Summary
Här beskriver vi immunnederbörd av ribosomer och tillhörande RNA från utvalda populationer av vuxna manliga musbakterier celler med hjälp av RiboTag-systemet. Strategisk avel och noggrann immunnederbörd resulterar i rena, reproducerbara resultat som informerar om könscellsöversättning en inblick i mekanismerna för muterade fenotyper.
Abstract
Kvantifiera skillnader i mRNA överflöd är ett klassiskt tillvägagångssätt för att förstå effekterna av en viss genmutation på cellfysiologi. Teckenskillnader i översättaren (hela översatta mRNAs) ger dock ytterligare ett lager av information som är särskilt användbar när man försöker förstå funktionen av RNA-reglering eller bindande proteiner. Ett antal metoder för att åstadkomma detta har utvecklats, inklusive ribosome profilering och polysome analys. Båda metoderna har dock betydande tekniska utmaningar och kan inte tillämpas på specifika cellpopulationer i en vävnad om de inte kombineras med ytterligare sorteringsmetoder. RiboTag-metoden är däremot ett genetiskt baserat, effektivt och tekniskt enkelt alternativ som gör det möjligt att identifiera ribosomassocierade RNA-kort från specifika cellpopulationer utan att lägga till sorteringssteg, förutsatt att en tillämplig cellspecifik Cre-drivrutin finns tillgänglig. Denna metod består av avel för att generera genetiska modeller, provinsamling, immunnederbörd och nedströms RNA-analyser. Här beskriver vi denna process i vuxna manliga musbakterier celler mutant för en RNA bindande protein som krävs för manlig fertilitet. Särskild uppmärksamhet ägnas åt överväganden för avel med fokus på effektiv koloniförvaltning och generering av korrekt genetisk bakgrund och immunnederbörd för att minska bakgrunden och optimera produktionen. Diskussion om felsökningsalternativ, ytterligare bekräftande experiment och potentiella nedströmsprogram ingår också. De presenterade genetiska verktygen och molekylära protokoll utgör ett kraftfullt sätt att beskriva de ribosomassocierade RNAs av specifika cellpopulationer i komplexa vävnader eller i system med avvikande mRNA-lagring och översättning med målet att informera om de molekylära drivkrafterna för mutantfenotyper.
Introduction
Analys av en cell eller vävnads RNA överflöd, som undersöks av microarray eller RNA-sekvensering, har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att förstå de molekylära drivkrafterna för mutantfenotyper. Dessa relativt ofullständiga analysverktyg får dock inte informera om cellens fysiologi eller proteom, särskilt i system där många mRNAs lagras före översättning såsom neurala och könsceller. I dessa system, definiera befolkningen i mRNAs aktivt översätts till protein, eller cellens translatome, kan vara en bättre indikator på cellens faktiska fysiologiska tillstånd1,2. Till exempel könsceller i olika utvecklingsstadier transkribera RNAs som lagras för senare översättning, drivs antingen av utvecklingsmässiga3 eller signalering ledtrådar4. Denna process exemplifieras av mRNAs kodning protaminer, där mRNA avskrift är detekterbara dagar innan proteinet görs1,2,5,6. På samma sätt transkriberar neurala celler RNA i kärnan och transportera ner yxan, vilket är fallet med β-actin7. Förutom dessa specialiserade cellsystem, steady-state transkriptomer är osannolikt att vara informativ i modeller där RNA lagring, ribosome biogenesis, eller mRNA översättning påverkas. Flera andra faktorer kan också påverka en cells steady-state RNA pool inkluderar mRNA förfall och aktiviteten av RNA bindande proteiner. I dessa fall är robusta verktyg för att analysera ribosomassocierade RNAs eller mRNAs under aktiv översättning mer benägna att ge biologiskt relevanta resultat.
I detta syfte har flera metoder utvecklats för att identifiera ribosomassocierade eller aktivt översatta meddelanden. Polysome profilering, som ger en ögonblicksbild av ribosom associerade utskrifter, har använts i många decennier för att isolera intakta RNAs i samband med antingen ribosomal underenheter eller mono-, di-, och poly-ribosom komplex3. Kortfattat appliceras insamlade celllysningar på en linjär sackarosgradient och centrifugeras som hög hastighet, vilket resulterar i separation av ribosomerna, intakta ribosomer och polysomer efter storlek. Traditionellt har denna teknik tillämpats för att studera en eller några mRNAs, men nyligen har denna metod kombinerats med RNA-seq studier för att belysa funktionen hos potentiella translationella regulatorer8,9 Medan ett kraftfullt sätt att skilja mellan aktivt översätta och icke-översätta mRNAs10,polysome profilering kräver tidskrävande metoder (gradient fraktionering och ultracentrifug) och kan kräva en hel del prov gör analysen av sällsynta cell populationer utmanande.
Ett alternativt tillvägagångssätt för att undersöka översättan är ribosome profilering, som identifierar de delar av utskrifter som är direkt förknippade med ribosomen. I korthet genereras ribosomassocierade RNA-fragment via RNase skyddsanalys, enskilda ribosomkomplex åtskilda via sackarosgradient och tillhörande RNA-fragment isolerade och konverterade till RNA-seq-taggar som är mottagliga för djupsekvensering11. En av de viktigaste fördelarna för ribosome profilering är förmågan att bestämma de specifika platserna för ribosomerna vid tidpunkten för isolering som gör det möjligt att identifiera översättningstart platser, beräkning av ribosomal beläggning och distribution, och identifiering av ribosom bås12. Denna metod har dock flera inneboende nackdelar, inklusive utrustningsbehov (gradientfraktioneratorn och ultracentrifug), ett relativt komplext protokoll som kräver omfattande felsökning och beräkningsproblem som inte lätt hanteras av den oerfarna användaren11. Viktigt, ribosome profilering tillämpas främst på isolerade celler i kulturen och kräver betydande material, vilket gör dess tillämpning på blandade cell-typ vävnader eller sorterade celler från in vivo begränsad.
