Weitfeld-Echtzeit-Bildgebung lokaler und systemischer Wundsignale bei Arabidopsis

Zusammenfassung

Extrazelluläre Glutamat-ausgelöste systemische Kalziumsignalisierung ist entscheidend für die Induktion von pflanzlichen Abwehrreaktionen auf mechanische Wunden und Pflanzenfresserangriffe in Pflanzen. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um die räumliche und zeitliche Dynamik dieser beiden Faktoren mit Arabidopsis thaliana-Pflanzen zu visualisieren, die kalzium- und glutamatempfindliche fluoreszierende Biosensoren exprimieren.

Zusammenfassung

Pflanzen reagieren auf mechanische Belastungen wie Verwundung und Pflanzenfresser, indem sie Abwehrreaktionen sowohl in den beschädigten als auch in den distalen unbeschädigten Teilen hervorrufen. Bei der Verwundung eines Blattes tritt an der Wundstelle ein Anstieg der zytosolischen Calciumionenkonzentration (Ca²⁺ Signal) auf. Dieses Signal wird schnell an unbeschädigte Blätter übertragen, wo Abwehrreaktionen aktiviert werden. Unsere jüngste Forschung ergab, dass Glutamat, das aus den verwundeten Zellen des Blattes in den Apoplasten um sie herum austritt, als Wundsignal dient. Dieses Glutamat aktiviert Glutamatrezeptor-ähnliche Ca²⁺ durchlässige Kanäle, was dann zu einer Fernausbreitung des Ca²⁺ Signals in der gesamten Pflanze führt. Die räumlichen und zeitlichen Eigenschaften dieser Ereignisse können mit Echtzeit-Bildgebung lebender Pflanzen erfasst werden, die genetisch kodierte fluoreszierende Biosensoren exprimieren. Hier stellen wir eine pflanzenweite Echtzeit-Bildgebungsmethode vor, um die Dynamik sowohl der Ca²⁺ Signale als auch Veränderungen des apoplastischen Glutamats, die als Reaktion auf Wunden auftreten, zu überwachen. Dieser Ansatz verwendet ein Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop und transgene Arabidopsis-Pflanzen, die Green Fluorescent Protein (GFP)-basierte Ca²⁺ und Glutamat-Biosensoren exprimieren. Darüber hinaus stellen wir Methoden vor, um eine wundinduzierte, glutamatgesteuerte schnelle und ferngesteuerte Ca²⁺ Signalausbreitung leicht hervorzulösen. Dieses Protokoll kann auch auf Studien zu anderen Pflanzenstress angewendet werden, um zu untersuchen, wie die systemische Signalübertragung von Pflanzen an ihren Signal- und Reaktionsnetzwerken beteiligt sein könnte.

Einleitung

Pflanzen können biotischen Belastungen, z. B. Insekten, die sich von ihnen ernähren, nicht entkommen, daher haben sie ausgeklügelte Stresssensor- und Signaltransduktionssysteme entwickelt, um Herausforderungen wie Pflanzenfresser zu erkennen und sich dann vor ihnen zu schützen¹. Bei Verwundung oder Pflanzenfresserangriff initiieren Pflanzen schnelle Abwehrreaktionen, einschließlich der Ansammlung des Phytohormons Jasmonsäure (JA) nicht nur an der verwundeten Stelle, sondern auch in unbeschädigten distalen Organen². Dieses JA löst dann sowohl Abwehrreaktionen in den direkt geschädigten Geweben aus als auch präventiv Abweh....

Protokoll

1. Pflanzenmaterialaufbereitung

1. In einer 1,5 ml Mikroröhrchen sterilisieren Sie die Samen der Arabidopsis thaliana (Col-0 Accession) Pflanze, die entweder GCaMP3 oder CHIB-iGluSnFR exprimiert, indem Sie mit 20% (v / v) NaClO für 3 min schütteln und dann 5 mal mit sterilem destilliertem Wasser waschen.
   HINWEIS: Die transgenen Linien von Arabidopsis, die GCaMP3 oder CHIB-iGluSnFR exprimieren, wurden zuvor beschrieben⁶.
2. Säen Sie in einer sterilen Haube 13 oberflächensterilisierte Samen auf einer 10 cm großen quadratischen Kunststoff-Petrischale, die mit 30 ml sterilem (autoklaviertem) Murashige und Skoog (M....

Ergebnisse

Die Signalausbreitung von [Ca²⁺]_cyt und [Glu]_apo als Reaktion auf Wunden ist in Abbildung 3, Abbildung 4, Movie S1und Movie S2dargestellt. Das Schneiden des Blattstiels 1 in Pflanzen, die GCaMP3 (bei 0 s) exprimierten, führte zu einem signifikanten Anstieg des [Ca²⁺]_Zyts, der schnell lokal durch das Gefäß (bei 40 s) induziert wurde (

Diskussion

Systemische Signalisierung ist wichtig für Pflanzen, um auf lokalisierte äußere Umweltreize zu reagieren und dann ihre Homöostase auf einer ganzen Pflanzenebene zu erhalten. Obwohl sie nicht wie Tiere mit einem fortgeschrittenen Nervensystem ausgestattet sind, verwenden sie eine schnelle Kommunikation sowohl innerhalb als auch zwischen Organen, basierend auf Faktoren wie mobilen elektrischen (und möglicherweise hydraulischen) Signalen und sich ausbreitenden Wellen von ROS und Ca^{2 + 46}

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Arabidopsis exprimierende GCaMP3	Saitama University
Arabidopsis exprimierende CHIB-iGluSnFR	Saitama University
GraphPad Prism 7	GraphPad Software
L-Glutamat	FUJIFILM Wako	072-00501	Gelöst in einem flüssigen Wachstumsmedium [1/2x MS-Salze, 1 % (w/v) Saccharose und 0,05 % (w/v) MES; pH 5,1 eingestellt mit 1N KOH].
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige und Skoog (MS) Medium	FUJIFILM Wako	392-00591	Zusammensetzung: 1x MS-Salze, 1 % (w/v) Saccharose, 0,01 % (w/v) Myoinositol, 0,05 % (w/v) MES und 0,5 % (w/v) Gellangummi; pH 5,7 eingestellt mit 1N KOH.
Nikon SMZ25 Stereomikroskop	Nikon
NIS-Elements AR-Analyse	Nikon
1x Objektiv (P2-SHR PLAN APO)	Nikon
sCMOS Kamera (ORCA-Flash4.0 V2)	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Quadratische Petrischale aus Kunststoff	Simport	D210-16