Summary
Isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun karakterisering door middel van flowcytometrie kan aanzienlijk bijdragen aan het begrijpen van het patroon van immuunrespons tegen implantaten. Dit artikel beschrijft een nauwkeurige methode voor de isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun kleuring voor flowcytometrische analyse.
Abstract
Het succes van het implanteren van in het laboratorium gekweekt weefsel of een medisch hulpmiddel bij een persoon is afhankelijk van de immuunrespons van de ontvangende gastheer. Als een implantaat als een vreemd lichaam wordt beschouwd, kan een vijandige en ontregelde immuunrespons leiden tot de afstoting van het implantaat, terwijl een gereguleerde respons en het herwinnen van homeostase kan leiden tot de acceptatie ervan. Het analyseren van de micro-omgevingen van implantaten die zijn ontleed onder in vivo of ex vivo settings kan helpen bij het begrijpen van het patroon van immuunrespons, wat uiteindelijk kan helpen bij het ontwikkelen van nieuwe generaties biomaterialen. Flowcytometrie is een bekende techniek voor het karakteriseren van immuuncellen en hun subsets op basis van hun markers op het celoppervlak. Deze review beschrijft een protocol gebaseerd op handmatige dobbelstenen, enzymatische vertering en filtratie door een celzeef voor de isolatie van uniforme celsuspensies uit ontleed implantaatweefsel. Verder is een meerkleurig flowcytometriekleuringsprotocol uitgelegd, samen met stappen voor initiële cytometerinstellingen om deze geïsoleerde cellen te karakteriseren en te kwantificeren door middel van flowcytometrie.
Introduction
Vooruitgang op het gebied van de geneeskunde heeft geleid tot het veelvuldig gebruik van geïmplanteerde materialen ter ondersteuning van de functie of hergroei van beschadigd weefsel 1,2. Deze omvatten apparaten zoals pacemakers, reconstructieve cosmetische implantaten en orthopedische platen die worden gebruikt voor fixatie van botbreuken 3,4. De materialen die worden gebruikt om deze implantaten te maken en de locaties waar ze worden geïmplanteerd, spelen echter een belangrijke rol bij het bepalen van het succes van deze implantaten 5,6,7. Als vreemde lichamen kunnen deze implantaten een immuunrespons van de gastheer opwekken die kan leiden tot afstoting of tolerantie8. Deze factor heeft biomateriaalonderzoek ertoe aangezet materialen te genereren die de gewenste immuunrespons kunnen aantrekken na implantatie 9,10,11,12.
De immuunrespons is een essentiële vereiste op het gebied van regeneratieve geneeskunde, waarbij in een laboratorium een weefsel of een orgaan wordt gekweekt rond een biomateriaalskelet (steiger) voor de vervanging van een beschadigd weefsel of orgaan13,14,15,16. In de regeneratieve geneeskunde is het doel om ontbrekend of beschadigd weefsel te vervangen door het gebruik van cellen, signalen en steigers, die elk sterk kunnen worden gemoduleerd door immuunresponsen17. Bovendien, zelfs wanneer een gebrek aan immuunrespons gewenst is, is het zeer zelden een afwezigheid van immuunactiviteit in plaats van de aanwezigheid van een regulerend profiel dat gewenst is18. Technieken zoals flowcytometrie kunnen een belangrijke rol spelen bij het karakteriseren van het patroon van immuunrespons op verschillende biomaterialen die worden gebruikt voor het coaten van implantaten of voor het ontwikkelen van steigers voor weefselmanipulatie19.
Deze informatie zal op zijn beurt uiteindelijk helpen bij het ontwikkelen van biomaterialen voor implantaten die goed kunnen worden verdragen door het immuunsysteem of bij het ontwikkelen van steigers die een constructieve rol kunnen spelen bij tissue engineering. Een goede voorbereiding van monsters voor analyse door middel van flowcytometrie is een belangrijke stap om onnauwkeurige resultaten bij immuunkarakterisering via fluorescentie-geactiveerde celsorteringte voorkomen 20,21. Daarom presenteert deze review een gedetailleerde methodologie die kan worden gebruikt voor de isolatie van cellen uit steigerweefsel, het kleuren van de celsuspensie en analyse door middel van flowcytometrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Figuur 1 geeft een overzicht van het flowcytometrieprotocol.
