リボソームに直接関連する転写産物の部分を特定するリボソームプロファイリングである。簡単に言えば、リボソーム関連RNA断片は、RNase保護アッセイを介して生成され、スクロース勾配を介して分離された個々のリボソーム複合体、およびRNA-seqタグに分離され、深いシーケンシング11に適合するRNA-seqタグに変換される関連RNA断片が含まれる。リボソームプロファイリングの主な利点の1つは、分離時にリボソームの特定の位置を決定する能力であり、翻訳開始部位の識別、リボソーム占有率および分布の計算、およびリボソームストール12の同定を可能にする。しかし、この方法には、機器のニーズ(勾配フラクレータおよび超遠心分離機)、広範なトラブルシューティングを必要とする比較的複雑なプロトコル、および経験の浅いユーザー11では容易に処理できない計算上の問題を含むいくつかの固有の欠点がある。重要なことに、リボソームプロファイリングは主に培養中の単離された細胞に適用され、実質的な材料を必要とし、インビボから混合細胞型組織またはソートされた細胞への適用を制限する。
2009年13年にSanzらによって開発された哺乳類のRiboTag法は、ポリソームおよびリボソームプロファイリングの両方に固有の多くの問題を排除する。この方法では、リボソーム関連RNAは、他の方法13、14で必要とされる別の分離技術および特殊な装置を用いることなく、複雑な組織における細胞型特異的な翻訳体の調査を可能にする特定の細胞型から分離することができる。リボタグ法の基礎は、トランスジェニックマウスモデル(RiboTag)が60Sリボソームサブユニットタンパク質遺伝子Rpl22に対する修飾軌跡を担うものである。この遺伝子座(Rpl22-HA)は、凝集型の末端エキソンとそれに続く、C末端ヘマグルチニン(HA)タグをコード領域内に含むように修正された端末エキソンの追加コピーを含む。細胞特異的Cre Recombinaseを発現するマウスに渡ると、フローキセドエキソンが除去され、HAタグ付きRPL22の発現を細胞固有の方法で行える(図1)。HAタグは、選択した細胞タイプから免疫沈降(IP)リボソームおよび関連するRNAを使用することができます。
技術を開発した最初の出版物に加えて、他のいくつかの研究所は、RiboTagモデルを利用しています。マウスセルトリおよびライディッヒ細胞15、ミクログリア16、ニューロン17、18、卵母細胞19、及び培養細胞20などの多様な組織が、プロファイリングおよび研究されている。このプロトコルは明らかに、多様な組織タイプにわたってリボソームと関連するRNAを正常に分離することができるが、特に突然変異体系に適用された場合、改善が必要な領域がまだ残っている。特に、新鮮な組織への共通の依存は、分析の力を大幅に減少させることができる増加した技術的な変動をもたらす。第二に、以前に報告された非Cre再結合細胞タイプから高い免疫沈降背景が生じると、異なる翻訳された標的の確実な同定がより困難になされる。Sanzらは技術の基本的な前提を設計しましたが、この原稿では、スナイダー研究所はこれらの懸念を減らすためにプロトコルの最適化を提示し、メソッドをより実用的で効率的にレンダリングします。
この記事の目的は、細胞特異的HAタグ付きリボソームを発現するマウスを繁殖させ、これらのリボソームをフラッシュ凍結サンプルから免疫沈降させ、さらに下流分析のために関連するRNAを精製するためのステップを説明することです。哺乳類の雄生殖細胞と不妊の突然変異が独自の課題を提供するので、この技術を他の細胞系に適応させる方法を照らす努力がなされている。
Protocol
すべての動物の使用と取り扱いの慣行は、ラトガース大学の内部動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. マウスの繁殖
- 雌マウスホモ接マウスは、Stra8-iCre対立遺伝子(B6)のオスに対するトリオ交配における男性不妊症(本明細書中の目的の遺伝子と呼ばれる)を男性不妊症に導くRNA結合タンパク質突然変異に対するホモ接マウスを有する。FVB-Tg(Stra8-iCre)1Reb /LguJ) (Cre+) は、2匹のメスをすべての雄に対して組み合わせることで繁殖効率が向上します。
注:Mの雌のホモ接合は正常な生殖能力を有するので、目的の変異遺伝子(M)は母親に渡された。これは、オスの生殖細胞Cre(ヘミジゴス)の父方の伝染を可能にし、推奨される21と目的のアレリック組み合わせで子孫の割合を最適化するという付加的な利点を有する。ホモ接合性Cresは生殖細胞毒性22を示すので、アレレをヘテロ接合またはヘミジゴス状態で維持し、通過することが推奨される。重要なことに、Cre発現は実験集団までRpl22-HAアレレと共生してはならない。繁殖動物のCreからRpl22-HAアレレを分離しないと、生殖細胞Cre活性のためにRpl22-HAを世界的に発現する子孫が生じる。この問題は、胚細胞に固有のものです。さらに、Stra8-iCreは、プレレプトテンとレプトテンを含むミオシスに移行し、非常に早い段階で移行する細胞を標的とする、関心のある22の著者の細胞集団に特有である。別の種類のセルに固有の別のCreドライバを代わりに使用できます。一般的な習慣は、男性の生殖細胞発現Cresが父方側に伝達されることを指示する。しかし、Stra8-iCreの母親の伝達は、男性の子孫で同様の経遺伝子発現をもたらす可能性がある。選択された繁殖スキームに関係なく、同等のCre発現を持つ子孫を生成するために、すべての実験サンプルは、同じ親側(常に母親または常に父方)からCre伝達を介して生成されるべきである。 - セクション2.4で説明したように、遺伝子型結果の雄の子犬。下流の繁殖のためにCre(+/M:Cre+)のためにMアレレと陽性を運ぶものを選択してください。
- Rpl22-HAのオスホモ接合におけるMアレに雌マウスホモ接合を繁殖させる(B6J.129(Cg)-Rpl22tm1.1Psam/SjJ)。
注: Rpl22-HAのバックグラウンドは非常に混合されているので、歪み特異的な表型を評価する際には注意が必要です。 - 遺伝子型は、Mアレを運ぶものを識別するために、女性の子犬を生成し、Rpl22-HA(+/M:Rpl22-HA+)のために陽性(セクション2.3を参照)。下流の繁殖のためにこれらのメスを選択してください。
