Summary
בידוד תאים משתלים מנותחים ואפיונם לפי ציטומטריית זרימה יכולים לתרום משמעותית להבנת דפוס התגובה החיסונית נגד שתלים. מאמר זה מתאר שיטה מדויקת לבידוד תאים משתלים מנותחים וצביעתם לצורך אנליזה ציטומטרית של זרימה.
Abstract
ההצלחה של השתלת רקמה שגודלה במעבדה או מכשיר רפואי באדם כפופה לתגובה החיסונית של המארח המקבל. בהתחשב בשתל כגוף זר, תגובה חיסונית עוינת ולא מווסתת עלולה לגרום לדחיית השתל, בעוד תגובה מווסתת והחזרת הומאוסטזיס יכולה להוביל לקבלתו. ניתוח המיקרו-סביבות של שתלים המנותחים תחת הגדרות in vivo או ex vivo יכול לסייע בהבנת דפוס התגובה החיסונית, אשר בסופו של דבר יכול לסייע בפיתוח דורות חדשים של ביו-חומרים. ציטומטריית זרימה היא טכניקה ידועה לאפיון תאי מערכת החיסון ותת-קבוצותיהם בהתבסס על סמני פני התא שלהם. סקירה זו מתארת פרוטוקול המבוסס על חיתוך ידני, עיכול אנזימטי וסינון באמצעות מסננת תאים לבידוד מתרחיפים אחידים של תאים מרקמת השתל המנותחת. יתר על כן, הוסבר פרוטוקול צביעת ציטומטריה של זרימה מרובת צבעים, יחד עם שלבים להגדרות ציטומטר ראשוניות כדי לאפיין ולכמת תאים מבודדים אלה על ידי ציטומטריית זרימה.
Introduction
ההתקדמות בתחום הרפואה הובילה לשימוש תכוף בחומרים מושתלים לתמיכה בתפקוד או צמיחה מחדש של רקמות פגועות 1,2. אלה כוללים מכשירים כגון קוצבי לב, שתלים קוסמטיים משחזרים, ולוחות אורתופדיים המשמשים לקיבוע שבר עצם 3,4. עם זאת, החומרים המשמשים לייצור שתלים אלה והמיקומים שבהם הם מושתלים ממלאים תפקיד חשוב בקביעת ההצלחה של שתלים אלה 5,6,7. כגופים זרים, שתלים אלה יכולים ליצור תגובה חיסונית מהמארח שיכולה להוביל לדחייה או לסבילות8. גורם זה הניע את המחקר הביו-חומרי ליצור חומרים שיכולים למשוך את התגובה החיסונית הרצויה לאחר ההשתלה 9,10,11,12.
התגובה החיסונית היא דרישה חיונית בתחום הרפואה הרגנרטיבית, כאשר רקמה או איבר גדלים סביב שלד ביו-חומרי (פיגום) במעבדה להחלפת רקמה או איבר פגומים13,14,15,16. ברפואה רגנרטיבית, המטרה היא להחליף רקמות חסרות או פגומות באמצעות שימוש בתאים, אותות ופיגומים, שכל אחד מהם יכול להיות מווסת במידה רבה על ידי תגובות חיסוניות17. יתר על כן, גם כאשר רוצים חוסר תגובה חיסונית, לעיתים רחוקות מאוד מדובר בהיעדר פעילות חיסונית ולא בנוכחות פרופיל ויסות רצוי18 . טכניקות כגון ציטומטריית זרימה יכולות למלא תפקיד משמעותי באפיון דפוס התגובה החיסונית לביו-חומרים שונים המשמשים לציפוי מכשירי שתלים או לפיתוח פיגומים להנדסת רקמות19.
מידע זה, בתורו, יסייע בסופו של דבר בפיתוח ביו-חומרים לשתלים שיכולים להיות נסבלים היטב על ידי מערכת החיסון או בפיתוח פיגומים שיכולים למלא תפקיד בונה בהנדסת רקמות. הכנה נכונה של דגימות לניתוח לפי ציטומטריית זרימה היא צעד חשוב למניעת תוצאות לא מדויקות באפיון חיסוני באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי20,21. לכן, סקירה זו מציגה מתודולוגיה מפורטת שניתן להשתמש בה לבידוד תאים מרקמת פיגום, צביעת תרחיף התא וניתוח על ידי ציטומטריית זרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: איור 1 נותן סקירה כללית של פרוטוקול ציטומטריית הזרימה.