1) Bereiding van reagens
- Bereid media voor op het verdunnen van enzymen en voor weefselkweek.
- Voeg 5 ml 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES)-bufferoplossing toe aan 500 ml RPMI-medium en schud goed. Bewaar het medium bij 4 °C tot verder gebruik.
- Bereken het volume van de enzymoplossing.
OPMERKING: Het volume van de enzymoplossing is het volume van het medium dat de enzymen (collagenase en DNase I) bevat die nodig zijn om in blokjes gesneden weefsel in platen met 6 putjes te verteren; Het hangt af van het aantal monsters.- Gebruik de volgende vergelijking om het vereiste volume te berekenen:
(Aantal te verteren monsters) × 5 ml serumvrije RPMI met 10 mM HEPES-buffer
OPMERKING: Gebruik bijvoorbeeld voor 0,1 tot 0,3 g ontlede milt 5 ml medium om de enzymoplossing te bereiden. Het enzymatische verteringsprotocol dat in dit manuscript wordt beschreven, is voornamelijk bedoeld voor zachte weefsels (variërend van 0,1 tot 1 g) die worden ontleed van muizen, waaronder de hersenen, nieren, huid, lever, longen, milt, spieren, evenals capsules rond onderhuidse implantaten gemaakt van synthetische materialen of extracellulaire matrixeiwitten. Het verteren van harde kraakbeenweefsels kan verschillende omstandigheden en volumes spijsverteringsenzymen vereisen, die alleen kunnen worden vastgesteld door optimalisatie. - Bereken de hoeveelheid collagenase en DNase die ik nodig had voor de enzymoplossing.
OPMERKING: In dit protocol werden 0,25 mg/ml collagenase en 0,2 mg/ml DNase I gebruikt. De werkconcentraties die nodig zijn voor collagenase en DNase kunnen variëren voor verschillende soorten weefsels19.
- Gebruik de volgende vergelijking om het vereiste volume te berekenen:
- Bereid een 1:1000 levensvatbaarheidskleurstofoplossing door 1 μL van de levensvatbaarheidskleurstof (zie materiaaltabel) toe te voegen aan 999 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en de oplossing te vortexen. Bewaar de oplossing in het donker bij 4 °C tot verder gebruik.
- Bereid de kleuringsbuffer voor door 1 g runderserumalbumine (BSA) toe te voegen aan 100 ml PBS en draai de oplossing totdat BSA volledig is opgelost. Bewaar de oplossing bij 4 °C tot verder gebruik.
2) Opzetten van enzymatische verteringsplaten
- Plaats een plaat met 6 putjes met 70 μm celzeven in elk putje. Voeg 3 ml van het voorbereide medium uit stap 1.1.1 toe aan elk putje en incubeer op ijs.
- Bewaar de resterende media (2 ml/putje) in een incubator of waterbad bij 37 °C om de berekende hoeveelheid collagenase en DNase I te suspenderen (stap 1.2.2).
3) Isolatie van cellen
- Plaats de ontlede implantaten/weefsel in platen en snijd ze fijn met een schaar. U kunt ook een mechanische verstoringsmethode gebruiken met behulp van een weefseldissociator of draagbare homogenisator. Vanwege het grote aantal leukocyten, ontleedt u de milt om deze bij elke run als kleuringscontrole te gebruiken.
