Summary
La procedura descrive l'isolamento dei villi dall'epitelio intestinale del topo sottoposto a dedifferenziazione per determinare il loro potenziale di formazione organoide.
Abstract
La clonogenicità degli organoidi dell'epitelio intestinale è attribuita alla presenza di cellule staminali in esso. L'epitelio intestinale di topo è compartimentato in cripte e villi: le cellule staminali e proliferanti sono confinate nelle cripte, mentre l'epitelio villi contiene solo cellule differenziate. Quindi, le normali cripte intestinali, ma non i villi, possono dare origine a organoidi nelle colture 3D. La procedura qui descritta è applicabile solo all'epitelio villus sottoposto a dedifferenziazione che porta allo staminale. Il metodo descritto utilizza il topo mutante condizionale Smad4-loss-of-function:β-catenina gain-of-function (Smad4 KO:β-cateninaGOF). La mutazione fa sì che i villi intestinali dedifferenziati e generino cellule staminali nei villi. I villi intestinali sottoposti a dedifferenziazione vengono raschiati via dall'intestino usando vetrini, posti in un colino da 70 μm e lavati più volte per filtrare eventuali cellule sciolte o cripte prima della placcatura nella matrice BME-R1 per determinare il loro potenziale organoide-formante. Due criteri principali sono stati utilizzati per garantire che gli organoidi risultanti fossero sviluppati dal compartimento dei villi dedifferenzianti e non dalle cripte: 1) valutare microscopicamente i villi isolati per garantire l'assenza di cripte tethered, sia prima che dopo la placcatura nella matrice 3D, e 2) monitorare il corso temporale dello sviluppo organoide dai villi. L'iniziazione organoide dai villi avviene solo da due a cinque giorni dopo la placcatura e appare di forma irregolare, mentre gli organoidi derivati dalla cripta dello stesso epitelio intestinale sono evidenti entro sedici ore dalla placcatura e appaiono sferici. Il limite del metodo, tuttavia, è che il numero di organoidi formati e il tempo necessario per l'iniziazione organoide dai villi variano a seconda del grado di dedifferenziazione. Quindi, a seconda della specificità della mutazione o dell'insulto che causa la dedifferenziazione, lo stadio ottimale in cui i villi possono essere raccolti per saggiare il loro potenziale organoide-formante, deve essere determinato empiricamente.
Introduction
Le cripte intestinali ma non i villi, formano organoidi quando coltivate in matrice Matrigel o BME-R1. Questi organoidi sono strutture auto-organizzanti, spesso indicate come il "mini-intestino" a causa della presenza dei vari lignaggi differenziati, progenitori e cellule staminali presenti nell'epitelio intestinale in vivo. Il potenziale di formare organoidi dalle cripte è attribuito alla presenza di cellule staminali1. I villi intestinali d'altra parte sono costituiti solo da cellule differenziate e quindi non possono formare organoidi. Tuttavia, mutazioni2 o condizioni che consentono la dedifferenziazione dell'epitelio villi possonoportarea cellule staminali nei villi 2,3. Questo cambiamento di destino con conseguente staminalità nell'epitelio villi può essere confermato placcando l'epitelio villi dedifferenziante in matrice 3D per determinare il loro potenziale organoide-formante come indicatore di staminalità de-novo nell'epitelio villus. Quindi, l'aspetto critico di questa procedura è quello di garantire l'assenza di contaminazione della cripta.