1) הכנת ריאגנטים
- הכינו מדיה לדילול אנזימים ולתרבית רקמות.
- הוסף 5 מ"ל של תמיסת חיץ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) ל-500 מ"ל של סל"ד בינוני ונער היטב. יש לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.
- חשב את נפח תמיסת האנזים.
הערה: נפח תמיסת האנזים הוא נפח התווך המכיל את האנזימים (collagenase ו- DNase I) הדרושים לעיכול רקמות חתוכות לקוביות בצלחות 6 בארות; זה תלוי במספר הדגימות.- השתמש במשוואה הבאה כדי לחשב את אמצעי האחסון הנדרש:
(מספר הדגימות לעיכול) × 5 מ"ל של סל"ד ללא סרום עם חיץ HEPES של 10 mM
הערה: לדוגמה, עבור 0.1 עד 0.3 גרם של טחול מנותח, השתמש 5 מ"ל של מדיום כדי להכין את תמיסת האנזים. פרוטוקול העיכול האנזימטי המתואר בכתב יד זה מיועד בעיקר לרקמות רכות (בטווח שבין 0.1 ל-1 גרם) המנותחות מעכברים הכוללות את המוח, הכליות, העור, הכבד, הריאות, הטחול, השרירים וכן קפסולות סביב שתלים תת-עוריים העשויים מחומרים סינתטיים או חלבוני מטריצה חוץ-תאיים. עיכול רקמות סחוס קשות עשוי לדרוש תנאים שונים ונפחים שונים של אנזימי עיכול, אשר ניתן לברר רק על ידי אופטימיזציה. - חשב את כמות collagenase ו- DNase שהייתי צריך עבור תמיסת אנזים.
הערה: בפרוטוקול זה נעשה שימוש ב-0.25 מ"ג/מ"ל של קולגנאז ו-0.2 מ"ג/מ"ל של DNase I. ריכוזי העבודה הנדרשים עבור collagenase ו- DNase יכולים להשתנות עבור סוגים שונים של רקמות19.
- השתמש במשוואה הבאה כדי לחשב את אמצעי האחסון הנדרש:
- הכינו תמיסת צבע בכדאיות בקנ"מ 1:1000 על ידי הוספת 1 מיקרוליטר של צבע הכדאיות (ראו טבלת חומרים) ל-999 מיקרוליטר של מלח חוצץ פוספט (PBS) ומערבלו את התמיסה. יש לאחסן את התמיסה בחושך בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.
- הכינו את מאגר הצביעה על ידי הוספת גרם אחד של אלבומין בסרום בקר (BSA) ל-100 מ"ל PBS, וערבבו את התמיסה עד להמסת BSA לחלוטין. יש לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.
2) הגדרת לוחות עיכול אנזימטיים
- הגדר צלחת 6 בארות עם מסננות תאים 70 מיקרומטר בכל באר. מוסיפים 3 מ"ל של המדיום המוכן משלב 1.1.1 לכל באר, ודגרים על קרח.
- יש לאחסן את המדיה הנותרת (2 מ"ל/באר) באינקובטור או באמבט מים בטמפרטורה של 37°C להשעיית הכמות המחושבת של collagenase ו-DNase I (שלב 1.2.2).
3) בידוד תאים
- מניחים את השתלים/הרקמה המנותחים בצלחות, וחותכים דק בעזרת מספריים. לחלופין, השתמש בשיטת הפרעה מכנית באמצעות דיסוצייאטור רקמות או הומוגנייזר ידני. בשל המספר הגבוה של לויקוציטים, יש לנתח את הטחול כדי להשתמש בו כבקרת כתמים בכל ריצה.
הערה: מכיוון שחומרים מסוימים גורמים לרמות גבוהות יותר של פיברוזיס, פרוטוקול זה ישים הן עבור חומרים פיברוטיים מאוד והן עבור חומרים פיברוטיים מינימליים. עם זאת, יש להעריך כל שיטת עיבוד הן מבחינת תפוקת התאים והן מבחינת הכדאיות לאחר העיכול לפני הצביעה. הימנע זיהום דם היקפי במהלך דיסקציה. - הוסף collagenase ו- DNase I (נפח מחושב בשלב 1.2.2) ל- RPMI הנותר (2 מ"ל) שחומם ל- 37 ° C. הוסף 2 מ"ל של תמיסת האנזים המלאה לכל באר.
