Summary
Prosedyren beskriver isolasjon av villi fra musen intestinal epitel gjennomgår dedifferentiation for å bestemme deres organoid forming potensial.
Abstract
Clonogenicity av organoider fra tarmepitelet tilskrives tilstedeværelsen av stamceller der. Musen liten intestinal epitel er delt inn i krypter og villi: stammen og spredningscellene er begrenset til kryptene, mens villi epitelet bare inneholder differensierte celler. Derfor kan de normale tarmkryptene, men ikke villi, gi opphav til organoider i 3D-kulturer. Prosedyren beskrevet her gjelder bare for villus epitel som gjennomgår dedifferentiation som fører til stemness. Metoden som er beskrevet, bruker den betingede mutantmusen Smad β 4KO:β-cateninGOF). Mutasjonen får tarm villi til å dedifferentiate og generere stamceller i villi. Intestinal villi gjennomgår dedifferentiation skrapes av tarmen ved hjelp av glass lysbilder, plassert i en 70 μm sil og vasket flere ganger for å filtrere ut eventuelle løse celler eller krypter før plating i BME-R1 matrise for å bestemme deres organoid-forming potensial. To hovedkriterier ble brukt for å sikre at de resulterende organoidene ble utviklet fra det dedifferensierende villusrommet og ikke fra kryptene: 1) mikroskopisk evaluering av den isolerte villi for å sikre fravær av tethered krypter, både før og etter plating i 3D-matrisen, og 2) overvåking av tidsforløpet for organoidutvikling fra villi. Organoid initiering fra villi oppstår bare to til fem dager etter plating og vises uregelmessig formet, mens krypt-avledede organoider fra samme intestinale epitel er tydelige innen seksten timer etter plating og virker sfæriske. Begrensningen av metoden er imidlertid at antall organoider dannet, og tiden som kreves for organoid initiering fra villi varierer avhengig av graden av dedifferensiering. Derfor, avhengig av mutasjonens spesifisitet eller fornærmelsen som forårsaker dedifferensiering, må det optimale stadiet der villi kan høstes for å analyse deres organoide formingspotensial, bestemmes empirisk.
Introduction
Tarmen krypter, men ikke villi, danner organoider når de dyrkes i Matrigel eller BME-R1 matrise. Disse organoidene er selvorganiserende strukturer, ofte referert til som "mini-gut" på grunn av tilstedeværelsen av de forskjellige differensierte avstamninger, forfedre og stamceller som er tilstede i tarmepitelet in vivo. Potensialet til å danne organoider fra krypter tilskrives tilstedeværelsen av stamceller1. Intestinal villi derimot består bare av differensierte celler, og kan derfor ikke danne organoider. Mutasjoner2 eller tilstander som tillater dedifferensiering av villus epitelet kan imidlertid føre til stamceller i villi2,3. Denne skjebneendringen som resulterer i stemness i villi epitelet kan bekreftes ved å plating dedifferentiating villus epitel i 3D matrise for å bestemme deres organoid-forming potensial som en indikator på de-novo stemness i villus epitel. Derfor er det kritiske aspektet ved denne prosedyren å sikre fravær av kryptforurensning.
Smad4KO:β-cateninGOF betinget mutasjon forårsaker dedifferensiering i tarmepitelet preget av uttrykket av spredning og stamcellemarkører i villi, og til slutt dannelsen av kryptlignende strukturer i villi referert til som ektopiske krypter Tilstedeværelsen av stamceller disse dedifferensierte villi ble bestemt av uttrykket av stamcellemarkører i ektopkryptene (in vivo) og mutant villiens evne til å danne organoider wh innbelagt Matrigel3. Den nedenfor nevnte prosedyren utdyper metodikken som brukes til å bekrefte stemness av dedifferentiating intestinal epitel i Smad4KO:β-cateninGOF mutant mus. Et sentralt trekk ved denne metoden for å isolere villi var bruken av skraping av tarmlumen, i motsetning til EDTA-chelasjonsmetoden4. I motsetning til i EDTA-chelasjonsmetoden beholder villi-isolasjon ved skraping mesteparten av det underliggende mesenchymet og gjør det mulig å justere skrapetrykket for å gi villi uten bundet krypter. Skrapetrykket er subjektivt for operatøren, derfor må det optimale trykket for å gi villi uten krypter bundet bestemmes empirisk av operatøren. Det kritiske aspektet ved denne prosedyren er å sikre fravær av kryptforurensning ved mikroskopisk undersøkelse av villi både før og etter plating i BME-R1-matrisen.
