Summary
격리된 RNA의 순도와 무결성은 RNA 의존적 인 에세이에서 중요한 단계입니다. 여기서, 우리는 손상되지 않은 췌장 조직의 소량에서 RNA를 추출하는 실용적이고 빠르며 저렴한 방법을 제시합니다.
Abstract
추출 방법에 관계없이 조직 및 세포주의 최적화된 RNA 추출은 RNA로부터 의 단백질의 1) 균질화, 2) 효과적인 단백질 성축, 3) 리보넥리스 비활성화, 4) DNA, 단백질 및 탄수화물로부터의 오염 제거의 4단계로 수행된다. 그러나, 조직에 RNase의 높은 수준이 있을 때 RNA의 무결성을 유지하는 것은 매우 힘들다. 자발적인 자가 분해는 그것을 손상시키지 않고 췌장 조직에서 RNA를 추출하는 것을 아주 어렵게 만듭니다. 따라서, 추출 과정에서 췌장 조직의 무결성을 유지하기 위해서는 실용적인 RNA 추출 방법이 필요하다. 기존 프로토콜의 실험 및 비교 연구는 2분 이내에 쥐 췌장 조직의 20-30 mg을 획득하고 RNA를 추출함으로써 수행되었다. 결과는 전기 전도에 의해 평가되었습니다. 실험은 결과의 일반화를 위해 세 번 수행되었다. RNA 안정화 시약에서 췌장 조직을 24시간 동안 -80°C로 침우시키는 것은 RNA 추출 시약으로 사용되었을 때 고결성 RNA를 산출하였다. 얻은 결과는 스핀 컬럼 바인딩이 있는 상용 키트에서 얻은 결과와 비교할 수 있었습니다.
Introduction
구조적 유전자 데이터는 유전자 발현을 통해 기능성 제품에 전사될 수 있다. RNA 분석은 다른 조건에 걸쳐 유전자 발현의 다름을 발견하기 위하여 이용됩니다. 다음과 같이 핵산을 추출하는 방법에는 여러 가지가 있습니다: guanidinium thiocyanate, 페놀 클로로폼을 통한 추출, 셀룰로오스 계 크로마토그래피, 실리카 행렬에 의한 추출, 및 애니온 교환1,,2.
유전자 발현의 적절한 검출은 조직으로부터 분리된 RNA의 무결성에 의해 좌우됩니다. 따라서, 저품질 RNA에 대한 보완적인 분자 검사가 진단 적용 결과를 위태롭게 할 수 있기 때문에 추가 검사가 수행되기 전에 조직으로부터 분리된 RNA의 무결성을 평가하는 것이 중요합니다. 따라서, 정량적 RT-PCR, 마이크로 어레이, 리보너클로스 보호 분석, 북부 블롯 분석, RNA 매핑 및 cDNA 라이브러리 건설3,,4: 따라서, 고무결성 RNA는 다른 진단 응용 프로그램을 가진 분자 생물학적 시험에 필요하다.
RNA는 오랜 시간 동안 보관된 후에 오히려 불안정해집니다. 10kb 이상의 긴 mRNA 단편은 특히 분해5,,6에취약하다. 따라서, 연구원은 정제 된 RNA의 무결성에 영향을 미치는 다양 한 요인을 고려해 야 한다. RNA의 순도는 RNases, 단백질, 게놈 DNA 및 효소 억제제 오염에 대하여 보호되어야 합니다. 또한, RNA와 UV(260/280)의 가장 우수하고 허용 가능한 흡수비는 전기전도에 비해 최소 단편화로 1.8-2.0 범위 내에 있어야 한다. 최근 개발된 실험실 기술을 통해 과학자들은 분자 분석 샘플의 무결성을 보다 실질적으로7,,8로평가할 수 있게 되었다.
많은 양의 ribonucleases (RNases)로 인해 다른 유형의 조직보다 췌장 조직에서 손상되지 않은 RNA를 추출하는 것이 훨씬 더 어렵습니다. 그러나, 기존의 추출 방법, 즉 RNases를 방해하기 위해 저온에서 복강 및 균질화로부터 췌장 조직의 신속한 배출은 효과가 없는 것으로 입증되었으며,7,,8,9,9,10,,11,,12,,13,,14.