Den däggdjurribotag metod, som utvecklats av Sanz et al. under 200913, eliminerar ett antal frågor som är inneboende i både polysomoch ribosome profilering. I denna metod kan ribosome-associerade RNAs isoleras från specifika celltyper som möjliggör undersökning av celltyp specifika översättar i komplexa vävnader utan ytterligare isoleringtekniker och specialiserad utrustning, vilket är nödvändigt i andra metoder13,14. Grunden för RiboTag-metoden är en transgen musmodell (RiboTag) som bär en modifierad locus för 60S ribosomal subunit protein gen Rpl22. Denna locus (Rpl22-HA) innehåller en floxed terminal exon följt av en ytterligare kopia av terminalexon ändras för att inkludera en C-terminal hemagglutinin (HA) tag inom kodning regionen. När den korsas till en mus som uttrycker en cellspecifik Cre Recombinase tas den floxed exon bort så att uttrycket av HA-märkta RPL22 på ett cellspecifikt sätt(figur 1). HA-taggen kan sedan användas för att immunoprecipitate (IP) ribosomer och deras tillhörande RNAs från den valda celltypen.
Förutom den första publikationen som utvecklade tekniken har flera andra laboratorier använt RiboTag-modellen. Olika vävnader som mus Sertoli och Leydig celler15, microglia16, nervceller17,18, äggceller19, och odlade celler20 har profilerats och studerats. Även om detta protokoll är klart kunna framgångsrikt isolera ribosomer och tillhörande RNAs över en mångsidig vävnad typer finns det fortfarande områden som behöver förbättras, särskilt när de tillämpas på mutantsystem. I synnerhet leder vanligt beroende av färsk vävnad till ökad teknisk variation som i hög grad kan minska analysens kraft. För det andra, säker identifiering av differentierade översatta mål görs mer utmanande när hög immunnederbörd bakgrund uppstår frånicke-Cre recombined celltyper som tidigare rapporterats13. Medan Sanz et al. konstruerade den grundläggande förutsättningen för tekniken, presenterar Snyder-laboratoriet i detta manuskript optimering av protokollet för att minska dessa problem, vilket gör metoden mer praktisk och effektiv.
Syftet med denna artikel är att förklara stegen för avel möss uttrycker cell-specifika HA-märkta ribosomer, immunoprecipitating dessa ribosomer från flash-frysta prover, och rena sina tillhörande RNAs för ytterligare nedströms analyser. Eftersom däggdjurscellen i hanen och infertilitetsmutationen som studeras ger unika utmaningar har ansträngningar gjorts för att belysa hur denna teknik kan anpassas till andra cellsystem.
Protocol
Alla djuranvändnings- och hanteringsmetoder har godkänts av Rutgers University's Internal Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Musavel
- Ras kvinnliga möss homozygous för en RNA bindande proteinmutation som leder till manlig infertilitet (manuskript som förberedelse, kallad häri som gen av intresse) i trioparings till män hemizygous för Stra8-iCre allele (B6. FVB-Tg (Stra8-iCre)1Reb/LguJ) (Cre+), som parning två honor till varje hane ökar aveleffektivitet.
OBS: Den muterade genen av intresse (M) passerades maternally, som honor homozygous för M har normal fertilitet. Detta har den extra fördelen av att tillåta faderlig överföring av den manliga könsceller Cre (hemizygous), som rekommenderas21 och optimera procent av avkomma med önskad allelisk kombination. Eftersom homozygous Cres uppvisar könsceller toxicitet22,rekommenderas det allel en underhålls och passeras i en heterozygous eller hemizygous tillstånd. Viktigt, Cre uttryck får inte samuppträda med Rpl22-HA allelförrän den experimentella befolkningen. Underlåtenhet att isolera Rpl22-HA allel från Cre i avelsdjur kommer att resultera i avkommor som globalt uttrycker Rpl22-HA på grund av könsceller Cre aktivitet. Det här problemet är specifikt för könsceller. Dessutom är Stra8-iCre specifik för författarnas cellpopulation av intresse22, inriktning celler som övergår till och mycket tidigt i meios, inklusive preleptotenes och leptotenes. En annan Cre-drivrutin som är specifik för en annan celltyp av intresse kan användas i stället. Vanlig praxis dikterar manlig bakteriecell uttryckt Cres överföras på faderliga sidan. Det är dock möjligt moderns överföring av Stra8-iCre kommer att resultera i liknande transgen uttryck hos manliga avkommor. Oavsett utelssystem som valts, för att generera avkommor med motsvarande Cre-uttryck, bör alla experimentella prover genereras via Cre-överföring från samma föräldrasida (antingen alltid moderns eller alltid faderliga). - Genotyp resulterande manliga valpar som beskrivs i avsnitt 2.4. Välj dem som bär M allel och positivt för Cre (+/M:Cre+) för nedströmsavel.
- Ras kvinnliga möss homozygous för M alleli trio parningar till män homozygous för Rpl22-HA (B6J.129 (Cg)-Rpl22tm1.1Psam/SjJ).
OBS: Rpl22-HA bakgrunden är mycket blandad, så försiktighet bör iakttas vid bedömning av stamspecifika fenotyper. - Genotyp resulterande kvinnliga valpar för att identifiera dem som bär M allel och positiva för Rpl22-HA (+/M:Rpl22-HA+) (se avsnitt 2.3). Välj dessa honor för nedströmsavel.
- Cross +/M:Cre+ hanar med +/M:Rpl22+ honor i trioparings. Genotype de resulterande valparna (se avsnitten 2.3 och 2.4) för att identifiera hanar som är både Cre+ och Rpl22+ och antingen wildtype eller M/M.
OBS: Eftersom detta arbete fokuserar på en mutation som resulterar i fullständig manlig infertilitet, särskilda överväganden har tagits i avelsprogrammet för att mest effektivt få önskad experimentellgenotyper. Sådana överväganden kan vara onödiga i andra experimentella modeller. Se figur 2 för en fullständig avelsschematisk och medföljande legend för ytterligare diskussion om avelsöverväganden.