OPMERKING: Aangezien sommige materialen hogere niveaus van fibrose induceren, is dit protocol van toepassing op zowel zeer fibrotische als minimaal fibrotische materialen. Elke verwerkingsmethode moet echter worden geëvalueerd op zowel celopbrengst als levensvatbaarheid na vertering voorafgaand aan de kleuring. Vermijd perifere bloedbesmetting tijdens dissectie. - Voeg collagenase en DNase I (volume berekend in stap 1.2.2) toe aan de resterende RPMI (2 ml) die is opgewarmd tot 37 °C. Voeg 2 ml van de volledige enzymoplossing toe aan elk putje.
- Plaats de borden 45 minuten in een geïncubeerde shaker bij 37 °C en 100 rpm.
NOTITIE: Wees voorzichtig bij het stapelen van platen, omdat dit een goede warmteoverdracht kan belemmeren. - Bereid ondertussen een suspensie-doseerpunt voor door met een schaar 3-4 mm van het uiteinde van een punt van 1000 μL af te hakken. Na incubatie pipetteer je de suspensie in de putjes op en neer om het grondig te mengen met behulp van de gehakte punt. Plaats de celzeef op de bovenkant van een conische buis van 50 ml en laat de verteerde oplossing door de celzeef lopen.
OPMERKING: De celzeef van 70 μm is voldoende om cellen te scheiden van geïmplanteerd biomateriaal, zoals alginaat. Als een grotere zuiverheid vereist is, gebruik dan processen zoals dichtheidsgradiëntscheiding om een verrijkte populatie leukocyten te verkrijgen. - Spoel de putjes met 1x PBS-oplossing en breng het spoelvolume door de zeef, gevolgd door het toevoegen van de wasbeurten van de zeef met 1x PBS-oplossing tot het volume in de buis 50 ml bereikt.
OPMERKING: De 1x PBS moet op kamertemperatuur zijn om een toename van de viscositeit van de digest te voorkomen en om celpelletvorming tijdens het centrifugeren mogelijk te maken. - Centrifugeer de buis bij 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Na het centrifugeren het supernatans voorzichtig opzuigen met behulp van een serologische pipet zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer de pellet in 1000 μL 1x PBS en breng de suspensie over naar een microcentrifugebuis.
- Meng 10 μL van de celsuspensie met 10 μL trypanblauw en laad de suspensie op telkamerglaasjes voor het tellen van cellen met behulp van een automatische celteller of op een hemocytometer om te tellen via de conventionele methode onder een microscoop. U kunt ook flowcytometrie gebruiken voor het tellen van cellen.
4) Kleuring voor flowcytometrie
- Zie afbeelding 2 voor een voorbeeld van een plaatlay-out voor een 14-kleurenexperiment met 45 monsters, fluorescentie minus één (FMO)-controles, compensatiecontroles en een volledig gekleurde miltmonstercontrole. Bereken na schatting van het totale aantal cellen het volume van de celsuspensie dat nodig is voor het kleuren van 1 × 10 6 cellen voor elk monster en 0,5 × 106 cellen voor elke compensatie en FMO-controle. Doseer het vereiste volume van de celsuspensie in de putjes van een V-bodem 96-wells plaat en vul het volume aan tot 100 μL met 1x PBS.
OPMERKING: Als bijvoorbeeld 1000 μL celsuspensie verkregen bij stap 3.6 40 × 10 6 cellen bevat, dan is voor 1 × 106 cellen 1000/40 × 106 = 25 μL celsuspensie vereist. - Centrifugeer de plaat bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C, zuig het supernatant op en resuspendeer vervolgens de cellen in de monsterputjes en in een compensatiecontroleputje om de levensvatbaarheid te bepalen, met 100 μL van een 1:1000-oplossing van de levensvatbaarheidskleurstof (zie Materiaaltabel).
- Voor cellen in de andere compensatieputjes, evenals FMO en ongekleurde putjes, resuspendeert u deze met 100 μL 1x PBS.
- Incubeer de cellen gedurende 30 minuten in het donker bij 4 °C.