본 비교 실험 연구의 목적은 기존 방법을 수정하고 비교하여 가장 효율적인 방법을 결정하는 것이다. 이를 위해, RNA 추출의 다양한 프로토콜이 수정되고 비교되었다. 그것은 특히 췌장 조직의 최소 금액을 필요로 하는 가장 저렴한 방법을 결정 하기 위한.
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Protocol
이 연구에 대한 윤리적 승인은 시라즈 의과 대학에서 얻어졌다 (승인 번호: 93-01-01-7178\03-07-2014).
참고: 250g의 수컷 스프라그-Dawley 쥐를 사용하십시오. -80°C의 액체 질소 탱크에서 RNA 안정화 시약에 침지된 췌장 조직의 조각을 함유한 유리병을 배치하고 RNA 추출 시약 용액을 사용하여 RNA의 무결성을 유지한다.
1. 쥐 췌장 조직의 제거
- 수술실을 준비하고 필요한 모든 재료를 후드 아래에 놓습니다.
- 모든 수술 기구 (드레싱 집게, 갈색 Adson 집게, 홍채 가위 및 리틀러 가위)를 240 °C에서 적어도 4 시간 동안 오븐에서 살균하여 RNases15를비활성화합니다. 후드 아래에 70 % 알코올로 수술 장소의 표면을 살균하십시오.
- 인슐린 주사기를 사용하여 케타민 /자일라진을 주입 [80/8 mg/kg]. 반응의 부족을 위해 쥐의 발가락을 꼬집어 마취의 깊이를 확인합니다.
- 적절한 마이크로튜브(2mL)에 RNA 안정화 시약 1mL를 추가하여 절제된 조직에서 엔도날리스의 활성화를 억제한다.
- 즉시 중간 라인 절개를 위해 외과 보드 (외과 의사로부터 멀리 머리)에 쥐를 배치합니다.
- 70% 알코올로 전체 복부 표면을 살균하고 #40 블레이드가있는 헤어 클리퍼를 사용하여 쥐 머리를 제거하십시오.
- 드레싱 포셉, 브라운 애슬론 집게, 아이리스 가위 및 리틀러 가위로 음모 부위에서 앞다리까지 복부를 열어 V 자랑 절개를 합니다.
- 복부 장기를 왼쪽으로 뒤집어 췌장을 노출시합니다. 조심스럽게 복강에 퍼지는 췌장 조직을 찾습니다. 비장 아래 영역을 찾아 지방 조직과 혼동하지 않고 췌장을 찾을 수 있습니다.
- 즉시 2 분 이내에 복강에서 췌장 20-30 mg을 제거하십시오. 제거된 조직을 2mL 마이크로튜브에 신속하게 넣고 멸균 커터로 절단하여 RNA 안정화 시약으로 분리된 조직을 관통합니다.
- 마이크로튜브를 질소 탱크에 넣어 즉시 동결합니다. 마이크로튜브를 -80°C 냉동고에 24h16으로보관하십시오.
- 24 시간 후, 얼음 용기에 췌장 조직의 작은 조각을 전송합니다.
- 수술 후 쥐의 안락사를 위해 염화칼륨(KCl)을 장내 내로 주입하십시오.
2. RNA 추출
- 70 %의 알코올로 후드 아래 표면을 살균하십시오.
- 멸균 마이크로튜브에 RNase를 억제하기 위해 구니디늄 티오야네이트를 함유한 RNA 추출 시약 1mL을 넣습니다.
- 분리된 췌장 조직을 마이크로튜브로 옮기다. 마이크로튜브를 액체 질소로 전송하여 즉시 동결합니다.
- 마이크로 팁 프로브 초음파 처리기로 조직을 균질화하여 60 s온에 대해 레벨 20으로 설정하고 5 soff.
- 핵단백질 복합체가 완전히 해리될 수 있도록 분쇄된 얼음을 사용하여 4°C에서 5분 동안 각 균질화 샘플을 배양한다.
- RNA 추출 시약의 각 1mL에 대해 0.2 mL의 클로로폼으로 샘플을 풍부하게 하십시오. 튜브를 단단히 캡하고 15 s를 위해 강제로 흔들어줍니다.
- 분쇄된 얼음(4°C)에 15분 동안 튜브를 배양하여 시약을 3단계로 분리한다.
- 원심분리기를 12,000 x g에서 15분 동안 +2 ~ +8°C로 실행합니다. 무색 수성 위상을 새로운 마이크로튜브로 옮기다.