- クロス+/M:トリオの交配で+/M:Rpl22+女性とクレ+男性。結果として得られる子犬を遺伝子入力し(セクション2.3および2.4を参照)、Cre+とRpl22+の両方の雄と野生型またはM/Mの両方である男性を識別する。
注:この研究は、完全な男性不妊症をもたらす突然変異に焦点を当てているので、最も効率的に所望の実験的遺伝子型を得るために繁殖スキームに特別な考慮事項が取られています。このような検討事項は、他の実験モデルでは不要である可能性があります。繁殖に関する考慮事項の詳細については、図 2で完全な繁殖の概略図とそれに付随する凡例を参照してください。
2. サンプル収集
- 産後21日(dpp)で雄のマウスから精巣を収集します。
- CO2吸入によるマウスの犠牲、その後に頸部脱臼を行う。両側切開部を2つの短い(それぞれ2cm)で横たわる各動物に腹側切開(3cm)し、横切りを接続する。精巣を明らかにするために皮膚と腹皮を引き戻します。
- 鉗子を使用して、体腔の片側からエピジマル脂肪パッドを引っ張って、精巣上体および精巣を明らかにする。テノトミーはさみで、精巣を切除し、精巣上体、周囲の脂肪、および任意の外部血管系を取り除くために注意してください。無傷の精巣を清潔な1.7 mLチューブに入れます。
- 反対側で繰り返し、第1のチューブに2番目の精巣を加えます。このチューブをキャップし、すぐにフラッシュ凍結する液体窒素に沈めます。
注:サンプルは使用まで-80 °Cで保存することができます。
- ジェノタイピング確認のために、各動物(2mm)の追加のテールチップサンプルを収集します。
- DNAを抽出するには、1.7 mLチューブの2mmテールチップに50mM NaOHの100μLを加え、95°Cで30分間沸騰させ、50mM HClの100μLと1MトリスHCl pH 8.0の20μLと10,00xgで3分間の遠心分離サンプルを加えます。上清(ゲノムDNAを含む)を保持し、抽出したDNAを以下のジェノタイピング反応のテンプレートとして使用するまで4°Cで保存する。
- 次のプライマーを使用してSanzら13から適応した方法に従ってRpl22-HAジェノタイピングを行う:5' GGGAGGCTGcTGGATG 3';逆: 5' TTCcAGACACAAGTACAC 3'.
- ステップ2.2.1で抽出した2μLのDNAからなる反応混合物を調製し、25mM dNTPsの0.08 μL、10mMフォワードプライマーの0.1μL、10mMフォワードプライマー、 0.1 μL の 10 mM リバースプライマー、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) バッファーの 2 μL (650 mM トリス pH = 8.8、165 mM (NH 4)2SO 4、30 mM MgCl 2、0.1% Tween)、0.2 μL のタクサーゼの 0.2 μL、および核無 2 0 0 0 00 μL の合計 O0 μL に対して合計 20 μL のポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) バッファー (165 mM (NH4)2 SO4)、 0.1% Tween ) 、タクラーゼの 0.2 μL、および核無 2 0 0 0 0 00 00 00 00 00 00 000 000 00 000 0000
- 95°Cで30sプライマー融解ステップ、64°Cで30sのアニール、72°Cで30s伸長を用い、72°Cで最終5分伸びで37回繰り返した。
注: これは、野生型サンプルの場合は 260 bp、Rpl22-HA+のサンプルの場合は 292 bp の製品サイズを生み出しました。
- 次のプライマーを使用してクレ・ジェノタイピングを実行する:フォワード:5'GTGCCAGCTGAACAACAGGA 3';逆: 5' アガカカガキャットガGTC 3'.代わりに、Creプライマーを利用してステップ2.3.2で説明したPCR反応を準備する。95°Cで30sプライマー融解ステップ、60°Cで30sのアニール、72°Cで15sの伸びを用い、72°Cで最終5分の伸びで35回繰り返した。
- 対象遺伝子の標準として目的遺伝子の遺伝子を実行します。
注 : 著者のジェノタイピング プロトコルは、集中型カスタムTaqを使用するため、他のユーザーは、そのユーザーの必要条件に合わせて条件を変更する必要があります。この関心喪失の遺伝子が翻訳に及ぼす影響をよりよく理解するために、対象の変異対立遺伝子に対して野生型またはホモ接合体のいずれかであり、Cre+およびRpl22+も実験サンプルとして選択された。遺伝子型の選択は、セクション1で上で更に論じられます。
3. ソリューションの準備
注: ソリューションの準備と以降のすべての手順は、厳しい条件下で行う必要があります。
- 均質化バッファー(HB)を調製するには、1 M トリス pH 7.4 の 2.5 mL、1 M KCl の 5 mL、1 M MgCl2の 600 μL、50 mL の NP-40 の 500 μL を追加します。ジエチルパイロカーボネート(DEPC)H2 Oで体積(50mL)に持ち込み、すべての成分が組み込まれるまで混合します。
注:最終濃度は、50 mM トリス pH 7.4、100 mM KCl、12 mM MgCl2、および 1% NP-40 です。 - 高塩洗浄バッファー(HSWB)を調製するには、1 M トリス pH 7.4 の 2.5 mL、1 M KCl の 15 mL、1 M MgCl2の 600 μL、50 mL の NP-40 の 500 μL を 50 mL チューブに追加します。DEPC H2Oで体積(50 mL)に持ち込み、すべての成分が組み込まれるまで混合します。
注:最終濃度は、以下のようになります:50 mMトリスpH 7.4、300 mM KCl、12 mM MgCl2、および1%NP-40プロトコルはここで一時停止することができ、溶液は使用まで室温で保存することができます。
4. 組織の調製
- すべてのサンプルチューブを事前に重くし、重量を記録し、液体窒素でプレクールします。
- プレクール無菌モルタル、害虫、およびドライアイス上のヘラの重量を量る。