- הניחו את הצלחות בשייקר מודגר למשך 45 דקות ב-37°C וב-100 סל"ד.
הערה: היזהר בעת ערימת צלחות מכיוון שהדבר עלול לעכב העברת חום נכונה. - בינתיים, הכינו קצה לחלוקת מתלים על ידי קיצוץ 3-4 מ"מ מקצה קצה 1000 μL עם מספריים. לאחר הדגירה, פיפטה את התרחיף בבארות למעלה ולמטה כדי לערבב אותו היטב באמצעות קצה קצוץ. מניחים את מסננת התא על גבי צינור חרוטי של 50 מ"ל ומעבירים את התמיסה המעוכלת דרך מסננת התא.
הערה: מסננת התאים בגודל 70 מיקרומטר מספיקה כדי להפריד תאים מביו-חומר מושתל, כגון אלגינט. אם נדרש טוהר רב יותר, השתמש בתהליכים כגון הפרדת שיפוע צפיפות כדי להשיג אוכלוסייה מועשרת של לויקוציטים. - שטפו את הבארות בתמיסת PBS 1x, והעבירו את נפח השטיפה דרך המסננת, ולאחר מכן הוסיפו את שטיפות המסננת בתמיסת PBS 1x עד שהנפח בצינור מגיע ל-50 מ"ל.
הערה: PBS 1x חייב להיות בטמפרטורת החדר כדי למנוע כל עלייה בצמיגות העיכול ולאפשר כדורי תאים במהלך צנטריפוגה. - צנטריפוגה את הצינור ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, יש לשאוף את הסופרנאטנט בזהירות באמצעות פיפטה סרולוגית מבלי להפריע לכדורית. להשעות מחדש את הגלולה ב 1000 μL של 1x PBS, ולהעביר את המתלה לצינור מיקרוצנטריפוגה.
- מערבבים 10 μL של תרחיף התא עם 10 μL של כחול טריפאן, וטוענים את המתלה על שקופיות תא ספירה לספירת תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי או על המוציטומטר לספירה בשיטה המקובלת תחת מיקרוסקופ. לחלופין, השתמש בחרוזים לספירת תאי ציטומטריה של זרימה.
4) צביעה לציטומטריית זרימה
- ראו איור 2 לדוגמה פריסת לוחות עבור ניסוי של 14 צבעים עם 45 דגימות, פקדי פלואורסצנטיות פחות אחד (FMO), בקרות פיצוי ובקרת דגימת טחול מוכתמת במלואה. לאחר הערכת המספר הכולל של תאים, חשב את נפח תרחיף התא הדרוש לצביעת 1 × 106 תאים עבור כל דגימה, ו- 0.5 × 106 תאים עבור כל פיצוי ובקרת FMO. הוציאו את הנפח הנדרש של תרחיף התא לבארות של צלחת V תחתונה 96 בארות, והשלימו את הנפח ל -100 μL עם PBS 1x.
הערה: לדוגמה, אם 1000 μL של תרחיף תאים המתקבל בשלב 3.6 מכילים 40 × 10 6 תאים, אז עבור 1 × 10 6 תאים, 1000/40 × 106 = 25 μL של השעיית תאים יידרש. - צנטריפוגו את הצלחת ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, לשאוף את supernatant, ולאחר מכן להשעות מחדש את התאים בבארות הדגימה ובבאר בקרת פיצוי כדי לקבוע כדאיות, עם 100 μL של תמיסה 1:1000 של צבע הכדאיות (ראה טבלה של חומרים).
- עבור תאים בבארות פיצוי אחרות, כמו גם FMO ובארות לא מוכתמות, להשעות אותם עם 100 μL של 1x PBS.
- לדגור על התאים בחושך במשך 30 דקות ב 4 ° C.