- 수상에 100% 이소프로파놀의 0.5mL를 추가합니다. 튜브를 닫은 다음 RNA를 완전히 혼합하기 위해 적어도 3 번 반전하십시오.
- RNA 강수량을 허용하기 위해 차가운 상자(4°C)에서 5-10분 동안 샘플을 배양한다.
- 원심분리기를 12,000 x g에서 15분 동안 +2 ~ +8°C로 실행합니다. 상부체를 폐기합니다.
- 75% 에탄올의 1mL로 원심분리기 튜브를 각각 풍부하게 합니다.
- RNA 펠릿을 3회 이상 반전시켜 세척한다.
- 원심분리기를 +2 ~ +8°C에서 7,500 x g에서 5분 동안 실행합니다. 공기 건조에 의해 RNA 펠릿에서 과도한 에탄올을 제거하기 위해 상체를 폐기하십시오.
- 디틸피로카보네이트(DEPC)에서 RNA 펠릿을 다시 중단하여 RNase 가 없는 물을 처리한다.
- 파이펫 팁을 통해 용액을 여러 번 전달하여 RNA 펠릿을 용해시십시오. 그런 다음+ 65°C에서 10-15분 동안 용액을 배양합니다.
3. RNA 무결성 평가 에 데아포성 전기 전광
- 젤 러닝 버퍼 준비: DEPC 처리 H2O에서 50m M NaAc(DEPC 처리) 및 0.5 M EDTA(pH 8.0).
- 5배 포름알데히드 겔 실행 버퍼(MOPS 실행 버퍼): 0.1 M MOPS(pH 7.0), 40mM NaAc, 5mM EDTA(pH 8.0)를 준비합니다.
- 50mM 나트륨 아세테이트를 치료한 DEPC800mL에서 20.6g의 MOPS를 녹입니다. pH를 2N NaOH로 7.0으로 조정합니다. DEPC 처리 0.5 M EDTA (pH 8.0)의 10 mL을 추가합니다. DEPC 처리된 물로 용액의 부피를 1L로 조정합니다.
- 0.2 μm 필터를 통해 용액을 필터링하고 살균을 위해 빛으로부터 멀리 떨어진 실온에서 유지하십시오. 버퍼가 빛에 노출되거나 오토클레이브된 경우 시간이 지남에 따라 노란색이 됩니다. 빨대 색 버퍼는 잘 작동하지만 어두운 버퍼는17이아닙니다.
- 1.5% 아가로즈 젤18을준비한다. 50mL의 경우, 아가로즈 0.75g, H2O의31mL을 전자레인지에 1분간 넣으세요. 포름알데히드 9mL, 5배 MOPS 실행 버퍼 10mL를 추가합니다.
- 젤샘플을 준비합니다. 멸균 미세 분리 튜브에 다음을 혼합 :
X μL RNA(최대 30μg)
5x 젤 로딩 버퍼 의 2 μL
포르마미드 10 μL
MOPS 실행 버퍼의 4 μL
0.1 mg/mL EtBr의 1 μL
DEPC-H2O의 포름알데히드 5-x μL 3 μL - 샘플을 65°C에서 15분 동안 배양하고 얼음위에 식힙니다. 모든 유체가 증착 될 때까지 5 s에 대한 원심 분리기.
- 젤을 5V/cm에서 5분간 미리 실행합니다.
- 샘플을 즉시 젤의 차선에 로드한 다음 젤을 1x 포름알데히드 젤 실행 버퍼에 담급드합니다. 3-4 V / cm19에서실행합니다.
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Representative Results
RNA 안정화 시약없이 일상 적이고 수정 된 수술 프로토콜에 따라 RNA 추출 시약에서 RNA의 무결성 평가
일상적인 외과 프로토콜에서 RNA 추출 시약으로 RNA를 추출한 후 허용되지 않는 대역이 관찰되었다. 레인 1은 간에서 RNA를 대조군으로 나타낸다. 레인 2는 일상적인 수술 프로토콜로부터 얻은 총 RNA에서 28S/18S rRNA 대역의 저하된 상태를 나타낸다. 췌장 조직의 양이 50 mg (차선 3) 또는 20-30 mg (레인 4)으로 감소되고 수술이 RNA 안정화 시약없이 즉시 수행 (수정 프로토콜)을 수행했을 때, RNA 분리는 간 조직 제어 및 비특이적 대역보다 덜 성공적이었다.