- フラッシュ凍結組織サンプルを、ドライアイス上のプレクール、無菌モルタル、害虫を使用して微粉に粉砕します。
- フラッシュ凍結組織をドライアイスのプレクールモルタルに入れます。害虫を使って組織を細かく割り、組織が微細な粉末になるまでゆっくりと粉砕します。
注:新鮮な組織も使用することができますが、元のプロトコル13に従って、フラッシュ凍結組織の使用で結果に有意な差は認められない。詳細については、「代表的な結果と議論」を参照してください。 - プレクールヘラを使用してモルタルから粉末を掻き取ることによって、粉砕したサンプルをプレクールの収集管に慎重に移します。組織のみが収集され、冷たいモルタルに堆積した水分がないことを確認してください。
- 可能な限りドライアイスに保つように注意して、組織とチューブを計量します。サンプルを含むチューブの重量からチューブの初期重量を減算して組織の質量を計算します。この値を記録して、後でリシスバッファボリュームを計算します。
注:プロトコルはここで一時停止することができ、サンプルは使用まで-80°Cで保存することができます。
- フラッシュ凍結組織をドライアイスのプレクールモルタルに入れます。害虫を使って組織を細かく割り、組織が微細な粉末になるまでゆっくりと粉砕します。
5. サンプルの均質化
- 1Mジチオトレイトール(DTT)の10μL、1本のプロテアーゼ阻害剤錠、RNase阻害剤50μL(40,000単位/mL)、200μLの200μLの5mg/mLシクロヘキシミド、100μLの100mg/mLを100mg/mlのHBL100mg/mlを加えて、100μLの100mg/mLを調製する。すべてのコンポーネントが組み込まれるまで混ぜ、使用するまで氷の上に保管してください。
注: 10 mL HB のサプリメントの最終濃度は次のようになります: 1 mM DTT、 200 U/mL RNase 阻害剤、100 μg/mL シクロヘキシミド、および 1 mg/mL ヘパリン。この溶液は、サプリメントの添加の24時間以内に使用する必要があり、使用まで4°Cまたは氷の上に保つことができます。 - 100 mg のサンプルごとに、1 mL のリシス バッファーを追加します。同じピペットを使用して、リシスバッファーを追加し、慎重に結果として得られるライセートを上下にフラグメント細胞にピペットし、混合する。サンプルが粘性でなくなるまでピケットを続けます(通常は25-30ストローク)。
注:ソリューションは最初は非常に粘性があるため、大口径ピペットを使用して溶液を混合する必要があります。標準の1000μLは、通常、100mgの組織に対して十分です。 - 氷の上にサンプルを10分間セットして、リスにします。次いで、予冷遠心分離機(4°C)で10,000 x gで10分間スピンサンプルを。大きく、緩く、曇ったペレットは、チューブの底部に形成する必要があります。
- ペレットを乱さないよう注意して、各サンプルの新しいチューブと記録体積にライセートを収集します。サンプルのデグレデータを防ぐために、サンプルが残りのプロトコル全体で冷たく保たれるようにし、可能な限り氷上または4°Cで保存してください。
6. ビーズの平衡化
- ステップ5.2からのライセートの体積を用いて、適切な抗体結合タンパク質(この場合はタンパク質G)に結合した磁気ビーズの必要量を計算する。1 mL のライセートの場合は、375 μL のタンパク質 G ビーズ (30 mg/mL) を使用します。
注:コンジュゲートビーズの選択は、使用される抗HA抗体によって異なります。例えば、ウサギ生成抗HA抗体が選択される場合、タンパク質Aビーズが好ましいであろう。 - 磁気チューブラックを使用して、ビーズの溶媒を取り出し、ビーズに同じ量の新鮮な溶解バッファーを加えます。4 °Cで5分回転して洗います。20 rpmに設定されたベンチトップチューブ回転器を使用して、すべての回転ステップを実行します。
- 磁気チューブラックにチューブを置き、洗浄バッファーを取り外します。
- 手順 6.1-6.3 をさらに 2 回繰り返します。
- 元のボリュームにライシスバッファーを加え、平衡ビーズを使用します。使用するまで4°Cまたは氷の上に保管してください。
7. プリクリアリングサンプル
- 1 mL のライセートごとに 50 μL の平衡ビーズを加え、ライセートサンプルの上清 (ライセート) に加え、4 °Cで 1 時間回転させます。
- マグネットラックにチューブを置き、新鮮なチューブにライセートを収集します。使用済みビーズを捨てます。
- ライセートに1 mLごとに25 μLの平衡ビーズを加え、4°Cで1時間回転させます。
- マグネットラックにチューブを置き、新鮮なチューブにライセートを収集します。使用済みビーズを捨てます。クリアされたライセートから、50 μLを保持してサンプル入力制御として機能します。80 °Cで保管してください。
注:入力サンプルは、組織の他の細胞タイプに関連するRNAを含むサンプルの総RNA集団を表すコントロールとして機能し、下流の分析中に遺伝子発現の変化を突然変異の関数として補正するために使用されます。
8. 抗体のインキュベーション
- 1 mLのクリアライセートごとに、抗HA抗体を5μg添加する。サンプルの損失を防ぐために、実験室のフィルムでチューブキャップを密封します。サンプルを4°Cで16-18時間回転させます。
注:抗体インキュベーション時間と濃度は最適化されていません。著者らは、5 μgで一晩のインキュベーションで十分であることを発見した。しかし、インキュベーションが短いか、抗体が少ない場合には十分である可能性がある、あるいはより長いインキュベーションまたはより抗体が結合を改善する。
9. ビーズのインキュベーション
- 1 mLのクリアライセートごとに、300 μLのタンパク質Gビーズを加えます。試験用フィルムでチューブキャップを再シールし、4°Cで2時間回転させます。
10. ビーズの洗浄
- サンプルチューブをマグネットラックに置き、ビーズをIPedライセートから分離できるようにします。ピペットは、ビーズを保持し、フロースルーライセートをオフにして廃棄します。
- ビーズにHSWBの800 μLを適用し、4°Cで10分間回転させます。サンプルチューブをマグネットラックに置き、ビーズを洗浄から分離します。洗い物を取り出して捨てます。