2. Provtagning av stickprov
- Samla in testiklar från hanmöss vid 21 dagar efter förlossningen (dpp).
- Offra möss genom CO2 inandning följt av livmoderhalscancer störning. Gör en ventral snitt (3 cm) på varje djur flankerad av två kortare (2 cm vardera), anslutna laterala snitt. Dra huden och buktett tillbaka för att avslöja testiklarna.
- Med hjälp av pincett, dra den epidymal fett pad från ena sidan av kroppen hålighet för att avslöja epididymis och testis. Med tenotomy sax, punktskatt testis, var noga med att trimma bort epididymis, omgivande fett, och eventuella externa vasculature. Placera intakta testiklar i ett rent 1,7 ml-rör.
- Upprepa med andra sidan, lägga till den andra testiklarna till det första röret. Täck detta rör och omedelbart doppa det i flytande kväve för att blinka-frysa.
OBS: Proverna kan bevaras vid -80 °C fram till användning.
- Samla in ytterligare svansspetsprover för varje djur (2 mm) för genotypningsbekräftelse.
- För att extrahera DNA, tillsätt 100 μl av 50 mM NaOH till en 2 mm svans spets i en 1,7 ml rör och koka vid 95 °C i 30 min. Tillsätt 100 μl av 50 mM HCl och 20 μL av 1 M Tris-HCl pH 8.0 och centrifugprover i 3 min vid 10.000 x g. Behåll supernatant (innehållande genomiskt DNA) och förvara extraherat DNA vid 4 °C tills den används som mall för följande genotypningsreaktioner.
- Utför Rpl22-HA genotypning efter en metod anpassad från Sanz et al.13 med hjälp av följande primers: framåt: 5' GGGAGGCTGCTGGATATG 3'; omvänd: 5' TTTCCAGACACAGGCTAAGTACAC 3'.
- Förbered en reaktionsblandning bestående av 2 μL DNA som extraherats i steg 2.2.1, 0,08 μL 25 mM dNTPs, 0,1 μL av 10 mM framåtprimer. 0,1 μL av 10 mM omvänd primer, 2 μL av en polymeraskedjereaktion (PCR) buffert (650 mM Tris pH = 8,8, 165 mM (NH4)2SO4, 30 mM MgCl2, och 0,1% Tween), 0,2 μL taq polymeras och nuclease-free H2O till en total volym på 20 μL.
- Använd följande termohjulsförhållanden: ett 30-tals primer smältsteg vid 95 °C, 30 s anneal vid 64 °C och en 30 s långlivslängd vid 72 °C, upprepas 37 gånger med en slutlig 5 min förlängning vid 72 °C.
OBS: Detta gav en produktstorlek på 260 bp för wildtype prover och 292 bp för prover som var Rpl22-HA +
- Utför Cre genotyping med hjälp av följande grundfärger: framåt: 5'GTGCCAGCTGAACAACAGGA 3'; omvänd: 5' AGGGACACAGCATTGGAGTC 3'. Förbered PCR-reaktionen enligt beskrivningen i steg 2.3.2 med hjälp av Cre primers istället. Använd följande termohjulsförhållanden: ett 30-tals primersmältsteg vid 95 °C, 30 s anneal vid 60 °C och en 15 s långhet vid 72 °C, upprepas 35 gånger med en slutlig 5 min förlängning vid 72 °C.
- Utför gen av intresse genotyping som är standard för genen i fråga.
OBS: Författarens genotypning protokoll använder en koncentrerad anpassade Taq, och som sådan, andra användare kan behöva ändra villkoren för att passa deras enzymatiska krav. För att bättre förstå effekten av denna gen av intresse förlust på översättning, män som var antingen wildtype eller homozygous för mutant allel av intresse och som också cre + och Rpl22 + valdes ut som experimentella prover. Genotyp urval diskuteras vidare ovan i avsnitt 1.
3. Utarbetande av lösningar
OBS: Utarbetande av lösningar och alla efterföljande steg måste göras under stränga förhållanden.
- För att förbereda homogeniseringsbuffert (HB) lägger du till 2,5 ml 1 M Tris pH 7,4, 5 ml 1 M KCl, 600 μL 1 M MgCl2och 500 μL NP-40 till ett 50 ml-rör. Bringa till volym (50 ml) i dietyl pyrokarbonat (DEPC) H2O och blanda tills alla komponenter ingår.
OBS: De slutliga koncentrationerna kommer att vara följande: 50 mM Tris pH 7,4, 100 mM KCl, 12 mM MgCl2, och 1% NP-40. - För att förbereda hög salttvättbuffert (HSWB) tillsätt 2,5 ml 1 M Tris pH 7,4, 15 ml 1 M KCl, 600 μL 1 M MgCl2och 500 μl NP-40 till ett 50 ml-rör. Ta till volym (50 ml) i DEPC H2O och blanda tills alla komponenter ingår.
OBS: De slutliga koncentrationerna kommer att vara följande: 50 mM Tris pH 7,4, 300 mM KCl, 12 mM MgCl2, och 1% NP-40Protokollet kan pausas här, och lösningar kan lagras i rumstemperatur tills användning.
4. Beredning av vävnad
- Förväg alla provrör, inspelningsvikt och förkylning i flytande kväve.
- Precool steril murbruk, mortel, och vägning spatel på torris.
- Mala blixtfrysta vävnadsprover till ett fint pulver med hjälp av en förkyld, steril murbruk och mortel på torris.
- Placera blixtfryst vävnad i förkyld murbruk på torris. Försiktigt bryta vävnad i stora bitar med mortel och slipa långsamt tills vävnaden är ett fint pulver.