RNA 안정화 시약에 침지된 변형된 수술 프로토콜에 따른 RNA 샘플의 무결성 평가
RNA 추출 시약으로 생성된 RNA의 무결성은 보존 시간 및 온도(차선 5-8)에 따라 달라집니다. 대조간 조직과 비교하여, 췌장 조직의 양이 50 mg (차선 5) 또는 20-30 mg (차선 6)이었을 때 RNA 분리가 성공하지 못했습니다. RNA는 조직이 RNA 안정화 시약에 침지된 직후 추출되었다. 20-30 mg의 조직이 -80°C에서 -80°C로 RNA 안정화 시약에 침수되었을 때 특이적 대역이 관찰되지 않았으며, RNA는 프로토콜에 기초하여 추출되었다. 전기 전도 결과에 따르면, RNA는 완전히 저하되었다 (차선 7). 레인 8에 묘사된 바와 같이, 허용 밴드(28S/18S rRNA)는 RNA 안정화 시약에서 20-30 mg의 췌장 조직을 24시간 동안 -80°C로 침수한 후 관찰된 후 RNA를 추출하였다.
도 1: 조사 하에 프로토콜에 따라 RNA 추출 시약을 사용하여 쥐 췌장 조직에서 분리된 RNA의 무결성 평가. 레인 1은 제어로서 간에서 얻은 RNA의 무결성을 묘사합니다. 레인 2는 일상적인 수술 프로토콜로부터 얻은 총 RNA에서 28S/18S rRNA 대역의 상태를 나타낸다. 레인 3은 수정된 수술 프로토콜과 50 mg의 조직에서 얻은 총 RNA에서 28S/18S rRNA 대역의 상태를 나타낸다. 레인 4는 수정된 수술 프로토콜과 20-30 mg의 조직으로부터 얻은 총 RNA에서 28S/18S rRNA 대역의 상태를 나타낸다. 레인 5는 변형된 수술 프로토콜으로부터 얻은 총 RNA에서 28S/18S rRNA 대역의 상태를 나타내며, RNA 안정화 시약에 침지된 직후 추출된 50mg의 조직이다. 레인 6은 RNA 안정화 시약에 침지된 직후 추출된 수정된 외과 프로토콜로부터 췌장 조직의 20-30 mg으로부터 얻은 RNA의 무결성을 나타낸다. 레인 7은 -80°C에서 RNA 안정화 시약에 48h의 침수 후 수정된 수술 프로토콜로부터 20-30 mg의 조직에서 얻은 RNA의 무결성을 묘사한다. 레인 8은 -80°C에서 RNA 안정화 시약에 침지 후 수정된 수술 프로토콜로부터 20-30 mg의 조직에서 얻은 RNA의 무결성을 묘사합니다.
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Discussion
분자 생물학에서는 고품질 RNA를 얻는 것이 중요합니다. 세포와 조직에 있는 ribonuclease 효소의 존재는 RNA를 빨리 저하시키고 추출 복합체를 만듭니다. RNases는 어떤 공동 요인 없이 작동 하는 안정적인 효소. 소량의 RNase는 RNA를 파괴하기에 충분합니다. 쥐 췌장 조직이 복강에서 제거되면 강한 세제에 의해 수술 기구를 소독하고 철저히 헹구고 수술 전에 RNases를 비활성화하기 위해 240 °C에서 적어도 4 시간 동안 오븐에 넣어야합니다. RNase 수준이 췌장에서 매우 높다는 사실을 감안할 때, 수술 장소는 NaOH와 가벼운 표백제로 살균되어 RNases를 비활성화합니다. 췌장 조직이 해부 도중 제거되는 동안, RNA는 저하될 것입니다. 효율성을 높이기 위해서는 해부를 가능한 한 빨리20,21,,,22, 23,,24로완료할 필요가23있다.
췌장은 신체의 근종 기전을위한 중요한 조직입니다. 따라서, 향상된 췌장 RNA 추출 절차는 연구원이 활동적인 통로를 더 잘 이해하는 것을 돕습니다. 본 프로토콜은 췌장에서 RNA 추출을 위한 효율적이고 간단하며 최적화된 방법에 대한 모델을 제안하였다. 췌장 조직에서 다른 일반적인 RNA 추출 방법을 평가하였다. 그것은 냉동 저장 및 RNAse 억제 전략RNA 품질에 영향을 미치는 효과에 집중되었다. RNA의 무결성에 영향을 미치는 두 가지 가장 중요한 요인은 수술 기간과 수집 된 췌장 조직의 양입니다. 최근 연구에 따르면 RNA 분해와 췌장 조직의 양 사이에 는 양성8상관관계가 있는 것으로 나타났다8,13,,20.