- ビーズにHSWBの別の800 μLを適用します。サンプルを閉じ、4°Cで5分間回転させます。サンプルチューブをマグネットラックに置き、ビーズを洗浄から分離します。洗い物を取り出して捨てます。
- 手順 10.3 をもう一度繰り返します。
11. RNA抽出
- サンプルチューブをマグネットラックに置き、ビーズを洗浄から分離します。ピペットオフと廃棄洗浄、RNA抽出のためのビーズを保持します。ビーズに3.5 μLのβ-メルカプトエタノール(bME)を加え、15sの渦を混合します。
- 市販のRNA精製キットを用いてRNAを抽出します。RNaseフリーH2Oの30 μLの溶出サンプル。
メモ:10 μL/サンプルDNase処理は、ほとんどのキットではオプションですが、強くお勧めします。このオプションのクリーンアップステップにより、バックグラウンドが大幅に減少し、より正確な最終濃度が得られます。リシスバッファーにβ-メルカプトエタノール(bME)を含むキットを使用することは強く再確認される。bMEはRNA分離中のサンプル分解を防ぐために、追加のRNase阻害剤として機能します。 - サンプルを-80°Cに保存するか、すぐに分析してください。
12. 定量とサンプル分析
- UV-Vis分光光度計を使用して、RNA濃度と予備品質を定量化します。
- バイオアナライザーを介してサンプルから抽出したRNAの品質を分析します。
注: その後、得られた RNA は、RNA シーケンシングや、ノーザン ブロッティング PCR や定量的逆転写 PCR (qRT-PCR) などのダウンストリーム解析に使用できます。
Representative Results
以前の報告では、Cre14を欠いている細胞からの非特異的免疫沈降が示唆されている。これが当社の改変プロトコルに当てはまるかどうかを判断するために、IP効率はCreとRpl22-HAの両方を運ぶ動物と、Cre-driverとRpl22-HAの両方がなければ、免疫沈降RNAが最小限でなければならないという期待を持って、一方のみを運ぶ動物から得られたサンプルで決定されました。図3に示すように、CREまたはRpl22-HAを欠いているサンプルから分離されたRNAは、IPの背景を減らし、本物のHAタグ付きリボソームRNAを分離するこのプロトコルの有効性を実証しています。また、Cre-のみおよびRpl22-HA-HA-サンプルの両方が、適切な陰性コントロールを表す。
試薬源がIPの効率に大きな影響を与える可能性を考えると、CreおよびRpl22-HA陽性サンプルで一連の抗体およびRNA分離プロトコル(図4)を試験した。これらの結果は、試薬の選択がIP効率に大きな影響を与える可能性があることを示すため、試薬選択に対する変更は注意して行う必要があります。
RNA結合タンパク質変異体の文脈でこのプロトコルをテストするために、野生型Cre+Rpl22-HA+および関心のある遺伝子-/-Cre+Rpl22-HA+(関心のある遺伝子-/-)精巣はリボソームを分離するリボタグシステムの有効性について調べた(図5)。野生型入力とIPのRNA濃度を対象遺伝子-/-入力とIPと比較した場合、遺伝子型間に有意差は見られなかった。しかし、両方の遺伝子型について、入力濃度はIP濃度よりも有意に高く、入力サンプル中にRNAが多いことを示している(図5B)。この結果は、細胞内に存在するすべてのmRNAが、特にRNAが翻訳されるずっと前に転写される可能性がある生殖細胞の場合に、任意の時点でリボソームに関連付けられているわけではないので、期待される。
シーケンシング用に送られたRNAサンプルの品質を確認するために、バイオアナライザーでサンプルを実行した。RNAインテグリティ数(RIN)は、通常、28Sおよび18S rRNAピークの比として計算され、サンプル間で比較された。合計 RNA プールでは、RIN 値は 10 近くになると予想され、より高い RIN と推測されるサンプルの完全性と品質が高くなります。IPサンプルは入力よりもRINが低かったが、RINはまだ許容範囲内にあり、サンプルの遺伝子型に依存していなかった(図5C)。IPedサンプルのRIN値の低下はRNA分解の結果である可能性が高いが、分析されたRNAの平均ヌクレオチド長の比較的小さな減少を考えると非常に軽微である。免疫沈降に必要なプロトコルの長さと温度を考えると、いくつかの劣化が予想されます。また、減少したRINおよびRNA長さは、mRNAなどの非rRNA種に対する濃縮の機能である可能性もある。
図 1: リボタグメソッドこの方法の前提は生物学的に簡単です。新しい Exon 4 は、元のエキソン 4 のRpl2 2ローカスダウンストリームのシーケンスに挿入されます。Creドライバの存在下では、元のExon 4の両側にあるloxPサイトが切断され、凝集したエキソンを切り取ります。HA タグ付きの Exon 4 はRpl22 mRNA に組み込まれ、CRE を発現する細胞に HA タグ付き RPL22 を生成します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:リボタグマウスのサンプル繁殖スキーム実験動物を生成するために使用される繁殖計画が示されている。2つのスキームが利用された。第1世代では、2つの並列セットのブリーダートリオが確立されました。一方の側は、関心のあるアレを組み合わせた(この特定の突然変異が男性不妊をもたらすので母親に運ばれる)、もう一方は関心のあるアレを組み合わせたもので、再び母親に運ばれ、Rpl22-HAを有する。そして、第2世代において、関心のアレレを運ぶ最初の組み合わせとCreの男性は、関心のアレレを運ぶ第2の組み合わせの女性の子孫に渡される。得られた子孫の遺伝子型が決定され、そして実験的に関連する動物が選択される(この場合、CreおよびRpl22-HAアレの両方を担う野生型またはホモ接合変異体)。Cre-ドライバを発現する生殖細胞に関しては、CreとRpl22-HAの対立する対立する対立を実験世代まで一緒に繁殖させてはならないことに注意することが重要です。繁殖世代における生殖細胞発現クレへのRpl22-HAアレレの曝露は、生殖細胞Rpl22-HA切除を促進するであろう。