Summary
Her beskriver vi immunnedbøren av ribosomer og tilhørende RNA fra utvalgte populasjoner av voksne mannlige musbakterieceller ved hjelp av RiboTag-systemet. Strategisk avl og forsiktig immunnedbør resulterer i rene, reproduserbare resultater som informerer om bakteriecelletranslatomen og gir innsikt i mekanismene til muterte fenotyper.
Abstract
Kvantifiserende forskjeller i mRNA overflod er en klassisk tilnærming for å forstå virkningen av en gitt genmutasjon på cellefysiologi. Karakterisere forskjeller i translatomen (hele oversatte mRNAs) gir imidlertid et ekstra lag med informasjon spesielt nyttig når du prøver å forstå funksjonen til RNA regulere eller bindende proteiner. En rekke metoder for å oppnå dette er utviklet, inkludert ribosome profilering og polysom analyse. Begge metodene har imidlertid betydelige tekniske utfordringer og kan ikke brukes på bestemte cellepopulasjoner i et vev, med mindre de kombineres med flere sorteringsmetoder. I motsetning er RiboTag-metoden et genetisk basert, effektivt og teknisk enkelt alternativ som gjør det mulig å identifisere ribosome tilknyttede RNAer fra bestemte cellepopulasjoner uten ekstra sorteringstrinn, forutsatt at en gjeldende cellespesifikk Cre-driver er tilgjengelig. Denne metoden består av avl for å generere de genetiske modellene, prøveinnsamling, immunnedbør og nedstrøms RNA-analyser. Her skisserer vi denne prosessen i voksne mannlige musbakterieceller mutant for en RNA bindende protein som kreves for mannlig fruktbarhet. Spesiell oppmerksomhet er tatt hensyn til hensyn til avl med fokus på effektiv kolonihåndtering og generering av riktig genetisk bakgrunn og immunnedbør for å redusere bakgrunnen og optimalisere produksjonen. Diskusjon av feilsøkingsalternativer, flere bekreftende eksperimenter og potensielle nedstrømsprogrammer er også inkludert. De presenterte genetiske verktøy og molekylære protokoller representerer en kraftig måte å beskrive ribosome-assosiert RNAs av spesifikke cellepopulasjoner i komplekse vev eller i systemer med avvikende mRNA lagring og oversettelse med mål om å informere om molekylære drivere av muterte fenotyper.
Introduction
Analyse av en celle eller vevs RNA overflod, som undersøkt av mikroarray eller RNA-sekvensering, har vist seg et kraftig verktøy for å forstå molekylære drivere av muterte fenotyper. Disse relativt ufullstendige analyseverktøyene kan imidlertid ikke informere om fysiologi eller proteome av cellen, spesielt i systemer der mange mRNAs er lagret før oversettelse som nevrale og bakterieceller. I disse systemene kan det å definere populasjonen av mRNAer som aktivt oversettes til protein, eller cellens translatome, være en bedre indikator på cellens faktiske fysiologiske tilstand1,2. For eksempel, bakterieceller på ulike stadier av utvikling transkribere RNAs som er lagret for senere oversettelse, drevet enten avutviklings3 eller signalsignaler4. Denne prosessen er eksemplifisert av mRNAs koding protaminer, karakterisert ved at mRNA-transkripsjonen kan oppdages dager før proteinet er laget1,2,5,6. På samme måte transkribererer nevrale celler RNA i kjernen og transporterer den ned aksonen, som det er tilfelle med β-actin7. I tillegg til disse spesialiserte cellesystemene, er det lite sannsynlig at steady-state transkripsjoner er informative i modeller der RNA-lagring, ribosome biogenese eller mRNA-oversettelse påvirkes. Flere andre faktorer kan også påvirke en celles steady-state RNA pool inkluderer mRNA forfall og aktiviteten til RNA bindende proteiner. I disse tilfellene er det mer sannsynlig at robuste verktøy for å analysere ribosome-tilknyttede RNAer eller mRNAer under aktiv oversettelse gir biologisk relevante resultater.
For dette formål er flere metoder utviklet for å identifisere ribosome-tilknyttede eller aktivt oversatte meldinger. Polysome profilering, som gir et øyeblikksbilde av ribosom tilknyttede transkripsjoner, har blitt brukt i mange tiår for å isolere intakte RNAer forbundet med enten ribosomale underenheter eller mono-, di- og polyribosomkomplekser3. Kort, innsamlede cellelysater påføres en lineær sukrose gradient og sentrifugert som høy hastighet, noe som resulterer i separasjon av ribosome subunits, intaktribosomer, og polysomer etter størrelse. Tradisjonelt har denne teknikken blitt brukt til å studere en eller noen få mRNAer, men nylig har denne metoden blitt kombinert med RNA-seq-studier for å belyse funksjonen til potensielle translasjonelle regulatorer8,9 Mens en kraftig måte å skille mellom aktivt oversette og ikke-oversette mRNAs10,krever polysom profilering tidkrevende metoder (gradient fraksjonering og ultracentrifuge) og kan kreve en god avtale med prøveå gjøre den sjeldne analysen av den sjeldne analysen av den sjeldne analysen av den sjeldne analysen av den sjeldne analysen av den sjeldne analysen populasjoner utfordrende.
En alternativ tilnærming til å undersøke translatomen er ribosome profilering, som identifiserer deler av transkripsjoner direkte forbundet med ribosom. Kort sagt, ribosome tilknyttede RNA fragmenter genereres via RNase beskyttelse analyse, individuelle ribosome komplekser atskilt via sukrose gradient, og tilknyttede RNA fragmenter isolert og konvertert til RNA-seq koder mottagelig for dyp sekvensering11. En av de viktigste fordelene med ribosome profilering er muligheten til å bestemme de spesifikke plasseringene av ribosomene på isolasjonstidspunktet som tillater identifisering av oversettelsesstartsteder, beregning av ribosomal belegg og distribusjon, og identifisering av ribosome boder12. Denne metoden har imidlertid flere iboende ulemper, inkludert utstyrsbehov (gradientbrøkerog ultracentrifuge), en relativt kompleks protokoll som krever omfattende feilsøking, og beregningsproblemer som ikke lett håndteres av den uerfarne brukeren11. Viktigere, ribosome profilering er primært brukt på isolerte celler i kultur og krever betydelig materiale, noe som gjør sin søknad til blandet celle-type vev eller sorterte celler fra in vivo begrenset.