- Bereid intussen een oppervlakte-antilichaamcocktail voor het kleuren van het monster en FMO-controles: 50 μL per monster of FMO. Zie tabel 1 voor een voorbeeld van de antilichaamcocktail.
- Voeg na de incubatie 100 μl 1x PBS toe aan elk putje en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 300 × g .
- Aspireer het supernatans op en resuspendeer in 200 μL kleuringsbuffer (1x PBS + 1% BSA); centrifugeren bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Aspireer het supernatant op en resuspendeer de cellen in de compensatie-, FMO- en ongekleurde putjes met 50 μL 1x PBS. Voeg 50 μL van de antilichaamcocktail toe aan de respectievelijke monsterputjes en FMO-putjes. Voeg de respectievelijke antilichamen toe aan de verschillende compensatieputjes.
- Incubeer de plaat gedurende 45 minuten in het donker bij 4 °C. Voeg na incubatie 150 μl kleurstofbuffer toe aan elk putje en centrifugeer de celsuspensie bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Zuig het supernatant op, resuspendeer de cellen met 200 μl kleuringsbuffer en centrifugeer de celsuspensie bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Als u monsters analyseert zonder fixatie, resuspendeer ze dan in 200 μL kleuringsbuffer en ga verder met sectie 6 over het instellen van de cytometer en monsteranalyse. Als u de cellen fixeert, zuig dan het supernatans na het wassen op en voeg 100 μL van een fixeermiddel toe, zoals 4% paraformaldehyde. Als u kleurt voor intracellulaire markers, ga dan verder met sectie 5 over intracellulaire kleuring en fixeer en permeabiliseer de cellen (zie Tabel met materialen). Incubeer de cellen gedurende 20 minuten in het donker bij 4 °C.
OPMERKING: Aangezien fixatie de fluorescentie-intensiteit van sommige fluoroforen kan beïnvloeden, moet u elk paneel zowel met als zonder fixatie evalueren. - Voeg na incubatie 100 μl 1x PBS toe, gevolgd door centrifugeren bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig het supernatant op, resuspendeer in 1x PBS en centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Breng de cellen opnieuw in suspendeer in 200 μl kleuringsbuffer en bewaar ze bij 4 °C voordat de flowcytometrische analyse wordt uitgevoerd.
5) Intracellulaire kleuring
- Voortbordurend op stap 4.11 voor fixatie en permeabilisatie voor intracellulaire markers, voegt u 100 μL van de juiste buffer toe. Centrifugeer de cellen bij 350 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig het supernatant op en suspendeer de pellets opnieuw in 200 μl van de oplossing van het fixeermiddel-permeabiliserende middel; centrifugeer de cellen bij 350 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig het supernatant op en resuspendeer de pellets met intracellulaire antilichamen verdund in de juiste buffer.
OPMERKING: Antilichaamtypes en verdunningen zijn afhankelijk van de doelcellen. Een veel voorkomende intracellulaire marker is bijvoorbeeld forkhead box P3 voor regulerende T-cellen, die vaak wordt gebruikt bij een verdunning van 1:100. - Incubeer de celsuspensie gedurende 45 minuten in het donker bij 4 °C. Voeg na incubatie 150 μl van de juiste buffer toe en centrifugeer de suspensie bij 350 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Zuig het supernatant op en suspendeer de cellen opnieuw in 200 μl kleuringsbuffer, gevolgd door centrifugeren bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Aspireer de cellen op en suspendeer ze opnieuw in 200 μL kleuringsbuffer voor flowcytometrische analyse.
6) Cytometer en compensatie-instelling
- Bereid onmiddellijk voordat u de monsters uitvoert compensatieparels voor (zie Materiaaltabel) als u gebruik maakt van compensatie op basis van kralen in plaats van compensatie op basis van cellen.