結果として生じる子孫は、Rpl22-HAを世界的に発現し、細胞特異的リボソーム分離を防止します。本明細書に記載される系において、遺伝子型当たりn=4は下流分析に十分な統計的パワーを与えた。生物学的反復数は、各実験系について決定されるべきである。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ネガティブコントロールの確認Cre+およびRpl22-HA+であるサンプルは、Cre+またはRpl22-HA+単独のサンプルよりも RNA プルダウンが高いことを示します。Cre+とRpl22-HA+サンプルRNAプルダウン効果に有意な差はなく、CreまたはRpl22-HAのいずれかを欠いているサンプルが適切な陰性コントロールであることを示す。「+」は、対応する対立遺伝子またはトランスジーンがこれらのサンプルに存在し、「-」がその存在を示していることを示す。IP/入力は、総(入力)RNAに対する免疫沈降(IP)の割合を表します。ナノグラムの濃度から計算された値。** は p < 0025 を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: 試薬がプロトコルの成功に影響を与える(A) フラッシュ凍結組織は、新鮮な組織と同様の免疫沈降効率をもたらす。(B) 2つの商用抗体に対するIP効率を決定し、抗体1および抗体2(材料表)と指定した。試験を受けた場合、抗体1は、陰性(CreまたはRpl22-HA+のいずれも発現していない)と陽性対照(CreおよびRpl22-HA+の両方を発現していない)とを区別することができないと思われる抗体2よりもRNAを引き下げる上でより効率的であった。個々の生物学的複製に対するIPed対入力RNAの比を示すドット。(C) RNA抽出キット (材料表)を比較した場合、キット2はキット1を著しく上回った。両方のキットは陰性対照から同様の量のRNAをIPedしたが、キット2は陽性サンプルからのRNA収率が有意に高い結果となった。* は、p < 0.05, ** p < 0.025, *** p < 0.01 を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:変異モデルへの方法の適用(A)目的タンパク質の遺伝子に対するカスタムの社内抗体を用いたウェスタンブロッティングを介した目的の遺伝子型確認のサンプル遺伝子は、対象遺伝子を示す-/- (M/M) オスは、関連タンパク質を産生しない。GAPDH はローディングコントロールとして示されています。(B) 野生型と変異型のサンプルの対の入力およびIPedサンプルからのグラフィカルなバイオアナライザ出力。(C) サンプル型と遺伝子型によるRNA完全性数(RIN)の比較。(D) バイオアナライザーで解析したRNA種の平均ヌクレオチド長をサンプル型および遺伝子型別に解析した。* は、p < 0.05、 ** p < 0.025、 *** p < 0.01, N.S. 重要ではないことを示します。N = 1 つの遺伝子型あたり 4。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: Creドライバの確認の例胚細胞発生初期に翻訳された遺伝子(Stra8)と、2つの異なる生殖細胞クレスによって駆動されるRPL22-HAから誘導されたRNA免疫沈降RNAのqRT PCRによって分析された胚細胞開発の後期(Stra8)および2つの遺伝子の定量化、Stra8-iCre(胚細胞発達初期に発現)およびHspa2-Cre(胚細胞の発達の初期に発現する)(後に胚細胞の開発で発現する)。ここで、Stra8のHA-IPは、初期胚細胞Creドライバでは達成されるが、免疫沈降の細胞特異性を示す後の生殖細胞Creドライバでは達成されない。これに対し、後期生殖細胞に翻訳された転写物のHA-IPは、Stra8-iCreおよびHspa2-Creの両方によって達成される。これは、Stra8-iCreを発現する細胞が開発全体を通じてHAタグ付きRPL22を生成し、Hspa2-Creを発現する細胞は開発の後半にのみそうすることが期待されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
特定の細胞タイプの翻訳体系を理解することは、正常または変異状態における細胞の生理学をより正確に理解するために非常に貴重です。翻訳が転写から非常に遠く離れている神経組織や、翻訳のずっと前に転写が起こる生殖細胞など、翻訳が転写から切り離されるシステムでは、特別な利点が見られます。他の翻訳法に比べて、RiboTagシステムの最大の利点は、Creリコンビナーゼシステムの使用から来ています。これにより、関連するCreドライバーを持つ任意のセルの集団を対象とする自由ができます。第二に、本明細書に記載されているリボタグIPは、ポリソームまたはリボソームプロファイリングのいずれかよりも効果的で、技術的に困難で時間のかかるものははるかに少ない。最後に、リボタグIPはベンチトップで容易に行うことができる。
このプロトコルには、いくつかの重要な手順があります。その中でも、リボタグマウスラインの確立と実験動物の研究が主役です。すべての遺伝的モデルに関しては、マウスコロニー内の個人の注意深い追跡と慎重なジェノタイピングプロトコルを適用する必要があります。SanzらによるPCRジェノタイピングは、野生型アレ(260bp)と変異型(290bp)13とを区別する野生型エキソン4'のloxP部位5'を標的とするプライマーを含むべきである。生殖細胞モデルにおけるリボタグ分析の場合、非常に特異的な飼育要件を遵守すべきである。まず、不妊症をもたらす変異体の場合、思慮深い繁殖戦略には、中間世代および実験世代において所望の遺伝子型を有する子孫の数を最適化する方法が含まれるべきである。第二に、生殖細胞特異的Cresの場合、クレ毒性に対する生殖細胞の感受性を考えると、Cre-zygosityに関する注意が必要である。 生殖細胞では、高レベルのCreタンパク質は、繁殖スキームにおけるCre/Cre動物の使用を禁止する有害な効果22を有することができる。最後に、生殖細胞Cresを使用する場合、中間世代の生殖細胞におけるCre発現として最終世代まで、リボタグアレを分離することが重要であり、Rpl22-HAを世界的に発現する子孫をもたらす。