Intestinal villi skrapes av tarmlumen med glasssklier og plasseres i et 70 μm filter og vaskes med PBS for å kvitte seg med løse celler eller krypter, om noen, før plating i BME-R1 matrise. Metoden understreker følgende kriterier for å unngå kryptforurensning: a) begrense villi høste den proksimale halvdelen av tolvfingertarmen der villi er den lengste, b) minimere antall villi-yielding skraper, c) vaske filteret som inneholder villi gjennom en rekke PBS i en seks-brønns tallerken, og d) bekrefter fraværet av kryptforurensning ved mikroskopisk undersøkelse før og etter plating i BME-R1 matrise. Villi isolasjon ved skraping, i stedet for ved EDTA chelation, forhindrer fullstendig tap av underliggende mesenchyme som kan gi nisjesignalene5,6,7,8, om nødvendig, for organoid initiering fra villus epitelet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle museeksperimentene som ble utført, inkludert bruk av Tamoxifen og eutanasi ved cervical dislokasjon, hadde godkjenning fra Institutional Animal Care and Use Committee ved Stevens Institute of echnology.
1. Mus
MERK: Generasjonen Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 mus har tidligere blitt beskrevet3. Voksne kvinnelige mus mellom åtte til tolv uker ble brukt.
- Induser Smad4KO:β-cateninGOF mutasjon i Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 med intraperitoneal injeksjon av Tamoxifen i maisolje i fire påfølgende dager.
- Ofre miceby cervical dislokasjon ti dager etter den første tamoxifen injeksjon.
- Spray magen med 70% etanol for å forhindre at musepels kommer inn i bukhulen.
- Åpne bukhulen med disseksjonssaks for å eksponere tarmen. Isoler tarmen ved hjelp av saks og tang.
MERK: Samtidig tap av Smad4 sammen med gevinst av funksjonsmutasjon av β-catenin (Smad4KO;β-cateninGOF) i intestinal epitel ble oppnådd ved å injisereSmad4f /f; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 mus hver dag i fire påfølgende dager med 0,05 g Tamoxifen / kg kroppsvekt i maisolje. Disse musene høstes ti dager etter den første tamoxifen-injeksjonen for å sikre tilstedeværelsen av celler som uttrykker stamcelle-tilknyttede markører i dedifferentiating villi.
2. Duodenum isolasjon og forberedelse
- Disseker ut den proksimale halvdelen av tolvfingertarmen.
- Skyll tolvfingertarmen med 5 ml iskald PBS i en 10 ml sprøyte for å fjerne lysinnholdet.
- Åpne tolvfingertarmen med en vinklet saks og legg tolvfingertarmen flatt på en 15 cm Petri-plate på is med lumen på tolvfingertarmen vendt mot operatøren.
3. Villi-isolasjon ved skraping
- Før du begynner å skrape, plasser en 70 μm nettingsil i en av brønnene til en 6-brønns vevskulturplate. Fyll alle brønnene med 4 ml 1x PBS og plasser den 6-brønns vevskulturplaten på is (figur 1).
- Skrap villi som følger ved hjelp av to mikroskopiske glasssklier: den ene for å holde tolvfingertarmen nede og den andre å skrape (Figur 1B1).
- Skrap lyssiden av tolvfingertarmen overfladisk til og fra to ganger for å fjerne slimet. Påfør trykk slik at dette trinnet fjerner slimlaget, men ikke villi.
- Skrap tolvfingertarmen igjen, to ganger med samme trykk som i 3..1, hvor villi kan sees samle på lysbildene (Figur 1B2). Dette er det optimale trykket (som må bestemmes empirisk av operatøren) for å gi villi uten kryptene bundet.
- Bruk en 1 ml overføringspipet som inneholder PBS for å overføre villi (som samles på lysbildet fra trinn 3.2.2.) til en 70 μm nettingsil plassert i en 6-brønns tallerken. Villi samles dermed etter hver skrape (Figur 1B2).
- Vask villi samlet i 70 μm silen (fra trinn 3.3) ved å overføre silen (med villi) gjennom en rekke brønner i en 6-brønns tallerken som inneholder kald PBS (~ 4 ml / brønn). Dette er for å fjerne eventuelle løse krypter.
- Bruk en p1000 pipet, overfør villi-fjæringen i PBS (~ 3 ml) fra 70 μm silen til et nytt 15 ml rør på is.