OBS: Även om färsk vävnad också kan användas, enligt det ursprungliga protokollet13,observeras ingen signifikant skillnad i resultatet med användning av flash-frysta vävnader. Mer information finns i representativa resultat och diskussion. - Överför noggrant markprov till förkylt samlingsrör genom att skrapa pulver från murbruk med förkyld spatel. Se till att endast vävnad samlas in och inte någon fukt deponeras på den kalla murbruket.
- Väg röret med vävnad, var noga med att hålla på torris när det är möjligt. Beräkna vävnadens massa genom att subtrahera rörets initiala vikt från rörets vikt med provet i den. Registrera det här värdet för senare beräkning av lyssbuffertvolymer.
OBS: Protokollet kan pausas här, och prover kan lagras på -80 °C tills det används.
- Placera blixtfryst vävnad i förkyld murbruk på torris. Försiktigt bryta vävnad i stora bitar med mortel och slipa långsamt tills vävnaden är ett fint pulver.
5. Homogenisering av provet
- Förbered lysbuffert (10 ml HB + kosttillskott) genom att lägga till 10 μL av 1 M dithiothreitol (DTT), 1 proteashämmare tablett, 50 μL av RNase-hämmare (40.000 enheter/ml), 200 μL av 5 mg/mL cycloheximide, och 100 μL av 100 mg/ml heparin till 10 ml HB. Blanda tills alla komponenter är införlivade och håll på is tills de används.
OBS: De slutliga koncentrationerna av kosttillskott i 10 ml HB kommer att vara följande: 1 mM DTT, 200 U/mL RNase-hämmare, 100 μg/ml cycloheximide och 1 mg/mL heparin. Denna lösning skall användas inom 24 h från tillsatsen av kosttillskott och kan hållas vid 4 °C eller på is tills användning. - För varje 100 mg prov, tillsätt 1 ml lysbuffert. Med samma pipett används för att lägga till lysbufferten, försiktigt pipette den resulterande lysate upp och ner till fragmentceller och blanda. Fortsätt pipettning tills provet inte längre är viskös, i allmänhet 25−30 slag.
OBS: Eftersom lösningen är mycket viskös i början, en stor diameter pipett bör användas för att blanda lösningen. En standard 1000 μL är normalt tillräcklig för 100 mg vävnad. - Ställ prover på is i 10 min till lysen. Sedan, spinnprover i en förkyld centrifug (4 °C) i 10 min vid 10 000 x g. En stor, lös, grumlig pellet bör bildas i botten av röret.
- Var noga med att inte störa pelleten, samla in lysat i ett nytt rör och rekordvolym för varje prov. För att förhindra provavgredataion, se till att proverna förblir svala i hela det återstående protokollet, lagring på is eller vid 4°C när så är möjligt.
6. Jämvikt av pärlor
- Beräkna den nödvändiga volymen av magnetiska pärlor kopplade till lämpligt antikroppsbindande protein (i detta fall protein G). För 1 ml lysate, använd 375 μl proteingpärlor (30 mg/ml).
OBS: Valet av konjugerade pärlor varierar med anti-HA antikroppar som används; Till exempel, om en kaningenererad anti-HA antikropp väljs, protein A pärlor kommer att vara att föredra. - Ta bort binadlösningsmedel med hjälp av ett magnetiskt rörställ och tillsätt en lika stor volym färsk lysbuffert till pärlorna. Rotera 5 min vid 4 °C för att tvätta. Utför alla rotationssteg med hjälp av en bänkrörsrotator inställd på 20 varv/min.
- Placera röret på det magnetiska rörstället och ta bort tvättbufferten.
- Upprepa steg 6.1−6.3 två gånger till.
- Lägg lysbuffert vid den ursprungliga volymen till jämvikta pärlor. Förvaras vid 4 °C eller på is tills den används.
7. Preclearing prov
- Tillsätt 50 μl hästdjur för varje 1 ml lysate till supernatant av lysedprov (lysate) och rotera vid 4 °C för 1 h.
- Placera röret på magnetstället och samla in lysate i ett nytt rör. Kasta använda pärlor.
- Till lysat tillsätt 25 μl jämvikta pärlor för varje 1 ml och rotera vid 4 °C för 1 h. Lagra återstående ekviliberade protein G pärlor vid 4 °C över natten.
- Placera röret på magnetstället och samla in lysate i ett nytt rör. Kasta använda pärlor. Från den rensade lysningen, behåll 50 μL för att fungera som provinmatningskontroll. Förvaras vid -80 °C.
OBS: Ingångsprovet fungerar som en kontroll som representerar den totala RNA-populationen av provet, inklusive RNA-enheter som är associerade med andra celltyper i vävnaden, som ska användas under nedströmsanalyser för att korrigera för genuttrycksförändringar som en funktion av mutationen.
8. Inkubation av antikropp
- För varje 1 ml rensad lysate, tillsätt 5 μg anti-HA antikroppar. För att förhindra provförlust, försegla rörlocket med laboratoriefilm. Rotera proverna 16−18 h vid 4 °C.
OBS: Antikroppsinkubationstiden och koncentrationen har inte optimerats. Författarna fann en övernattning inkubation med 5 μg vara tillräcklig; Det är dock möjligt att en kortare inkubationsinformation eller mindre antikropp kommer att vara tillräcklig, eller att en längre inkubationsinformation eller mer antikropp kommer att förbättra bindningen.
9. Inkubation av pärlor
- För varje 1 ml rensad lysate, tillsätt 300 μl protein G pärlor. Återförseglar rörlocket med laboratoriefilm och rotera r 2 h vid 4 °C.
10. Tvättning av pärlor
- Placera provröret på magnetstället så att pärlorna kan separeras från IPed lysate. Pipette utanför flow-through lysate och kasta, behålla pärlorna.
- Applicera 800 μl HSWB på pärlor och låt rotera i 10 min vid 4 °C. Placera provröret på magnetgallret och låt pärlorna separera från tvätt. Ta bort och kassera tvätt.