セルシステムに関係なく、多くの推奨制御は、Cre発現および特異性の両方の堅牢性を検証することが可能です。クレの適切な表現とRpl22-HAの予想される切除は、複数の方法を使用して決定することができます。第1に、実験動物から単離された組織は、免疫組織化学または免疫蛍光15のいずれかを用いてHAについて染色することができる。この方法は、対象細胞型の翻訳されたmRNAに関する知識を必要としないという条件で最適です。2 番目の方法は、図 6に示す例で、ターゲット セル型の翻訳で規制されたメッセージに関する知識が必要です。この方法では、既知の翻訳調節mRNAに対する濃縮は、IPed対インプットRNAの定量PCRを用いて選択されたCre-driverから確認することができる。同様に、信頼性の高いRpl22-HA式は、Cre+/Rpl22+サンプル (陽性コントロール) と、有効な負の制御として機能するCre-/Rpl22+またはCre+/Rpl22-サンプルとの比較によって確認できます (図 3を参照)。これらの比較は、qRT-PCRまたは他の定量的方法によって評価される既知の翻訳調節mRNAに対して、合計IPed RNAまたは濃縮で行うことができます。
プロトコルの実行における一般的な問題は、RNAの収率が予想外に低いか高い場合にのみ明らかになる傾向があります。これらの失敗の最も一般的な原因は、個人の誤ったジェノタイピングから生じます。予期しないRNAの収量の場合、すべてのサンプルの遺伝子型を確認するために、収集されたサンプルから追加の組織を保持することをお勧めします。確認後、RNase汚染やサンプル劣化の可能性など、他の可能性を考慮する必要があります。ラボ内のRNaseフリーゾーンの慎重なサンプル保管と取り扱いおよびメンテナンスにより、これらの問題を大幅に軽減または排除できます。RNA 分離の問題はこのプロトコルのもう 1 つの潜在的な問題ですが、市販キットを使用すると、RNase が解放され、期限切れのソリューションが含まれていないように注意する必要がありますが、この問題は大幅に削減されます。最後に、すべての抗体ベースの手順と同様に、ロット、保管条件、濃度、あるいは出荷の変動は、抗体の品質とその後のプルダウンの成功に悪影響を及ぼす可能性があります。その結果、慎重かつ繰り返しの試験に続いて、我々は利用可能な最も一貫した、効率的な抗体を選んだ。
このプロトコルには、他の公開された RiboTag プロトコルに関連する 2 つの主要な変更が含まれています。1つは、フラッシュ凍結組織を使用する能力であり、それによってロット、技術者、または技術的な実行のバリエーションに関する問題を軽減します。サンプルを収集して保存し、すべてのサンプルからHA-リボソームを一度に分離し、主な変動源となる可能性があります。第二に、プリクリアステップの追加は、RiboTagシステムの他のユーザーによって報告された背景の種類を大幅に減少させる。最近、Sanzらによるプロトコル報告は、非Cre-駆動細胞14からのリボソーム関連転写物の豊富さによる高い背景の存在を示す。当社のプロトコルは、プレクリアリングステップを含めることによってこの問題を解決し、Cre陰性IPサンプル中のRNAの存在を効果的に排除します。
すべてのシステムと同様に、RiboTagシステムの固有の制限を念頭に置く必要があります。特徴のないCreドライバを使用する場合、実験サンプル生産の前に発現の分析を行う必要があります。翻訳の観点から、この方法のいくつかのニュアンスに注意する必要があります。まず、リボタグは、翻訳する準備ができているmRNAと積極的に翻訳している人との間の差別化を許可しません。したがって、現在のRiboTagベースの方法は、個々のmRNAの関数としての翻訳効率の定量化を可能にしません。翻訳効率が目的の場合、RiboTag法をポリソームプロファイリングなどの他の変換解析ツールと組み合わせる場合は、セル固有の基準で測定することができます。第二に、個人または遺伝子型依存の分散に起因する総RNAの存在量変化を考慮することが基本です。このため、入力RNAを慎重に分離すると免疫沈降が伴い、それぞれの下流分析を通じてサンプルが組み合わされたままになります。最後に、RiboTagベースの分析に関しては、リボソームとの関連付けが必ずしも翻訳が起こっているとは限らないということを覚えるべきだ。対象とするターゲットの翻訳規則を確認するために、二次的な分析方法を実行する必要があります。
このプロトコルは、RiboTagモデルを用いた雄マウスの生殖細胞からのリボソーム関連RNAの単離について説明する。マウスの繁殖とサンプル収集を考慮しないプロトコルは、最初の日に3時間、午後に行い、一晩のインキュベーション、その後の朝に5時間の作業を行う2日かかります。ストック液(HBおよびHSWB)の調製と組織研削を事前に行うことを強くお勧めします。プロトコルの全体的な成功は、正しいジェノタイピングと厳格なRNaseフリーの条件に依存しています。特定の細胞型の翻訳を調べる能力により、将来の研究は、無数の細胞型および変異型の転写、翻訳、およびプロテオームとの関係をよりよく理解することができます。
Disclosures
著者たちは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この仕事は、EMSへのNIH助成金NICHD R00HD083521とラトガース大学からEMSへの内部支援によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 1,4-Dithio-DL-threitol (8% | Alfa Aesar | A15797 | |
| 1.7 mL or 2mL tubes | Preference of researcher | ||
| 10 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
| 10 mL serological pippettes | Preference of researcher | ||