Den pattedyr ribotag metoden, utviklet av Sanz et al. i 200913, eliminerer en rekke problemer som ligger i både polysome og ribosome profilering. I denne metoden kan ribosome-tilknyttede RNAer isoleres fra bestemte celletyper som tillater undersøkelse av celletype spesifikke translatomer i komplekse vev uten ytterligere isolasjonsteknikker og spesialisert utstyr, som nødvendig i andre metoder13,14. Grunnlaget for RiboTag-metoden er en transgen musemodell (RiboTag) som bærer en modifisert locus for 60S ribosomal subunit protein genet Rpl22. Denne locus (Rpl22-HA) inkluderer en floxed terminal exon etterfulgt av en ekstra kopi av terminalen exon endret til å inkludere en C-terminal hemagglutinin (HA) tag innenfor koding regionen. Når krysset til en mus som uttrykker en cellespesifikk Cre Recombinase, fjernes den floxed exon slik at uttrykket av HA-merket RPL22 på en celle-spesifikk måte (Figur 1). HA-koden kan deretter brukes til å immunprecipitate (IP) ribosomer og deres tilknyttede RNAer fra den valgte celletypen.
I tillegg til den første publikasjonen som utviklet teknikken, har flere andre laboratorier benyttet RiboTag-modellen. Diverse vev som mus Sertoli og Leydig celler15, microglia16, nevroner17,18, oocytes19, og kultiverte celler20 har blitt profilert og studert. Selv om denne protokollen er klart i stand til å isolere ribosomer og tilhørende RNAer på tvers av en mangfoldig vevstyper er det fortsatt områder som trenger forbedring, spesielt når den brukes på muterte systemer. Spesielt resulterer felles avhengighet av ferskt vev i økt teknisk variasjon som i stor grad kan redusere effekten av analysen. For det andre, trygg identifisering av differensialt oversatte mål er gjort mer utfordrende når høy immunnedbør bakgrunn oppstår fra ikke-Cre recombined celletyper som tidligere rapportert13. Mens Sanz et al. konstruerte den grunnleggende forutsetningen for teknikken, presenterer Snyder-laboratoriet i dette manuskriptet optimalisering av protokollen for å redusere disse bekymringene, noe som gjør metoden mer praktisk og effektiv.
Hensikten med denne artikkelen er å forklare trinnene for avl mus uttrykker celle-spesifikke HA-merkede ribosomer, immunutløse disse ribosoms fra flash-frosne prøver, og rense sine tilknyttede RNAs for ytterligere nedstrøms analyser. Som pattedyr mannlig bakteriecelle og ufruktbarhet mutasjon studert gir unike utfordringer, har det blitt gjort forsøk på å belyse måter denne teknikken kan tilpasses andre cellesystemer.
Protocol
All dyrebruk og håndteringspraksis er godkjent av Rutgers University's Internal Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Avl av mus
- Avle kvinnelige mus homozygot for en RNA bindende proteinmutasjon som fører til mannlig infertilitet (manuskript i forberedelse, referert til hersom genet av interesse) i trioparinger til menn hemizygous for Stra8-iCre allele (B6. FVB-Tg(Stra8-iCre)1Reb/LguJ)(Cre+), som paring av to kvinner til hver mann øker avlseffektiviteten.
MERK: Det muterte genet av interesse (M) ble passert på morsvis, da kvinner homozygot for M har normal fruktbarhet. Dette har den ekstra fordelen av å tillate paternal overføring av den mannlige bakteriecellen Cre (hemizygous), som anbefalt21 og optimalisere prosent av avkom med ønsket allelic kombinasjon. Fordi homozygous Cres viser bakteriecelletoksisitet22,anbefales det at allele opprettholdes og passeres i en heterozygous eller hemizygous tilstand. Viktigere, Cre uttrykk må ikke sam-skje med Rpl22-HA allele før den eksperimentelle befolkningen. Unnlatelse av å isolere Rpl22-HA allele fra Cre i avl dyr vil resultere i avkom som globalt uttrykker Rpl22-HA på grunn av bakteriecelle Cre aktivitet. Dette problemet er spesifikt for bakteriecelle. I tillegg er Stra8-iCre spesifikk for forfatternes cellepopulasjon av interesse22, rettet mot celler som går over til og veldig tidlig i meiosis, inkludert preleptotenes og leptotenes. En annen Cre driver som er spesifikk for en annen celletype av interesse kan brukes i stedet. Vanlig praksis tilsier at mannlig bakteriecelle uttrykte cres overføres på farssiden. Det er imidlertid mulig mors overføring av Stra8-iCre vil resultere i lignende transgene uttrykk hos mannlige avkom. Uavhengig av avlsordning valgt, for å generere avkom med tilsvarende Cre-uttrykk, bør alle eksperimentelle prøver genereres via Cre-overføring fra samme foreldreside (enten alltid mors eller alltid paternal). - Genotype som resulterte i mannlige valper som beskrevet i pkt. 2.4. Velg de som bærer M allele og positivt for Cre (+/M:Cre+) for nedstrøms avl.
- Avle kvinnelige mus homozygous for M allele i trio parring til menn homozygous for Rpl22-HA (B6J.129(Cg)-Rpl22tm1.1Psam/ SjJ).
MERK: Rpl22-HA-bakgrunnen er svært blandet, så det bør utvises forsiktighet ved vurdering av belastningsspesifikke fenotyper. - Genotype som resulterte i at kvinnelige unger identifiserer de som bærer M allele og positiv for Rpl22-HA (+/M:Rpl22-HA+) (se pkt. 2.3). Velg disse hunnene for nedstrøms avl.
- Kryss +/M:Cre+ hanner med +/M:Rpl22+ kvinner i trioparinger. Genotype de resulterende valpene (se pkt. 2.3 og 2.4) for å identifisere menn som er både Cre+ og Rpl22+ og enten wildtype eller M/M.