- בינתיים, הכינו קוקטייל נוגדנים משטח להכתמת הדגימה ובקרות FMO: 50 מיקרוליטר לדגימה או FMO. ראו טבלה 1 לדוגמה של קוקטייל הנוגדנים.
- לאחר הדגירה, להוסיף 100 μl של 1x PBS לכל באר, להסתובב למטה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- לשאוף את supernatant ו resuspend ב 200 μL של חיץ צביעה (1x PBS + 1% BSA); צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (75 °F).
- לשאוף את supernatant, ולהשעות מחדש את התאים פיצוי, FMO, בארות לא מוכתמים עם 50 μL של 1x PBS. הוסף 50 μL של קוקטייל הנוגדנים לבארות הדגימה ולבארות FMO המתאימות. הוסף את הנוגדנים המתאימים לבארות הפיצוי השונות.
- לדגור על הצלחת במשך 45 דקות בחושך ב 4 ° C. לאחר הדגירה, להוסיף 150 μL של חיץ מכתים בכל באר, ולצנטריפוגה את תרחיף התא ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- שאפו את הסופרנטנט, השהו מחדש את התאים עם 200 מיקרוליטר של חיץ צביעה, וצנטריפוגו את תרחיף התא ב 300 × גרם למשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- אם מנתחים דגימות ללא קיבוע, יש להשעות אותן מחדש ב-200 מיקרוליטר של חיץ צביעה, ולהמשיך לסעיף 6 על הגדרת ציטומטר וניתוח דגימות. אם מקבעים את התאים, יש לשאוף את הסופרנאטנט לאחר השטיפה, ולהוסיף 100 μL של חומר קיבוע כגון 4% פרפורמלדהיד. אם יש צביעה לסמנים תוך-תאיים, יש לעבור לסעיף 5 בנושא צביעה תוך-תאית, ולתקן ולחדור לתאים (ראו טבלת חומרים). לדגור על תאים במשך 20 דקות בחושך ב 4 ° C.
הערה: מכיוון שקיבוע יכול להשפיע על עוצמת הפלואורסצנטיות של פלואורופורים מסוימים, הערך כל פאנל עם ובלי קיבוע. - לאחר הדגירה, להוסיף 100 μL של 1x PBS, ואחריו צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. שאפו את הסופרנטנט, השהו מחדש ב-1x PBS וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-4°C.
- יש להשהות מחדש את התאים ב-200 μL של חיץ הצביעה, ולאחסן ב-4°C לפני ניתוח ציטומטרי של זרימה.
5) צביעה תוך תאית
- המשך משלב 4.11 עבור קיבוע וחדירה עבור סמנים תאיים, להוסיף 100 μL של המאגר המתאים. צנטריפוגה את התאים ב 350 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לשאוף את supernatant, ולתלות מחדש את הכדורים ב 200 μL של תמיסת סוכן מחלחל; צנטריפוגה את התאים ב 350 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. שאפו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את הכדוריות עם נוגדנים תוך תאיים מדוללים בחיץ המתאים.
הערה: סוגי נוגדנים ודילול יהיו תלויים בתאי היעד. לדוגמה, סמן תוך-תאי נפוץ אחד הוא תיבת ראש מזלג P3 עבור תאי T רגולטוריים, אשר משמש לעתים קרובות בדילול של 1:100. - לדגור על תרחיף התא בחושך במשך 45 דקות ב 4 ° C. לאחר הדגירה, להוסיף 150 μL של המאגר המתאים, וצנטריפוגה את המתלה ב 350 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- שאפו את הסופרנטנט, והשהו מחדש את התאים ב 200 מיקרוליטר של חיץ צביעה ואחריו צנטריפוגה ב 300 × גרם למשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. שאפו והשעו מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של חיץ מכתים לצורך ניתוח ציטומטרי של זרימה.
6) ציטומטר והגדרת פיצוי
- מיד לפני הרצת הדגימות, הכינו חרוזי פיצוי (ראו טבלת חומרים) אם משתמשים בפיצוי מבוסס חרוזים לעומת פיצוי מבוסס תאים.
- תייגו צינורות מיקרו-צנטריפוגות נפרדים עבור כל נוגדן מצומד פלואורוכרום, והוסיפו 100 μL של 1x PBS ואחריו טיפה אחת מלאה של חרוזי פיצוי בקרה שלילית נגד עכברים וטיפה אחת של חרוזי פיצוי בקרה חיובית לכל צינור. הוסף 1 μL של הנוגדן המתאים לכל צינור נפרד. מערבלים ודגרים במשך 5 דקות לפני הרכישה.
