Summary
A pureza e integridade do RNA isolado é um passo vital nos ensaios dependentes do RNA. Aqui, apresentamos um método prático, rápido e barato para extrair RNA de uma pequena quantidade de tecido pancreático não danificado.
Abstract
Independentemente do método de extração, a extração otimizada de RNA de tecidos e linhas celulares é realizada em quatro estágios: 1) homogeneização, 2) desnaturação efetiva de proteínas de RNA, 3) inativação de ribonuclease e 4) remoção da contaminação do DNA, proteínas e carboidratos. No entanto, é muito trabalhoso manter a integridade do RNA quando há altos níveis de RNase no tecido. A autolise espontânea torna muito difícil extrair RNA do tecido pancreático sem danificá-lo. Assim, é necessário um método prático de extração de RNA para manter a integridade dos tecidos pancreáticos durante o processo de extração. Um estudo experimental e comparativo dos protocolos existentes foi realizado obtendo 20-30 mg de tecidos pancreáticos de ratos em menos de 2 minutos e extraindo o RNA. Os resultados foram avaliados por eletroforese. Os experimentos foram realizados três vezes para generalização dos resultados. A imersão do tecido pancreático no reagente de estabilização de RNA a -80 °C por 24 h rendeu RNA de alta integridade, quando o reagente de extração de RNA foi usado como reagente. Os resultados obtidos foram comparáveis aos resultados obtidos a partir de kits comerciais com as vinculações da coluna spin.
Introduction
Dados genéticos estruturais podem ser transcritos para um produto funcional através da expressão genética. A análise de RNA é usada para descobrir diferenças na expressão genética em diferentes condições. Existem uma série de métodos para extrair ácidos nucleicos da seguinte forma: tiocianato de guanidinium, extração via fenol-clorofórmio, cromatografia à base de celulose, extração por matrizes de sílica e troca deânion 1,,2.
A detecção adequada da expressão genética é influenciada pela integridade do RNA isolado dos tecidos; portanto, é vital avaliar a integridade do RNA isolado dos tecidos antes que novos testes sejam realizados, pois testes moleculares complementares em RNA de baixa qualidade podem comprometer os resultados da aplicação diagnóstica. Assim, o RNA de alta integridade é necessário para testes biológicos moleculares com diferentes aplicações diagnósticas: RT-PCR quantitativo, micro arrays, ensaio de proteção à ribonuclease, análise de manchas do norte, mapeamento de RNA e construção de biblioteca cDNA3,,4.
O RNA torna-se bastante instável depois de ser mantido por muito tempo. Fragmentos longos de mRNA acima de 10 kb são particularmente suscetíveis à degradação5,6. Assim, os pesquisadores devem considerar vários fatores que influenciam a integridade do RNA purificado. A pureza do RNA deve ser protegida contra RNases, proteínas, DNA genômico e contaminação inibidora enzimática. Além disso, a melhor e aceitável razão de absorção de RNA para UV (260/280) deve estar dentro da faixa de 1,8-2.0 com fragmentação mínima sobre a eletroforese. Técnicas laboratoriais recentemente desenvolvidas permitiram aos cientistas avaliar a integridade da amostra de análise molecular mais praticamente7,,8.
É muito mais difícil extrair RNA não danificado do tecido pancreático do que outros tipos de tecidos devido à alta quantidade de ribonucleases (RNases). Entretanto, os métodos de extração existentes, ou seja, a rápida ejeção do tecido pancreático da cavidade abdominal e a homogeneização a baixas temperaturas para impedir as RNases, provaram-se ineficazes7,,8,,9,,10,,11,,12,,13,14.
O objetivo do presente estudo experimental comparativo é modificar e comparar os métodos existentes para determinar os métodos mais eficientes. Para isso, vários protocolos de extração de RNA foram modificados e comparados. O objetivo foi especificamente determinar o método mais barato que exige uma quantidade mínima de tecido pancreático.
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Protocol
A aprovação ética para este estudo foi obtida pela Universidade de Ciências Médicas de Shiraz (número de aprovação: 93-01-01-7178\03-07-2014).
NOTA: Use ratos machos Sprague-Dawley pesando 250 g. Coloque o frasco contendo uma lasca de tecido pancreático imerso no reagente estabilizador de RNA em um tanque de nitrogênio líquido a -80 °C e use a solução de reagente de extração de RNA para manter a integridade do RNA.