MERK: Da dette arbeidet fokuserer på en mutasjon som resulterer i fullstendig mannlig infertilitet, er det tatt spesielle hensyn i avlsordningen for å få mest effektivt inn ønskede eksperimentelle genotyper. Slike hensyn kan være unødvendige i andre eksperimentelle modeller. Se figur 2 for en full avl skjematisk og tilhørende legende for ytterligere diskusjon av avlshensyn.
2. Eksempel samling
- Samle testiklene fra hannmus ved 21 dager etter partum (dpp).
- Offer mus ved CO2 innånding etterfulgt av cervical dislokasjon. Lag et ventralsnitt (3 cm) på hvert dyr flankert med to kortere (2 cm hver), tilkoblede laterale snitt. Trekk huden og bukhinnen tilbake for å avsløre testiklene.
- Bruk tang, trekk epidymal fettpute fra den ene siden av kroppshulen for å avsløre epididymis og testis. Med tenotomy saks, avgifttestis, ta vare på å trimme bort epididymis, omkringliggende fett, og noen ekstern vaskulatur. Plasser intakte testiklene i et rent 1,7 ml rør.
- Gjenta med den andre siden, og legg til de andre testiklene i det første røret. Kap dette røret og senk det umiddelbart ned i flytende nitrogen for å fryse.
MERK: Prøver kan bevares ved -80 °C til bruk.
- Samle inn ekstra haletipsprøver for hvert dyr (2 mm) for genotypingbekreftelse.
- For å trekke ut DNA, tilsett 100 μL 50 mM NaOH til en 2 mm halespiss i et 1,7 ml rør og kok ved 95 °C i 30 min. Tilsett 100 μL 50 mM HCl og 20 μL av 1 M Tris-HCl pH 8,0 og sentrifugeprøver i 3 min ved 10 000 x g. Behold supernatant (som inneholder genomisk DNA) og lagre ekstrahert DNA ved 4 °C til bruk som mal for følgende genotypingreaksjoner.
- Utfør Rpl22-HA genotyping etter en metode tilpasset fra Sanz et al.13 ved hjelp av følgende primere: fremover: 5' GGGAGGCTTGCTGGATATG 3'; omvendt: 5' TTTCCAGACACAGGCTAAGTACAC 3'.
- Forbered en reaksjonsblanding bestående av 2 μL DNA som ekstrahert i trinn 2.2.1, 0,08 μL av 25 mM dNTPs, 0,1 μL av 10 mM fremover primer, 0,1 μL revers primer på 10 mM, 2 μL polymerasekjedereaksjon (PCR) buffer (650 mM Tris pH = 8,8, 165 mM (NH4)2SO4, 30 mM MgCl2og 0,1 % Tween), 0,2 μL Taq polymerase og kjernefri H2O til et totalt volum på 20 μL.
- Bruk følgende termocycler forhold: en 30 s primer smeltetrinn ved 95 °C, 30 s anneal ved 64 °C og en 30 s forlengelse ved 72 °C, gjentatt 37 ganger med en endelig 5 min forlengelse ved 72 °C.
MERK: Dette ga en produktstørrelse på 260 bp for wildtype prøver og 292 bp for prøver som var Rpl22-HA +
- Utfør Cre genotyping ved hjelp av følgende primere: fremover: 5' GTGCCAGCTGAACAACAGGA 3'; revers: 5' AGGGACACAGCATTGGAGTC 3'. Klargjør PCR-reaksjonen som beskrevet i trinn 2.3.2 ved hjelp av Cre-primere i stedet. Bruk følgende termocycler forhold: en 30 s primer smeltetrinn ved 95 °C, 30 s anneal ved 60 °C og en 15 s forlengelse ved 72 °C, gjentatt 35 ganger med en endelig 5 min forlengelse ved 72 °C.
- Utfør genet av interesse genotyping som er standard for det aktuelle genet.
MERK: Forfatterens genotyping-protokoll benytter en konsentrert tilpasset Taq, og som sådan kan andre brukere måtte endre betingelsene for å passe deres enzymatiske krav. For å bedre forstå virkningen av dette genet av interesse tap på oversettelse, menn som var enten villtype eller homozygot for mutant allele av interesse, og som også var Cre + og Rpl22 + ble valgt til å være eksperimentelle prøver. Genotype valg er videre diskutert ovenfor i § 1.
3. Utarbeidelse av løsninger
MERK: Utarbeidelse av løsninger og alle påfølgende tiltak må gjøres under strenge forhold.
- For å forberede homogeniseringsbuffer (HB), tilsett 2,5 ml 1 M Tris pH 7,4, 5 ml 1 M KCl, 600 μL 1 M MgCl2og 500 μL NP-40 til 50 ml rør. Ta til volum (50 ml) i diethyl pyrokarbonat (DEPC) H2O og bland til alle komponentene er innlemmet.
MERK: De endelige konsentrasjonene vil være som følger: 50 mM Tris pH 7.4, 100 mM KCl, 12 mM MgCl2og 1% NP-40. - For å forberede høy saltvaskbuffer (HSWB), tilsett 2,5 ml 1 M Tris pH 7,4, 15 ml 1 M KCl, 600 μL 1 M MgCl2og 500 μL NP-40 til et 50 ml rør. Ta til volum (50 ml) i DEPC H2O og bland til alle komponentene er innlemmet.
MERK: De endelige konsentrasjonene vil være som følger: 50 mM Tris pH 7.4, 300 mM KCl, 12 mM MgCl2og 1% NP-40Protokollen kan settes på pause her, og løsninger kan lagres ved romtemperatur til bruk.
4. Fremstilling av vev
- Forhåndsvekt alle prøverør, opptaksvekt og forkjøles i flytende nitrogen.
- Precool steril mørtel, pestle, og veiing slikkepott på tørris.
- Grind flash-frosne vevsprøver til et fint pulver ved hjelp av en forhåndskjølt, steril mørtel og pestle på tørris.
- Plasser flash frosset vev i precooled mørtel på tørris. Bryte forsiktig vev i store biter ved hjelp av pestle og slip sakte til vev er et fint pulver.