La mutazione condizionale Smad4 KO:β-cateninaGOF provoca dedifferenziazione nell'epitelio intestinale caratterizzata dall'espressione di marcatori di proliferazione e cellule staminali nei villi, ed eventualmente la formazione di strutture simili a cripte nei villi denominate cripte ectopiche La presenza di cellule staminali questi villi dedifferenziati è stata determinata dall'espressione di marcatori di cellule staminali nelle cripte ectopiche (in vivo) e dalla capacità dei villi mutanti di formare organoidi wh en placcato Matrigel3. La procedura di seguito indicata elabora la metodologia utilizzata per confermare la staminalitàdell'epitelio intestinale dedifferenziante nei topi mutanti Smad4 KO:β-cateninaGOF. Una caratteristica chiave di questa metodologia per isolare i villi era l'uso del raschiamento del lume intestinale, al contrario del metodo di chelazione EDTA4. A differenza del metodo di chelazione EDTA, l'isolamento dei villi mediante raschiatura trattiene la maggior parte del mesenchima sottostante e consente di regolare la pressione di raschiatura per produrre villi senza cripte tethered. La pressione di raschiatura è soggettiva per l'operatore, quindi la pressione ottimale per produrre villi senza cripte tethered deve essere determinata empiricamente dall'operatore. L'aspetto critico di questa procedura è quello di garantire l'assenza di contaminazione da cripta mediante esame microscopico dei villi sia prima che dopo la placcatura nella matrice BME-R1.
I villi intestinali vengono raschiati via dal lume intestinale con vetrini e posti in un filtro da 70 μm e lavati con PBS per eliminare le cellule sciolte o le cripte, se presenti, prima della placcatura in matrice BME-R1. Il metodo sottolinea i seguenti criteri per evitare la contaminazione della cripta: a) confinare i villi raccogliere la metà prossimale del duodeno dove i villi sono più lunghi, b) ridurre al minimo il numero di graffi che producono villi, c) lavare il filtro contenente i villi attraverso una serie di PBS in un piatto a sei pozzetti e d) confermare l'assenza di contaminazione della cripta mediante esame microscopico prima e dopo la placcatura in matrice BME-R1. L'isolamento dei villi mediante raschiatura, piuttosto che per chelazione EDTA, impedisce la completa perdita del mesenchima sottostante che può fornire i segnali di nicchia5,6,7,8,se necessario, per l'iniziazione organoide dall'epitelio villuso.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sui topi condotti, incluso l'uso di Tamoxifene e l'eutanasia per lussazione cervicale, hanno avuto l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Istituto Stevens di echnologia.
1. Topi
NOTA: La generazione di Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; I topi Villin-CreERT2 sono stati precedentemente descritti3. Sono stati utilizzati topi femmina adulti di età compresa tra le otto e le dodici settimane.
- Indurre la mutazione Smad4 KO:β-cateninaGOF nel Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 con iniezione intraperitoneale di Tamoxifene in olio di mais per quattro giorni consecutivi.
- Sacrificare la lussazione cervicale del topo dieci giorni dopo la prima iniezione di tamoxifene.
- Spruzzare l'addome con etanolo al 70% per evitare che la pelliccia di topo entri nella cavità peritoneale.
- Aprire la cavità addominale con le forbici di dissezione per esporre l'intestino. Isolare l'intestino con l'aiuto delle forbici e della pinza.
NOTA: La perdita concomitante di Smad4 insieme alla mutazione gain of function di β-catenina (Smad4KO;β-cateninaGOF) nell'epitelio intestinale è stata ottenuta iniettandoSmad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Topi Villin-CreERT2 ogni giorno per quattro giorni consecutivi con 0,05 g di Tamoxifene/kg di peso corporeo in olio di mais. Questi topi vengono raccolti dieci giorni dopo la prima iniezione di tamoxifene per garantire la presenza di cellule che esprimono marcatori associati alle cellule staminali nei villi dedifferenzianti.
2. Isolamento e preparazione del duodeno
- Sezionare la metà prossimale del duodeno.
- Lavare il duodeno con 5 mL di PBS ghiacciato in una siringa da 10 mL per eliminare il contenuto luminale.
- Aprire il duodeno longitudinalmente con una forbice angolata e posare il duodeno piatto su una piastra di Petri di 15 cm su ghiaccio con il lume del duodeno rivolto verso l'operatore.
3. Isolamento dei villi mediante raschiatura
- Prima di iniziare la raschiatura, posizionare un filtro a rete da 70 μm in uno dei pozzetti di una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti. Riempire tutti i pozzetti con 4 mL di 1x PBS e posizionare la piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti sul ghiaccio (Figura 1).