1. Remoção do tecido pancreático de rato
- Prepare a sala de cirurgia e coloque todos os materiais necessários sob o capô.
- Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos (Fórceps de curativo, fórceps brown-adson, tesoura Iris e tesoura Littler) em forno por pelo menos 4 h a 240 °C para inativar RNases15. Esterilize a superfície do local cirúrgico com 70% de álcool sob o capô.
- Injete cetamina/xilazina intraperitonealmente usando uma seringa de insulina [80/8 mg/kg]. Verifique a profundidade da anestesia beliscando os dedos dos dedos do rato por falta de resposta.
- Adicione 1 mL de reagente de estabilização de RNA no microtubo adequado (2 mL) para inibir a ativação de endonucleases em tecidos excisados.
- Coloque imediatamente o rato na placa cirúrgica (cabeça longe do cirurgião) para uma incisão de linha média.
- Esterilize toda a superfície abdominal com 70% de álcool e remova o cabelo de rato usando um cortador de cabelo com lâminas #40.
- Faça uma incisão em forma de V para abrir o abdômen da área púbica para as pernas dianteiras com fórceps de curativo, fórceps Brown-Adson, tesoura Iris e tesoura Littler.
- Vire os órgãos abdominais para o lado esquerdo para expor o pâncreas. Encontre cuidadosamente o tecido pancreático, que se espalha na cavidade abdominal. Localize a área sob o baço para encontrar o pâncreas sem ser confundido com o tecido adiposo.
- Remova imediatamente 20-30 mg de pâncreas da cavidade abdominal em menos de 2 minutos. Coloque o tecido removido no microtubo de 2 mL rapidamente e corte-o com um cortador estéril para penetrar os tecidos separados com reagente de estabilização de RNA.
- Coloque o microtubo em um tanque de nitrogênio para congelar imediatamente. Mantenha o microtubo em um congelador de -80 °C por 24 h16.
- Depois das 24h, transfira os pequenos pedaços de tecidos pancreáticos para um recipiente de gelo.
- Injete cloreto de potássio (KCl) intracardialmente para eutanásia de ratos após a cirurgia.
2. Extração de RNA
- Esterilize a superfície sob o capô com 70% de álcool.
- Coloque 1 mL do reagente de extração de RNA, que contém tiocianato de guanidinium para inibir rnase, no microtubo estéril.
- Transfira o tecido pancreático separado para o microtubo. Transfira o microtubo para o nitrogênio líquido para congelar imediatamente.
- Homogeneize o tecido com o sônico da sonda de micro ponta a 4 °C definido para o nível 20 para 60 s ligado e 5 s desligado.
- Incubar cada amostra homogeneizada por 5 min a 4 °C usando gelo esmagado para permitir que os complexos de nucleoproteína sejam completamente dissociados.
- Enriqueça as amostras com 0,2 mL de clorofórmio para cada 1 mL de reagente de extração de RNA. Tampe o tubo com firmeza e agite-o com força para 15 s.
- Incubar o tubo por 15 minutos no gelo esmagado (4 °C) para separar o reagente em três fases.
- Execute a centrífuga a 12.000 x g por 15 min a +2 a +8 °C. Transfira a fase aquosa incolor para um novo microtubo.
- Adicione 0,5 mL de isopropanol de 100% à fase aquosa. Feche o tubo e, em seguida, inverta-o pelo menos 3 vezes para misturar bem o RNA.
- Incubar a amostra por 5-10 min em uma caixa fria (4 °C) para permitir a precipitação do RNA.
- Execute a centrífuga a 12.000 x g por 15 min a +2 a +8 °C. Descarte o supernaspeso.
- Enriqueça cada um dos tubos de centrífuga com 1 mL de 75% de etanol.
- Lave a pelota de RNA invertendo o tubo pelo menos 3 vezes.
- Execute a centrífuga a 7.500 x g a +2 a +8 °C por 5 min. Descarte o supernatante para remover o excesso de etanol da pelota de RNA por secagem a ar.
- Suspenda a pelota de RNA em água livre de dietilpirocarbonato (DEPC) tratada com RNase.