- Label afzonderlijke microcentrifugebuisjes voor elk fluorochroom-geconjugeerd antilichaam en voeg 100 μL 1x PBS toe, gevolgd door een volledige druppel anti-muis negatieve controlecompensatiekorrels en één druppel positieve controlecompensatiekorrels aan elk buisje. Voeg 1 μL van het juiste antilichaam toe aan elk afzonderlijk buisje. Vortex en incubeer gedurende 5 minuten voor acquisitie.
OPMERKING: Aangezien sommige kleurstoffen, zoals BUV737, niet aan kralen kunnen worden gebonden, moet u een op cellen gebaseerde controle gebruiken.
- Label afzonderlijke microcentrifugebuisjes voor elk fluorochroom-geconjugeerd antilichaam en voeg 100 μL 1x PBS toe, gevolgd door een volledige druppel anti-muis negatieve controlecompensatiekorrels en één druppel positieve controlecompensatiekorrels aan elk buisje. Voeg 1 μL van het juiste antilichaam toe aan elk afzonderlijk buisje. Vortex en incubeer gedurende 5 minuten voor acquisitie.
- Kalibreer de flowcytometer voor elk experiment door de cytometeropstelling uit te voeren met de volgkralen en handhaaf de flowcytometerinstellingen voor elk experiment.
- Voordat u het monster analyseert, past u de flowcytometer aan door een niet-gekleurd monster uit te voeren om de celpopulatie aan te passen op een side scatter (SSC) versus forward scatter (FSC) plot, zodat de celpopulatie in het midden van de plot valt en niet off-scale is.
- Voer het gekleurde monster kort uit om de spanningen voor FSC en SSC en voor elk kanaal aan te passen om er zeker van te zijn dat er geen gebeurtenissen buiten de logaritmische schaal van elk kanaal vallen. Registreer 5.000 gebeurtenissen voor elke compensatiecontrole, gevolgd door gating van positieve en negatieve populaties. Bereken de compensatiematrix en voer vervolgens de steekproeven uit, waarbij ten minste 1.000 gebeurtenissen worden verzameld voor de populaties van belang.
OPMERKING: Compensatie op panelen met grotere kleuren moet worden geverifieerd, aangezien geautomatiseerde compensatie gevoelig kan zijn voor over- of ondercompensatie. Elke parameter moet worden afgezet tegen elke andere parameter om te controleren op tekenen van over- of ondercompensatie, en elke controle met één kleur moet worden geëvalueerd. Complexe compensatie van experimenten met grotere kleuren moet worden uitgevoerd met de hulp van een medewerker of een kernfaciliteit met uitgebreide ervaring met flowcytometrie. Nieuwere soorten flowcytometers, zoals spectrale cytometers, maken gebruik van het volledige spectrum van een fluorofoor via een proces dat bekend staat als spectrale ontmenging, wat een duidelijker onderscheid van fluorescerende overlap kan opleveren in vergelijking met alleen standaardcompensatie22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het proces van ontwikkeling van flowcytometriepanels voor immuunanalyse is vaak afhankelijk van de vergelijking van resultaten met bestaande gegevens en de literatuur in het veld. Kennis van hoe populaties zich kunnen presenteren in flowcytometrie is van cruciaal belang voor een goede interpretatie van gegevens. Hoe dan ook, populaties en celtypen kunnen er in verschillende weefsels anders uitzien, dus enige variabiliteit is te verwachten. In de context van goed gedefinieerde controleweefsels kan een dergelijke kleuringsoptimalisatie worden geëvalueerd ten opzichte van bekend weefsel met goed onderzochte celtypen. Figuur 3 toont de resultaten van een 14-kleuren FACS op controlemuizenweefsel. In dit geval werd de milt gebruikt om alle markers te identificeren waarvoor gekleurd was, en om aan te tonen dat de kleuring technisch functioneel was. Vanaf dit punt werd het gemakkelijker om in onbekende omstandigheden te testen, vertrouwen te hebben in de selectie van fluorofoor en het protocol te optimaliseren voor verschillende weefselbronnen. Figuur 3 toont ook populaties van verschillende celtypen geïsoleerd uit een milt van muizen19.