- Applicera ytterligare 800 μl HSWB på pärlor. Stäng provet och låt rotera i 5 min vid 4 °C. Placera provröret på magnetgallret och låt pärlorna separera från tvätt. Ta bort och kassera tvätt.
- Upprepa steg 10.3 igen.
11. RNA extraktion
- Placera provröret på magnetgallret och låt pärlorna separera från tvätt. Pipette av och kasta tvätt, behålla pärlor för RNA utvinning. Tillsätt 3,5 μl 14,2 M beta-mercaptoetanol (bME) till pärlor och blanda genom virvlande för 15 s.
- Extrahera RNA med hjälp av ett kommersiellt RNA-reningssats enligt tillverkarens anvisningar. Elute prov i 30 μL rnase fri H2O.
OBS: Även om 10 μL/prov DNase-behandlingen är valfri för de flesta satser, uppmuntras den starkt. Detta valfria saneringssteg minskar avsevärt bakgrunden, vilket möjliggör en mer exakt slutlig koncentration. Det är starkt recommened att använda ett kit som innehåller beta-mercaptoetanol (bME) i lysis buffert. bME fungerar som en ytterligare RNase-hämmare för att förhindra provnedbrytning under RNA-isolering. - Förvara provet vid -80 °C eller analysera omedelbart.
12. Kvantifiering och provanalys
- Med hjälp av en UV-Vis spektrofotometer, kvantifiera RNA-koncentration och preliminär kvalitet.
- Analysera kvaliteten på RNA som extraheras från prover via en bioanalysator.
OBS: Den resulterande RNA kan sedan användas för RNA-sekvensering eller andra nedströms analyser såsom norrgående blotting eller kvantitativomvänd transkription PCR (qRT-PCR).
Representative Results
Tidigare rapporter har föreslagit icke-specifika immunnederbörd från celler som saknar Cre14. För att avgöra om detta var fallet i vårt ändrade protokoll fastställdes IP-effektivitet i prover som härrör från djur som transporterar både Cre och Rpl22-HA och djur som endast transporterar en men inte den andra med förväntan att utan både cre-driveroch Rpl22-HA, immunoprecipitated RNA bör vara minimal. Som visas i figur 3,mycket lite RNA är isolerad från prover som saknar antingen Cre eller Rpl22-HA visar effektiviteten i detta protokoll för att minska IP-bakgrund och isolera äkta HA-märkta ribosom RNAs. Vidare representerar både Prover na Cre-only och Rpl22-HAlämpliga negativa kontroller.
Med tanke på reagenskällans potential att avsevärt påverka ip-undersökningsperiodens effektivitet testades en rad antikroppar och RNA-isoleringsprotokoll(figur 4)i Cre- och Rpl22-HA-positiva prover. Dessa resultat visar reagens val kan ha en betydande inverkan på IP effektivitet så alla ändringar av reagens urval bör göras med försiktighet.
För att testa detta protokoll i samband med en RNA-bindande proteinmutant undersöktes wildtype-Cre+Rpl22-HA+ (wildtype) och gen av intresse-/--Cre+Rpl22-HA+ (Gene of interest-/-) testis för riboTag-systemets effektivitet för att isolera ribosomassocierade RNA(figur 5). När RNA-koncentrationen av wildtype-ingång och IP jämfördes med Gene av intresse-/- insatsoch IP sågs ingen signifikant skillnad mellan genotyper. För båda genotyperna var dock ingångskoncentrationen betydligt högre än IP-koncentrationen, vilket tyder på att det fanns fler RNA i ingångsprovet(figur 5B). Detta resultat förväntas, eftersom inte alla mRNAs som finns i cellen är associerade med ribosom vid varje given tidpunkt, särskilt när det gäller könsceller där RNAs kan transkriberas långt innan de översätts.
För att bekräfta kvaliteten på rna-prover som skickades för sekvensering kördes prover på en bioanalysator. RNA integritetsnummer (RINs), normalt beräknat som förhållandet mellan 28S och 18S rRNA-toppar, jämfördes mellan proverna. I totalt ANTAL RNA-pooler förväntas RIN-värdena vara nära 10 med en högre RIN korrelerad till högre uppskjuten provintegritet och kvalitet. Medan IP-proverna hade lägre RIN än ingångarna, var De-riterna fortfarande inom ett godtagbart intervall och var inte beroende av provgenotyp(figur 5C). De reducerade RIN-värdena för IPed-prover är sannolikt ett resultat av RNA-nedbrytning, men mycket liten med tanke på den relativt lilla minskningen av den genomsnittliga nukleotidslängden hos analyserade RNAs. Med tanke på längden på protokollet och temperaturer som krävs för immunnederbörd en viss nedbrytning förväntas. Det är också möjligt att den reducerade RIN- och RNA-längden är en funktion av anrikning för icke-rRNA-arter, såsom mRNAs.