MERK: Selv om ferskt vev også kan brukes, i henhold til den opprinnelige protokollen13,observeres ingen signifikant forskjell i utfallet ved bruk av flash-frosne vev. Se Representative resultater og diskusjon for detaljer. - Overfør forsiktig bakken prøve til precooled samling tube ved å skrape pulver fra mørtel ved hjelp av precooled slikkepott. Sørg for at bare vev samles inn og ikke fuktighet deponert på den kalde mørtelen.
- Vei røret med vev, vær forsiktig med å holde på tørris når det er mulig. Beregn massen av vev ved å trekke innledende vekt av røret fra vekten av røret med prøven i den. Registrer denne verdien for senere beregning av lysisbuffervolumer.
MERK: Protokollen kan settes på pause her, og prøver kan lagres ved -80 °C til bruk.
- Plasser flash frosset vev i precooled mørtel på tørris. Bryte forsiktig vev i store biter ved hjelp av pestle og slip sakte til vev er et fint pulver.
5. Homogenisering av prøven
- Forbered lysisbuffer (10 ml HB + kosttilskudd) ved å tilsette 10 μL av 1 M ditiothreitol (DTT), 1 proteasehemmertablett, 50 μL RNase-hemmer (40 000 enheter/ml), 200 μL av 5 mg/ml cykloheximid og 100 μL av 100 mg/ml heparin til 10 ml HB. Bland til alle komponentene er inkorporert og hold på is til bruk.
MERK: De endelige konsentrasjonene av kosttilskudd i 10 ml HB vil være som følger: 1 mM DTT, 200 U/ml RNase-hemmer, 100 μg/ml cykloheksimid og 1 mg/ml heparin. Denne løsningen må brukes innen 24 timer etter tillegg av kosttilskudd og kan holdes ved 4 °C eller på is til bruk. - For hver 100 mg prøve legger du til 1 ml lysisbuffer. Med samme pipette som brukes til å legge til lysisbufferen, pipette forsiktig den resulterende lysate opp og ned til fragmentceller og bland. Fortsett pipettering til prøven ikke lenger er viskøs, vanligvis 25-30 slag.
MERK: Fordi løsningen er veldig viskøs i begynnelsen, bør en pipette med stor diameter brukes til å blande oppløsningen. En standard 1000 μL er normalt tilstrekkelig for 100 mg vev. - Sett prøver på is i 10 min til lyse. Deretter spinner du prøver i en forkjølt sentrifuge (4 °C) i 10 min ved 10 000 x g. En stor, løs, overskyet pellet skal danne si i bunnen av røret.
- Vær forsiktig så du ikke forstyrrer pelleten, samle lysate inn i et nytt rør og ta opp volum for hver prøve. For å unngå prøveavvik, sørg for at prøvene forblir kjølige gjennom den gjenværende protokollen, lagring på is eller ved 4 °C når det er mulig.
6. Equilibration av perler
- Bruk volumet av lysat fra trinn 5.2, beregn det nødvendige volumet av magnetiske perler kombinert til riktig antistoffbindingsprotein (i dette tilfellet protein G). For 1 ml lysat, bruk 375 μL protein G perler (30 mg/ml).
MERK: Valg av konjugerte perler vil variere med anti-HA antistoff som brukes; for eksempel, hvis et kaningenerert anti-HA antistoff er valgt, vil protein A perler være å foretrekke. - Bruk et magnetisk rørstativ til å fjerne perleløsningsmiddel og tilsett et likt volum av fersk lysebuffer til perlene. Roter 5 min ved 4 °C for å vaske. Utfør alle rotasjonstrinn ved hjelp av en benkerørroter satt til 20 rpm.
- Plasser røret på magnetrørstativet og fjern vaskebufferen.
- Gjenta trinn 6.1−6.3 to ganger til.
- Tilsett lysisbuffer ved det opprinnelige volumet til likevektierte perler. Oppbevares ved 4 °C eller på is til bruk.
7. Preclearing eksempel
- Tilsett 50 μL likevektierte perler for hver 1 ml lysat til supernatant av lysed prøve (lysate) og roter ved 4 °C i 1 time.
- Plasser røret på magnetstativet og samle lysate i et friskt rør. Kast brukte perler.
- Til lysatlegge 25 μL med likevekterte perler for hver 1 ml og roter ved 4 °C i 1 t. Oppbevar gjenværende likevektiert protein G-perler ved 4 °C over natten.
- Plasser røret på magnetstativet og samle lysate i et friskt rør. Kast brukte perler. Fra den fjernede lysate, behold 50 μL for å fungere som prøveinngangskontroll. Oppbevares ved -80 °C.
MERK: Inndataprøven fungerer som en kontroll som representerer den totale RNA-populasjonen av prøven, inkludert RNAer knyttet til andre celletyper i vevet, som skal brukes under nedstrømsanalyser for å korrigere for genuttrykksendringer som en funksjon av mutasjon.
8. Inkubasjon av antistoff
- For hver 1 ml av ryddet lysat, tilsett 5 μg anti-HA antistoff. For å forhindre prøvetap, forsegle rørhetten med laboratoriefilm. Roter prøver 16-18 timer ved 4 °C.
MERK: Antistoffinkubasjonstiden og konsentrasjonen er ikke optimalisert. Forfatterne fant en overnattinginkubasjon med 5 μg for å være tilstrekkelig; Det er imidlertid mulig at en kortere inkubasjon eller mindre antistoff vil være tilstrekkelig, eller at en lengre inkubasjon eller mer antistoff vil forbedre bindingen.
9. Inkubasjon av perler
- For hver 1 ml ryddet lysat, tilsett 300 μL protein G perler. Forsegle rørhetten igjen med laboratoriefilm og roter i 2 timer ved 4 °C.
10. Vasking av perler
- Plasser prøverøret på magnetstativet slik at perler kan skilles fra IPed lysate. Pipette av gjennomstrømning lysat og kast, beholde perlene.
- Påfør 800 μL HSWB på perler og la det rotere i 10 min ved 4 °C. Plasser prøverøret på magnetstativet og la perler skille satere fra vask. Fjern og kast vask.