- Bruk en 0,1% BSA belagt stump-endet p200 pipet tips for å aspirere 50 μL volum av villi suspensjon på en glass lysbilde. Tell antall villi i 50 μL-dråpen under 4x forstørrelse for å bestemme konsentrasjonen av villi i PBS-suspensjonen. For eksempel, hvis det er 10 villi i 50 μL suspensjon undersøkt, så er villikonsentrasjonen 0,2 villi / μL. Dette er også tiden for å bekrefte fraværet av tethered krypter.
- Beregn volumet av villi suspensjon som kreves for å plate i en konsentrasjon på 0,5 villi / μL BME-R1 matrise. Legg til en ekstra 100 μL for å gjøre rede for pipetteringsfeil og volumet som kreves for mikroskopisk undersøkelse som kreves for å sikre renheten til villi.
FORSIKTIG: Trykket som brukes i de to første skrapene, som fjerner slimet, men ikke villi, bør brukes i de etterfølgende skrapene der villi vil bli frigjort. Begrens antall til-og-fro skrapinger til to etter at villi-utgivelsen først er observert. Dette tiltaket unngår frigjøring av villi med kryptene bundet. Det er viktig å mikroskopisk evaluere villi for å sikre fraværet av de tethered kryptene.
4. Plating av villi på BME-R1 matrise
- Ved hjelp av en 0,1% BSA-belagt p200 stump pipetspiss, overfør til et mikrocentrifugerør volumet av villi (fra trinn 3.6) som kreves for å tallerken med en tetthet på ~ 6 villi per brønn i 12,5 μL BME-R1 matrise. Bruken av BSA-belagt stump spiss på dette punktet sikrer at villi, som er for stor for en spiss spiss, aspireres uten å bli blokkert eller mistet fra å sitte fast på sidene av spissen.
- Spinn ned villi i 2 min ved 200 x g i en nedkjølt sentrifuge (4 °C) og fjern supernatanten.
- Gjenta trinn 4.2 for å fjerne eventuell gjenværende PBS og gå videre til neste trinn under en laminær strømningshette.
- Skru forsiktig på villi-pelletsen forsiktig i den nødvendige mengden kald BME-R1 tint på is.
- Bruk en p20 pipet, plate 12,5 μL/brønn av villi i BME-R1 matrise i 3D i en forhåndsvarslet 96-brønns U-bunnplate.
- Inkuber platen i en vevskulturinkubator ved 37 °C i 15 minutter for å tillate størkning av BME-R1-matrisen.
- Tilsett 125 μL/brønn med forvarmet ENR (Epidermal vekstfaktor/Noggin/R-spondin1) medier: avanserte DMEM F-12-medier, supplert med 1x Penicillin: Streptomycin, 10 mM HEPES, Glutamax, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 5 % kondisjonerte medier fra HEK293-T-celler som uttrykker R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acetyl cysteine og 0,05 mg/ml Primocin.
- Inkuber den belagte villi i en vevskulturinkubator opprettholdt ved 37 °C med 5 % CO2, og bytt media annenhver dag.
- Kast bort brønner der organoider vises før to dager med plating, siden det tidligste tidspunktet hvor villi-avledede organoider forventes er etter to dager.
MERK: Enhver villi som har halvparten eller mer enn halvparten av lengden på villi regnes som en villus. I motsetning til krypt-avledede organoider forventes ikke villi-avledede organoider innen 24 timer etter plating. Den organoidinitierende villi ser ut til å være mørkere og krympende før dannelsen av organoider. Derfor bør eventuelle brønner med organoider som utvikler seg innen en dag etter plating kastes for å unngå plausibilitet av å ha avledet fra plaustisk kryptforurensning. Metodikken som brukes til å produsere det betingede mediet er tilgjengelig på forespørsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den avgjørende faktoren for prosedyrens suksess forhindrer kryptforurensning. Organoid utvikling fra villi (og ikke fra noen forurensende krypter) sikres ved å bekrefte fire store kriterier: 1) sikre renheten av høstet villi ved mikroskopisk undersøkelse før og etter plating villi i BME-R1, 2) plating begrenset antall villi per brønn for å tillate visualisering av alle belagte villi individuelt, 3) på for å sikre utvikling av organoid daglig; bilder av tidsforløpet viser utvikling av organoider fra villi (figur 3) og 4) som fortærer kinetikken og morfologiske utseendet til organoidene som initierer fra villi; organoidene som initierer fra villi, vises uregelmessig formet med det første og tar to til fem dager før de kan ses under 4x forstørrelse i motsetning til de kryptavledede organoidene (dyrket ved å isolere krypter ved hjelp av EDTA / PBS-chelasjonsmetoden1,4) som vises over natten som sfæriske strukturer med veldefinerte grenser (Figur 2).
