Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

एक मुरीन टेल लिम्फेडेमा मॉडल

Published: February 10, 2021 doi: 10.3791/61848
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Surgery, Indiana Center for Regenerative Medicine and Engineering, Indiana University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

लिम्फेडाइमा लिम्फेटिक डिसफंक्शन के कारण सूजन के चरम है। हम लिम्फेडेमा के एक पुरानी मुरीन पूंछ मॉडल और पूंछ के लिए आनुवंशिक कार्गो वितरण के लिए ऊतक नैनोट्रांजेक्शन प्रौद्योगिकी (टीएनटी) के उपन्यास उपयोग का वर्णन करते हैं।

Abstract

लिम्फेडाइमा लिम्फेटिक डिसफंक्शन के कारण सूजन के चरम है। द्रव, एडीपोज और फाइब्रोसिस के संचय के कारण प्रभावित अंग बढ़ता है। इस बीमारी का कोई इलाज नहीं है। एक माउस पूंछ मॉडल जो पूंछ के आधार के पास एक फोकल पूर्ण मोटाई त्वचा उत्तेजना का उपयोग करता है, जिसके परिणामस्वरूप पूंछ सूजन होती है, लिम्फेडेमा का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, इस मॉडल के परिणामस्वरूप संवहनी शामिल हो सकते हैं और परिणामस्वरूप पूंछ परिगलन और प्रारंभिक पूंछ सूजन संकल्प हो सकता है, जो इसकी नैदानिक अनुवादशीलता को सीमित करता है। क्रोनिक मुरीन टेल लिम्फेडेमा मॉडल 15 सप्ताह से अधिक निरंतर लिम्फेडेमा और पूंछ के लिए एक विश्वसनीय परफ्यूजन को प्रेरित करता है। पारंपरिक मुरीन टेल लिम्फेडेमा मॉडल के संवर्द्धन में 1) सटीक पूर्ण मोटाई उत्तेजना और लिम्फेटिक क्लिपिंग शामिल हैं, जो सर्जिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, 2) उच्च रिज़ॉल्यूशन लेजर स्पेक्टल का उपयोग करके पोस्ट-ऑपरेटिव धमनी और शिराध्य की पुष्टि, और 3) अवरक्त लेजर लिम्फ एंजियोग्राफी के पास इंडोसायनीन हरे रंग का उपयोग करके कार्यात्मक मूल्यांकन। हम माउस टेल वेक्यूलेचर के लिए उपन्यास गैर-वायरल, ट्रांसक्यूटेनियस, जेनेटिक कार्गो की फोकल डिलीवरी के लिए ऊतक नैनोट्रांसफेक्शन तकनीक (टीएनटी) का भी उपयोग करते हैं।

Introduction

लिम्फेडाइमा लिम्फेटिक डिसफंक्शन के कारण सूजन के चरम है। प्रभावित अंग तरल पदार्थ, एडीपोज और फाइब्रोसिस1के संचय के कारण बढ़ता है। लिम्फेडेमा दुनिया भर में 250 मिलियन लोगों को प्रभावित करता है2,3,4. यह अनुमान लगाया गया है कि स्तन कैंसर, मेलानोमा, स्त्री रोगविज्ञान/यूरोलॉजिक ट्यूमर, या सारकोमा जैसे ठोस घातक रोगियों के लिए उपचार कराने वाले 20-40% रोगियों में लिम्फेडेमा2,4,5विकसित होते हैं। लिम्फेडेमा से रुग्णता में आवर्ती संक्रमण, दर्द और विकृति6शामिल हैं। इस प्रगतिशील, जीवन भर की बीमारी का कोई इलाज नहीं है। वर्तमान उपचार प्रभावी7 हैं और इसमें संपीड़न, भौतिक चिकित्सक द्वारा पूर्ण भीड़भाड़ वाली चिकित्सा, एक्सीसिनल प्रक्रियाएं, और माइक्रोसर्जिकल ऑपरेशन शामिल हैं, जिनमें संवहनीलिम्फ नोड ट्रांसफर और लिम्फोवेनस बाईपास7,8, 9,10,11,12,13, 14शामिल हैं। लिम्फेडेमा के लिए आदर्श उपचार अभी तक खोजा जाना बाकी है।

लिम्फेडेमा के तंत्र और चिकित्सा का अध्ययन सीमित किया गया है। लिम्फेटिक इंजरी15,16 के बाद एक वर्ष की औसत देरी हुई है और विकिरण और सर्जरी के साथ iatrogenic अपमान का अनुभव करने वाले अधिकांश व्यक्तियों में लिम्फेडेमा4,6,17विकसित नहीं होते हैं । यद्यपि कुत्ते, भेड़ और सुअर सहित बड़े पशु मॉडलोंको18, 19,20वर्णित किया गया है, माउस पूंछ मॉडल आसानी, लागत और प्रजनन क्षमता के कारण सबसे व्यापक रूप से लागू किया गया है। लिम्फेडेमा की जांच के लिए माउस मॉडल में एक पूंछ मॉडल, डिप्थीरिया-टॉक्सिन मध्यस्थता लिम्फेटिक एब्लेशन, और एक्सिलरी या पॉपलाइटल लिम्फ नोड विच्छेदन21,22, 23,24,25, 26शामिल हैं। अधिकांश पूंछ मॉडल एक फोकल, पूर्ण मोटाई त्वचा का उपयोग लिम्फेटिक चैनल क्लिपिंग के साथ करते हैं जो पूंछ22के आधार के पास किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप पूंछ में सूजन और हिस्टोलॉजिकल विशेषताएं मानव लिम्फेडेमा24,27, 28,29केसमान होती हैं। हालांकि, मानक मुरीन पूंछ मॉडल आमतौर पर 20 दिनों में सहज हल करता है और आवधिक पूंछ परिगलन30के साथ होता है। लिम्फेडेमा माउस पूंछ मॉडल 15 सप्ताह से परे एक निरंतर लिम्फेडेमा का विस्तार करता है, पुष्टि की गई धमनी और शिरापन को दर्शाता है, और कार्यात्मक लिम्फेटिक डिसफंक्शन मूल्यांकन की अनुमति देता है।