- Påfør ytterligere 800 μL HSWB på perler. Lukk prøven og la det rotere i 5 min ved 4 °C. Plasser prøverøret på magnetstativet og la perler skille satere fra vask. Fjern og kast vask.
- Gjenta trinn 10,3 en gang til.
11. RNA-ekstraksjon
- Plasser prøverøret på magnetstativet og la perler skille satere fra vask. Pipette av og kast vask, beholde perler for RNA ekstraksjon. Tilsett 3,5 μL på 14,2 M beta-merkaptoetanol (bME) til perler og bland ved virvlende i 15 s.
- Trekk ut RNA ved hjelp av et kommersielt RNA-rensesett, i henhold til produsentens instruksjoner. Elute prøve i 30 μL rnase gratis H2O.
MERK: Selv om 10 μL/sample DNase-behandlingen er valgfritt for de fleste sett, oppfordres den sterkt. Dette valgfrie oppryddingstrinnet reduserer bakgrunnen betydelig, noe som gir en mer nøyaktig endelig konsentrasjon. Det er sterkt recommened å bruke et sett som inneholder beta-merkaptoetanol (bME) i lysis buffer. bME fungerer som en ekstra RNase-hemmer for å forhindre prøvenedbrytning under RNA-isolasjon. - Oppbevar prøven ved -80 °C eller analyser umiddelbart.
12. Kvantifisering og prøveanalyse
- Ved hjelp av et UV-Vis spektrofotometer kvantifiserer du RNA-konsentrasjon og foreløpig kvalitet.
- Analyser kvaliteten på RNA hentet fra prøver via en bioanalysator.
MERK: Den resulterende RNA kan deretter brukes til RNA-sekvensering eller andre nedstrømsanalyser som nordvendt blotting eller kvantitativ omvendt transkripsjon PCR (qRT-PCR).
Representative Results
Tidligere rapporter har antydet ikke-spesifikk immunnedbør fra celler som mangler Cre14. For å avgjøre om dette var tilfelle i vår modifiserte protokoll, ble IP-effektivitet bestemt i prøver avledet fra dyr som bærer både Cre og Rpl22-HA og dyr som bare bærer en, men ikke den andre med forventning om at uten både en Cre-driverog Rpl22-HA,bør immunoprecipitated RNA være minimal. Som vist i figur 3,er svært lite RNA isolert fra prøver som mangler enten Cre eller Rpl22-HA som viser effektiviteten av denne protokollen for å redusere IP-bakgrunn og isolere ekte HA-merket ribosome RNAs. Videre representerer både Cre-only og Rpl22-HA-bare prøver egnede negative kontroller.
Gitt potensialet for reagenskilde til å påvirke effektiviteten av IP betydelig, ble en rekke antistoffer og RNA-isolasjonsprotokoller testet (figur 4) i Cre og Rpl22-HA positive prøver. Disse resultatene viser reagensvalg kan ha en betydelig innvirkning på IP-effektivitet, og dermed bør eventuelle endringer i reagensvalg gjøres slik med forsiktighet.
For å teste denne protokollen i sammenheng med en RNA bindende protein mutant, wildtype-Cre + Rpl22-HA + (wildtype) og genav interesse-/--Cre + Rpl22-HA + (Gene of interest-/-) testis ble undersøkt for effektiviteten av RiboTag-systemet for å isolere ribosom assosiert RNA ( Figur5). Når RNA-konsentrasjon av wildtype-inndata og IP ble sammenlignet med Genav interesse-/- inngang og IP, ble det ikke sett noen signifikant forskjell mellom genotyper. For begge genotypene var imidlertid inngangskonsentrasjonen signifikant høyere enn IP-konsentrasjonen, noe som indikerer at det var mer RNA i inngangsprøven (figur 5B). Dette resultatet forventes, da ikke alle mRNAs tilstede i cellen er forbundet med ribosomet til enhver tid, spesielt når det gjelder bakterieceller hvor RNAer kan transkriberes lenge før de oversettes.
For å bekrefte kvaliteten på RNA-prøvene som ble sendt til sekvensering, ble prøver kjørt på en bioanalysator. RNA integritettall (RIns), normalt beregnet som forholdet mellom 28S og 18S rRNA topper, ble sammenlignet på tvers av prøver. I totale RNA-bassenger forventes RIN-verdier å være nær 10 med en høyere RIN korrelert med høyere utsatt prøveintegritet og kvalitet. Mens IP-prøvene hadde lavere RIN enn inngangene, var RIN-ene fortsatt innenfor et akseptabelt område og var ikke avhengig av prøvegenotype (figur 5C). De reduserte RIN-verdiene for IPed-prøver er sannsynligvis et resultat av RNA-nedbrytning, men svært liten gitt den relativt små reduksjonen i gjennomsnittlig nukleotidlengde for analyserte RNAer. Gitt lengden på protokollen og temperaturer som kreves for immunnedbør en del nedbrytning forventes. Det er også mulig at den reduserte RIN- og RNA-lengden er en funksjon av berikelse for ikke-rRNA-arter, som mRNAs.