הערה: מכיוון שלא ניתן לקשור צבעים מסוימים, כגון BUV737, לחרוזים, השתמש בפקד מבוסס תאים.
- תייגו צינורות מיקרו-צנטריפוגות נפרדים עבור כל נוגדן מצומד פלואורוכרום, והוסיפו 100 μL של 1x PBS ואחריו טיפה אחת מלאה של חרוזי פיצוי בקרה שלילית נגד עכברים וטיפה אחת של חרוזי פיצוי בקרה חיובית לכל צינור. הוסף 1 μL של הנוגדן המתאים לכל צינור נפרד. מערבלים ודגרים במשך 5 דקות לפני הרכישה.
- כייל את ציטומטר הזרימה לפני כל ניסוי על ידי הפעלת מערך הציטומטר עם חרוזי המעקב, ושמור על הגדרות ציטומטר הזרימה עבור כל ניסוי.
- לפני ניתוח הדגימה, התאימו את ציטומטר הזרימה על ידי הפעלת דגימה לא מוכתמת כדי להתאים את אוכלוסיית התא בתרשים פיזור צדדי (SSC) לעומת פיזור קדימה (FSC) כך שאוכלוסיית התא תיפול במרכז העלילה ולא תהיה מחוץ לקנה המידה.
- הפעל את הדגימה המוכתמת לזמן קצר כדי להתאים את המתחים עבור FSC ו- SSC ועבור כל ערוץ כדי לוודא שאף אירוע אינו חורג מהסולם הלוגריתמי של כל ערוץ. שיא של 5,000 אירועים עבור כל בקרת פיצוי, ואחריה גידור של אוכלוסיות חיוביות ושליליות. חשב את מטריצת הפיצוי ולאחר מכן הפעל את הדגימות, איסוף לפחות 1,000 אירועים עבור האוכלוסיות המעניינות.
הערה: יש לוודא פיצוי על לוחות צבעוניים גדולים יותר, מכיוון שפיצוי אוטומטי עלול להיות מועד לפיצוי יתר או חסר. כל פרמטר צריך להיות גרף מול כל פרמטר אחר כדי לעקוב אחר סימנים של פיצוי יתר או חסר, וכל פקד בצבע יחיד צריך להיות מוערך. פיצוי מורכב של ניסויים בצבע גדול יותר צריך להתבצע בסיוע של משתף פעולה או מתקן ליבה עם ניסיון ציטומטריה זרימה נרחב. סוגים חדשים יותר של ציטומטרים של זרימה כגון ציטומטרים ספקטרליים מנצלים את הספקטרום המלא של פלואורופור בתהליך המכונה אי-ערבוב ספקטרלי, אשר יכול להניב הבחנה נקייה יותר של חפיפה פלואורסצנטית בהשוואה לפיצוי סטנדרטי בלבד22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תהליך הפיתוח של לוחות ציטומטריית זרימה לניתוח חיסוני מסתמך לעתים קרובות על השוואת התוצאות לנתונים הקיימים ולספרות בתחום. הידע על האופן שבו אוכלוסיות עשויות להופיע בציטומטריית זרימה הוא קריטי לפרשנות נכונה של נתונים. בכל מקרה, אוכלוסיות וסוגי תאים יכולים להופיע באופן שונה ברקמות שונות, כך שיש לצפות לשונות מסוימת. בהקשר של רקמות בקרה מוגדרות היטב, אופטימיזציה כזו של צביעה יכולה להיות מוערכת מול רקמות ידועות שיש להן סוגי תאים שנחקרו היטב. איור 3 מציג את התוצאות של FACS של 14 צבעים על רקמת עכבר בקרה. במקרה זה, הטחול שימש לזיהוי כל הסמנים שהוכתמו, ולהראות כי הצביעה הייתה פונקציונלית מבחינה טכנית. מנקודה זו ואילך, היה קל יותר לבדוק בתנאים לא ידועים, להיות בטוחים בבחירת הפלואורופור, ולייעל את הפרוטוקול עבור מקורות רקמות שונים. איור 3 מראה גם אוכלוסיות של סוגי תאים שונים שבודדו מטחול מורין19.
