Kinetische Visualisierung von einzelzelligen Interspezies-Bakterien-Wechselwirkungen

Polymikrobielle Gemeinschaften sind in der Natur weit verbreitet und umfassen eine Vielzahl von^Umwelt-1,2,3 und menschlichen Nischen^4,5. Zu den berüchtigtsten polymikrobiellen Infektionen bei menschlichen Erkrankungen gehören Zahnbiofilme⁶, chronische Wunden^7,8, und Atemwegsinfektionen bei Personen mit chronisch obstruktiver Lungenerkrankung⁹, Beatmungs-assoziierte Lungenentzündung¹⁰, und die genetische Krankheit Mukoviszidose (CF)^11,12. Diese Infektionen bestehen oft aus verschiedenen mikrobiellen Arten; jedoch ist ein neuer Fokus auf die Wechselwirkungen zwischen dem Gram-positiven Bakterium Staphylococcus aureus und dem Gram-negativen Bakterium Pseudomonas aeruginosa entstanden. Studien, die mit diesen Organismen koinfiziert sind, und In-vitro-Analysen zeigen sowohl kompetitive als auch kooperative Wechselwirkungen, die tiefgreifende und unerwartete Einflüsse auf das Fortschreiten der Krankheit, das mikrobielle Überleben, die Virulenz, den Stoffwechsel und die Antibiotikaanfälligkeit haben können (im Detail von Hotterbeekx et al. 2017¹³ und Limoli und Hoffman 2019³).

Das wachsende Interesse an Wechselwirkungen zwischen Arten während der Infektion hat zu einer Vielzahl von Methoden zur Untersuchung polymikrobiellen Gemeinschaftsverhaltens geführt. Typischerweise haben diese Studien Platten- oder Brühe-basierte Assays verwendet, um die phänotypischen Unterschiede zwischen Monokultur und Kokultur zu untersuchen. Zum Beispiel hat die Kokultivierung von P. aeruginosa und S. aureus auf festen Oberflächen die Visualisierung von Wachstumshemmungen oder Veränderungen der Koloniephänotyp-, Pigment- oder Polysaccharidproduktion^14,15,16ermöglicht. Gemischte Arten Biofilme, auf biotischen oder abiotischen Oberflächen, sowie die Kokultivierung von Bakterienarten in der flüssigen Kultur hat auch die Messung von Veränderungen in Wachstum, Stoffwechsel, Antibiotikatoleranz, Wettbewerb und Lebensfähigkeit ermöglicht, zusätzlich zu Gen- und Proteinexpression^17,18. Während diese Massenkulturexperimente Erkenntnisse darüber gewonnen haben, wie P. aeruginosa und S. aureus sich gegenseitig auf der Community-Skala beeinflussen könnten, sind sie nicht in der Lage, wichtige Fragen über die Interaktionen zu beantworten, die auf einzelliger Ebene stattfinden. Die hier vorgestellte Methode ergänzt die Ansätze zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Denspezies, indem sie sich auf die Veränderungen der Bewegung, der Zelllebensfähigkeit und der Genexpression einzelner Zellen innerhalb einer kokultivierten Gemeinschaft im Laufe der Zeit konzentriert.

Einzelzellige Interaktionen können sich stark von den Interaktionen unterscheiden, die in einer Massengemeinschaft von Zellen stattfinden. Durch Einzelzellanalyse kann die Heterogenität innerhalb einer Gemeinschaft quantifiziert werden, um zu untersuchen, wie die räumliche Platzierung von Zellen die Gemeinschaftsdynamik beeinflusst oder wie sich die Gen- und Proteinexpressionsniveaus innerhalb einzelner Mitglieder einer Gruppe verändern. Tracking-Zellen können auch einen Einblick in die Bewegung und das Verhalten einzelner Zellen im Laufe der Zeit über mehrere Generationen hinweg bieten. Durch die gleichzeitige Verfolgung der Zellbewegung und Veränderungen der Genexpression können Korrelationen zwischen Genschwankungen und entsprechenden Phänotypen hergestellt werden. Frühere Protokolle zur Untersuchung einzelner Bakterienarten auf einzelzeller Ebene wurden beschrieben. Diese Studien nutzen Live-Imaging-Zellen im Laufe der Zeit in einer einzigen Ebene und waren nützlich für die Beobachtung von Phänotypen wie Zellteilung und Antibiotikaanfälligkeit^19,20. Zusätzliche Live-Imaging-Mikroskopie wurde verwendet, um Wachstum, Beweglichkeit, Oberflächenbesiedlung und Biofilmbildung einzelner Bakterienarten zu überwachen^21,22,23. Während diese Studien jedoch aufschlussreich waren, um die Physiologie von Bakterien in der Monokultur zu verstehen, sind Experimente zur Beobachtung des einzelzelligen Verhaltens mehrerer Bakterienarten im Laufe der Zeit in der Kokultur begrenzt.