Figur 1: RiboTag-metoden. Premisset for metoden er biologisk enkel. En ny Exon 4 settes inn i sekvensen for Rpl22-gressstrømmen til den opprinnelige Exon 4. I nærvær av en Cre-driver kuttes loxP-områder på hver side av den opprinnelige Exon 4, og utbryter den floxed exon. Den HA-merkede Exon 4 er nå innlemmet i Rpl22 mRNA, genererer en HA merket RPL22 i celler som uttrykker CRE. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Prøveavlsordning for RiboTag-mus. Avlsordningen som brukes til å generere eksperimentelle dyr, vises. En todelt ordning ble benyttet. I generasjon 1 ble det etablert to parallelle sett med oppdrettertrioer. Den ene siden kombinerte allele av interesse (båret mors som denne spesifikke mutasjonen resulterer i mannlig infertilitet) med hemizygous Cre og på den andre kombinere allele av interesse, igjen båret morsly, med Rpl22-HA. Deretter, i generasjon 2, menn fra den første paringen som bærer allele av interesse og Cre er krysset til kvinnelige avkom av den andre paringen som bærer allele av interesse og Rpl22-HA. Genotypene til de resulterende avkombestemmes, og eksperimentelt relevante dyr valgt (i dette tilfellet enten villtype eller homozygot mutant bærer både Cre og Rpl22-HA alleles). Det er viktig å merke seg at bakteriecelle som uttrykker Cre-drivere, Cre og Rpl22-HA alleler ikke bør avle sammen før den eksperimentelle generasjonen. Eksponering av Rpl22-HA-allele til bakteriecelleuttrykt cre i avlsgenerasjoner vil drive bakteriecelle Rpl22-HA-eksisjon. Eventuelle resulterende avkom vil globalt uttrykke Rpl22-HA og dermed forhindre cellespesifikk ribosom isolasjon. I systemet som er beskrevet her, ga en n = 4 per genotype tilstrekkelig statistisk effekt for nedstrømsanalyser. Biologisk replikeringsnummer bør bestemmes for hvert eksperimentelt system. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Bekreftelse av negative kontroller. Prøver som er Cre+ og Rpl22-HA+ viser høyere RNA-pulldown enn prøver som er Cre+ eller Rpl22-HA+ alene. Det er ingen signifikant forskjell mellom Cre+ og Rpl22-HA+ prøve RNA pulldown effekt, noe som indikerer at prøver som mangler enten Cre eller Rpl22-HA er egnede negative kontroller. En "+" indikerer at den tilsvarende allele eller transgene var til stede i disse prøvene og en "-" betegner sitt fravær. IP/inngang representerer forholdet mellom RNA immunoprecipitated (IP) over total (inngang) RNA. Verdi beregnet fra konsentrasjon i nanogram. ** indikerer p < 0025. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Reagenser påvirker protokollsuksessen. (A) Flash frosset vev resulterer i immunnedbør effektivitet ligner på friskt vev. (B) IP effektivitet for to kommersielle antistoffer ble bestemt, utpekt som Antistoff 1 og Antistoff 2 (Materialtabell). Når testet, Antistoff 1 var mer effektiv til å trekke ned RNA enn Antistoff 2 som syntes å være ute av stand til å skille mellom negativ (ikke uttrykke enten Cre eller Rpl22-HA+) og positive kontroller (uttrykker både Cre og Rpl22-HA +). Prikker som indikerer forholdet mellom IPed versus input RNA for individuelle biologiske replikater. (C) Når RNA ekstraksjonssett (Materialtabell)ble sammenlignet, ble Kit 2 betydelig overgått Kit 1. Selv om begge settene IPed en tilsvarende mengde RNA fra negative kontroller, Kit 2 resulterte i en betydelig høyere RNA-avkastning fra positive prøver. * indikerer p < 0,05, ** p < 0,025, *** p < 0,01. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Anvendelse av metoden til en mutant modell. (A) Eksempel Genet av interesse genotype bekreftelse via vestlig flekkved hjelp av en tilpasset in-house antistoff mot genet av interesse protein demonstrerer Genav interesse-/- (M / M) menn ikke klarer å produsere tilhørende protein. GAPDH vises som en innlastingskontroll. (B) Grafisk bioanalysatorutgang fra sammenkoblede inndata- og IPed-prøver for villtype- og mutantprøver. (C) Sammenligning RNA integritettall (RIN) etter eksempeltype og genotype. (D) Gjennomsnittlig nukleotidlengde av RNA-arter analysert av bioanalysator etter prøvetype og genotype. * indikerer p < 0,05, ** p < 0,025, *** p < 0,01, N.S. ikke signifikant. N = 4 per genotype. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Eksempel på Cre driver bekreftelse. Kvantifisering av et gen oversatt tidlig i bakteriecelleutvikling (Stra8) og to gener oversatt sent i bakteriecelleutvikling (Tnp1 og Prm1) analysert av qRT-PCR av RNA immunoprecipitated fra RPL22-HA drevet av to forskjellige bakteriecelle Cres, Stra8-iCre (uttrykt tidlig i bakteriecelleutvikling) og Hspa2-Cre (uttrykt senere i bakteriecelleutvikling, spesielt etter Stra8-oversettelse). Her oppnås HA-IP av Stra8 med den tidlige bakteriecellen Cre driver, men ikke med den senere bakteriecellen Cre driver demonstrere celle-spesifisitet av immunnedbør. I motsetning, HA-IP av transkripsjoner oversatt i sene bakterieceller oppnås av både Stra8-iCre og Hspa2-Cre. Dette forventes som celler som uttrykker Stra8-iCre vil generere HA-merket RPL22 gjennom hele utviklingen, mens de som uttrykker Hspa2-Cre bare vil gjøre det i løpet av de senere delene av utviklingen. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Discussion
Å forstå translatomen til en bestemt celletype er uvurderlig for å forstå en celles fysiologi i normal eller mutant tilstand. Spesiell fordel er sett i systemer der oversettelse er koblet fra transkripsjon, for eksempel i nevrale vev hvor oversettelse skjer svært langt fra transkripsjon, eller i bakterieceller hvor transkripsjon skjer lenge før oversettelse. I forhold til andre metoder for translatomeanalyse kommer RiboTag-systemets største fordel fra bruk av Cre recombinase-systemet. Dette gjør det mulig å målrette mot enhver cellepopulasjon som har en relevant Cre-sjåfør. For det andre er RiboTag IP som beskrevet her, effektiv og mye mindre teknisk utfordrende og tidkrevende enn enten polysom eller ribosom profilering. Til slutt kan RiboTag IP enkelt utføres på benkeplaten.