כאן, ניתן היה לראות מספר אוכלוסיות ברורות, כגון נויטרופילים Ly6G+, ורמות ביטוי שונות של Ly6C על מחלקות מונוציטים שונות. תאים דנדריטיים מסוג CD11chi MHCII+ נראו בקלות כאשר גודרו כנגד CD11b כדי לשלול מקרופאגים ותאי שושלת מיאלואידים אחרים כגון נויטרופילים ומונוציטים. ניתן למצוא תת-קבוצה של תאים דנדריטיים CD206+CD86+ על ידי התמקדות באוכלוסיית CD11c+ זו. CD86 ו- CD206 נכללו בפנוטיפ תאים מיאלואידים כנמצאים במצב קיטוב דמוי M1 יותר (CD86hi) לעומת במצב קיטוב דמוי M2 יותר (CD206hi). F4/80 הראה שיפוע של ביטוי, שניתן לראות בדרך כלל באוכלוסיות מקרופאגים שונות. Siglec-F היה נוכח בשתי אוכלוסיות, F4/80+ ו-F4/80-, ככל הנראה מתאים לתת-קבוצה של מקרופאגים ואאוזינופילים, בהתאמה. למרות שניתן לבצע כינויים אלה של סוגי תאים, חשוב לציין כי תאים המבטאים סמנים שונים צריכים להיתפס באופן פונקציונלי בניגוד לסיווג בינארי יותר. ההכרה בכך שמה שנחשב למקרופאג עשוי להיות שונה בטחול ובקפסולת הגוף הזר סביב השתל, חשובה ומונעת פרשנות שגויה פוטנציאלית של התוצאות.
איור 1: סקירה כללית של פרוטוקול צביעת ציטומטריה של זרימה. ההכנה כוללת דיסקציה של הרקמה המעניינת ואחריה 1) חיתוך ידני, 2) עיכול אנזימטי, 3) מאמץ ושטיפת תאים, 4) צביעה בנוגדנים מתויגים פלואורסצנטית ואחריה ניתוח ציטומטרי זרימה. האיור נעשה עם Biorender. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דוגמה לפריסת לוחות לצביעת ציטומטריית זרימה. פריסה זו כוללת את הדגימות, פקדי פלואורסצנטיות פחות אחד (FMO), בקרות פיצוי ודגימת רקמת בקרה (טחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תוצאות מייצגות של צביעת FACS ב-14 צבעים על רקמת עכבר הבקרה. פנוטיפ של תאים מיאלואידים של תאי טחול מורין עם דוגמאות של התקבצות ידנית ואלגוריתם אשכולות אוטומטי של שכנות סטוכסטית (t-SNE) לתצוגת נתונים. דמות זו שוחזרה מסדטלר ואליסף19. קיצורים: FACS = מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות; SSC = פיזור צד; CD = אשכול של בידול; PE = phycoerythrin; CCR = סוג קולטן כימוקין C-C; MHC = קומפלקס היסטותאימות מרכזי; PerCP = קומפלקס חלבון כלורופיל פרידינין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| מגיב/נוגדן | μL לדגימה |
| CD86 BUV395 | 0.25 |
| CD45 BUV737 | 0.5 |
| CD8a BV421 | 0.25 |
| Ly6g BV510 | 0.125 |
| סיגלק F BV605 | 0.25 |
| MHCII BV786 | 0.25 |
| Ly6c AF488 | 0.125 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | 0.2 |
| CD206 PE | 0.2 |
| CD197 PE/Dazzle594 | 0.125 |
| F4/80 PE/Cy7 | 0.25 |
| נגמ"ש CD200R3 | 0.25 |
| CD11b AF700 | 0.25 |
| בלוק FC | 1 |
| BD מבריק מאגר כתמים פלוס | 10 |
| 1x PBS | 35.975 |
| נפח כולל: | 50 מיקרוליטר |