Hier konden verschillende voor de hand liggende populaties, zoals Ly6G+-neutrofielen, en verschillende expressieniveaus van Ly6C op verschillende monocytenklassen worden waargenomen. CD11chiMHCII+ dendritische cellen waren duidelijk zichtbaar wanneer ze werden afgeschermd tegen CD11b om macrofagen en andere myeloïde afstammingscellen zoals neutrofielen en monocyten uit te sluiten. Een subset van CD206+CD86+ dendritische cellen kon worden gevonden door zich te concentreren op deze CD11c+ populatie. CD86 en CD206 werden opgenomen in het fenotype van myeloïde cellen als zijnde in een meer M1-achtige (CD86hi) versus in een meer M2-achtige (CD206hi) polarisatietoestand. F4/80 vertoonde een gradiënt van expressie, die vaak kan worden waargenomen in verschillende macrofaagpopulaties. Siglec-F was aanwezig in twee populaties, F4/80+ en F4/80-, die hoogstwaarschijnlijk overeenkomen met respectievelijk een macrofaagsubgroep en eosinofielen. Hoewel deze aanduidingen van celtypen kunnen worden gemaakt, is het belangrijk op te merken dat cellen die verschillende markers tot expressie brengen, op een functionele manier moeten worden bekeken, in tegenstelling tot een meer binaire classificatie. Erkenning dat wat als een macrofaag wordt beschouwd, kan verschillen in de milt en het vreemde lichaamskapsel rond een implantaat, is belangrijk en voorkomt de mogelijke verkeerde interpretatie van de resultaten.
Figuur 1: Overzicht van het kleuringsprotocol voor flowcytometrie. De voorbereiding omvat dissectie van het weefsel van belang, gevolgd door 1) handmatig in blokjes snijden, 2) enzymatische vertering, 3) celpersen en wassen, en 4) kleuring met fluorescerend gelabelde antilichamen gevolgd door flowcytometrische analyse. De illustratie is gemaakt met Biorender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbeeld van een plaatlay-out voor flowcytometriekleuring. Deze lay-out omvat de monsters, fluorescentie minus één (FMO)-controles, compensatiecontroles en een controleweefselmonster (milt). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve resultaten van 14-kleuren FACS-kleuring op controlemuizenweefsel. Myeloïde celfenotypering van miltcellen van muizen met voorbeelden van hand-gating en geautomatiseerd t-stochastisch neighbor-embedding (t-SNE) clustering-algoritme voor gegevensweergave. Deze figuur is overgenomen uit Sadtler en Elisseeff19. Afkortingen: FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering; SSC = zijwaartse spreiding; CD = cluster van differentiatie; PE = fycoerythrine; CCR = C-C chemokinereceptortype; MHC = belangrijk histocompatibiliteitscomplex; PerCP = peridinine chlorofyl proteïne complex. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Reagens/antilichaam | μL per monster |
| CD86 BUV395 | 0.25 |
| CD45 BUV737 | 0.5 |
| CD8a BV421 | 0.25 |
| Ly6g BV510 | 0.125 |
| Siglec F BV605 | 0.25 |
| MHCII BV786 | 0.25 |
| Ly6c AF488 | 0.125 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | 0.2 |
| CD206 PE | 0.2 |
| CD197 PE/Dazzle594 | 0.125 |
| F4/80 PE/Cy7 | 0.25 |
| CD200R3 APC | 0.25 |
| CD11b AF700 | 0.25 |
| Fc-blok | 1 |
| BD Briljante Beits Buffer Plus | 10 |
| 1x PBS | 35.975 |
| Totaal volume: | 50 μL |