Det finnes en rekke kritiske trinn i denne protokollen. Chief blant dem er etableringen av RiboTag muselinje og generasjon av eksperimentelle dyr for studier. Som for alle genetiske modeller, bør nøye sporing av individer i musekolonien samt forsiktige genotyping protokoller brukes. PCR genotyping som per Sanz et al. bør inkludere primere rettet mot loxP området 5 ' av wildtype exon 4 å skille mellom wildtype alleles (260 bp) og mutant (290 bp)13. For tilfelle av RiboTag analyse i bakteriecellemodeller, bør svært spesifikke avlskrav overholdes. Først, i tilfelle av mutanter som resulterer i ufruktbarhet, gjennomtenkte avlsstrategier bør inkludere metoder for å optimalisere antall avkom med ønsket genotype i mellomliggende og eksperimentelle generasjoner. For det andre, i tilfelle av bakteriecellespesifikke Cres,bør det tas hensyn til Cre-zygositet gitt følsomheten til bakterieceller til Cre toksisitet. I bakteriecellen kan høye nivåer av cre protein ha skadelige effekter22, som forbyr bruk av cre/ cre dyr i avlsordningen. Til slutt, når du bruker bakteriecelle Cres, er det viktig å isolere RiboTag-allele fra Cre til den siste generasjonen som Cre-uttrykk i bakteriecellen i en mellomliggende generasjon vil resultere i avkom som uttrykker Rpl22-HA globalt.
Uavhengig av cellesystem er en rekke anbefalte kontroller mulig å verifisere robusthet av både Cre-uttrykk og spesifisitet. Riktig uttrykk for din Cre og forventet utskjæring av Rpl22-HA kan bestemmes ved hjelp av flere metoder. I den første kan vev isolert fra eksperimentelle dyr være farget for HA ved hjelp av enten immunhistokjemi eller immunofluorescens15. Denne metoden er optimal ved at det ikke krever noen forkunnskaper om oversatte mRNAer i målcelletypene. Den andre metoden, et eksempel som er demonstrert i figur 6,krever litt kunnskap om translasjonsregulerte meldinger i målcelletypene. I denne metoden kan berikelse for en kjent translasjonsregulert mRNA bekreftes fra den valgte Cre-driverenved hjelp av kvantitativ PCR av IPed versus input RNA. På samme måte kan robuste Rpl22-HA-uttrykk bekreftes ved sammenligning av Cre+/Rpl22+-prøver (positive kontroller) med enten Cre-/Rpl22+ eller Cre+/Rpl22- prøver som fungerer som effektive negative kontroller (se figur 3). Disse sammenligningene kan enten gjøres på total IPed RNA eller berikelse for en kjent translasjonalt regulert mRNA vurdert av qRT-PCR eller en annen kvantitativ metode.
Vanlige problemer i utførelsen av protokollen har en tendens til å bare bli tydelig når RNA-utbyttet er uventet lavt eller høyt. Den vanligste årsaken til disse feilene oppstår ved feil genotyping av individer. Vi anbefaler å beholde ekstra vev fra innsamlet prøve for å bekrefte genotyper av alle prøver i tilfelle uventede RNA-utbytter. Når det er bekreftet, bør andre muligheter vurderes, inkludert muligheten for RNase-kontaminering eller prøvenedbrytning. Nøye prøveoppbevaring og håndtering og vedlikehold av RNase frie soner i laboratoriet kan i stor grad redusere eller eliminere disse problemene. Selv om RNA isolasjonproblemer er et annet potensielt problem i denne protokollen, reduserer bruken av kommersielle sett i stor grad dette problemet, selv om det bør tas hensyn til at de opprettholdes som RNase gratis og inneholder ingen utløpte løsninger. Til slutt, som med alle antistoffbaserte prosedyrer, har variasjoner i mye, lagringsforhold, konsentrasjon eller til og med frakt potensial til å påvirke antistoffets kvalitet negativt og den påfølgende suksessen til nedtrekkingen. Som et resultat, etter nøye og gjentatt testing, valgte vi det mest konsekvente og effektive antistoffet som er tilgjengelig.
Denne protokollen inneholder to store endringer i forhold til andre publiserte RiboTag-protokoller som forbedrer sannsynligheten for suksess betydelig. Den ene er evnen til å bruke flash frosset vev, og dermed redusere eventuelle problemer som involverer mye, tekniker, eller tekniske kjøre variasjoner. Prøver kan samles inn og lagres slik at isolasjon av HA-ribosomer fra alle prøver samtidig, noe som senker det som kan være store kilder til variasjon. For det andre reduserer tillegget av det forhåndsklare trinnet betydelig den type bakgrunn rapportert av andre brukere av RiboTag-systemet. Nylig indikerer en protokollrapport fra Sanz et al. tilstedeværelsen av høy bakgrunn på grunn av overflod av ribosome-tilknyttede transkripsjoner fra ikke-Cre-drevneceller14. Vår protokoll rettsmidler dette problemet ved å inkludere en preclearing trinn, effektivt eliminere tilstedeværelsen av RNA i Cre negative IP-prøver.
Som alle systemer bør de iboende begrensningene i RiboTag-systemet holdes i bakhodet. Når du bruker ukarakteriserte Cre-drivere, bør analyse av uttrykk utføres før eksperimentell prøveproduksjon. Fra oversettelsesperspektivet bør flere nyanser av denne metoden noteres. Først tillater RiboTag ikke differensiering mellom mRNAs klar til å oversette og de som aktivt oversetter. Som sådan tillater ikke gjeldende RiboTag-baserte metoder kvantifisering av oversettelseseffektivitet som en funksjon av individuelle mRNAer. Hvis oversettelseseffektivitet er av interesse, kan den måles på cellespesifikk basis hvis RiboTag-metoden kombineres med andre translatomeanalyseverktøy som polysom profilering. For det andre er det grunnleggende å ta hensyn til totale RNA overflod endringer som stammer fra individuell eller genotype avhengig varians. Det er av denne grunn at forsiktig isolering av input RNA følger immunnedbør og prøver avledet fra hver forblir paret gjennom eventuelle nedstrøms analyser. Til slutt, og i forhold til RiboTag-basert analyse, bør det huskes at tilknytning til en ribosom ikke nødvendigvis bevise oversettelse skjer. Sekundære analysemetoder bør utføres for å bekrefte translasjonsregulering i mål av interesse.