טבלה 1: דוגמה לקוקטייל נוגדנים משטחי. קוקטייל נוגדנים לדוגמה לפנוטיפ מיאלואיד של רקמת עכבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
סקירה זו מתארת מתודולוגיה מפורטת לבידוד תאים משתלים ביו-חומריים להשגת תרחיף תאים אחיד. בנוסף, סופק פרוטוקול מפורט לצביעת תרחיף התא עבור ציטומטריית זרימה צבעונית, יחד עם השלבים להגדרת ציטומטר זרימה לקבלת תוצאות אופטימליות. שיטות בידוד תאים יכולות לכלול שלבים מרובים, לעתים קרובות באמצעות דיסקציה ידנית של רקמות ואחריה עיכול אנזימטי עם אנזימים מפרקי חלבון כדי לנתק את המטריצה החוץ תאית ברקמה ולשבש את הצטלבויות התא כדי לשחרר תאים בודדים מהרקמה. לאחר העיכול, יש צורך בעיבוד נוסף, כגון מאמץ תאים, כדי להסיר את הפסולת שנותרה ולהבטיח השעיה של תא יחיד. דגימות מסוימות שיש בהן רמות גבוהות של פסולת או סוגי תאים אחרים (כגון גידולים) עשויות לדרוש ניקוי יסודי יותר באמצעות שימוש באמצעי הפרדת צפיפות23. ללא ניקוי דגימה מתאים, הנתונים עלולים להיות מוטים בשל פסולת או אוכלוסיות תאים אחרות המסתירות את האוכלוסיות המעניינות. עודף פסולת יכול גם להוביל לסתימה מלאה או חלקית של נוזל הציטומטר.
בעוד אפיון תאי מערכת החיסון יכול להתבצע גם בשיטות אחרות, כגון מיקרוסקופ אור, על ידי ביצוע ספירת תאים דיפרנציאלית על הכנת ציטוספין התא, ציטומטריית זרימה מספקת אפיון מדויק יותר של התאים על סמך סמני פני התא. בנוסף, נתוני ציטומטריית זרימה מדויקים יותר מכיוון שהם יכולים לאפיין ולכמת מיליוני תאים בתרחיף ויכולים לספק הערכות מדויקות של תת-קבוצות תאים נפרדות הרבה יותר מהר מאשר ספירה דיפרנציאלית ידנית המבוססת על 400 תאים בלבד24. התוצאות המוצגות במאמר זה מסתמכות על תכנון פאנל איטרטיבי עם בחירת נוגדנים שנעשה על ידי שימוש בכלים מקוונים מרובים כדי להשוות את ספקטרום העירור והפליטה ואת החפיפה התיאורטית בהתאם לתצורת הציטומטר. כאשר מתכננים ניסויי צבע גדולים יותר, עדיף להתחיל מלוח נקי, בניגוד לתוספת לפאנל צבע קטן יותר, כדי לשקול באופן מלא את שפע האנטיגן, בהירות הפלואורופורים והחפיפה הספקטרלית.
מחקרים המנתחים תת-קבוצות נפרדות של תאי חיסון ספציפיים דורשים מספר מספיק של תאים כוללים כדי לבצע ציטומטריית זרימה, שכן מספר קטן יותר של תאים יכול להוות אתגר משמעותי בבידוד שלהם על ידי מיון תאים או קבלת הערכות מדויקות. ניתן להתגבר על אתגר זה על ידי שימוש בחרוזים מגנטיים לבידוד והעשרה של תאים חיסוניים ספציפיים, כגון נויטרופילים, בפרקי זמן קצרים יותר ובשטיפה מוגבלת25. תאים מבודדים מרקמות של איברים כגון ריאות יכולים להכיל כמויות משמעותיות של ריר, אשר יכול להפוך את תרחיף התא "דביק" ולגרום למספר מוגבר של אירועים כפולים במהלך ציטומטריית זרימה26,27. הוספת חומרים chelating כגון 2 mM ethylenediamine tetraacetic חומצה למאגר הצביעה יכול למנוע הצטברות של תאים בדגימות כאלה.