Den optimale tiden for å ofre musene for å teste villiens organoiddannende potensial er etter dedifferentiating villi-epitelekspress stamcellemarkører og begynne utviklingen av ektopiske krypter i villi in vivo (rundt 10 dager etter Tamoxifen injeksjon av Smad4f / f; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 mus). Disse musene har en tamoxifen inducible cre-recombinase som forårsaker Smad4 tap samtidig med β-catenin aktivering med tamoxifen. De ektopiske kryptene utvikler seg fullt ut innen to uker etter induksjon av mutasjonen, mens stamcellene i villus epitelet vises innen en uke etter induksjon av mutasjon in vivo. Antall villi som danner organoider når de er belagt i Matrigel har blitt rapportert å variere mellom 2% til 12%3. Høsting av mutantmusen for å plating villi rundt den tiden da stamceller er til stede (rundt en uke etter cre-recombinase induksjon) vil forlenge tiden som kreves for villi-avledede organoider vises, mens forsinkelse av høsten til senere enn ti dager etter cre-induksjon øker risikoen krypt av forurensning.
Figur 1: Eksperimentelt oppsett og villi-skraping fra intestinal epitel. A) PBS-fylt sprøyte (syrg) med rør og filter (Fltr) i PBS. B) Villi-isolasjon ved å skrape (B1) og overføre til et filter (B2). Pilen peker villi samlet på lysbildet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Distinksjon i utseendet til organoidene som kommer fra kryptene kontra det dedifferensierte villi-epitelet fra samme musetarm: A) Tegneserie som viser villus og krypter. B) Hel montering (i PBS) av villi fremstilt ved skraping (topppanel) og krypter tilberedt av EDTA-chelation (nedre panel). C) Villi-avledede (topppanel) og krypt-avledede (nedre panel) organoider fra samme mus intestinal epitel i BME-R1 (skalastenger, 500 um). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Tidsforløp for organoiddannelse fra dedifferentierende villi. Organoid initiering fra to forskjellige villi er vist (de innrammede områdene forstørres i midtre og nederste paneler). Villi med organoiddannende potensial virker tett, muligens på grunn av oppbevaring av det underliggende mesenchymet. Organoid initiering fra villus er tydelig på dag to (solid pil) fra en av villi (boks med ødelagt grense), mens i den andre villus (boks med solid grense) vises organoiden på dag fire (pil). Den øvre boksen på dag 6-panelet viser en utviklet villi-avledet organoid. Skalalinje, 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metoden kan bekrefte selvfornyelseskapasiteten til dedifferensierende villi epitel som får stamcellemarkører in vivo. Det normale intestinale epitelet kan gi opphav til organoider fra krypten, men ikke villi-rommet, når det dyrkes i 3D på grunn av tilstedeværelsen av stamceller i kryptene1. Dermed bekrefter organoiddannelse fra dedifferensiert villi epitel dyrket i 3D-kulturer stamcelledannelse fra celle skjebne reversering. Rapporter om celle skjebne reversering i tarm epitelet som oppstår fra mutasjoner og / eller skade øker2,3,9,10,11,12. Derfor er denne metoden anvendelig i lignende scenarier der dedifferentiating villi epitel ekspress stamcellemarkører in vivo.
Vi bekreftet utviklingen av organoidene fra villi av Smad4KO:β-cateninGOF mutant gjennom tidsforløpet som viser utvikling av organoid fra villi (Figur 3). Det mest kritiske aspektet er å ta forholdsregler mot kryptforurensning, noe som vil føre til falske positiver. Følgende tiltak ble tatt for å sikre renheten av villipreparatet før og etter plating: a) isolering av villi fra den proksimale halvdelen av tolvfingertarmen der villi er den lengste, b) minimere antall skraper og justere trykket for skraping for å gi villi uten bundet krypter, c) vaske villi med PBS etter å ha plassert dem i en 70 μm mesh sil for å utelukke eventuelle løse krypter eller celler d) mikroskopisk undersøkelse av høstet villi før og etter plating, og e) minimerer antall villibelagt per brønn slik at de kan visualiseres individuelt i den belagte matrisen.