Hier wurden frühere Protokolle für die Bildgebung von Einzelarten angepasst, um Wechselwirkungen zwischen P. aeruginosa und S. aureuszu untersuchen. Diese Organismen können unter Phasenkontrast anhand ihrer Zellmorphologien unterschieden werden(P. aeruginosa sind Bazillen und S. aureus sind Kokzien). Die Entwicklung dieser Methode ermöglichte vor kurzem die Visualisierung von bisher unbeschriebenen Motilitätsverhalten von P. aeruginosa in Gegenwart von S. aureus²⁴. Es wurde festgestellt, dass P. aeruginosa in der Lage war, S. aureus aus der Ferne zu erfassen und mit erhöhten und gerichteten einzelzelligen Bewegungen auf Cluster von S. aureus-Zellen zu reagieren. P. aeruginosa Bewegung in Richtung S. aureus wurde gefunden, um den Typ IV pili (TFP), haarähnliche Projektionen, deren koordinierte Verlängerung und Rückzug erzeugen eine Bewegung namens zuckende Motilität²⁵.

Diese Studien zeigen den Nutzen dieser Methode für die Vernehmung früherer Wechselwirkungen zwischen Arten. Die Bildgebung bei hoher Zelldichte zu späteren Interaktionszeitpunkten ist jedoch schwierig, da einzelne Zellschichten nicht mehr identifiziert werden können, was bei der nach-Imaging-Analyse meist Probleme aufwirft. Angesichts dieser Einschränkung eignet sich die Methode am besten für frühere Interaktionen, die dann mit traditionellen makroskopischen Assays bei höheren Zelldichten, die für spätere Wechselwirkungen repräsentativ sind, weiterverfolgt werden könnten. Weitere Einschränkungen dieser Methode sind die geringe Durchsatz-Natur, da jeweils nur eine Probe abgebildet werden kann und die Kosten für Mikroskop, Kamera und Umweltkammer. Darüber hinaus birgt die Fluoreszenzmikroskopie Risiken für die Bakterienzellen wie Phototoxizität und Photobleaching und begrenzt somit die Häufigkeit, mit der Fluoreszenzbilder erfasst werden können. Schließlich sind die bei dieser Methode verwendeten Agarose-Pads sehr anfällig für Veränderungen in der Umgebung, was es wichtig macht, Bedingungen wie Temperatur und Luftfeuchtigkeit zu kontrollieren, da die Pads zu schrumpfen oder zu erweitern beginnen können, wenn die Bedingungen nicht korrekt sind. Schließlich, während diese Methode nicht die Wirtsumgebung imitiert, liefert sie Hinweise darauf, wie verschiedene Bakterienarten auf Oberflächen reagieren, die in Assays, die Umwelt-/Wirtsbedingungen nachahmen, weiterverfolgt werden können.

Diese Methode unterscheidet sich von früheren Studien, die die Bewegung einzelner Zellen verfolgen, indem Zellen zwischen einem Deckslip und einem Agarose-Pad geimpft werden, wodurch Zellen auf die Oberfläche beschränkt werden. Dies ermöglicht die Zellverfolgung im Laufe der Zeit in einer einzelnen Ebene. begrenzt jedoch Zyklen der transienten Oberflächeninteraktion, die beobachtet werden, wenn Zellen in Flüssigkeit²⁶eingetaucht sind. Ein weiterer Vorteil der Bildgebung von Bakterien unter einem Agarose-Pad ist, dass es makroskopische plattenbasierte Sub-Oberflächen-Inokulations-Assays imitiert, die klassisch verwendet werden, um P. aeruginosa zuckende Motilität zu untersuchen²⁵. In diesem Test werden Bakterienzellen zwischen dem Boden einer Petrischale und dem Agar geimpft, wodurch die Zellen in einer einzigen Ebene gehalten werden, während sie sich vom Punkt der Impfung nach außen bewegen, ähnlich wie dieses Mikroskopieprotokoll.

Das hier vorgestellte Zeitraffer-Mikroskopieprotokoll zur Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen Spezies besteht aus 1) der Vorbereitung der Bakterienprobe und des Agarose-Pads, 2) der Auswahl von Mikroskopeinstellungen für die bildgebende Erfassung und 3) der nach-imaging-Analyse. Eine detaillierte Visualisierung der Zellbewegung und -verfolgung kann durch Erfassung von Bildern in kurzen Zeitintervallen durch Phasenkontrast erfolgen. Die Fluoreszenzmikroskopie kann auch verwendet werden, um die Zelllebensfähigkeit oder Genexpression im Laufe der Zeit zu bestimmen. Hier zeigen wir ein Beispiel für die Anpassung an die Fluoreszenzmikroskopie durch Zugabe von Lebensfähigkeitsfarbstoffen zu den Agarose-Pads.

HINWEIS: Eine vollständige Beschreibung und Katalognummern für alle Verbrauchsmaterialien in diesem Protokoll finden Sie in der Tabelle der Materialien.