- Raschiare i villi come segue usando due microscopici vetrini: uno per tenere il duodeno verso il basso e l'altro per raschiare (Figura 1B1).
- Raschiare il lato luminale del duodeno superficialmente avanti e indietro due volte per rimuovere il muco. Applicare una pressione tale che questo passaggio rimuova lo strato di muco, ma non i villi.
- Raschiare di nuovo il duodeno, avanti e indietro due volte applicando la stessa pressione di cui al punto 3..1, durante il quale si possono vedere i villi che si raccolgono sulle diapositive (Figura 1B2). Questa è la pressione ottimale (che deve essere determinata empiricamente dall'operatore) per produrre i villi senza le cripte legati.
- Utilizzare un pipetto di trasferimento da 1 mL contenente PBS per trasferire i villi (che vengono raccolti sul vetrino dal passaggio 3.2.2.) a un filtro a rete da 70 μm posto in un piatto a 6 pozzetto. I villi vengono raccolti così, dopo ogni graffio (Figura 1B2).
- Lavare i villi raccolti nel filtro da 70 μm (dal punto 3.3) trasferendo il filtro (con i villi) attraverso una serie di pozzelli in un piatto a 6 pozzedi contenente PBS freddo (~ 4 ml/pozzet). Questo per rimuovere le cripte sciolte, se presenti.
- Utilizzando un pipetto p1000, trasferire la sospensione dei villi in PBS (~ 3 mL) dal filtro da 70 μm a un nuovo tubo da 15 mL su ghiaccio.
- Utilizzare una punta del pipetto p200 con estremità smussata rivestita BSA allo 0,1% per aspirare un volume di 50 μL della sospensione di villi su un vetrino. Contare il numero di villi nella goccia da 50 μL con ingrandimento 4x per determinare la concentrazione di villi nella sospensione PBS. Ad esempio, se ci sono 10 villi nella sospensione da 50 μL esaminata, la concentrazione di villi è di 0,2 villi/μL. Questo è anche il momento di confermare l'assenza di cripte tethered.
- Calcolare il volume di sospensione di villi necessario per placcare ad una concentrazione di 0,5 villi/μL di matrice BME-R1. Aggiungere un ulteriore 100 μL per tenere conto dell'errore di pipettaggio e del volume necessario per l'esame microscopico necessario per garantire la purezza dei villi.
ATTENZIONE: La pressione utilizzata nei primi due graffi, che rimuove il muco ma non i villi, deve essere utilizzata nei graffi successivi durante i quali verranno rilasciati i villi. Limitare il numero di raschiature avanti e indietro a due dopo che il rilascio di villi è stato osservato per la prima volta. Questa misura evita il rilascio di villi con le cripte tethered. È essenziale valutare al microscopio i villi per garantire l'assenza delle cripte tethered.
4. Placcatura di villi su matrice BME-R1
- Utilizzando una punta di pipetta smussata p200 rivestita BSA allo 0,1%, trasferire in un tubo microcentrifuga il volume di villi (dal passaggio 3.6) richiesto alla piastra ad una densità di ~ 6 villi per pozzetto in 12,5 μL di matrice BME-R1. L'uso della punta smussata rivestita di BSA a questo punto assicura che i villi, che sono troppo grandi per una punta appuntita, vengano aspirati senza essere bloccati o persi dall'essere attaccati ai lati della punta.
- Girare i villi per 2 minuti a 200 x g in una centrifuga refrigerata (4 °C) e rimuovere il surnatante.
- Ripetere il passaggio 4.2 per rimuovere eventuali PBS residui e procedere al passaggio successivo sotto una cappa a flusso laminare.
- Rispenare delicatamente il pellet di villi nella quantità richiesta di BME-R1 freddo scongelato sul ghiaccio.
- Utilizzando un pipetto p20, piastra 12,5 μL / pozzetto dei villi in matrice BME-R1 in 3D in una piastra a U a 96 pozzetti preriscaldata.