लिम्फेडेमा का एक मुरीन पूंछ मॉडल लिम्फेडेमा के इलाज के लिए उपन्यास चिकित्सा विज्ञान के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। वायरल वैक्टर31,32द्वारा मध्यस्थता किए गए माउस मॉडल में जीन आधारित रणनीतियों का उपयोग किया गया है। हम लिम्फेडेमेटस माउस टेल के लिए जेनेटिक कार्गो डिलीवरी के लिए एक उपन्यास ऊतक नैनोट्रांजेक्शन तकनीक (टीएनटी) का भी उपयोग करते हैं। टीएनटी तेजी से केंद्रित इलेक्ट्रिकफील्ड33, 34, 35, 36में नैनोचैनल के साथ चिप का उपयोग करकेप्रत्यक्ष,ट्रांसक्यूटेनियस जीन डिलीवरी की सुविधा प्रदान करता है। मॉडल में टीएनटी2.0 का उपयोग करना शामिल है ताकि माउस पूंछ35की लिम्फेटिक चोट साइट के लिए संभावित जीन-आधारित चिकित्सीय के फोकल जीन डिलीवरी की अनुमति दी जा सके।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

यह प्रोटोकॉल संस्था की पशु अनुसंधान आचार समिति के दिशा-निर्देशों का पालन करता है । सभी पशु प्रयोगों इंडियाना विश्वविद्यालय स्कूल ऑफ मेडिसिन संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया । जानवरों को भोजन और पानी विज्ञापन libitum के साथ एक 12 घंटे के प्रकाश अंधेरे चक्र के तहत रखे गए थे ।

1. माउस टेल लिम्फाटिक्स का सर्जिकल व्यवधान

  1. समान लिंग वितरण के आठ सप्ताह पुराने C57BL/6 चूहों का उपयोग करें ।
  2. सामान्य संज्ञाहरण के तहत एक माउस को 100% ऑक्सीजन में 3-4% आइसोफ्लुन के साथ एक इंडक्शन चैंबर में रखें और प्रक्रिया के दौरान 1-3% पर रखरखाव की शिक्षा के बाद।
  3. दर्द नियंत्रण के लिए 0.5 मिलीग्राम/किलो निरंतर रिलीज (एसआर) बुप्रेनोरफिन को चमड़े के लिए प्रशासित करें।
    नोट: अतिरिक्त एनाल्जेसिक दवाओं के बाद सेशन प्रशासित: Carprofen एक बार हर 24 घंटे के लिए कम से ४८ एच और Bupivacaine के लिए या तो चीरा के बाद किया गया था या चीरा बंद करने से पहले, त्वचा के किनारों पर टपकाव से लागू (4-6 घंटे तक रहता है) ।
  4. माउस को पृष्ठीय स्थिति में रखें और पूंछ को 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल के साथ प्रस्तुत करें।
  5. कैलिपर का उपयोग करके पूंछ के आधार से 20 मिमी शुरू होने वाली 5 मिमी वेतन वृद्धि पर प्रक्रिया से पहले पूंछ व्यास को मापें। इन मापों का उपयोग कटे हुए शंकु समीकरण37का उपयोग करके मात्रा की गणना करने के लिए किया जाएगा ।
  6. आधार से 20 मिमी पूंछ पर 3 मिमी परिभेदित उत्तेजना चिह्नित करें।
  7. एक बाँझ सर्जिकल ब्लेड (आकार 15) के साथ एक सावधानीपूर्वक 3 मिमी पूर्ण मोटाई त्वचा उत्तेजना करें, जिससे सर्जिकल सूक्ष्म आवर्धन के तहत सभी अंतर्निहित वास्कुलेचर बरकरार रहे। पहले डर्मिस के माध्यम से बेहतर परिधि चिह्न (पूंछ आधार से 20 मिमी) को चीरा लगाना और उसके बाद पहले चीरा लगाने के लिए एक परिधि पूर्ण मोटाई चीरा 3 मिमी डिस्टल के बाद।
    1. दो चीरों को जोड़ने के लिए एक लंबवत पूर्ण मोटाई ऊर्ध्वाधर चीरा बनाएं। एक प्रमुख किनारे को समझने के लिए एक दांतेदार ठीक पिकअप का उपयोग करें और माइक्रो कैंची का उपयोग सावधानी से आवस्कुलर विमान के भीतर गहरी विच्छेदन करने के लिए डर्मिस और नस एडेगेटिया के लिए सतही।
  8. आइसोसल्फान ब्लू (1%) की 0.1 मिलील को पूंछ की नोक के लिए चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें।
  9. सर्जिकल माइक्रोस्कोप के नीचे पार्श्व पूंछ नसों से सटे दो लसीका चैनलों की पहचान करें। आइसोसल्फान इंजेक्शन की वजह से लिम्फाटिक्स नीला दिखाई देगा। सीधे माइक्रोसर्जिकल कैंची का उपयोग करके लिम्फटिक्स को पार करें। पार्श्व नस और लसीका के बीच एक विमान को सावधानीपूर्वक विच्छेदन करने के लिए कैंची का उपयोग करें। फिर लिम्फेटिक पोत और पार्श्व नस के बीच एक कैंची ब्लेड की नोक को पारित करें और लिम्फेटिक पोत को पार करने के लिए ब्लेड को बंद करें।
  10. एक बाँझ अनुयायी स्पष्ट ड्रेसिंग के साथ पूंछ घाव पोशाक। यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे संक्रमित या रक्तस्राव नहीं कर रहे हैं और 2 सप्ताह के लिए घाव की देखभाल प्रदान करने के लिए दैनिक पोस्ट-ऑप चीरों की जांच करें।
  11. जानवरों को अकेले घर पूंछ के लिए किसी भी आगे की चोट को रोकने के लिए और एक दूसरे को काटने से जानवरों को रोकने के लिए, जो शल्य चिकित्सा जटिलताओं के लिए नेतृत्व करेंगे ।