Bild 1: RiboTag-metoden. Metodens premiss är biologiskt enkel. En ny Exon 4 sätts in i sekvensen för Rpl22 locus nedströms den ursprungliga Exon 4. I närvaro av en Cre förare, loxP platser på vardera sidan av den ursprungliga Exon 4 skärs, excising floxed exon. Den HA-märkta Exon 4 är nu införlivas i Rpl22 mRNA, genererar en HA taggade RPL22 i celler som uttrycker CRE. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Provavelsschema för RiboTag-möss. Det avelssystem som används för att generera försöksdjur visas. Ett system med två delade program utnyttjades. I generation 1 etablerades två parallella uppsättningar av uppfödare trios. Ena sidan kombinerade allelen av intresserar (buret maternally, som denna specifika mutation resulterar i manlig infertilitet) med hemizygouscreen och på annan som kombinerar allelen av intresserar, igen burit maternally, med Rpl22-HA. Sedan, i generation 2, män från den första parning som bär allel av intresse och Cre korsas till kvinnliga avkomma av den andra ihopkoppling som bär allel av intresse och Rpl22-HA. Genotyperna av den resulterande avkomman bestäms och experimentellt relevanta djur som väljs ut (i detta fall antingen wildtype eller homozygous mutant som transporterar både Cre och Rpl22-HA alleler). Det är viktigt att notera för cellcell som uttrycker Cre-drivrutiner, Cre och Rpl22-HA alleler bör inte födas tillsammans förrän den experimentella generationen. Exponering av Rpl22-HA allele till könsceller uttryckt Cre i avel generationer kommer att driva bakterie-cell Rpl22-HA excision. Alla resulterande avkommor kommer globalt att uttrycka Rpl22-HA vilket förhindrar cellspecifik ribosome isolering. I det system som beskrivs häri gav en n = 4 per genotyp tillräcklig statistisk effekt för nedströmsanalyser. Biologiskt replikatnummer bör bestämmas för varje experimentellt system. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Bekräftelse av negativa kontroller. Prover som är Cre+ och Rpl22-HA+ visar högre RNA-pulldown än prover som är Cre+ eller Rpl22-HA+ ensam. Det finns ingen signifikant skillnad mellan Rpl+ och Rpl22-HA+ prov RNA pulldown effekt, vilket tyder på att prover som saknar antingen Cre eller Rpl22-HA är lämpliga negativa kontroller. En "+" anger att motsvarande allel eller transgen fanns i dessa prover och en "-" betecknar dess frånvaro. IP/input representerar förhållandet mellan RNA-immunoprecipitated (IP) över totalt (input) RNA. Värde beräknat från koncentration i nanogram. ** anger p < 0025. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Reagents effektprotokoll framgång. (A)Flash fryst vävnad resulterar i immunnederbörd effektivitet liknar den av färsk vävnad. (B)IP-effektivitet för två kommersiella antikroppar fastställdes, betecknades som Antikropp 1 och Antibody 2(Materialförteckning). Vid provning en provning var Antibody 1 effektivare när det gäller att dra ner RNA än Antibody 2 som föreföll inte kunna skilja mellan negativa (inte uttrycka vare sig Cre eller Rpl22-HA+) och positiva kontroller (uttrycker både Cre och Rpl22-HA+). Punkter som tyder på förhållandet mellan IPed kontra ingång RNA för enskilda biologiska replikat. (C)När RNA-extraktionssatser(Table of Materials)jämfördes överträffade sats 2 signifikant sats 1. Även om båda kiten IPed en liknande mängd RNA från negativa kontroller, resulterade Kit 2 i en betydligt högre RNA avkastning från positiva prover. * anger p < 0,05, ** p < 0,025, *** p < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5: Tillämpning av metoden till en mutantmodell. (A)Prov Gen av intresse genotyp bekräftelse via västerländska blotting med hjälp av en anpassad egen antikropp mot genen av intresse protein visar Gene av intresse -/- (M / M) män misslyckas med att producera det associerade proteinet. GAPDH visas som en laddningskontroll. (B)Grafisk bioanalysatorutgång från parade ingångs- och IPed-prover för wildtype- och mutantprover. (C)Jämförelse RNA integritetsnummer (RIN) efter provtyp och genotyp. (D)Genomsnittlig nukleotidlängd av RNA-arter som analyserats av bioanalysator efter provtyp och genotyp. * anger p < 0,05, ** p < 0,025, *** p < 0.01, N.S. inte betydande. N = 4 per genotyp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 6: Exempel på bekräftelse av cre-drivrutinen. Kvantifiering av en gen som översattes tidigt i könscellers utveckling (Stra8) och två gener översatta sent i könscellers utveckling (Tnp1 och Prm1) analyseras av qRT-PCR av RNA immunoprecipitated från RPL22-HA drivs av två olika bakteriecell Cres, Stra8-iCre (uttryckt tidigt i könsceller utveckling) och Hspa2-Cre (uttryckt senare i bakteriecell utveckling, särskilt efter översättning Stra8). Här uppnås HA-IP av Stra8 med den tidiga bakteriecellCre föraren men inte med den senare könsceller Cre föraren visar cell-specificitet av immunnederbörd. Däremot, HA-IP av utskrifter översatta i sena könsceller uppnås av både Stra8-iCre och Hspa2-Cre. Detta förväntas som celler som uttrycker Stra8-iCre kommer att generera HA-märkta RPL22 under hela sin utveckling medan de som uttrycker Hspa2-Cre kommer bara att göra det under de senare delarna av sin utveckling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Att förstå översättan det normala eller muterade tillståndet. Särskild nytta ses i system där översättning är frikopplad från transkription, såsom i neuralvävnad där översättning sker mycket långt från transkription, eller i könsceller där transkription sker långt före översättning. I förhållande till andra metoder för translatome analys, RiboTag systemets största fördel kommer från användningen av Cre recombinase systemet. Detta gör det möjligt för friheten att rikta sig till alla cellpopulationer som har en relevant Cre-förare. För det andra är RiboTag IP som beskrivs häri effektiv och mycket mindre tekniskt utmanande och tidskrävande än antingen polysomen eller ribosome profilering. Slutligen kan RiboTag IP enkelt utföras på bänkskivan.
Det finns ett antal kritiska steg i det här protokollet. Främst bland dem är inrättandet av RiboTag muslinje och generering av försöksdjur för studier. När det gäller alla genetiska modeller, noggrann spårning av individer inom muskolonin samt noggrann genotypning protokoll bör tillämpas. PCR genotyping enligt Sanz et al. bör omfatta primers inriktning loxP plats 5 "av wildtype exon 4 att skilja mellan wildtype alleler (260 bp) och mutant (290 bp)13. När det gäller RiboTag-analys i könscellsmodeller bör mycket specifika avelskrav följas. För det första, när det gäller mutanter som resulterar i infertilitet, tankeväckande avel strategier bör innehålla metoder för att optimera antalet avkommor med önskad genotyp i mellanliggande och experimentella generationer. För det andra, när det gäller könsceller specifika Cres,bör försiktighet iakttas om Cre-zygosity med tanke på känsligheten hos könsceller till Cre toxicitet. I könsceller cell, höga halter av Cre protein kan ha skadliga effekter22, förbjuder användning av Cre / Cre djur i avelsystemet. Slutligen, när du använder könsceller Cres, är det viktigt att isolera RiboTag allele från Cre tillden sista generationen som Cre uttryck i könsceller cellen i en mellanliggande generation kommer att resultera i avkommor uttrycker Rpl22-HA globalt.