1. Vorbereitung von M8T Minimalmedien

1. Bereiten Sie 1 L M8 minimale Salzbasis (5x) durch Auflösen von 64 g Na₂HPO₄7H₂O, 15 g KH₂PO₄und 2,5 g NaCl in 800 ml Reinstwasser (UPW, Widerstand 18 M/cm) in einer 2 L Flasche vor. pH bis 7,6. Komplettes Volumen bis 1 L mit UPW. Autoklav für 45 min.
2. Bereiten Sie 500 ml einer Glukoselösung (20% w/v) vor, indem Sie 100 g Glukose in 400 ml UPW in einer 1 L Flasche auflösen. Komplettlösung auf 500 ml mit UPW. Autoklav für 45 min.
3. Bereiten Sie 500 ml einer Trypton-Lösung (20% w/v) vor, indem Sie 100 g Trypton in 400 ml UPW auflösen. Mit UPW auf 500 ml abschließen. Autoklav für 45 min.
4. Bereiten Sie 1 L M8 + 10% Trypton (M8T) minimale Medien vor, indem Sie 200 ml 5x M8 minimale Salze (1x Endsalze), 10 ml 20% Glukose (0,2% End) und 1 ml MgSO₄ (1 mM Finale) und 50 ml 20% Trypton (1% End) bis 600 ml UPW hinzufügen. Komplett auf 1 L mit UPW. Filtern Sie durch einen 0,2 m sterilen Filter in eine sterile 500 ml Medienspeicherflasche.

Tag 1:

2. Vorbereitung von bakteriellen Nachtkulturen

1. 5 ml M8T-Minimalmedien mit einer einzigen Kolonie von P. aeruginosa oder S. aureus (gegebenenfalls einschließlich Antibiotika) impfen und bei 37 °C über Nacht mit Belüftung von nicht länger als 16 h bebrüten.
   HINWEIS: Die bakteriellen Krankheitserreger P. aeruginosa und S. aureus wurden für diese Methode verwendet, da sie häufig von chronischen Infektionen isoliert werden, und die Untersuchung ihrer Wechselwirkungen ist wichtig zu verstehen, wie sie zu den Ergebnissen der Patienten bei polymikrobiellen Infektionen beitragen. Je nach Schwerpunkt der Studie könnten andere Bakterienarten verwendet werden.

Tag 2:

3. Subkultur von Bakterienstämmen

1. Subkultur P. aeruginosa 1:500 und S. aureus 1:1000 in 5 ml frischem M8T (gegebenenfalls Antibiotika enthalten). Inkubieren Sie mit Belüftung bei 37 °C, bis die Kulturen die Mittlere Logphase erreichen (OD₆₀₀ = 0,3 - 0,5).

4. Herstellung von Materialien für Pad-Formen

1. Bereiten Sie Metallspachtel vor, indem Sie das Ende eines flachen, abgerundeten Laborspachtels mit einem Bunsenbrenner erhitzen, bis die Hälfte des flachen Endes in einen 90°-Winkel gebogen werden kann. Das Ende eines weiteren flachen, abgerundeten Laborspachtels erhitzen und die letzten 10 mm leicht auf einen 45 °C-Winkel biegen.
2. Schneiden Sie die vier Ecken der Silikonformen ab, so dass die Formen in eine 35 mm Schale passen.
3. Sterilisieren Sie die Spachtel und eine Pinzette, indem Sie 70% Ethanol hinzufügen und durch die Flamme des Bunsenbrenners passieren.
4. Reinigen Sie die Schale und Silikonformen mit 70% Ethanol und trocknen Sie sie mit fusselfreien Tüchern.

5. Herstellung von Agarose-Pads

HINWEIS: Die Pads werden mit dem M8T Minimal Medium als Nährstoffquelle für die in diesem Protokoll verwendeten Bakterien hergestellt. Die in den Pads verwendeten Nährstoffe können jedoch für verschiedene Organismen verändert werden.

1. 2% Niedrigschmelz-Agarose in 10 ml M8T in einem sauberen 50 ml Erlenmeyer Kolben schmelzen. Mikrowelle in kurzen Intervallen (2-5 s) bis die Agarose in Lösung ist, um zu verhindern, dass der Inhalt des Kolbens überkocht. Nach dem Schmelzen in einem 50 °C-Wasserbad mindestens 15 min abkühlen lassen.
2. Bereiten Sie Formen vor, indem Sie den Silikonausschnitt mit der Öffnung in der 35-mm-Schale ausrichten und leicht mit Spachtel tippen, um das Silikon an der Schale zu befestigen und alle Luftblasen zwischen der Form und der Schale zu entfernen.
3. Nach dem Abkühlen wird die Pipette 915 l geschmolzener Agarose in die Form einfließen lassen. Lassen Sie den Deckel ajar und lassen Sie das Pad bei Raumtemperatur für 30 min trocknen.
4. Bedecken Sie die Schale mit dem Deckel und lassen Sie bei Raumtemperatur für zusätzliche 2 h.
5. Bereiten Sie Feuchtigkeitstücher vor, indem Sie ein fusselfreies Tuch fest aufrollen. Legen Sie das gerollte Tuch in eine sterile Petrischale und fügen Sie gleichmäßig 500 l steriles Wasser über das Tuch. 1 h auf 37 °C erwärmen.
6. Das Pad und eine sterile 35-mm-Schale 1 h auf 37 °C erwärmen.