- Incubare la piastra in un incubatore di colture tissutali a 37 °C per 15 minuti per consentire la solidificazione della matrice BME-R1.
- Aggiungere 125 μL/pozzetti di mezzi ENR (epidermici di crescita/Noggin/R-spondin1) preriscaldati: mezzi DMEM F-12 avanzati, integrati con 1x Penicillina: Streptomicina, 10 mM HEPES, Glutamax, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 5% mezzi condizionati da cellule HEK293-T che esprimono R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acetil cisteina e 0,05 mg/mL Primocin.
- Incubare i villi placcati in un incubatore di colture tissutali mantenuto a 37 °C con il 5% di CO2e cambiare il mezzo a giorni alterni.
- Scartare qualsiasi pozzo in cui gli organoidi compaiono prima di due giorni di placcatura, poiché il primo punto temporale in cui sono attesi gli organoidi derivati dai villi è dopo due giorni.
NOTA: Tutti i villi che hanno la metà o più della metà della lunghezza dei villi sono conteggiati come un villi. A differenza degli organoidi derivati dalla cripta, gli organoidi derivati dai villi non sono attesi entro 24 ore dalla placcatura. I villi che ingiungono gli organoidi sembrano scurirsi e restringersi prima della formazione di organoidi. Quindi, tutti i pozzetto con organoidi che si sviluppano entro un giorno dalla placcatura dovrebbero essere scartati per evitare la plausibilità di aver derivato da una contaminazione plausibile della cripta. La metodologia utilizzata per produrre i supporti condizionati è disponibile su richiesta.
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Representative Results
Il fattore determinante per il successo della procedura è prevenire la contaminazione della cripta. Lo sviluppo organoide dai villi (e non da cripte contaminanti) è assicurato confermando quattro criteri principali: 1) garantire la purezza dei villi raccolti mediante esame microscopico prima e dopo la placcatura dei villi in BME-R1, 2) placcare un numero limitato di villi per pozzo per consentire la visualizzazione di tutti i villi placcati singolarmente, 3) onitoring lo sviluppo degli organoidi quotidianamente; le immagini del corso temporale mostrano lo sviluppo di organoidi da villi (Figura 3), e 4) che onitoring la cinetica e l'aspetto morfologico degli organoidi che presentano ciò che da villi; gli organoidi che iniziano dai villi appaiono inizialmente di forma irregolare e impiegano da due a cinque giorni prima di poter essere visti sotto ingrandimento 4x rispetto agli organoidi derivati dalla cripta (coltivati isolando cripte usando il metodo di chelazione EDTA/PBS1,4) che appaiono durante la notte come strutture sferiche con bordi ben definiti (Figura 2).
Il momento ottimale per sacrificare i topi per testare il potenziale organoide-formante dei villi è dopo che i marcatori di cellule staminali villi-epitelio dedifferenzianti esprimono i marcatori delle cellule staminali e iniziano lo sviluppo di cripte ectopiche nei villi in vivo (circa 10 giorni dopo l'iniezione di Tamoxifene dello Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Topi Villin-CreERT2). Questi topi hanno una cre-ricombiinasi inducibile da tamoxifene che causa la perdita di Smad4 concomitante con l'attivazione di β-catenina con tamoxifene. Le cripte ectopiche si sviluppano completamente entro due settimane dall'induzione della mutazione, mentre le cellule staminali nell'epitelio villus compaiono entro una settimana dall'induzione della mutazione in vivo. Il numero di villi che formano organoidi quando placcati in Matrigel è stato segnalato per variare tra il 2% e il 12%3. La raccolta del topo mutante per la placcatura dei villi nel periodo in cui sono presenti le cellule staminali (circa una settimana dopo l'induzione della cre-ricombinasi) prolungherà il tempo necessario per la comparsa di organoidi derivati dai villi, mentre ritardare la raccolta a più tardi di dieci giorni dopo la cre-induzione aumenta il rischio di cripta di contaminazione.