이 프로토콜에서, 췌장 조직의 20-30 mg은 마취 된 쥐로부터 2 분 이내에 수득되었다. 긴 외과 단계는 췌장에 있는 내인성 엔토넥리스의 활성화로 이끌어 내고 RNA를 빨리 저하시킬 수 있습니다. 이 연구에서RNA는 관니디늄 티오시야네이트를 사용한 상이한 샘플로부터 분리되었고, 페놀 클로로폼 추출 기술은 RNA 활성을 저해하기 위해 액체 질소를 사용했다. 이 방법은 췌장 조직에서 RNA 안정화 시약의 신속한 투과, 세포 RNA 보호 및 보존 시간 증가의 세 가지 목표를 달성했습니다. 결과는 RNA 안정화 시약을 포함하는 견본이 24 시간 동안 -80°C에서 유지될 때 최적이었습니다.
그러나 RNA 안정화 시약이 도입되었을 때 RNA 무결성이 크게 증가했습니다. 또한, 이 과정은 재현 할 수 있었다. 췌장의 작은 부분 (20-30 mg)은 마취 된 쥐에서 수술 중에 해부되었고 1-2 일 동안 -80 °C에서 RNA 안정화 시약 1 mL에 침수되었습니다. 레인 8에서 볼 수 있듯이, 24 h의 저장이 최적의 시간이었습니다.
상기 방법은 RNA 안정화 시약의 소량이 기관으로 침투할 수 있도록 허용했다. 더욱이, 해부된 조각의 크기가 작기 때문에 실험 직후에 분해 과정이 중단되었다. 이 프로토콜에서, 중요한 단계는 RNA 안정화 시약에 있는 침지된 조직을 세포를 관통하고 RNase의 활성화를 억압할 때까지 가능한 한 빨리 아주 작은 조각으로 절단하는 것입니다. 균질화 단계에서는 RNA 추출 시약에서 버블 생산을 방지하고 4°C에서 모든 단계를 수행하는 것이 매우 중요합니다. DNA 오염을 피하기 위해 아쿠아 상(RNA를 함유하는 단계)을 매우 신중하게 분리하는 것이 중요합니다. 자가 용해 및 내인성 RNases의 존재는 쥐 췌장에서 그대로 RNA 절연을 손상하지만, RNA의 무결성은 제안 된 췌장 관류 법에서 유지되었다. 따라서, 제안된 방법은 다른 기존 방법보다 적은 양의 RNA 안정화 시약을 요구하는 간단하고 재현 가능하며 저렴한 절차이다.
다른 연구와 마찬가지로 이 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 얻어진 RNA의 무결성과 수율은 조직의 단지 20-30 mg이 사용됨에 따라 전체 췌장 조직을 사용하는 것보다 적습니다. 둘째, RNA 추출 및 cDNA 합성 테스트를 신속하고 연속적으로 수행하여 RNA 분해를 감소시키기 때문에 하루에 많은 수의 샘플을 채취할 수 없습니다. 셋째, 다른 쥐 그룹과 연구 프로젝트를 수행하기 위해서는 쥐 췌장 조직이 복막 구멍에서 완전히 확산되기 때문에 데이터의 변화를 줄이기 위해 동일한 수술 영역에서 정확히 20-30 mg의 조직을 섭취하는 것이 필수적입니다.
결론, RNA 안정화 시약 계수 후 RNA 추출 시약 용액을 사용하는 것은 고가의 및 컬럼 기반 RNA 추출 키트에 대한 좋은 대안이다.
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Disclosures
아무도 선언되지 않았습니다.
Acknowledgments
본 연구는 시라즈 의과 대학에 의해 재정적으로 지원되었다 (그랜트 번호 93-01-01-7178\03-07-2014). 조모로디안 씨와 로스타미(Rostami) 의학 과학 분야의 e-러닝 학과, 가상 학교 및 e-러닝 우수 센터, 시라즈 의료 과학 대학이 비디오를 편집해 주셔서 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
References
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