6. Herstellung von Bakterienzellen und Impfpads

1. Messen Sie die OD₆₀₀ jeder Subkultur und verdünnen Sie P. aeruginosa auf eine OD₆₀₀ = 0,03 und S. aureus auf eine OD₆₀₀ = 0,10 in M8T vorgewärmt auf 37 °C. Mischen Sie P. aeruginosa und S. aureus in einem Verhältnis von 1:1 und Wirbel.
   HINWEIS: Wenn Stämme Antibiotika benötigen, können die Antibiotika der Nacht- und Subkultur zugesetzt werden, sollten aber nicht beim Mischen von Arten zur Bildgebung hinzugefügt werden, wenn sie die anderen Arten in der Kokultur betreffen. Die Plasmidstabilität und die Auswirkungen von Antibiotika auf alle Arten in der Kokultur müssen für jeden verwendeten Organismus/Plasmid bestimmt werden.
2. Pipette 1 l Cokultur gleichmäßig über den Boden einer vorgewärmten, sterilen 35 mm Glasabdeckung.
3. Entfernen Sie den Silikonausschnitt aus der Form mit einer sterilen Pinzette.
4. Entfernen Sie das Pad von der Schale mit sterilen Spachtel.
   1. Schieben Sie den leicht gebogenen Spachtel unter den Rand des Pads, während Sie die Form auf den Kopf halten, um sie auf einen sterilen Petriplattendeckel fallen zu lassen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, das Pad nicht zu erzwingen, oder es wird reißen. Behalten Sie den Überblick, welche Seite des Pads ist die Unterseite.
5. Übertragen Sie das Pad auf die Schale mit den Bakterienzellen, unten-seite-unten, durch Schieben der 90° abgewinkelten Spachtel unter dem Pad und legen Sie es auf der Oberseite der geimpften Abdeckung. Verwenden Sie den 90° abgewinkelten Spachtel, um das Pad bündig gegen den Deckelrutsch zu machen und alle Luftblasen vorsichtig herauszudrücken.
6. Entfernen Sie überschüssige Feuchtigkeit von feuchten Tüchern und legen Sie sie dann um den Rand der Schale, um sicherzustellen, dass sie das Pad nicht berührt. Die Probe ist nun zur Bildgebung bereit.

7. Einrichten des Mikroskops für Live-Bildgebung

1. Vor dem Versuchsaufbau die Umweltkammer mindestens 2 h auf 37 °C erwärmen.
2. Schalten Sie alle Komponenten ein, einschließlich Mikroskop, Computer und Lichtquellen für Hellfeld- und Fluoreszenz-Bildgebung.
3. Öffnen Sie die Bildverarbeitungssoftware, und stellen Sie sicher, dass Lichtquellen verbunden sind und ausgeführt werden.
4. Führen Sie Köhler-Beleuchtung²⁷ aus, um alle Bildebenen auszurichten.
   1. Bringen Sie zunächst markierten Coverslip mit einem 20-fachen Objektiv mit einer "dummen" Schale in den Fokus. Stellen Sie sicher, dass der Kondensatorrevolver auf die "offene" Position eingestellt ist.
      HINWEIS: Köhler-Beleuchtung sollte für jedes einzelne Objektiv/Beispiel durchgeführt werden, um Bildebenen richtig auszurichten. Die Fokussierung und Ausrichtung auf die "Dummy"-Schale auf die niedrigere Vergrößerung beschleunigt jedoch die Einrichtung von Live-Proben bei höherer Vergrößerung, um die Zeit zwischen Einrichtung und Versuchsstartzeit zu begrenzen.
   2. Fokussieren Sie den Kondensator.
      1. Schließen Sie die Feldmembran.
         HINWEIS: Eine achteckige Öffnung sollte angezeigt werden. Wenn der Kondensator vollständig aus dem Fokus fällt, erscheint das gesamte Sichtfeld (FOV) dunkel.
      2. Drehen Sie die Kondensatorfokussierungsknöpfe, bis die Achteckkanten gestochen scharf sind.
         HINWEIS: Die Lichtintensität wird zunehmen, wenn sich die Bildebenen der richtigen Ausrichtung nähern.
   3. Richten Sie den Kondensator aus.
      1. Zentrieren Sie den Feldkondensator, indem Sie die Ausrichtknöpfe anpassen.
         HINWEIS: Das Achteck sollte in der Mitte des FOV zentriert werden. Die Ausrichtknöpfe unterscheiden sich je nach Mikroskop. Zum Beispiel haben einige Mikroskopkondensatoren Knöpfe, während andere Schrauben haben, die einen Schraubendreher erfordern.
   4. Fokussieren Sie das Lampenfilament und stellen Sie die Kondensatoröffnung ein.