2. लेजर स्पेक्टल कंट्रास्ट इमेजिंग के साथ पूंछ संवहनी मूल्यांकन

  1. माउस को चरण 1.2 में एनेस्थेटाइज करें।
  2. पूंछ संवहनी कल्पना करने के लिए लेजर स्पेक्टल कंट्रास्ट इमेजिंग का उपयोग करने के लिए, चौड़ाई को 0.8 सेमी, ऊंचाई को 1.8 सेमी, बिंदु घनत्व को उच्च, फ्रेम दर से 44 छवियों/
  3. पैटेंसी के लिए शिरीन और धमनी परफ्यूजन का मूल्यांकन करें। गुणात्मक रूप से, प्रवाह की निरंतरता की कल्पना की जानी चाहिए।

3. अवरक्त लेजर एंजियोग्राफी के पास के साथ कार्यात्मक लसीका मूल्यांकन

  1. चरण 1.2 में जानवर को एनेस्थेटाइज करें
  2. इंडोसायनिन ग्रीन (आईसीजी) (25 मिलीग्राम/10 एमएल) का पुनर्गठन करें और टिप के पास डिस्टल माउस पूंछ में 0.1 एमएल को कम से कम प्रशासित करें।
  3. कमरे की रोशनी मंद करें। बफरिंग सेटिंग में नियर-इन्फ्रारेड लेजर एंजियोग्राफी रखें और उसके बाद लाइव कैप्चर करें।

4. टीएनटी का उपयोग करके माउस पूंछ के लिए न्यूक्लिक एसिड कार्गो की फोकल डिलीवरी

  1. चरण 1.2 में जानवर को एनेस्थेटाइज करें।
  2. सामयिक त्वचा एक्सफोलिएशन क्रीम का उपयोग करके माउस पूंछ को एक्सफोलिएट करें।
  3. माउस की पूंछ को कोलेजनेस समाधान (10 मिलीग्राम/एमएल) में 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर विसर्जित करें।
  4. टीएनटी2.0 चिप जलाशय35में डीएनए लोड करें।
  5. पूंछ के संपर्क में नैनोनेडल्स के साथ पूंछ पर डिलीवरी के वांछित फोकल साइट पर टीएनटी2.0 सिलिकॉन चिप डिवाइस रखें।
  6. जलाशय में एक सकारात्मक विद्युत जांच रखें। एक 30 जी सुई के लिए नकारात्मक जांच संलग्न करें और प्रसव की साइट के लिए पूंछ में चमड़े के नीचे सुई डालें ।
  7. वर्ग तरंग पल्स इलेक्ट्रिक उत्तेजना (10 x 10 एमएस दालें, 250 वी, 10 एमए) लागू करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