Denne protokollen beskriver isolasjonen av ribosome-tilknyttede RNAer fra bakteriecellene til hannmus ved hjelp av RiboTag-modellen. Ikke regnskap for mus avl og prøve samling, tar protokollen to dager, med tre timer den første dagen, best gjort på ettermiddagen, en overnatting inkubasjon, etterfulgt av fem timers arbeid den påfølgende morgenen. Det anbefales på det sterkeste at utarbeidelse av lagerløsninger (HB og HSWB) samt vevsliping gjøres på forhånd. Den generelle suksessen til protokollen er avhengig av riktig genotyping og strenge RNase-frie forhold. Evnen til å undersøke translatomen av bestemte celletyper vil tillate fremtidige studier å bedre forstå forholdet mellom transkripsjon, oversettelse og proteome i utallige celletyper og mutant bakgrunn.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av NIH gi NICHD R00HD083521 til EMS og intern støtte fra Rutgers University til EMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 1,4-Dithio-DL-threitol (8% | Alfa Aesar | A15797 | |
| 1.7 mL or 2mL tubes | Preference of researcher | ||
| 10 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
| 10 mL serological pippettes | Preference of researcher | ||
| 10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 5 mL serological pipettes | Preference of researcher | ||
| 50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
| Anti-HA tag antibody | Abcam | ab18181 | Antibody 1 |
| Anti-HA tag antibody | Antibodies.com | A85278 | Antibody 2 |
| B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ Mice | The Jackson Laboratory | 17490 | Or mice carrying Cre driver of choice |
| B6N.129-Rpl22tm1.1Psam/J Mice | The Jackson Laboratory | 11029 | |
| Benchtop centrifuge | Preference of researcher | ||
| C1000 Touch thermal cycler | BioRad | 184-1100 | Or equivalent thermal cycler |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000537 | Or equivalent refrigerated centrifuge |
| Cyclohexamide | Sigma Aldrich | C7698-1g | |
| Dissection scissors | Preference of researcher | ||
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 10009D | |
| DynaMag-2 Magnet rack | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| E.Z.N.A. Total RNA Kit 1 | OMEGA | 6834-01 | Kit 1 |
| Heat block | Preference of researcher | ||
| Heparin | Sigma Aldrich | 84020 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272-500g | |
| Microdissection forceps | Preference of researcher | ||
| Microdissection scissors | Preference of researcher | ||
| MiRNeasy kit | Qiagen | 217004 | Kit 2 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Or equivalent spectrophotometer |
| NP-40 Alternative - CAS 9016-45-9 - Calbiochem | Millipore Sigma | 492016 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | ThermoFisher Scientific | A32965 | |
| Potassium (KCl) | Sigma Aldrich | P3911-2.5kg | |
| RNase Inhibitor, Murine | New England BioLabs Inc. | M0314 | |
| SI vortex-genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Or equivalent benchtop vortex |
| Tips for 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-500 | |
| Tube Revolver / Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Or equivalent rotator |
| VWR Powerpette Plus pipet controller | VWR | 75856-450 | Or equivalent pipette controller |
References
- Snyder, E. M., et al. Gene expression in the efferent ducts, epididymis, and vas deferens during embryonic development of the mouse. Developmental Dynamics. 239 (9), 2479-2491 (2010).
- Snyder, E. M., Small, C. L., Li, Y., Griswold, M. D. Regulation of gene expression by estrogen and testosterone in the proximal mouse reproductive tract. Biology of Reproduction. 81 (4), 707-716 (2009).
- Iguchi, N., Tobias, J. W., Hecht, N. B. Expression profiling reveals meiotic male germ cell mRNAs that are translationally up- and down-regulated. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 103 (20), 7712-7717 (2006).
- Busada, J. T., et al. Retinoic acid regulates Kit translation during spermatogonial differentiation in the mouse. Developmental Biology. 397 (1), 140-149 (2015).
- Kleene, K. Patterns of translational regulation in the mammalian testis. Molecular Reproduction and Development. 43 (2), 268-281 (1996).
- Mali, P., et al. Stage-specific expression of nucleoprotein mRNAs during rat and mouse spermiogenesis. Reproduction Fertilility and Development. 1 (4), 369-382 (1989).
- Steward, O., Schuman, E. M. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. Annual Review of Neuroscience. 24, 299-325 (2001).
- Michel, A. M., Baranov, P. V. Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).
- Snyder, E., et al. Compound Heterozygosity for Y Box Proteins Causes Sterility Due to Loss of Translational Repression. PLoS Genetics. 11 (12), 1005690 (2015).
- Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. Polysome Profiling Analysis of mRNA and Associated Proteins Engaged in Translation. Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).
- McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling. Methods. 126, 112-129 (2017).
- Aeschimann, F., Xiong, J., Arnold, A., Dieterich, C., Grosshans, H. Transcriptome-wide measurement of ribosomal occupancy by ribosome profiling. Methods. 85, 75-89 (2015).
- Sanz, E., et al. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
- Sanz, E., Bean, J. C., Carey, D. P., Quintana, A., McKnight, G. S. RiboTag: Ribosomal Tagging Strategy to Analyze Cell-Type-Specific mRNA Expression In Vivo. Current Protocols in Neuroscience. 88 (1), 77 (2019).
- Sanz, E., et al. RiboTag analysis of actively translated mRNAs in Sertoli and Leydig cells in vivo. PLoS One. 8 (6), 66179 (2013).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Ceolin, L., et al. Cell Type-Specific mRNA Dysregulation in Hippocampal CA1 Pyramidal Neurons of the Fragile X Syndrome Mouse Model. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 340 (2017).
- Puighermanal, E., et al. drd2-cre:ribotag mouse line unravels the possible diversity of dopamine d2 receptor-expressing cells of the dorsal mouse hippocampus. Hippocampus. 25 (7), 858-875 (2015).
- Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes and Development. 25 (7), 755-766 (2011).
- Lesiak, A. J., Brodsky, M., Neumaier, J. F. RiboTag is a flexible tool for measuring the translational state of targeted cells in heterogeneous cell cultures. Biotechniques. 58 (6), 308-317 (2015).
- The Jackson Laboratory. B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ. , The Jackson Laboratory. (2019).
- Bao, J., Ma, H. Y., Schuster, A., Lin, Y. M., Yan, W. Incomplete cre-mediated excision leads to phenotypic differences between Stra8-iCre; Mov10l1(lox/lox) and Stra8-iCre; Mov10l1(lox/Delta) mice. Genesis. 51 (7), 481-490 (2013).