      1. Legen Sie ein Phasenteleskop oder eine Bertrand-Linse in den Lichtpfad, um die hintere Brennebene des Objektivs zu beobachten.
         HINWEIS: Es sollten zwei konzentrische Kreise vorhanden sein.
      2. Drehen Sie den Bertrand-Objektivfokusknopf, bis die Ringe knackig aussehen.
      3. Entfernen Sie die Bertrand-Linse vom Lichtpfad.
   5. Öffnen Sie die Feldmembran, bis sich das Achteck etwas außerhalb des FOV befindet.
   6. Wechseln Sie zum 100x Objektiv und schieben Sie den passenden Phasenring an Ort und Stelle, bevor Sie einen Tropfen Tauchöl hinzufügen, und legen Sie die vorbereitete Probenschale darauf.
   7. Führen Sie Köhler-Beleuchtung auf dem 100x Objektiv mit der bakteriellen Probenschale durch.
5. Konzentrieren Sie sich auf die Bakterien nur mit der Feineinstellung. Sobald die Bakterien im FOV durch das Okular fokussiert sind, schalten Sie den Lichtpfad zur Kamera, indem Sie die Kamerataste am Mikroskop drücken.
6. Klicken Sie in der Imaging-Software auf die Option Phase.
7. Passen Sie den Prozentsatz der dia LED-Lichtemittes an, indem Sie die Lichtquelle in der Software auswählen und entweder manuell den gewünschten Lichtprozentsatz eingeben oder den Balken auf der Lichtprozentskala verschieben.
8. Passen Sie die DIA LED-Lichtbelichtungszeit an, indem Sie auf die Lichtquelle klicken und entweder manuell die gewünschte Belichtungszeit eingeben oder eine Belichtungszeit aus dem bereitgestellten Dropdown-Menü auswählen.
   HINWEIS: Die Belichtungszeit hängt von der verwendeten Kamera ab.
9. Wenn Sie Fluoreszenz verwenden, passen Sie die Kameraeinstellungen in jedem entsprechenden Kanal (z. B. TxRed, GFP) an, indem Sie auf den fluoreszierenden Kanal von Interesse klicken.
   1. Stellen Sie den Prozentsatz des emittierten Fluoreszenzlichts ein, und passen Sie dann die Belichtungszeit an (wie in den Schritten 7.7 und 7.8 für DIA-LED-Licht ausgeführt).
   2. Alternativ können Sie die Bittiefe ändern, um den Dynamikbereich anzupassen, indem Sie eine der anderen Bittiefenoptionen im Dropdown-Menü "Visualisierungssteuerelemente" auswählen.
10. Wählen Sie die XY-Positionen aus, indem Sie im Menü erfassungssteuerelemente auf die Option XY klicken.
    1. Bewegen Sie die Bühnenposition mit dem Joy stick, oder indem Sie auf den FOV auf dem Bildschirm klicken und ihn ziehen, und klicken Sie auf das leere Feld, um die X- und Y-Koordinaten einer bestimmten Position zu speichern.
       HINWEIS: Die Auswahl von nicht mehr als drei verschiedenen XY-Positionen, die so nah wie möglich beieinander liegen, wird für die Zeitraffererfassung empfohlen.
11. Schalten Sie das Perfect Focus System (PFS) ein, indem Sie entweder auf das PFS-Feld auf der Registerkarte XY des Erfassungssteuerungsmenüs klicken oder die PFS-Taste auf dem Joy Stick-Bedienfeld drücken.
12. Drehen Sie die Feineinstellungsknöpfe, um sich auf die Bakterienzellen zu konzentrieren.
13. Klicken Sie auf die SCHALTFLÄCHE PFS für jede XY-Position, sobald sich die Zellen in der gewünschten Fokusebene befinden.
    HINWEIS: PFS kompensiert Drift en der Z-Achse bei Zeitrafferexperimenten. Dies ist notwendig, um den Fokus der Bakterienzellen im Laufe der Zeit zu halten. Verschiedene Hersteller haben unterschiedliche Kompensationssysteme.
14. Wählen Sie die Bildaufnahmebedingungen einschließlich Erfassungsintervall und Frequenz für jeden Kanal (z. B. Phasenkontrast und fluorophor), indem Sie aus den Optionen im Menü Erfassungssteuerungen auswählen.
    HINWEIS: Für die hier vorgestellten Experimente werden phasenkontrastbilder in Abständen alle 5-10 s erfasst, während alle 20 min Fluoreszenzbilder in den GfP- und TxRed-Kanälen aufgenommen werden.
15. Beginnen Sie mit der Bildgebung, sobald die Einstellungen für das Mikroskop und die Erfassung eingerichtet sind.