| 10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 5 mL serological pipettes | Preference of researcher | ||
| 50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
| Anti-HA tag antibody | Abcam | ab18181 | Antibody 1 |
| Anti-HA tag antibody | Antibodies.com | A85278 | Antibody 2 |
| B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ Mice | The Jackson Laboratory | 17490 | Or mice carrying Cre driver of choice |
| B6N.129-Rpl22tm1.1Psam/J Mice | The Jackson Laboratory | 11029 | |
| Benchtop centrifuge | Preference of researcher | ||
| C1000 Touch thermal cycler | BioRad | 184-1100 | Or equivalent thermal cycler |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000537 | Or equivalent refrigerated centrifuge |
| Cyclohexamide | Sigma Aldrich | C7698-1g | |
| Dissection scissors | Preference of researcher | ||
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 10009D | |
| DynaMag-2 Magnet rack | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| E.Z.N.A. Total RNA Kit 1 | OMEGA | 6834-01 | Kit 1 |
| Heat block | Preference of researcher | ||
| Heparin | Sigma Aldrich | 84020 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272-500g | |
| Microdissection forceps | Preference of researcher | ||
| Microdissection scissors | Preference of researcher | ||
| MiRNeasy kit | Qiagen | 217004 | Kit 2 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Or equivalent spectrophotometer |
| NP-40 Alternative - CAS 9016-45-9 - Calbiochem | Millipore Sigma | 492016 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | ThermoFisher Scientific | A32965 | |
| Potassium (KCl) | Sigma Aldrich | P3911-2.5kg | |
| RNase Inhibitor, Murine | New England BioLabs Inc. | M0314 | |
| SI vortex-genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Or equivalent benchtop vortex |
| Tips for 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-500 | |
| Tube Revolver / Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Or equivalent rotator |
| VWR Powerpette Plus pipet controller | VWR | 75856-450 | Or equivalent pipette controller |
References
- Snyder, E. M., et al. Gene expression in the efferent ducts, epididymis, and vas deferens during embryonic development of the mouse. Developmental Dynamics. 239 (9), 2479-2491 (2010).
- Snyder, E. M., Small, C. L., Li, Y., Griswold, M. D. Regulation of gene expression by estrogen and testosterone in the proximal mouse reproductive tract. Biology of Reproduction. 81 (4), 707-716 (2009).
- Iguchi, N., Tobias, J. W., Hecht, N. B. Expression profiling reveals meiotic male germ cell mRNAs that are translationally up- and down-regulated. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 103 (20), 7712-7717 (2006).
- Busada, J. T., et al. Retinoic acid regulates Kit translation during spermatogonial differentiation in the mouse. Developmental Biology. 397 (1), 140-149 (2015).