Figura 1: Set-up sperimentale e raschiatura dei villi dall'epitelio intestinale. A) Siringa riempita di PBS (syrg) con tubi e filtro (Fltr) in PBS. B)Isolamento dei villi mediante raschiatura (B1) e trasferimento ad un filtro (B2). La freccia indica i villi raccolti sulla diapositiva. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Distinzione nell'aspetto degli organoidi che emergono dalle cripte rispetto all'epitelio villi dedifferenziato dello stesso intestino di topo: A) Cartone animato che mostra villi e cripte. B)Montaggio intero (in PBS) di villi preparati per raschiatura (pannello superiore) e cripte preparate mediante chelazione EDTA (pannello inferiore). C)Organoidi derivati da Villi (pannello superiore) e da cripta (pannello inferiore) dallo stesso epitelio intestinale di topo in BME-R1 (barre di scala, 500 um). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Decorso temporale della formazione organoide dai villi dedifferenzianti. Viene mostrata l'iniziazione organoide da due diversi villi (le regioni in scatola sono ingrandite nei pannelli centrale e inferiore). I villi con potenziale organoide-formante appaiono densi, probabilmente a causa della ritenzione del mesenchima sottostante. L'iniziazione organoide dai villi è evidente al secondo giorno (freccia solida) da uno dei villi (scatola con confine spezzato), mentre negli altri villi (scatola con contorno solido) l'organoide appare al quarto giorno (freccia). La scatola superiore nel pannello del giorno 6 mostra un organoide derivato dai villi sviluppato. Barra della scala, 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo metodo può confermare la capacità di auto-rinnovamento dell'epitelio villi dedifferenziante che acquisisce marcatori di cellule staminali in vivo. Il normale epitelio intestinale può dare origine ad organoidi dalla cripta ma non dal compartimento dei villi, se coltivati in 3D a causa della presenza di cellule staminali nelle cripte1. Pertanto, la formazione di organoidi dall'epitelio villi dedifferenziato coltivato in colture 3D conferma la formazione di cellule staminali dall'inversione del destino cellulare. Le segnalazioni sull'inversione del destino cellulare nell'epitelio intestinale derivanti da mutazioni e/o lesioni sono in aumento2,3,9,10,11,12. Quindi, questo metodo è applicabile in scenari simili in cui l'epitelio villi dedifferenziante esprime marcatori di cellule staminali in vivo.
Abbiamo confermato lo sviluppo degli organoidi dai villi del mutanteGOF Smad4 KO:β-catenina attraverso il decorso temporale che mostra lo sviluppo dell'organoide dai villi (Figura 3). L'aspetto più critico è l'assunzione di misure precauzionali contro la contaminazione della cripta, che porterebbe a falsi positivi. Per garantire la purezza della preparazione dei villi prima e dopo la placcatura sono state adottate le seguenti misure: a) isolamento dei villi dalla metà prossimale del duodeno dove i villi sono i più lunghi, b) minimizzazione del numero di graffi e regolazione della pressione di raschiatura per produrre villi senza cripte legata, c) lavaggio dei villi con PBS dopo averli collocati in un filtro a rete da 70 μm per escludere eventuali cripte o celle sciolte d) esame microscopico dei villi raccolti prima e dopo la placcatura, ed e) minimizzando il numero di villi placcati per pozzo in modo che possano essere visualizzati individualmente nella matrice placcata.