निरंतर लिम्फेडेमा के लिए माउस टेल मॉडल की तकनीक चित्र 1में दिखाई गई है। यह आंकड़ा माउस टेल मॉडल की प्रासंगिक शरीर रचना को प्रदर्शित करता है। चित्रा 2 लिम्फेडेमा प्रेरण के बाद माउस पूंछ में प्रगतिशील सूजन और निरंतर प्रतिरोधी लिम्फेडेमा को दर्शाता है। माउस पूंछ की मात्रा, जैसा कि कटा हुआ शंकु समीकरण द्वारा गणना की जाती है, सप्ताह 4 में चोटियों और 6 सप्ताह के लिए पठारों के बाद क्रमिक सुधार है जो 15 सप्ताह तक निरंतर है। मॉडल में लिम्फेडेमा के लिए चिकित्सीय हस्तक्षेपों के प्रभाव का आकलन करने के लिए पूंछ की मात्रा का उपयोग परिणाम चर के रूप में किया जा सकता है। चित्र 3में, पूंछ वास्कुलेचर पैटेंसी के मूल्यांकन के लिए उच्च संकल्प लेजर स्पेक्टल देखा जा सकता है। यह सुनिश्चित करने के लिए मॉडल के लिए कठोरता कहते है welling लस शिथिलता के बजाय शिरा की चोट के लिए माध्यमिक है । हस्तक्षेप का प्रभाव तो संभावित अधिक आत्मविश्वास के साथ लिम्फेडेमा उपचार के लिए अनुवाद कर सकते हैं । चित्रा 4 एक कार्यात्मक लसीका मूल्यांकन अवरक्त लेजर लिम्फेंजियोग्राफी के पास के माध्यम से प्रदर्शन से पता चलता है । यह अतिरिक्त परिणाम चर हस्तक्षेप के कार्यात्मक लसीका प्रभाव के लिए अनुमति देता है। चित्रा 5 ऊतक नैनोट्रांजेक्शन तकनीक (टीएनटी2.0)का उपयोग करके सर्जिकल साइट पर आनुवंशिक कार्गो की फोकल डिलीवरी को दर्शाता है। टीएनटी2.0 इस लिम्फेडेमा मॉडल में संभावित उम्मीदवार जीन-आधारित चिकित्सीय के देखभाल वितरण के बिंदु की सुविधा प्रदान करता है।

Figure 1
चित्रा 1:माउस टेल मॉडल निरंतर लिम्फेडेमा के लिए। (ए)सर्जिकल माइकर्सस्कोप के नीचे बेस से 20 मिमी मुरीन पूंछ पर 3 मिमी चौड़ी पूर्ण मोटाई वाली त्वचा का एक्सिशन किया जाता है। वास्कुलेचर को संरक्षित करने के लिए देखभाल की जाती है। (ख)माउस पूंछ के क्रॉस-सेक्शन का एक योजनाबद्ध। डीवी = पृष्ठीय नस, एलवी = पार्श्व नसें, ए = वेंट्रल कौडल धमनी, सीवी = कौडल कशेरुका, टी = टेंडन और मांसपेशी, पीले तीर लिम्फाटिक्स को दिखाता है। (ग)लिम्फाटिक्स को स्थानीय बनाने के लिए पूंछ की नोक में आइसोसल्फान नीले रंग के प्रशासन के बाद, लिम्फाटिक्स (पीला तीर) नीले रंग का प्रदर्शन करता है। बगल की पार्श्व नसों (सफेद तीर) को संरक्षित करते समय लिम्फाटिक्स बाधित होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:माउस पूंछ लिम्फेडेमा मॉडल की प्रगतिशील सूजन। (ए)पूर्ण मोटाई त्वचा उत्तेजना और लिम्फेटिक ट्रांसेक्शन के बाद, माउस पूंछ प्रगतिशील सूजन प्रदर्शित करती है जो 15 सप्ताह से अधिक निरंतर होती है। ब्रैकेट पूंछ के आधार से सर्जिकल पूर्ण मोटाई त्वचा उत्तेजना की शुरुआत करने के लिए 20 मिमी को दर्शाता है। (बी-सी) 15 सप्ताह से अधिक पूंछ की मात्रा में परिवर्तन की मात्रा(बी)बार रेखांकन के रूप में प्रतिनिधित्व किया, प्रत्येक डॉट एक जानवर का प्रतिनिधित्व, n = 15, या के रूप में(सी)लाइन ग्राफ । एसईएम ± रूप में दर्शाए गए डेटा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3:लिम्फेडेमा माउस पूंछ मॉडल में माउस टेल परफ्यूजन की पुष्टि करने के लिए उच्च रिज़ॉल्यूशन लेजर स्पेक्टल कंट्रास्ट इमेजिंग। लेजर स्पेक्टल का उपयोग लिम्फेटिक एटियोलॉजी की सूजन को मान्य करने और पूंछ परिगलन को कम करने के लिए माउस टेल वेक्यूलेचर पोस्टऑपरेटिव रूप से आकलन करने के लिए किया जाता है। (A)लेजर स्केकल द्वारा पाए गए घायल पार्श्व नसों (काला तीर) के साथ एक माउस पूंछ। (ख)लेजर स्पेक्टल द्वारा पता लगाया गया अक्षुण्ण पार्श्व पूंछ नस (काला तीर) पोस्ट-लिम्फेडेमा सर्जरी। (n=5) संकल्प 0.02 मिमी; रंग कोडित बार पर्फ्यूजन (नीला: कम, लाल: उच्च) को इंगित करता है जैसा कि मनमाने ढंग से सापेक्ष इकाइयों में मापा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:माउस पूंछ मॉडल में अवरक्त लेजर लिम्फांगियोरफी के पास का उपयोग करके लिम्फेटिक फ़ंक्शन का आकलन। माउस पूंछ की नोक में इंजेक्ट किया गया इंडोसायनीन ग्रीन (आईसीजी) लिम्फाटिक्स को स्थानीय बनाता है। पहले से, माउस पूंछ के साथ लिम्फाटिक्स बरकरार हैं। पोस्टऑपरेटिव रूप से, सर्जिकल साइट से परे कोई आईसीजी पारगमन नहीं है, इस बात की पुष्टि करता है कि सूजन लिम्फेटिक डिसफंक्शन के कारण होती है। पीला तीर पूंछ के आधार को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:ऊतक नैनोट्रांजेक्शन तकनीक (टीएनटी) का उपयोग करके जेनेटिक कार्गो की फोकल डिलीवरी। (ए)टीएनटी डिलीवरी का चित्रण। (ख)प्लाज्मिड टीएनटी2.0 जलाशय में लोड किए जाते हैं। सकारात्मक और नकारात्मक विद्युत जांच संलग्न हैं और एक संक्षिप्त, वर्ग तरंग पल्स इलेक्ट्रिक उत्तेजना (10 x 10 एमएस दालें, 250 वी, 10 एमए), फोकल, गैर वायरल, ट्रांसक्यूटेनियस ट्रांसफेक्शन की सुविधा प्रदान की जाती है। (ग)टीएनटी2.0 का उपयोग करके आनुवंशिक कार्गो डिलीवरी की दक्षता जैसा कि फ्लोरोसीन अमीसाइट (एफएएम) के माध्यम से देखा गया है, ने मुरीन पूंछ में डीएनए डिलीवरी का लेबल लगाया है। माउस पूंछ टीएनटी उपचार के दो दिन बाद खंडित किया गया था और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मूल्यांकन किया गया था। सफेद बिंदीदार रेखाएं मुरीन पूंछ की त्वचा के एपिथेलियम का संकेत देती हैं। सफेद तीर FAM लेबल डीएनए का संकेत देते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