- Kleene, K. Patterns of translational regulation in the mammalian testis. Molecular Reproduction and Development. 43 (2), 268-281 (1996).
- Mali, P., et al. Stage-specific expression of nucleoprotein mRNAs during rat and mouse spermiogenesis. Reproduction Fertilility and Development. 1 (4), 369-382 (1989).
- Steward, O., Schuman, E. M. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. Annual Review of Neuroscience. 24, 299-325 (2001).
- Michel, A. M., Baranov, P. V. Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).
- Snyder, E., et al. Compound Heterozygosity for Y Box Proteins Causes Sterility Due to Loss of Translational Repression. PLoS Genetics. 11 (12), 1005690 (2015).
- Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. Polysome Profiling Analysis of mRNA and Associated Proteins Engaged in Translation. Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).
- McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling. Methods. 126, 112-129 (2017).
- Aeschimann, F., Xiong, J., Arnold, A., Dieterich, C., Grosshans, H. Transcriptome-wide measurement of ribosomal occupancy by ribosome profiling. Methods. 85, 75-89 (2015).
- Sanz, E., et al. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
- Sanz, E., Bean, J. C., Carey, D. P., Quintana, A., McKnight, G. S. RiboTag: Ribosomal Tagging Strategy to Analyze Cell-Type-Specific mRNA Expression In Vivo. Current Protocols in Neuroscience. 88 (1), 77 (2019).
- Sanz, E., et al. RiboTag analysis of actively translated mRNAs in Sertoli and Leydig cells in vivo. PLoS One. 8 (6), 66179 (2013).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Ceolin, L., et al. Cell Type-Specific mRNA Dysregulation in Hippocampal CA1 Pyramidal Neurons of the Fragile X Syndrome Mouse Model. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 340 (2017).
- Puighermanal, E., et al. drd2-cre:ribotag mouse line unravels the possible diversity of dopamine d2 receptor-expressing cells of the dorsal mouse hippocampus. Hippocampus. 25 (7), 858-875 (2015).
- Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes and Development. 25 (7), 755-766 (2011).
- Lesiak, A. J., Brodsky, M., Neumaier, J. F. RiboTag is a flexible tool for measuring the translational state of targeted cells in heterogeneous cell cultures. Biotechniques. 58 (6), 308-317 (2015).
- The Jackson Laboratory. B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ. , The Jackson Laboratory. (2019).
- Bao, J., Ma, H. Y., Schuster, A., Lin, Y. M., Yan, W. Incomplete cre-mediated excision leads to phenotypic differences between Stra8-iCre; Mov10l1(lox/lox) and Stra8-iCre; Mov10l1(lox/Delta) mice. Genesis. 51 (7), 481-490 (2013).