בנוסף, השעיית תאים בנפח מוגבר של מאגר יכולה גם להגביל את יצירת הכפילות על-ידי הפחתת אינטראקציות תא-תא. הליכי צביעה צריכים להיות מותאמים ביסודיות לכל רקמה שונה, פרוטוקול צביעה, ציטומטר זרימה ופאנל נוגדנים. חלק מהפלואורופורים יכולים להיות רגישים יותר לקיבוע, סוגי תאים מסוימים רגישים יותר לשיטות בידוד ועיבוד תאים שונות, וסוגי תאים רבים מתנהגים באופן שונה ברקמות שונות ובמיקומים שונים. עם הכנה נכונה וניתוח קפדני, ציטומטריית זרימה יכולה להניב ניתוח מפורט ברמת התא והחלבון כדי לאפיין את הפיגום ואת המיקרו-סביבה החיסונית הביו-חומרית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית המחקר האינטרמורלי של ה-NIH, כולל המכון הלאומי לדימות ביו-רפואי וביו-הנדסה. כתב ויתור: ה-NIH, נושאי המשרה שלו ועובדיו אינם ממליצים או תומכים בשום חברה, מוצר או שירות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 6 Well Plate | Fisher Scientific | 07-000-646 | |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | BD Biosciences | 566385 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | For only fixing cells |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A7906 | For preparing FACS staining buffer |
| CD11b AF700 | Biolegend | 101222 | Clone: M1/70 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 117325 | Clone: N418 |
| CD197 PE/Dazzle594 | Biolegend | 120121 | Clone: 4B12 |
| CD200R3 APC | Biolegend | 142207 | Clone: Ba13 |
| CD206 PE | Biolegend | 141705 | Clone: C068C2 |
| CD45 BUV737 | BD Biosciences | 612778 | Clone: 104/A20 |
| CD86 BUV395 | BD Biosciences | 564199 | Clone: GL1 |
| CD8a BV421 | Biolegend | 100737 | Clone: 53-6.7 |
| Comp Bead anti-mouse | BD Biosciences | 552843 | For compensation control |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I) |
| F4/80 PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone: BM8 |
| Fc Block | Biolegend | 101301 | Clone: 93 |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | For fixing and permeabilization of cells. |
| HEPES buffer | Thermo Fisher | 15630080 | Buffer to supplement cell media |
| Liberase | Millipore Sigma | 5401127001 | Blend of purified Collagenase I and Collagenase II |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L23105 | Viability dye |
| Ly6c AF488 | Biolegend | 128015 | Clone: HK1.4 |
| Ly6g BV510 | Biolegend | 127633 | Clone: 1A8 |
| MHCII BV786 | BD Biosciences | 742894 | Clone: M5/114.15.2 |
| Phosphate buffer saline | Thermo Fisher | D8537 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875176 | Cell culture media |
| Siglec F BV605 | BD Biosciences | 740388 | Clone: E50-2440 |
| V-bottom 96-well plate |
References
- Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
- Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules. Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).
- Rolfe, B., et al. The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering. Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials. Eberli, D., et al. , IntechOpen. (2011).
- Erdem, S., Gür, M., Kaman, M. O. Static and dynamic analyses of fracture fixation bone-plate systems for different plate materials and dimensions. Bio-Medical Materials and Engineering. 29 (5), 611-628 (2018).
- Kang, C. -W., Fang, F. -Z. State of the art of bioimplants manufacturing: part I. Advances in Manufacturing. 6 (1), 20-40 (2018).
- Sadtler, K., et al. Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds. Biomaterials. 192, 405-415 (2019).
- Sadtler, K., et al. Design, clinical translation and immunological response of biomaterials in regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1 (7), 16040 (2016).
- Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A.
- Badylak, S. F., Valentin, J. E., Ravindra, A. K., McCabe, G. P., Stewart-Akers, A. M. Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling. Tissue Engineering Part A. 14 (11), 1835-1842 (2008).
- Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
- Zhang, L., et al. Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction. Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).
- Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction. Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).
- Tan, H., Marra, K. G. Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications. Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).
- Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials. Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861 (2019).
- Sadtler, K., et al. Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells. Science. 352 (6283), 366-370 (2016).
- Gower, R. M., et al. Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression. Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).
- Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).
- Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A.
- Sadtler, K., Elisseeff, J. H. Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials. Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. , Wiley. (2003).
- Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.27 (2013).
- Wolf, M. T., et al. A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy. Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).
- Kahng, J., et al. Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts. Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).
- Sionov, R. V., et al. Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties. Journal of Visualized Experiments. (100), e52933 (2015).
- Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
- Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).