Det ble tatt flere hensyn for å optimalisere prosedyren. For det første høstet vi villi fra det proksimale tolvfingertarmen der villi er lengst. Den fysiske avgrensningen mellom differensiering og proliferative rom i tynntarmen gjør at vi kan vedta skraping for å mekanisk skille villi fra kryptene. Denne metoden kan dermed bare vedtas i tilfeller der oppdelingen mellom differensierings- og proliferative rommet er strengt avgrenset - som det er tilfelle i tynntarmen, men ikke i tykktarmen. For det andre optimaliserte vi tiden for villiisolasjon etter induksjon av mutasjonen basert på graden av dedifferensiering observert in vivo. Dedifferensiering i den betingede Smad4KO:β-cateninGOF mutant er preget av utseendet in vivo av stamcellemarkører og ektopiske krypter i villus epitel innen syv og ti dager henholdsvis3. Dermed reduseres tiden som kreves for å initiere organoider fra mutant villi etter hvert som tiden som går etter induksjon av mutasjonen øker. Derfor, mens du tilpasser denne metoden til andre av likegyldighetsmodeller i tarmen, bør den optimale tiden for å ofre musene for villi-isolasjon bestemmes empirisk avhengig av type mutasjon eller skade og graden av påfølgende dedifferensiation in vivo. For det tredje valgte vi å isolere villi ved å skrape i stedet for ved EDTA-chelation-metoden for å beholde det underliggende mesenchymet, da epitelial-mesenchymale krysssamtaler har blitt implisert i tarmstammecellefunksjon i tarmen5,6,7,8,13. Villi som initierer organoidene virker hovedsakelig mørke muligens på grunn av tilstedeværelsen av underliggende mesenchyme (Figur 2B og 3). Vi verifiserte uttrykket av stamcellen tilknyttet markør CD4414,15, og den tarmspesifikke transkripsjonsfaktoren Cdx216,17,18,19,20 bekrefter epitelets opprinnelse av de villi-avledede organoidene ( FigurS1).
Sammenlignet med in vivo tilnærminger, organoider er mer egnet til genetisk manipulasjon og screening. Siden vi observerer fenotypiske forskjeller mellom organoidene som kommer fra kryptene og villi av samme Smad4KO:β-cateninGOF intestinal epitel (Figur 2B), spekulerer vi molekylære forskjeller mellom de to, som for tiden undersøkes. Dermed er denne metoden nyttig for å undersøke implikasjonene av dedifferensiasjonsfremkallende mutasjoner og dens differensialeffekter i forfedre kontra differensieringsrom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne publikasjonen ble støttet av Pris nummer K22 CA218462-03 fra NIH National Cancer Institute. HEK293-T-cellene som uttrykte R-Spondin1 var en sjenerøs gave fra Dr. Michael P. Verzi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM F-12 media | Gibco | 12634010 | |
| 3,3-diaminobenzidine | Vector Labs | SK-4105 | |
| 96 well U-bottom plate | Fisher Scientific | FB012932 | |
| ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
| Angled scissor | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| CD44 antibody | BioLegend | 1030001 | |
| Cdx2 antibody | Cell Signaling | 12306 | |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
| Corning 70-micron cell strainer | Life Sciences | 431751 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 | R&D | 3433-005-R1 | |
| Dissection scissors | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEK 293-T cells expressing RSPO-1 | Gift from Dr. Michael Verzi | ||
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
| Mesh filter | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
| Micrscope glass slide | VWR | 89218-844 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| p200 Blunt tips | VWR | 46620-642 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Primocin (50mg/mL) | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Signal diluent | Cell Signaling | 8112L | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 50-146-770 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Schwitalla, S., et al. Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties. Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).
- Perekatt, A. O., et al. SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium. Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).
- Aoki, R., et al. Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).
- Seiler, K. M., et al. Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage. Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).
- Stzepourginski, I., et al. CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).
- Roulis, M., et al. Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche. Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).
- Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).
- Madison, B. B., et al. Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis. Development. 132 (2), 279-289 (2005).
- van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Tetteh, P. W., et al. Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
- Baulies, A., et al. The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages. Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).
- Zeilstra, J., et al. Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling. Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).
- Gracz, A. D., et al. Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells. Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).
- Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2. Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).
- Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes. Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).
- Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).
- Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine. PLoS One. 8 (1), 54757 (2013).
- Stringer, E. J., et al. Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm. Development. 139 (3), 465-474 (2012).