Tabel 1: Voorbeeld van een cocktail van oppervlakte-antilichamen. Een voorbeeld van een antilichaamcocktail voor myeloïde fenotypering van muizenweefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze review beschrijft een gedetailleerde methodologie voor het isoleren van cellen uit biomateriaalimplantaten om een uniforme celsuspensie te verkrijgen. Daarnaast is er een gedetailleerd protocol voor het kleuren van de celsuspensie voor meerkleurige flowcytometrie, samen met de stappen voor het configureren van een flowcytometer voor optimale resultaten. Celisolatiemethoden kunnen meerdere stappen omvatten, waarbij vaak gebruik wordt gemaakt van handmatige weefseldissectie gevolgd door enzymatische vertering met proteolytische enzymen om de extracellulaire matrix in het weefsel te dissociëren en de cel-celverbindingen te verstoren om individuele cellen uit het weefsel te bevrijden. Na de spijsvertering is verdere verwerking, zoals celpersing, nodig om achtergebleven vuil te verwijderen en een eencellige suspensie te garanderen. Sommige monsters met een hoog gehalte aan puin of andere celtypen (zoals tumoren) moeten mogelijk grondiger worden opgeruimd door het gebruik van dichtheidsscheidingsmedia23. Zonder de juiste monsteropruiming kunnen de gegevens vertekend zijn als gevolg van puin of andere celpopulaties die de interessante populaties verdoezelen. Overtollig vuil kan ook leiden tot volledige of gedeeltelijke verstopping van de fluïdica van de cytometer.
Hoewel de karakterisering van immuuncellen ook kan worden uitgevoerd met andere methoden, zoals lichtmicroscopie, door een differentiële celtelling uit te voeren op een celcytospinpreparaat, biedt flowcytometrie een nauwkeurigere karakterisering van de cellen op basis van markers op het celoppervlak. Bovendien zijn flowcytometriegegevens nauwkeuriger omdat ze miljoenen cellen in suspensie kunnen karakteriseren en kwantificeren en veel sneller nauwkeurige schattingen van verschillende celsubsets kunnen opleveren dan handmatige differentiële telling op basis van slechts 400 cellen24. De resultaten in dit artikel zijn gebaseerd op een iteratief paneelontwerp met antilichaamselectie door het gebruik van meerdere online tools om de excitatie- en emissiespectra en theoretische overlap te vergelijken, afhankelijk van de cytometerconfiguratie. Bij het ontwerpen van grotere kleurexperimenten is het het beste om met een schone lei te beginnen, in tegenstelling tot de toevoeging aan een kleiner kleurenpaneel, om volledig rekening te houden met de overvloed aan antigeen, de helderheid van fluorofoor en spectrale overlapping.
Studies die verschillende subsets van specifieke immuuncellen analyseren, vereisen voldoende totale cellen om flowcytometrie uit te voeren, aangezien het hebben van een kleiner aantal cellen een aanzienlijke uitdaging kan vormen bij hun isolatie door celsortering of het verkrijgen van nauwkeurige schattingen. Deze uitdaging kan worden overwonnen door magnetische kralen te gebruiken voor het isoleren en verrijken van specifieke immuuncellen, zoals neutrofielen, in kortere perioden en met beperkte wasbeurten25. Geïsoleerde cellen uit weefsels van organen zoals longen kunnen aanzienlijke hoeveelheden slijm bevatten, waardoor de celsuspensie "plakkerig" kan worden en kan resulteren in een verhoogd aantal doubletgebeurtenissen tijdens flowcytometrie26,27. Het toevoegen van chelaatvormers zoals 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur aan de kleuringsbuffer kan de aggregatie van cellen in dergelijke monsters voorkomen.