Oavsett cellsystem är ett antal rekommenderade kontroller möjliga för att verifiera robustheten i både Cre-uttryck och specificitet. Korrekt uttryck för din Cre och förväntad excision av Rpl22-HA kan bestämmas med hjälp av flera metoder. I den första, vävnad isolerade från försöksdjur kan färgas för HA med antingen immunohistochemistry eller immunofluorescens15. Denna metod är optimal eftersom det inte kräver någon priori kunskap om översatta mRNAs i målcelltyper. Den andra metoden, vars exempel visas i figur 6,kräver viss kunskap om översättningsreglerade meddelanden i målcelltyperna. I denna metod kan anrikning för en känd translationellt reglerad mRNA bekräftas från den valda Cre-drivrutinen med kvantitativ PCR av IPed kontra indata RNA. På samma sätt kan robusta Rpl22-HA-uttryck bekräftas i jämförelse med prover na cre+/Rpl22+(positiva kontroller) med antingen Cre-/Rpl22+ eller Cre+/Rpl22- prover som fungerar som effektiva negativa kontroller (se figur 3). Dessa jämförelser kan antingen göras på den totala IPed RNA eller anrikning för en känd translationellt reglerad mRNA bedöms med qRT-PCR eller någon annan kvantitativ metod.
Vanliga problem i genomförandet av protokollet tenderar att bara bli uppenbara när RNA-avkastningen är oväntat låg eller hög. Den vanligaste orsaken till dessa fel uppstår på grund av felaktig genotypning av individer. Vi rekommenderar att du behåller ytterligare vävnad från insamlat prov för att bekräfta genotyper av alla prover vid oväntade RNA-avkastning. När det har bekräftats bör andra möjligheter övervägas, inklusive möjligheten till rnaskontaminering eller provnedbrytning. Noggrann provlagring och hantering och underhåll av RNase frizoner inom laboratoriet kan kraftigt minska eller eliminera dessa frågor. Även om RNA isolering frågor är ett annat potentiellt problem i detta protokoll, minskar användningen av kommersiella kit kraftigt denna fråga men försiktighet bör iakttas för att säkerställa att de underhålls som RNase gratis och innehåller inga utgångna lösningar. Slutligen, som med alla antikroppsbaserade förfaranden, variationer i parti, lagringsförhållanden, koncentration, eller till och med sjöfarten har potential att negativt påverka antikroppens kvalitet och den efterföljande framgången för neddragningen. Som ett resultat, efter noggranna och upprepade tester, valde vi den mest konsekventa och effektiva antikropp tillgängliga.
Detta protokoll innehåller två större ändringar i förhållande till andra publicerade RiboTag-protokoll som avsevärt ökar sannolikheten för framgång. En är förmågan att använda flash fryst vävnad, vilket mildrar eventuella problem som rör parti, tekniker eller tekniska kör variationer. Prover kan samlas in och lagras så att isolering av HA-ribosomer från alla prover på en gång, sänka vad som kan vara stora källor till variation. För det andra minskar tillägget av det preclear-steget avsevärt den typ av bakgrund som rapporterats av andra användare av RiboTag-systemet. Nyligen, ett protokoll rapport från Sanz et al. visar förekomsten av hög bakgrund på grund av överflöd av ribosom-associerade utskrifter frånicke-Cre-drivnaceller14. Vårt protokoll löser detta problem genom att inkludera ett preclearingsteg, vilket effektivt eliminerar förekomsten av RNA i Cre negativa IP-prover.
Liksom alla system, bör de inneboende begränsningarna i RiboTag-systemet hållas i åtanke. Vid användning av okarakteriserade Cre-drivrutiner bör analys av uttryck utföras före experimentell provproduktion. Ur översättningsperspektiv bör flera nyanser av denna metod noteras. För det första tillåter RiboTag inte differentiering mellan mRNAs redo att översätta och de som aktivt översätter. Därför tillåter nuvarande RiboTag-baserade metoder inte kvantifieringen av översättningseffektiviteten som en funktion av enskilda mRNAs. Om översättningseffektiviteten är av intresse kan den mätas på cellspecifik basis om RiboTag-metoden kombineras med andra översättningsanalysverktyg som polydurig profilering. För det andra är det grundläggande att ta hänsyn till de totala RNA-överflödsförändringar som härrör från enskilda eller genotypberoende varians. Det är av denna anledning som noggrann isolering av ingång RNA åtföljer immunnederbörd och prover som härrör från varje förblir ihopkopplade under alla nedströmsanalyser. Slutligen, och när det gäller RiboTag-baserad analys, bör man komma ihåg att associering med en ribosom inte nödvändigtvis bevisa översättning sker. Sekundära analysmetoder bör utföras för att bekräfta translationell reglering i intressemål.