8. Optional: Modifikationen für Live/Dead Imaging

1. 2% Agarose in 10 ml M8T schmelzen und im 50 °C Wasserbad mindestens 15 min abkühlen lassen.
2. 1 mM Propidiumjodid zur geschmolzenen Agarose geben.
3. Nach dem Abkühlen die Pipette 915 l Agarose in der vorbereiteten Form.
4. Lassen Sie den Deckel ajar und lassen Pad bei Raumtemperatur für 30 min trocknen. Vor Licht schützen.
5. Bedecken Sie die Schale mit dem Deckel und lassen Sie bei Raumtemperatur für zusätzliche 2 h.
6. Bereiten Sie Feuchtigkeitstücher vor.
   1. Rollen Sie ein fusselfreies Papier fest abwischen.
   2. Das Tuch in eine sterile Petrischale geben und 500 l steriles Wasser zum Wischen geben.
   3. Bei 37 °C für 1 h inkubieren.
7. Das Pad und eine sterile 35-mm-Schale bei 37 °C für 1 h inkubieren.
8. Gehen Sie fort, um die Schale zu impfen, wie in Abschnitt 6 angegeben: Vorbereitung von Bakterienzellen und Impfpads.

9. Datenanalyse

1. Identifikation von Zellen
   1. Öffnen Sie die Bilddatei in der Bildverarbeitungssoftware, und schneiden Sie die Datei so zu, dass sie nur die Frames enthält, die für die Nachverfolgung verwendet werden sollen, auf die von Interesse betrachteten Zellen und nur im Phasenkontrastkanal vergrößert werden.
      HINWEIS: Die zugeschnittene Datei kann als neue Datei gespeichert werden, in der Tracking-Daten gespeichert werden können, ohne die Ursprüngliche Datei zu stören.
   2. Wählen Sie im Menü Analysesteuerelemente die Option zum Auswählen von Regionen von Interesse (ROI) aus, und definieren Sie ROIs, indem Sie entweder einzelne Bakterienzellen oder Zellcluster im ersten Frame, der für die Analyse verwendet werden soll, nachverfolgen.
      HINWEIS: Die ROIs können entweder manuell oder als Binärdateien definiert werden.
      1. Manuell den ROI definieren
         1. Verfolgen Sie den Umfang jeder einzelnen Bakterienzelle oder Zellcluster, um die ROIs manuell zu definieren.
            HINWEIS: In der Analysesoftware können P. aeruginosaoder andere stabförmige Zellen manuell nachverfolgt werden, indem der Ellipse-ROI ausgewählt und eine Ellipse gezeichnet wird, die an die Größe der Bakterienzelle angepasst ist. Alternativ kann Polygon die Polygon-ROI-Option ausgewählt werden, um nicht-traditionelle ROIs, z. B. Zellencluster, nachzuverfolgen.
      2. Identifizieren von binären ROIs
         1. Klicken Sie auf die Option Binär zu ROI, um binäre ROIs zu definieren.
            HINWEIS: Objekte werden in einer binären Ebene definiert, die auf der Trennung der dunkleren Bakterienzellen vom heller-pixeligen Hintergrund im Phasenkontrastkanal basiert.
         2. Um die Zellen zu begrenzen, wählen Sie im Menü Analysesteuerelemente die Option Schwellenwert aus. Wählen Sie den Kanal von Interesse aus, und schieben Sie die Balken im Fluoreszenzhistogramm, um die Schwellenwertintervallwerte anzupassen.
            HINWEIS: Die binäre Objektidentifikation für ROIs kann auch in fluoreszierenden Bildern definiert werden, indem die Bakterienzellen angrenzen. Die Schwellenwerte legen fest, welche Fluoreszenzintensitäten als Objekte betrachtet werden und welche Fluoreszenzintensitäten den Hintergrund bilden.
2. Zellverfolgung
   1. Um ROIs manuell nachzuverfolgen, wählen Sie den nächsten Frame in der Bildsequenz aus, und passen Sie die Position der ROIs an, indem Sie auf jeden ROI klicken und ziehen, um ihn an der neuen Position der ursprünglichen Bakterienzelle auszurichten.
      HINWEIS: Wenn die Bakterienzellen ihre Position nicht geändert haben, müssen die ROIs nicht verschoben werden.
   2. Wiederholen Sie dies in allen sequenziellen Frames, für die Zellen nachverfolgt werden sollen.
   3. Wenn sich Zellen teilen, definieren Sie die Tochterzellen als neue ROIs, wie in Schritt 9.1 beschrieben, und beginnen Sie mit der Verfolgung der neu aufgeteilten Zellen.
      HINWEIS: Wenn Zellen als Binärdateien identifiziert werden, verwenden Sie die Funktion Binärdateien verfolgen, um ROIs in ausgewählten Frames automatisch nachzuverfolgen.
   4. Nachdem Zellen durch alle ausgewählten Frames nachverfolgt wurden, exportieren Sie die zu analysierenden Daten.
   5. Öffnen Sie die Datentabelle, und identifizieren Sie die für die Analyse erforderlichen Messungen (z. B. Objektgeschwindigkeit, Beschleunigung oder Pfadlänge).
      HINWEIS: Bei der Messung der Richtung sind die Messungen der Pfadlänge und der Linienlänge erforderlich. Die Linienlänge ist eine Messung der euklidischen Entfernung oder des geraden Abstands vom Gleisursprung zum Rand der Kolonie S. aureus. Die Pfadlänge ist eine Messung des akkumulierten Abstands oder der Summe der Spursegmente aus allen Frames. Gerichtete Richtung kann als Verhältnis der euklidischen Entfernung, D_(E), (Linienlänge), über die akkumulierte Entfernung, D_(A), (Pfadlänge) berechnet werden.
3. Fluoreszenzquantifizierung
   1. Definieren Sie ROIs für fluoreszierende Bakterienzellen, wie in Schritt 9.1 beschrieben.
   2. Wiederholen Sie die Rückverfolgung oder Bewegung von ROIs für Bakterienzellen oder Cluster in den verbleibenden fluoreszierenden Rahmen.
   3. Exportieren Sie die generierte Tabelle zur Analyse der fluoreszierenden Intensität in eine Tabellendatei.
   4. Suchen Sie in der Datentabelle nach der Spalte mit "Mean Intensity", die die durchschnittliche Fluoreszenzintensität für den ROI der nachverfolgten Bakterienzellen darstellt.
   5. Grafisch die Mittelintensitätswerte, um die Veränderungen der Fluoreszenz im Laufe der Zeit zu untersuchen.
      HINWEIS: Die Veränderungen der Fluoreszenz im Laufe der Zeit stellen die Fluktuation der Genexpression für das fluoreszierend markierte Gen dar.