- Passe a solução através de uma ponta de pipeta várias vezes para dissolver a pelota de RNA. Em seguida, incubar a solução por 10-15 min a +65 °C.
3. Avaliação da Integridade do RNA com eletroforese de desnaturação
- Prepare o tampão de corrida de gel: 50 mM NaAc (tratado DEPC) e 0,5 M EDTA (pH 8.0) em H2O tratado por DEPC.
- Prepare 5x tampão de gel de formaldeído (tampão de execução MOPS): 0,1 M MOPS (pH 7.0), 40 mM NaAc, 5 mM EDTA (pH 8.0).
- Dissolver 20,6 g de MOPS em 800 mL de DEPC tratado 50 mM de acetato de sódio. Ajuste o pH para 7.0 com 2 N NaOH. Adicione 10 mL de EDTA tratado de DEPC 0,5 M (pH 8.0). Ajuste o volume da solução para 1 L com água tratada com DEPC.
- Filtre a solução através de um filtro de 0,2 μm e mantenha-a a temperatura ambiente longe da luz por causa da esterilização. O buffer fica amarelo com o tempo se for exposto à luz ou for autoclavado. Um tampão cor de palha funciona bem, mas os mais escuros não17.
- Prepare um gel de 1,5% agarose18. Para 50 mL, adicione 0,75 g de agarose e 31 mL de H2O. Micro-ondas a solução no micro-ondas por 1 min. Adicione 9 mL de formaldeído e 10 mL de buffer de execução MOPS de 5x.
- Prepare as amostras para o gel. Misture o seguinte em um tubo de microfuça estéril:
X rna μL (até 30 μg)
2 μL de tampão de carregamento de gel de 5x
10 μL de formamida
4 μL de buffer de execução MOPS
1 μL de 0,1 mg/mL EtBr
3 μL de formaldeído 5-x μL de DEPC-H2O - Incubar as amostras a 65 °C por 15 minutos e resfriá-las no gelo. Centrífuga por 5 s até que todo o fluido seja depositado.
- Pré-execute o gel a 5 V/cm por 5 minutos.
- Carregue as amostras nas pistas do gel imediatamente e, em seguida, submerse o gel em 1x tampão de gel de gel formaldeído. Executar em 3-4 V/cm19.
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Representative Results
Avaliação da integridade do RNA no reagente de extração de RNA de acordo com um protocolo cirúrgico de rotina e modificado sem reagente estabilizador de RNA
Bandas inaceitáveis foram observadas após a extração do RNA com o reagente de extração de RNA a partir de um protocolo cirúrgico de rotina. A faixa 1 mostra RNA do fígado como controle. A faixa 2 mostra o estado degradado das bandas de rRNA 28S/18S no total de RNA obtido a partir de um protocolo cirúrgico de rotina. Quando a quantidade de tecido pancreático foi reduzida para 50 mg (pista 3) ou 20-30 mgs (pista 4) e a cirurgia foi realizada imediatamente (protocolo modificado) sem o reagente de estabilização do RNA, a separação do RNA foi menos bem sucedida do que no controle do tecido hepático e foram observadas bandas inespecíficas.
Avaliação da integridade das amostras de RNA de acordo com um protocolo cirúrgico modificado imerso no reagente de estabilização de RNA
A integridade das RNAs produzidas com o reagente de extração de RNA depende do tempo de preservação e temperatura (pista 5-8). Em comparação com o tecido hepático controle, a separação do RNA não foi bem sucedida quando a quantidade de tecido pancreático foi de 50 mgs (pista 5) ou 20-30 mgs (pista 6). O RNA foi extraído imediatamente após o tecido ser imerso no reagente de estabilização do RNA. Nenhuma banda específica foi observada quando 20-30 mg de tecido foram submersos no reagente de estabilização de RNA a -80 °C para 48 h e o RNA foi extraído com base no protocolo. De acordo com os resultados da eletroforese, o RNA estava completamente degradado (pista 7). Como retratado na faixa 8, bandas aceitáveis (28S/18S rRNA) foram observadas após submergir 20-30 mg de tecido pancreático no reagente de estabilização de RNA a -80 °C por 24 h, e então o RNA foi extraído.