Detta protokoll beskriver isoleringen av ribosomassocierade RNAs från könsceller hos hanmöss med riboTag-modellen. Inte står för musavel och provinsamling, tar protokollet två dagar, med tre timmar den första dagen, bäst gjort på eftermiddagen, en övernattning inkubation, följt av fem timmars arbete den efterföljande morgonen. Det rekommenderas starkt att beredning av lagerlösningar (HB och HSWB) samt vävnadsslipning görs i förväg. Den övergripande framgången för protokollet är beroende av korrekt genotypning och strikt RNase-fria förhållanden. Möjligheten att undersöka översättningen av specifika celltyper gör det möjligt för framtida studier att bättre förstå förhållandet mellan transkription, översättning och proteom i otaliga celltyper och mutanta bakgrunder.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av NIH bevilja NICHD R00HD083521 till EMS och internt stöd från Rutgers University till EMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 1,4-Dithio-DL-threitol (8% | Alfa Aesar | A15797 | |
| 1.7 mL or 2mL tubes | Preference of researcher | ||
| 10 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
| 10 mL serological pippettes | Preference of researcher | ||
| 10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| 5 mL serological pipettes | Preference of researcher | ||
| 50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
| Anti-HA tag antibody | Abcam | ab18181 | Antibody 1 |
| Anti-HA tag antibody | Antibodies.com | A85278 | Antibody 2 |
| B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ Mice | The Jackson Laboratory | 17490 | Or mice carrying Cre driver of choice |
| B6N.129-Rpl22tm1.1Psam/J Mice | The Jackson Laboratory | 11029 | |
| Benchtop centrifuge | Preference of researcher | ||
| C1000 Touch thermal cycler | BioRad | 184-1100 | Or equivalent thermal cycler |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000537 | Or equivalent refrigerated centrifuge |
| Cyclohexamide | Sigma Aldrich | C7698-1g | |
| Dissection scissors | Preference of researcher | ||
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 10009D | |
| DynaMag-2 Magnet rack | Invitrogen by ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| E.Z.N.A. Total RNA Kit 1 | OMEGA | 6834-01 | Kit 1 |
| Heat block | Preference of researcher | ||
| Heparin | Sigma Aldrich | 84020 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272-500g | |
| Microdissection forceps | Preference of researcher | ||
| Microdissection scissors | Preference of researcher | ||
| MiRNeasy kit | Qiagen | 217004 | Kit 2 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Or equivalent spectrophotometer |
| NP-40 Alternative - CAS 9016-45-9 - Calbiochem | Millipore Sigma | 492016 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | ThermoFisher Scientific | A32965 | |
| Potassium (KCl) | Sigma Aldrich | P3911-2.5kg | |
| RNase Inhibitor, Murine | New England BioLabs Inc. | M0314 | |
| SI vortex-genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Or equivalent benchtop vortex |
| Tips for 1 mL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 10 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 20 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tips for 200 uL mechanical pipette | Preference of researcher | ||
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-500 | |
| Tube Revolver / Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Or equivalent rotator |
| VWR Powerpette Plus pipet controller | VWR | 75856-450 | Or equivalent pipette controller |
References
- Snyder, E. M., et al. Gene expression in the efferent ducts, epididymis, and vas deferens during embryonic development of the mouse. Developmental Dynamics. 239 (9), 2479-2491 (2010).
- Snyder, E. M., Small, C. L., Li, Y., Griswold, M. D. Regulation of gene expression by estrogen and testosterone in the proximal mouse reproductive tract. Biology of Reproduction. 81 (4), 707-716 (2009).
- Iguchi, N., Tobias, J. W., Hecht, N. B. Expression profiling reveals meiotic male germ cell mRNAs that are translationally up- and down-regulated. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 103 (20), 7712-7717 (2006).
- Busada, J. T., et al. Retinoic acid regulates Kit translation during spermatogonial differentiation in the mouse. Developmental Biology. 397 (1), 140-149 (2015).
- Kleene, K. Patterns of translational regulation in the mammalian testis. Molecular Reproduction and Development. 43 (2), 268-281 (1996).
- Mali, P., et al. Stage-specific expression of nucleoprotein mRNAs during rat and mouse spermiogenesis. Reproduction Fertilility and Development. 1 (4), 369-382 (1989).
- Steward, O., Schuman, E. M. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. Annual Review of Neuroscience. 24, 299-325 (2001).
- Michel, A. M., Baranov, P. V. Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).
- Snyder, E., et al. Compound Heterozygosity for Y Box Proteins Causes Sterility Due to Loss of Translational Repression. PLoS Genetics. 11 (12), 1005690 (2015).
- Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. Polysome Profiling Analysis of mRNA and Associated Proteins Engaged in Translation. Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).
- McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling. Methods. 126, 112-129 (2017).
- Aeschimann, F., Xiong, J., Arnold, A., Dieterich, C., Grosshans, H. Transcriptome-wide measurement of ribosomal occupancy by ribosome profiling. Methods. 85, 75-89 (2015).
- Sanz, E., et al. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
- Sanz, E., Bean, J. C., Carey, D. P., Quintana, A., McKnight, G. S. RiboTag: Ribosomal Tagging Strategy to Analyze Cell-Type-Specific mRNA Expression In Vivo. Current Protocols in Neuroscience. 88 (1), 77 (2019).
- Sanz, E., et al. RiboTag analysis of actively translated mRNAs in Sertoli and Leydig cells in vivo. PLoS One. 8 (6), 66179 (2013).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Ceolin, L., et al. Cell Type-Specific mRNA Dysregulation in Hippocampal CA1 Pyramidal Neurons of the Fragile X Syndrome Mouse Model. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 340 (2017).
- Puighermanal, E., et al. drd2-cre:ribotag mouse line unravels the possible diversity of dopamine d2 receptor-expressing cells of the dorsal mouse hippocampus. Hippocampus. 25 (7), 858-875 (2015).
- Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes and Development. 25 (7), 755-766 (2011).
- Lesiak, A. J., Brodsky, M., Neumaier, J. F. RiboTag is a flexible tool for measuring the translational state of targeted cells in heterogeneous cell cultures. Biotechniques. 58 (6), 308-317 (2015).
- The Jackson Laboratory. B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ. , The Jackson Laboratory. (2019).
- Bao, J., Ma, H. Y., Schuster, A., Lin, Y. M., Yan, W. Incomplete cre-mediated excision leads to phenotypic differences between Stra8-iCre; Mov10l1(lox/lox) and Stra8-iCre; Mov10l1(lox/Delta) mice. Genesis. 51 (7), 481-490 (2013).