लिम्फेडेमा को प्राथमिक (जन्मजात) या माध्यमिक (इट्रोजेनिक लिम्फेटिक) चोट38, 39के रूप में वर्गीकृत कियागयाहै। माध्यमिक लिम्फेडेमा में 39 मामलों मेंसे 99%शामिल हैं। माध्यमिक लिम्फेडेमा सबसे अधिक संक्रमण (फाइलेरिया) या लिम्फाडेनेक्टॉमी या विकिरण4,39के साथ ऑन्कोलॉजिकल उपचार के कारण होता है। एक ट्रांसलेशनल एनिमल मॉडल सेकेंडरी लिम्फेडेमा के लिए चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि लिम्फडेक्टोमी और विकिरण के साथ इलाज किए गए 70% जानवर लिम्फेडेमा2,16प्राप्त नहीं करते हैं। इसके अलावा, फेनोटाइपिकल लिम्फेडेमा लिम्फेटिक चोट के बाद देरी से शुरू (एक वर्ष) प्रदर्शित करता है। लिम्फेडेमा का माउस पूंछ मॉडल इन बाधाओं पर काबू पा जाता है, क्योंकि फोकल टेल लिम्फेटिक एक्सीशन के दौर से गुजर रहे सभी चूहे प्रक्रिया21,23के बाद के दिनों के भीतर लिम्फेडेमा प्रदर्शित करते हैं। पूर्ण मोटाई फोकल चमड़े के नीचे उत्तेजना शल्य चिकित्सा माइक्रोस्कोप के साथ दृश्य के तहत किया जाता है जिससे पूंछ की नसों और चमड़े के नीचे ऊतकों के बीच ऊतक विमान की निश्चित पहचान की अनुमति होती है और पोत संरक्षण की सुविधा होती है। हमने पहले नायलॉन सीवन के साथ लिम्फेटिक चैनल को लिम्फेटिक चैनल को लिगामेंट किया है, लेकिन जैसा कि लगातार लिम्फेडेमा को केवल लिम्फेटिक चैनल के ट्रांसेक्शन के साथ प्रेरित किया जा सकता है, लिगेशन को अनावश्यक समझा जाना चाहिए। माउस पूंछ में दो पार्श्व लिम्फेटिक चैनल पार्श्व पूंछ नसों के साथ निकटता में हैं। हिस्टोलॉजिकल रूप से, सूजन पूंछ सूजन, मध्यवर्ती द्रव प्रतिधारण, आदिपोज बयान और फाइब्रोसिस प्रदर्शित करती है, जो नैदानिक लिम्फेडेमा24, 27,28,40के समान है।

इस मॉडल का एक नुकसान पार्श्व नसों और वास्कुलेचर को चोट लगने का खतरा है। लूप आवर्धन का उपयोग करके पूर्ण मोटाई त्वचा उत्तेजना पर प्रक्रिया का प्रदर्शन विच्छेदन के दौरान अनजाने में शिरास रक्तस्राव का कारण बन सकता है। उच्च स्टीरियोस्कोपिक आवर्धन के तहत सावधान उत्तेजना पोत एडेक्टिशिया और सबडरमल परत के बीच एक संवहनी विमान के भीतर रहने के लिए अधिक सटीकता की सुविधा प्रदान करता है। एक और कठिनाई यह है कि पूंछ परिगलन 30%30के रूप में उच्च आवृत्ति के साथ होता है, क्योंकि पोत चोट पूंछ परिगलन जोखिम को बहुत बढ़ाती है। मॉडल के साथ पूंछ परिगलन (1) सावधानीपूर्वक विच्छेदन के लिए एक शल्य माइक्रोस्कोप का उपयोग और (2) लेजर स्पेक्टल इमेजिंग४१द्वारा पोत पैटेंसी की पुष्टि । यदि संवहनी चोट की पहचान की जाती है, तो जानवर को अध्ययन से हटा दिया जाना चाहिए। अन्य जांचकर्ताओं ने धमनी परफ्यूजन22का आकलन करने के लिए इंट्राकार्डिएक माइक्रोस्फीयर इंजेक्शन का इस्तेमाल किया है । लेजर स्पेक्टल इमेजिंग धमनियों के अलावा नसों के रक्त प्रवाह गतिज की मात्रा की मात्रा की अनुमति देता है41. यह न्यूनतम आक्रामक तकनीक सटीक माइक्रोपरफ्यूजन डेटा प्रदान कर सकती है। 41