Die erfolgreiche Verwendung der beschriebenen Methode führt zu einer Reihe von Frames, die ein Video erzeugen, in dem die Wechselwirkungen zwischen Denspezies im Laufe der Zeit beobachtet werden können. Der Schaltplan in Abbildung 1 bietet eine visuelle Darstellung der wichtigsten Schritte bei der Vorbereitung von Materialien für die Bildgebung. Die Anwendung dieser Methode hat die Demonstration von P. aeruginosa Zellen, die unterschiedliche Verhaltensweisen in der Monokultur im Vergleich zur Kokultur mit S. aureuserlaubt. Im Vergleich zu den P. aeruginosa Zellen in monokultur, die in Flößen gruppiert bleiben, wenn in Kokultur mit S. aureus, P. aeruginosa hat die einzellige Beweglichkeit gegenüber S. aureus Kolonien erhöht (Abbildung 2A-2B). Fluoreszierend markierte Bakterienstämme ermöglichen auch die Visualisierung gemischter Populationen von Bakterienarten. Die Verwendung von GFP-markiertem P. aeruginosa erlaubte die Beobachtung, dass nach P. aeruginosa einzelne Zellen die Beweglichkeit erhöhen, sie umgeben und schließlich in S. aureus Kolonien eindringen werden (Abbildung 2C). Die Nutzung fluoreszierend markierter Zellen ermöglicht auch die erstmalige Visualisierung der P. aeruginosa-Zellinvasion in die S. aureus-Kolonien (Abbildung 2C, unten).

Während das Protokoll qualitativ hochwertige Bilder für die Beobachtung von Interaktionen zwischen Denspezies liefert, gibt es mehrere häufige Probleme, die zu schlechten Bildsequenzen führen können. Inkonsistente Luftfeuchtigkeit über die Dauer des Experiments und falsch getrocknete Pads sind zwei häufige Probleme, die zu Driftführen führen, die durch das Verschieben des Pads und das Ziehen der Zellen mit ihm aus dem FOV resultieren (Abbildung 3A). Veränderungen der Luftfeuchtigkeit beeinflussen die Trockenheit der Agarose-Pads. Erhöhte Luftfeuchtigkeit macht die Pads zu nass, so dass Feuchtigkeit zwischen dem Pad und dem Boden der Glasbodenschale absetzen kann. Die Feuchtigkeit hinterlässt eine Flüssigkeitsschicht, die dick genug ist, damit motile Zellen durchschwärmen oder schwimmen können, und hält bakterienzellen nicht in einer einzigen Ebene. In der Zwischenzeit trocknen die Feuchtigkeitsrückgänge das Pad schneller aus, was dazu führt, dass Zellen früh driften. Ein weiterer häufiger Fehler bei der Verwendung dieser Methode mit Fluoreszenz ist das Erfassen von fluoreszierenden Bildern zu häufig oder die Exposition von Bakterienzellen zu lange an fluoreszierendes Licht. Kurze Erfassungsintervalle für fluoreszierende Bilder regen immer wieder Fluorophore mit hochintensivem Licht einer bestimmten Wellenlänge an. Angeregte Fluorophore reagieren dann mit Sauerstoff und verursachen den Abbau des Fluorophors. Die resultierende Photobleichung erschöpft die Fluoreszenz, bis ein weiterer Fluorophor exprimiert und gefaltet werden kann, aber den Bakterienzellen selbst nicht schadet (Abbildung 3B). Der Verlust der Fluoreszenz stört jedoch die Messung der Gen-/Proteinexpression und lässt die Zellen markerlos, bis das Fluorophor vollständig synthetisiert und wieder angeregt werden kann. Darüber hinaus kann der Sauerstoff, der mit angeregten Fluorophoren interagiert, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) bilden. Diese ROS-Radikale schädigen dann Bakterienzellen, werden schließlich toxisch und führen zu Zelltod innerhalb weniger Zellteilungen (Abbildung 3C). Die Prozesse der Photobleaching und Phototoxizität können leicht gesehen werden, da Zellen zuerst ihre Fluoreszenz vollständig verlieren, und in nachfolgenden Rahmen werden die Zellen aufhören zu teilen und können schließlich sterben (Abbildung 3B-3C). Ein letztes häufiges Problem beim Einrichten des Experiments ist der Beginn mit zu vielen Zellen pro FOV oder mit Zellen, die zu nahe beieinander liegen, was in der Regel weniger als 20 m voneinander entfernt ist. Überfüllte Zellen im ersten Frame ergeben Cluster von teilenden Zellen, die einfach ineinander übergehen, wenn sie wachsen, anstatt zu interagieren. Darüber hinaus haben Zellen, die zu nahe in der Nähe beginnen, möglicherweise nicht genügend Zeit, um einen Gradienten von sezernierten Signalen zu ermitteln, auf die die anderen Arten reagieren können (Abbildung 3D), während entfernte Bakterienzellen möglicherweise nicht die Möglichkeit haben, sich innerhalb der Dauer des Experiments zu begegnen.