Figura 1: Avaliação da integridade do RNA isolado dos tecidos pancreáticos de ratos usando reagente de extração de RNA de acordo com os protocolos sob a investigação. A faixa 1 mostra a integridade do RNA obtido do fígado como controle. A faixa 2 representa o status das bandas de rRNA 28S/18S no total de RNA obtido a partir de um protocolo cirúrgico de rotina. A faixa 3 representa o status de bandas de rRNA 28S/18S no total de RNA obtido a partir de um protocolo cirúrgico modificado e 50 mg de tecido. A faixa 4 representa o status de bandas de rRNA 28S/18S no total de RNA obtido a partir de um protocolo cirúrgico modificado e 20-30 mg de tecido. A faixa 5 representa o status de bandas de rRNA 28S/18S no total de RNA obtidos a partir de um protocolo cirúrgico modificado e 50 mg de tecido extraído imediatamente após ser imerso no reagente de estabilização de RNA. A faixa 6 mostra a integridade do RNA obtido a partir de 20-30 mg de tecido pancreático a partir de um protocolo cirúrgico modificado extraído imediatamente após ser imerso no reagente de estabilização de RNA. A faixa 7 retrata a integridade do RNA obtido a partir de 20-30 mg de tecido a partir de um protocolo cirúrgico modificado após 48 horas de imersão em um reagente de estabilização de RNA a -80 °C. A faixa 8 retrata a integridade do RNA obtido a partir de 20-30 mg de tecido a partir de um protocolo cirúrgico modificado após 24 horas de imersão em um reagente de estabilização de RNA a -80 °C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Na biologia molecular é vital obter RNA de alta qualidade. A presença das enzimas ribonuclease em células e tecidos rapidamente degrada o RNA e torna o complexo de extração. RNases são enzimas estáveis funcionando sem quaisquer cofatores. Pequenas quantidades de RNase são adequadas para destruir o RNA. Quando o tecido pancreático de rato é removido da cavidade abdominal, é necessário desinfetar os instrumentos cirúrgicos por detergentes fortes, enxaguar-os completamente e colocá-los em um forno por pelo menos 4 h a 240 °C para inativar RNases antes da cirurgia. Dado o fato de que o nível de RNase é extremamente alto no pâncreas, o local da cirurgia é esterilizado com NaOH e alvejante leve para desativar as RNases. Enquanto o tecido pancreático está sendo removido durante a dissecção, o RNA se degradaria. Para aumentar a eficiência, é necessário que a dissecção seja concluída o mais rápido possível20,21,22,23,,24.
O pâncreas é um tecido crítico para os mecanismos homeostáticos do corpo. Assim, os melhores procedimentos de extração de RNA pancreático ajudam os pesquisadores a entender melhor os caminhos ativos. O presente protocolo propôs um modelo para um método eficiente, simples e otimizado para extração de RNA a partir do pâncreas. Foram avaliados diferentes métodos comuns de extração de RNA a partir de tecido pancreático. Concentrou-se no efeito do armazenamento congelado e das estratégias de inibição de RNase que influenciam a qualidade do RNA. Os dois fatores mais significativos que influenciam a integridade do RNA são a duração da cirurgia e a quantidade de tecido pancreático coletado. Estudos recentes revelaram que há uma correlação positiva entre a degradação do RNA e a quantidade de tecido pancreático8,,13,20.
Neste protocolo, 20-30 mg de tecido pancreático foram obtidos em menos de 2 min dos ratos anestesiados. Longas etapas cirúrgicas podem levar à ativação de endonucleases endógenos no pâncreas e degradar o RNA rapidamente. Neste estudo, o RNA foi isolado de diferentes amostras com tiocianato guanidinium, e técnicas de extração fenol-clorofórmio utilizaram nitrogênio líquido para impedir a atividade de RNA. O método alcançou três objetivos: permeação rápida do reagente de estabilização de RNA em tecidos pancreáticos, proteção do RNA celular e aumento do tempo de preservação. Os resultados foram ótimos quando as amostras contendo reagente de estabilização de RNA foram mantidas a -80 °C por 24 h.
No entanto, a integridade do RNA aumentou significativamente quando o reagente de estabilização do RNA foi introduzido. Além disso, esse processo era reprodutível. Uma pequena seção do pâncreas (20-30 mgs) foi dissecada durante a cirurgia de ratos anestesiados e submersa em 1 mL de reagente estabilizador de RNA a -80°C por 1-2 dias. Como visto na pista 8, o armazenamento por 24 horas foi o momento ideal.