पूंछ की मात्रा मॉडल के फेनोटाइपिक परिणाम चर के रूप में उपयोग की जाती है। मॉडल में पूंछ के लिम्फेटिक फ़ंक्शन का आकलन करने का भी प्रयोगात्मक प्रभाव का आकलन करने के लिए किया जाता है। हम माउस पूंछ में लिम्फेटिक फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए अवरक्त लेजर लिम्फेंजियोग्राफी के पास उपयोग करते हैं। यह सीधे जीवित जानवर में वास्तविक समय लसीका प्रवाह की कल्पना करता है। आईसीजी लेजर लिम्फेंजियोग्राफी का उपयोग आमतौर पर लिम्फोवेनस एनास्टोमोसिस जैसी लिम्फेटिक माइक्रोसर्जिकल थ्रेपेटिक प्रक्रियाओं के दौरान भी चिकित्सकीय रूप से किया जाता है, इसलिए यह अच्छी तरह से10का अनुवाद करता है। चिकित्सकीय रूप से, यह लिम्फेडेमा7,10के इलाज के लिए लिम्फोवेनस एनाटॉमोसिस में नसों में जोड़ने के लिए इन्ट्रोपरेटिव लिम्फेटिक मैपिंग और लक्षित लिम्फेटिक जहाजों की पहचान की सुविधा प्रदान करता है। आईसीजी लेजर लिम्फेंजियोग्राफी का उपयोग करने का एक नुकसान वह आसानी है जिसके साथ माउस पूंछ और अन्य सामग्री आईसीजी के साथ लेपित हो सकती है, जिसके परिणामस्वरूप गैर-विशिष्ट फ्लोरोरेसेंस होता है और लिम्फाटिक्स के उचित दृश्य में बाधा आती है। इसलिए, हम इस जोखिम को कम करने के लिए आईसीजी हैंडलिंग और प्रशासन दोनों के तुरंत बाद दस्ताने बदलते हैं।

टीएनटी को शुरू में वीवो टिश्यू रीप्रोग्रामिंग33में विकसित किया गया था । यह एक जीन हस्तांतरण मंच के रूप में प्रयोग किया जाता है, अधिक मोटे तौर पर मधुमेह परिधीय न्यूरोपैथी के बचाव और कुचल नसों की मरंमत३४,३६ और तीन आवश्यक घटकों का उपयोग करता है: (1) नैनोनेडल आधारित जीन हस्तांतरण के लिए एक सिलिकॉन नैनोचिप; (2) एक न्यूक्लिक एसिड कार्गो (ओआरएफ या एसआईआरएन के साथ प्लाज्मिड); और (3) एक मानक बिजली की आपूर्ति। टीएनटी तेजी से केंद्रित इलेक्ट्रिक फील्ड के साथ डायरेक्ट, ट्रांसक्यूटेनियस, नॉन-वायरल जीन डिलिवरी की सुविधा देता है । इसका उपयोग माउस मॉडल33में नेवस्कुलराइजेशन को बढ़ाकर अंग इस्केमिया को कम करने के लिए किया गया है। हाल ही में, टीएनटी2.0 का उपयोग घाव-साइट एक्सोसोम्स35लेबल करने के लिए किया गया है। माउस पूंछ लिम्फेडेमा मॉडल में टीएनटी का उपयोग जीन-आधारित उपचारों के वितरण के लिए एक रोमांचक भविष्य प्रदान करता है।

माउस टेल लिम्फेडेमा मॉडल की एक अनुवादात्मक सीमा लिम्फेडेमा21, 22का सहज संकल्प रही है, क्योंकि कुछ प्रयोगात्मक मॉडलों में 20-30 दिनों के बाद पूंछ में सूजन का समाधानहोताहै। मॉडल में, पूंछ सूजन की मात्रा, जैसा कि आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले काटे गए शंकु समीकरण37द्वारा मापा जाता है, संकल्प का प्रदर्शन किए बिना 15 सप्ताह तक निरंतर किया गया है। शायद तकनीक संवर्द्धन ने लिम्फेडेमा के हठ को अधिकतम किया है। तकनीक संशोधनों में सूक्ष्म आवर्धन के तहत पूर्ण विच्छेदन, लिम्फेडेमा की लिम्फेटिक उत्पत्ति के लिए कठोरता सुनिश्चित करने के लिए पूंछ वाक्यूलेचर का लेजर स्पेक्टल मूल्यांकन, आईसीजी लेजर लिम्फेंजियोग्राफी के साथ कार्यात्मक मूल्यांकन और चिकित्सीय जीन वितरण के लिए टीएनटी2.0 शामिल हैं। लिम्फेडेमा का संशोधित माउस पूंछ मॉडल लिम्फेडेमा का एक प्रजनन योग्य और चिकित्सकीय रूप से अनुवादयोग्य पशु मॉडल है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के हित की कोई प्रतिस्पर्धी संघर्ष है ।