Abbildung 4 zeigt ein Beispiel dafür, wie die Lebensfähigkeit bakterieller Zellen mit diesem Protokoll visualisiert werden kann, indem den Agarose-Pads Propidiumjodid hinzugefügt wird. Propidiumiodid ist für lebende Zellen undurchlässig, kann aber in Zellen mit beschädigten Membranen eindringen und an Nukleinsäuren binden. Hier wurden GFP-beschriftete WT S. aureus mit Medien allein oder mit zellfreiem Überstand von P. aeruginosa behandelt und unmittelbar nach der Behandlung abgebildet. Drei verschiedene Kanäle wurden abgebildet: Phase, TxRed und GFP. Helle grüne Zellen zeigen lebende Zellen an, die das GFP aktiv ausdrücken, wie es für den S. aureus gesehen wird, der nur mit Medien behandelt wird (Abbildung 4A), und rote Zellen zeigen tote Propidium-iodid-gefärbte S. aureus-Zellen an, nachdem sie mit P. aeruginosa überstand behandelt wurden (Abbildung 4B). Während nur ein Zeitpunkt gezeigt wird, kann diese Methode angepasst werden, um die Zelllebensfähigkeit während der Zeitraffer-Live-Bildgebung zu bestimmen.

Mehrere post-imaging-Analysen können durchgeführt werden, um Aspekte von Wechselwirkungen zwischen Spezies zu quantifizieren. Beispielsweise kann die Zellverfolgung Messungen für die Ausrichtung von P. aeruginosa Einzelzellbewegungen in Richtung eines Clusters von S. aureus liefern. Die Bewegungen einzelner P. aeruginosa Zellen werden vom Rahmen aus verfolgt, eine Zelle verlässt das Floß durch den Rahmen, in dem die Zelle den S. aureus-Cluster erreicht (Abbildung 5A). Der Abstand zwischen dem P. aeruginosa Floß und dem S. aureus Cluster liefert die euklidische Entfernung, D(E), während die gesamten Streckenlängen die akkumulierte Entfernung liefern, D(A) (Abbildung 5B). Die Richtung jeder Zelle wird als Verhältnis von D(E)/D(A)berechnet. In den Cokulturexperimenten bewegte sich WT P. aeruginosa in Richtung WT S. aureus mit deutlich höherer Ausrichtung als in Richtung S. aureus agrBDCA, einem Mutanten ohne Agr-regulierte sekretionierte Faktoren, die zuvor für die Richtungsbeweglichkeit gegenüber S. aureus24 (Abbildung 5C)notwendig waren.

Abbildung 1: Schematic des Imaging-Setupprotokolls.
Überblick über kritische Schritte zur Herstellung von Bakterienkulturen und Agarosepads. Erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Die Zeitraffer-, Live-Imaging-Mikroskopie zeigt Unterschiede im Verhalten von P. aeruginosa, wenn sie mit S. aureus kokultiviert wird.
Repräsentative Schnappschüsse von P. aeruginosa (Bacilli, grün) in Monokultur (A) und in Derkokultur mit S. aureus (Cocci, unmarkiert) (B). (C) Fluoreszierend markierte Bakterien ermöglichen die Visualisierung von P. aeruginosa Einzelzellen, die in S. aureus-Cluster eindringen. Phasenkontrast und GFP-Kanal-Overlay (oben) und GFP-Kanal allein (unten). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentative Schnappschüsse von häufigen Bildverarbeitungsproblemen, die zu einer schlechten Bildaufnahme führen.
(A) Unsachgemäß getrocknete Pads und inkonsistente Feuchtigkeit führen während der Dauer der Bildgebung zum Driften von Zellen über den FOV. Die Position der Gründungszelle ist in jedem Rahmen (grüner Stab) markiert. (B) Photobleichungen aus der Exposition gegenüber Licht zu lange werden nachweisbare Fluoreszenzniveaus für einen bestimmten Zeitraum erschöpfen, aber die Zellen nicht abtöten. (C) Phototoxizität als Folge der häufigen Exposition gegenüber Licht führt zum Zelltod. Die ersten Anzeichen von Phototoxizität sind zu sehen, wenn Zellen die Fluoreszenz beenden und sich nicht teilen. (D) Hohe anfängliche Inokulum-Massenzellen im FOV und verhindert die Beobachtung von Wechselwirkungen zwischen Denspezies. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Vergleich von lebenden mit toten S. aureus-Zellen.
Repräsentative Schnappschüsse für GFP-markierte S. aureus, die entweder mit mittlerer Alone (A) oder zellfreiem P. aeruginosa überstand (B) behandelt wurden Die Zellen wurden nach der Behandlung sofort abgebildet. Lebende Zellen (grün) drücken aktiv GFP aus und schließen Propidiumjodid aus, während abgestorbene Zellen (rot) GFP-Fluoreszenz verlieren und Membranpermeabilisierung es Propidiumjodid ermöglicht, in die Zellen einzudringen und Nukleinsäuren zu binden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Zellverfolgungsanalyse von P. aeruginosa in Cokultur mit S. aureus.
Zuvor wurde diese Methode verwendet, um die Zellverfolgung von WT P. aeruginosa in Derkokultur mit entweder WT oderagrBDCA S. aureusdurchzuführen. (A) Darstellung von P. aeruginosa einzelzelligen Spuren in einer Kokultur mit S. aureus agrBDCA. (B) Schematische Messungen für die euklidische Entfernung (D(E)) und die akkumulierte Entfernung (D(A)) Messungen zur Bestimmung der Gerichtetheit ((D(E)/D(A)). (C) Directedness-Messungen einzelner WT P. aeruginosa-Zellen in Kokultur mit WT undAgrBDCA S. aureus. Diese Zahl wurde von Limoli et al. 201924geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Die Autoren erklären, dass sie nichts zu offenbaren haben.