Sono state fatte diverse considerazioni per ottimizzare la procedura. In primo luogo, abbiamo raccolto i villi dal duodeno prossimale dove i villi sono i più lunghi. La delineazione fisica tra la differenziazione e i compartimenti proliferativi nell'intestino tenue ci permette di adottare il raschiamento per separare meccanicamente i villi dalle cripte. Questo metodo può quindi essere adottato solo nei casi in cui la compartimentazione tra la differenziazione e il compartimento proliferativo è strettamente delineata - come nel caso dell'intestino tenue ma non nel colon. In secondo luogo, abbiamo ottimizzato il tempo di isolamento dei villi dopo l'induzione della mutazione in base al grado di dedifferenziazione osservato in vivo. La dedifferenziazione nel mutante condizionale Smad4KO:β-cateninaGOF è caratterizzata dalla comparsa in vivo di marcatori di cellule staminali e cripte ectopiche nell'epitelio villus entro sette e dieci giorni rispettivamente3. Pertanto, il tempo necessario per avviare gli organoidi dai villi mutanti diminuisce all'aumentare del tempo trascorso dopo l'induzione della mutazione. Pertanto, pur adattando questo metodo ad altri modelli di dedifferenziazione dell'intestino, il momento ottimale per sacrificare i topi per l'isolamento dei villi dovrebbe essere determinato empiricamente in base al tipo di mutazione o lesione e al grado di conseguente dedifferenziazione in vivo. In terzo luogo, abbiamo optato per isolare i villi raschiando piuttosto che con il metodo di chelazione EDTA al fine di mantenere il mesenchima sottostante, poiché i cross-talk epiteliali-mesenchimali sono stati implicati nella funzione delle cellule staminali intestinali nell'intestino5,6,7,8,13. I villi che avviano gli organoidi appaiono prevalentemente scuri probabilmente a causa della presenza del mesenchima sottostante (Figura 2B e 3). Abbiamo verificato l'espressione del marcatore associato alle cellule staminali CD4414,15,e del fattore di trascrizione specifico dell'intestino Cdx216,17, 18,19,20 confermando l'origine epiteliale degli organoidi derivati dai villi(Figura S1).
Rispetto agli approcci in vivo, gli organoidi sono più suscettibili alla manipolazione genetica e allo screening. Poiché osserviamo differenze fenotipiche tra gli organoidi che emergono dalle cripte e i villi dello stesso epitelio intestinale Smad4 KO:β-cateninaGOF (Figura 2B), ipotizziamo differenze molecolari tra i due, che è attualmente in fase di studio. Pertanto, questo metodo è utile per studiare le implicazioni delle mutazioni che causano la dedifferenziazione e i suoi effetti differenziali nel compartimento progenitore rispetto al compartimento di differenziazione.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questa pubblicazione è stata supportata dal numero di premio K22 CA218462-03 del NIH National Cancer Institute. Le cellule HEK293-T che esprimono R-Spondin1 sono state un dono generoso del Dr. Michael P. Verzi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM F-12 media | Gibco | 12634010 | |
| 3,3-diaminobenzidine | Vector Labs | SK-4105 | |
| 96 well U-bottom plate | Fisher Scientific | FB012932 | |
| ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
| Angled scissor | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| CD44 antibody | BioLegend | 1030001 | |
| Cdx2 antibody | Cell Signaling | 12306 | |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
| Corning 70-micron cell strainer | Life Sciences | 431751 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 | R&D | 3433-005-R1 | |
| Dissection scissors | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEK 293-T cells expressing RSPO-1 | Gift from Dr. Michael Verzi | ||
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
| Mesh filter | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
| Micrscope glass slide | VWR | 89218-844 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| p200 Blunt tips | VWR | 46620-642 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Primocin (50mg/mL) | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Signal diluent | Cell Signaling | 8112L | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 50-146-770 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Schwitalla, S., et al. Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties. Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).
- Perekatt, A. O., et al. SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium. Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).
- Aoki, R., et al. Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).
- Seiler, K. M., et al. Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage. Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).
- Stzepourginski, I., et al. CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).
- Roulis, M., et al. Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche. Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).
- Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).
- Madison, B. B., et al. Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis. Development. 132 (2), 279-289 (2005).
- van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Tetteh, P. W., et al. Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
- Baulies, A., et al. The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages. Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).
- Zeilstra, J., et al. Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling. Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).
- Gracz, A. D., et al. Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells. Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).
- Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2. Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).
- Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes. Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).
- Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).
- Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine. PLoS One. 8 (1), 54757 (2013).
- Stringer, E. J., et al. Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm. Development. 139 (3), 465-474 (2012).