Acknowledgments

इस काम को अमेरिकन एसोसिएशन ऑफ प्लास्टिक सर्जन अकादमिक छात्रवृत्ति और एएचएच को रक्षा विभाग W81XWH2110135 द्वारा प्रदान किए गए अनुदान वित्तपोषण द्वारा समर्थित किया   गया था। सौंदर्यशास्त्र सर्जरी शिक्षा और अनुसंधान फाउंडेशन एमएस NIH U01DK119099, R01NS042617 और R01DK125835 CKS को अनुदान ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tegaderm Film 1626W
Surgical Microscope Leica, Wetzlar, Germany MSV266
Adherent Dressing (Tegaderm) 3M, St. Paul, Minn. 1626W
Laser speckle (Pericam PSI System ) Perimed AB, Stockholm, Sweden) PSIZ
Near-infrared laser (LUNA) Stryker (Formerly Novadaq Technologies, Toronto, Canada) LU3000
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 000664
Micro-Adson Forceps - 1x2 Teeth Fine Science Tools (USA) Inc. 11019-12
V-Hook Fine Science Tools (USA) Inc. 18052-12
Scalpel SS NO15 Fischer Scientific 29556
Disposable Needle 30GX1 Fischer Scientific 305128
Operating Scissors Fischer Scientific 12-460-796
Surgi-Or Jeweler's Forceps, Sklar 4-1/2 in Fischer Scientific 50-118-4255
Spring Scissors - Straight/Sharp-Sharp/8mm Cutting Edge Fine Science Tools (USA) Inc. 15024-10
Cardiogreen Sigma I2633-25MG
IsosulfanBlue (Lymphazurin)  50 mg/5ml Mylan 67457-220-05