Bovendien kan het opschorten van cellen in een groter volume buffer ook de aanmaak van doublet beperken door cel-celinteracties te verminderen. Kleuringsprocedures moeten grondig worden geoptimaliseerd voor elk verschillend weefsel, kleuringsprotocol, flowcytometer en antilichaampaneel. Sommige fluoroforen kunnen gevoeliger zijn voor fixeermiddelen, sommige celtypen zijn gevoeliger voor verschillende celisolatie- en verwerkingsmethoden, en veel celtypen gedragen zich anders in verschillende weefsels en verschillende locaties. Met de juiste voorbereiding en ijverige analyse kan flowcytometrie een gedetailleerde analyse op cellulair en eiwitniveau opleveren om de immuunmicro-omgeving van de steiger en het biomateriaal te karakteriseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door het Intramural Research Program van de NIH, waaronder het National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering. Disclaimer: De NIH, haar functionarissen en werknemers bevelen geen enkel bedrijf, product of dienst aan of onderschrijven het.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 6 Well Plate | Fisher Scientific | 07-000-646 | |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | BD Biosciences | 566385 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | For only fixing cells |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A7906 | For preparing FACS staining buffer |
| CD11b AF700 | Biolegend | 101222 | Clone: M1/70 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 117325 | Clone: N418 |
| CD197 PE/Dazzle594 | Biolegend | 120121 | Clone: 4B12 |
| CD200R3 APC | Biolegend | 142207 | Clone: Ba13 |
| CD206 PE | Biolegend | 141705 | Clone: C068C2 |
| CD45 BUV737 | BD Biosciences | 612778 | Clone: 104/A20 |
| CD86 BUV395 | BD Biosciences | 564199 | Clone: GL1 |
| CD8a BV421 | Biolegend | 100737 | Clone: 53-6.7 |
| Comp Bead anti-mouse | BD Biosciences | 552843 | For compensation control |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I) |
| F4/80 PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone: BM8 |
| Fc Block | Biolegend | 101301 | Clone: 93 |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | For fixing and permeabilization of cells. |
| HEPES buffer | Thermo Fisher | 15630080 | Buffer to supplement cell media |
| Liberase | Millipore Sigma | 5401127001 | Blend of purified Collagenase I and Collagenase II |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L23105 | Viability dye |
| Ly6c AF488 | Biolegend | 128015 | Clone: HK1.4 |
| Ly6g BV510 | Biolegend | 127633 | Clone: 1A8 |
| MHCII BV786 | BD Biosciences | 742894 | Clone: M5/114.15.2 |
| Phosphate buffer saline | Thermo Fisher | D8537 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875176 | Cell culture media |
| Siglec F BV605 | BD Biosciences | 740388 | Clone: E50-2440 |
| V-bottom 96-well plate |
References
- Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
- Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules. Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).
- Rolfe, B., et al. The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering. Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials. Eberli, D., et al. , IntechOpen. (2011).
- Erdem, S., Gür, M., Kaman, M. O. Static and dynamic analyses of fracture fixation bone-plate systems for different plate materials and dimensions. Bio-Medical Materials and Engineering. 29 (5), 611-628 (2018).
- Kang, C. -W., Fang, F. -Z. State of the art of bioimplants manufacturing: part I. Advances in Manufacturing. 6 (1), 20-40 (2018).
- Sadtler, K., et al. Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds. Biomaterials. 192, 405-415 (2019).
- Sadtler, K., et al. Design, clinical translation and immunological response of biomaterials in regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1 (7), 16040 (2016).
- Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A.
- Badylak, S. F., Valentin, J. E., Ravindra, A. K., McCabe, G. P., Stewart-Akers, A. M. Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling. Tissue Engineering Part A. 14 (11), 1835-1842 (2008).
- Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
- Zhang, L., et al. Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction. Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).
- Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction. Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).
- Tan, H., Marra, K. G. Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications. Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).
- Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials. Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861 (2019).
- Sadtler, K., et al. Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells. Science. 352 (6283), 366-370 (2016).
- Gower, R. M., et al. Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression. Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).
- Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).
- Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A.
- Sadtler, K., Elisseeff, J. H. Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials. Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. , Wiley. (2003).
- Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.27 (2013).
- Wolf, M. T., et al. A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy. Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).
- Kahng, J., et al. Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts. Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).
- Sionov, R. V., et al. Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties. Journal of Visualized Experiments. (100), e52933 (2015).
- Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
- Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).