Os métodos acima mencionados permitiram que uma quantidade menor de reagente de estabilização de RNA penetrasse no órgão. Além disso, o processo de degradação descontinuou logo após os experimentos porque o tamanho das peças dissecadas era pequeno. Neste protocolo, o passo vital é cortar o tecido imerso no reagente de estabilização de RNA para pedaços muito pequenos o mais rápido possível até penetrar nas células e suprimir a ativação de RNase. Na etapa homogeneizadora, é muito crucial evitar a produção de bolhas no reagente de extração de RNA e realizar todas as etapas a 4 °C. É crucial separar a fase aquática (a fase que contém RNA) com muito cuidado para evitar a contaminação do DNA. Embora a autólise e a presença de RNases endógenas comprometam o isolamento intacto do RNA do pâncreas de rato, a integridade do RNA foi mantida no método de perfusão do pâncreas proposto. Assim, o método proposto é um procedimento simples, reprodutível e barato que requer quantidades menores de reagente de estabilização de RNA do que os outros métodos existentes.
Como qualquer estudo, este protocolo tem algumas limitações. Em primeiro lugar, a integridade e o rendimento do RNA obtido é menor do que o uso de tecido pancreático inteiro, pois apenas 20-30 mg de tecido é usado. Em segundo lugar, um grande número de amostras não pode ser colhida em um dia porque a extração de RNA e também testes de síntese de CDNA devem ser feitos de forma rápida e consecutiva para diminuir a degradação do RNA. Em terceiro lugar, para realizar projetos de pesquisa com diferentes grupos de ratos, é essencial tomar exatamente 20-30 mg de tecido da mesma área cirúrgica para diminuir a variação de dados porque o tecido pancreático de rato difunde completamente na cavidade peritoneal.
Para concluir, o uso da solução de reagente de extração de RNA após a perfusão do reagente de estabilização RNA é uma boa alternativa para kits de extração de RNA caros e baseados em colunas.
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Disclosures
Nenhum declarado.
Acknowledgments
O presente estudo foi apoiado financeiramente pela Universidade shiraz de ciências médicas (Grant No. 93-01-01-7178\03-07-2014). Agradecemos ao Sr. Zomorodian e ao Sr. Rostami no Departamento de e-Learning em Ciências Médicas, Escola Virtual e Centro de Excelência em e-Learning, Universidade shiraz de Ciências Médicas por editar o vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Merck | 116801 | Germany |
| Atoclave | Teb Zaim | Iran | |
| Centrifuge | Sigma | Germany | |
| Chloroform | Merck | 107024 | Germany |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water | Sigma | Germany | |
| EDTA | sigma | 60-00-4 | Germany |
| Electrophoresis tank | Payapajoohesh | Iran | |
| Eppendorf microTube | Extragene | Taiwan | |
| EtBr | sigma | E 8751 | Germany |
| Ethanol | Merck | 81870 | Germany |
| Falcon Tube | Extragene | Taiwan | |
| Formaldehyde | Merck | 344198 | Germany |
| Formamide | Merck | 344206 | Germany |
| Homogenizer-sunicator | Microson XL 2000 | USA | |
| Isopropanol | sigma | 19516 | Germany |
| Ketamine hydrochloride | sigma | 1867-66-9 | Germany |
| Laminar Flow Hood | Jal Tajhiz | Iran | |
| Mgnetic stirrer | Labrotechnik | USA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Germany | |
| Micropipette Tips | Extragene | Taiwan | |
| MOPS | sigma | 85022106 | Germany |
| Na AC | Merck | 567422 | Germany |
| NaOH | Merck | 109137 | Germany |
| Oven | Teb Zaim | Iran | |
| PH meter | Knick | Germany | |
| RNA Later/RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | USA |
| Surgical instrument | Agn Thos | German made | |
| Syringes | AvaPezeshk | Iran | |
| TriPure reagent/RNA extraction reagent | Roche | 11667157001 | USA |
| Vortex | Labinco | Netherland | |
| Water bath | Memmert | Germany | |
| zylazine | sigma | 7361-61-7 | Germany |
References
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