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kataru, R. P., et al. Fibrosis and secondary lymphedema: chicken or egg. Translation Research. 209, 68-76 (2019).
  2. Brayton, K. M., et al. Lymphedema prevalence and treatment benefits in cancer: impact of a therapeutic intervention on health outcomes and costs. PLoS One. 9 (12), 114597 (2014).
  3. Mendoza, N., Li, A., Gill, A., Tyring, S. Filariasis: diagnosis and treatment. Dermatology and Therapy. 22 (6), 475-490 (2009).
  4. Rockson, S. G., Rivera, K. K. Estimating the population burden of lymphedema. Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 147-154 (2008).
  5. Soran, A., et al. Breast cancer-related lymphedema--what are the significant predictors and how they affect the severity of lymphedema. Breast Journal. 12 (6), 536-543 (2006).
  6. Hayes, S. C., et al. Upper-body morbidity after breast cancer: incidence and evidence for evaluation, prevention, and management within a prospective surveillance model of care. Cancer. 118, 8 Suppl 2237-2249 (2012).
  7. Carl, H. M., et al. Systematic Review of the Surgical Treatment of Extremity Lymphedema. Journal of Reconstructive Microsurgery. 33 (6), 412-425 (2017).
  8. Garza, R., Skoracki, R., Hock, K., Povoski, S. P. A comprehensive overview on the surgical management of secondary lymphedema of the upper and lower extremities related to prior oncologic therapies. BMC Cancer. 17 (1), 468 (2017).
  9. Hassanein, A. H., et al. Deep Inferior Epigastric Artery Vascularized Lymph Node Transfer: A Simple and Safe Option for Lymphedema. Journal of Plastic, Reconstructive, Aesthetic Surgery. 73 (10), 1897-1916 (2020).
  10. Hassanein, A. H., Sacks, J. M., Cooney, D. S. Optimizing perioperative lymphatic-venous anastomosis localization using transcutaneous vein illumination, isosulfan blue, and indocyanine green lymphangiography. Microsurgery. 37 (8), 956-957 (2017).
  11. Chang, D. W., Masia, J., Garza, R., Skoracki, R., Neligan, P. C. Lymphedema: Surgical and Medical Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 138, 3 Suppl 209-218 (2016).
  12. Gould, D. J., Mehrara, B. J., Neligan, P., Cheng, M. H., Patel, K. M. Lymph node transplantation for the treatment of lymphedema. Journal of Surgical Oncology. 118 (5), 736-742 (2018).
  13. Cook, J. A., et al. Immediate Lymphatic Reconstruction after Axillary Lymphadenectomy: A Single-Institution Early Experience. Annals of Surgical Oncology. , (2020).
  14. Cook, J. A., Hassanein, A. H. ASO Author Reflections: Immediate Lymphatic Reconstruction: A Proactive Approach to Breast Cancer-Related Lymphedema. Annals of Surgical Oncology. , (2020).
  15. Johansson, K., Branje, E. Arm lymphoedema in a cohort of breast cancer survivors 10 years after diagnosis. Acta Oncologica. 49 (2), 166-173 (2010).
  16. Johnson, A. R., et al. Lymphedema Incidence After Axillary Lymph Node Dissection: Quantifying the Impact of Radiation and the Lymphatic Microsurgical Preventive Healing Approach. Annals of Plastic Surgery. 82, 4S Suppl 3 234-241 (2019).
  17. Gartner, R., Mejdahl, M. K., Andersen, K. G., Ewertz, M., Kroman, N. Development in self-reported arm-lymphedema in Danish women treated for early-stage breast cancer in 2005 and 2006--a nationwide follow-up study. Breast. 23 (4), 445-452 (2014).
  18. Shin, W. S., Rockson, S. G. Animal models for the molecular and mechanistic study of lymphatic biology and disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 50-74 (2008).
  19. Tobbia, D., et al. Lymphedema development and lymphatic function following lymph node excision in sheep. Journal of Vascular Research. 46 (5), 426-434 (2009).
  20. Olszewski, W., Machowski, Z., Sokolowski, J., Nielubowicz, J. Experimental lymphedema in dogs. Journal of Cardiovascular Surgery. 9 (2), 178-183 (1968).
  21. Rutkowski, J. M., Moya, M., Johannes, J., Goldman, J., Swartz, M. A. Secondary lymphedema in the mouse tail: Lymphatic hyperplasia, VEGF-C upregulation, and the protective role of MMP-9. Microvascular Research. 72 (3), 161-171 (2006).
  22. Tabibiazar, R., et al. Inflammatory manifestations of experimental lymphatic insufficiency. PLoS Medicine. 3 (7), 254 (2006).
  23. Slavin, S. A., Van den Abbeele, A. D., Losken, A., Swartz, M. A., Jain, R. K. Return of lymphatic function after flap transfer for acute lymphedema. Annals of Surgery. 229 (3), 421-427 (1999).
  24. Zampell, J. C., et al. Toll-like receptor deficiency worsens inflammation and lymphedema after lymphatic injury. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 302 (4), 709-719 (2012).
  25. Gardenier, J. C., et al. Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema. JCI Insight. 1 (15), 84095 (2016).
  26. Weiler, M. J., Cribb, M. T., Nepiyushchikh, Z., Nelson, T. S., Dixon, J. B. A novel mouse tail lymphedema model for observing lymphatic pump failure during lymphedema development. Scientific Reports. 9 (1), 10405 (2019).
  27. Avraham, T., et al. Th2 differentiation is necessary for soft tissue fibrosis and lymphatic dysfunction resulting from lymphedema. FASEB J. 27 (3), 1114-1126 (2013).
  28. Zampell, J. C., et al. CD4(+) cells regulate fibrosis and lymphangiogenesis in response to lymphatic fluid stasis. PLoS One. 7 (11), 49940 (2012).
  29. Arruda, G., Ariga, S., de Lima, T. M., Souza, H. P., Andrade, M. A modified mouse-tail lymphedema model. Lymphology. 53 (1), 29-37 (2020).
  30. Jun, H., et al. Modified Mouse Models of Chronic Secondary Lymphedema: Tail and Hind Limb Models. Annals of Vascular Surgery. 43, 288-295 (2017).
  31. Karkkainen, M. J., et al. A model for gene therapy of human hereditary lymphedema. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (22), 12677-12682 (2001).
  32. Yoon, Y. S., et al. VEGF-C gene therapy augments postnatal lymphangiogenesis and ameliorates secondary lymphedema. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 717-725 (2003).
  33. Gallego-Perez, D., et al. Topical tissue nano-transfection mediates non-viral stroma reprogramming and rescue. Nature Nanotechnology. 12 (10), 974-979 (2017).
  34. Moore, J. T., et al. Nanochannel-Based Poration Drives Benign and Effective Nonviral Gene Delivery to Peripheral Nerve Tissue. Advanced Biosystems. , 2000157 (2020).
  35. Zhou, X., et al. Exosome-Mediated Crosstalk between Keratinocytes and Macrophages in Cutaneous Wound Healing. ACS Nano. 14 (10), 12732-12748 (2020).
  36. Roy, S., et al. Neurogenic tissue nanotransfection in the management of cutaneous diabetic polyneuropathy. Nanomedicine. 28, 102220 (2020).
  37. Sitzia, J. Volume measurement in lymphoedema treatment: examination of formulae. European Journal of Cancer Care. 4 (1), 11-16 (1995).
  38. Smeltzer, D. M., Stickler, G. B., Schirger, A. Primary lymphedema in children and adolescents: a follow-up study and review. Pediatrics. 76 (2), 206-218 (1985).
  39. Maclellan, R. A., Greene, A. K. Lymphedema. Seminars in Pediatric Surgery. 23 (4), 191-197 (2014).
  40. Clavin, N. W., et al. TGF-beta1 is a negative regulator of lymphatic regeneration during wound repair. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 295 (5), 2113-2127 (2008).
  41. Gnyawali, S. C., et al. Retooling Laser Speckle Contrast Analysis Algorithm to Enhance Non-Invasive High Resolution Laser Speckle Functional Imaging of Cutaneous Microcirculation. Scientific Reports. 7, 41048 (2017).

Tags

चिकित्सा अंक 168 लिम्फेडेमा मॉडल लिम्फेंजियोग्राफी लेजर स्पेक्टल टीएनटी ऊतक नैनोट्रांस्फेक्शन
एक मुरीन टेल लिम्फेडेमा मॉडल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hassanein, A. H., Sinha, M.,… More

Hassanein, A. H., Sinha, M., Neumann, C. R., Mohan, G., Khan, I., Sen, C. K. A Murine Tail Lymphedema Model. J. Vis. Exp. (168), e61848, doi:10.3791/61848 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter