Weitfeld-Echtzeit-Bildgebung lokaler und systemischer Wundsignale bei Arabidopsis

Pflanzen können biotischen Belastungen, z. B. Insekten, die sich von ihnen ernähren, nicht entkommen, daher haben sie ausgeklügelte Stresssensor- und Signaltransduktionssysteme entwickelt, um Herausforderungen wie Pflanzenfresser zu erkennen und sich dann vor ihnen zu schützen¹. Bei Verwundung oder Pflanzenfresserangriff initiieren Pflanzen schnelle Abwehrreaktionen, einschließlich der Ansammlung des Phytohormons Jasmonsäure (JA) nicht nur an der verwundeten Stelle, sondern auch in unbeschädigten distalen Organen². Dieses JA löst dann sowohl Abwehrreaktionen in den direkt geschädigten Geweben aus als auch präventiv Abwehrkräfte in den unbeschädigten Teilen der Pflanze. Bei Arabidopsiswurde die durch Wunden induzierte Ansammlung von JA in distalen, intakten Blättern innerhalb weniger Minuten nach Beschädigung an anderer Stelle in der Pflanze nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass ein schnelles und fernweites Signal vom verwundeten Blatt³übertragen wird. Mehrere Kandidaten, wie Ca^2+,reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und elektrische Signale, wurden vorgeschlagen, um als diese Fernwundsignale in Pflanzen^4,5zu dienen.

Ca²⁺ ist eines der vielseitigsten und allgegenwärtigsten zweiten Botenstoffe in eukaryotischen Organismen. Bei Pflanzen verursachen Raupenkauen und mechanische Verwundungen einen drastischen Anstieg der zytosolischen Ca²⁺ Konzentration ([Ca²⁺]_Zyt) sowohl im verwundeten Blatt als auch in ungewickelten entfernten Blättern^6,7. Dieses systemische Ca^2+-Signal wird von intrazellulären^{Ca2+-Sensorproteinen}empfangen, die zur Aktivierung nachgeschalteter Abwehrsignalwege, einschließlich ja-Biosynthese^8,9führen. Trotz zahlreicher solcher Berichte, die die Bedeutung von Ca^2+-Signalen für pflanzliche Wundreaktionen unterstützen, sind Informationen über die räumlichen und zeitlichen Eigenschaften von Ca^2+-Signalen, die durch Verwundung induziert werden, begrenzt.

Die Echtzeitbildgebung mit genetisch kodierten Ca^{2+-Indikatoren} ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Überwachung und Quantifizierung der räumlichen und zeitlichen Dynamik von Ca^2+-Signalen. Bis heute wurden Versionen solcher Sensoren entwickelt, die die Visualisierung von Ca²⁺ Signalen auf der Ebene einer einzelnen Zelle, zu Geweben, Organen und sogar ganzen Pflanzen ermöglichen¹⁰. Der erste genetisch kodierte Biosensor für Ca^2+, der in Pflanzen verwendet wurde, war das biolumineszierende Protein Aequorin, das aus der Qualle Aequorea victoria¹¹gewonnen wurde. Obwohl dieses chemiluminineszierende Protein verwendet wurde, um Ca²⁺ Veränderungen als Reaktion auf verschiedene Spannungen in Pflanzen^12,13,^{14,15,16,17,18}zu erkennen, ist es aufgrund des extrem niedrigen Lumineszenzsignals, das es erzeugt, nicht gut für die Echtzeitbildgebung geeignet. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-basierte Ca²⁺ Indikatoren, wie die Gelben Kameleons, wurden auch erfolgreich verwendet, um die Dynamik einer Reihe von Ca²⁺ Signalereignissen in Pflanzen^{19,20,21,22,23,24}zu untersuchen. Diese Sensoren sind mit bildgebenden Ansätzen kompatibel und bestehen am häufigsten aus dem Ca^2+-bindenden Protein Calmodulin (CaM) und einem CaM-bindenden Peptid (M13) aus einer Myosin-Leichtkettenkinase, die alle zwischen zwei Fluorophorproteinen verschmolzen sind, im Allgemeinen einem Cyan Fluorescent Protein (CFP) und einer Yellow Fluorescent Protein Variante (YFP)^10. Die Ca^2+-Bindung an CaM fördert die Interaktion zwischen CaM und M13, was zu einer Konformationsänderung des Sensors führt. Diese Änderung fördert die Energieübertragung zwischen CFP und YFP, was die Fluoreszenzintensität des YFP erhöht und gleichzeitig die Fluoreszenzemission der CFP verringert. Die Überwachung dieser Verschiebung von CFP- zu YFP-Fluoreszenz liefert dann ein Maß für den Anstieg des Ca^2+-Niveaus. Zusätzlich zu diesen FRET-Sensoren sind einzelne fluoreszierende Protein (FP)-basierte Ca²⁺ Biosensoren wie GCaMP und R-GECO auch mit pflanzlichen Bildgebungsansätzen kompatibel und werden aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit und Benutzerfreundlichkeit häufig zur Untersuchung von [Ca²⁺]_{-Zytänderungen} verwendet^{25,26,27,28,29,30}. GCaMPs enthalten ein einzelnes zirkulär permutiertes (cp) GFP, das wiederum mit CaM und dem M13-Peptid verschmolzen ist. Die Ca^{2+-abhängige}Wechselwirkung zwischen CaM und M13 bewirkt eine Konformationsänderung im Sensor, die eine Verschiebung des Protonierungszustands des cpGFP fördert und sein fluoreszierendes Signal verstärkt. Wenn also die Ca^2+-Pegel steigen, nimmt das cpGFP-Signal zu.

Um die Dynamik von Ca²⁺ Signalen zu untersuchen, die als Reaktion auf mechanische Verwundung oder Pflanzenfresserfütterung erzeugt werden, haben wir transgene Arabidopsis thaliana Pflanzen verwendet, die eine GCaMP-Variante, GCaMP3, und ein Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop⁶exprimieren. Dieser Ansatz hat es geschafft, die schnelle Übertragung eines Ca 2+-Fernsignals von der Wundstelle auf^einem Blatt auf die gesamte Pflanze zu visualisieren. So wurde sofort ein Anstieg des^[Ca2+]_Zyts an der Wundstelle festgestellt, aber dieses Ca²⁺ Signal wurde dann innerhalb weniger Minuten nach der Verwundung durch das Gefäß durch die benachbarten Blätter verbreitet. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die Übertragung dieses schnellen systemischen Wundsignals in Arabidopsis-Pflanzen mit Mutationen in zwei Glutamatrezeptor-ähnlichen Genen, Glutamatrezeptor-like (GLR), GLR3.3 und GLR3.6⁶, aufgehoben wird. Die GLRs scheinen als aminosäuregesteuerte Ca²⁺ Kanäle zu fungieren, die an verschiedenen physiologischen Prozessen beteiligt sind, einschließlich Wundantwort^3,Pollenröhrenwachstum^31,Wurzelentwicklung^32,Kältereaktion³³und angeborene Immunität³⁴. Trotz dieser gut verstandenen, breiten physiologischen Funktion der GLRs sind Informationen über ihre funktionellen Eigenschaften, wie ihre Ligandenspezifität, Ionenselektivität und subzelluläre Lokalisation, begrenzt³⁵. Neuere Studien berichteten jedoch, dass GLR3.3 und GLR3.6 im Phloem bzw. Xylem lokalisiert sind. Pflanzliche GLRs haben Ähnlichkeiten mit ionotropen Glutamatrezeptoren (iGluRs)³⁶ bei Säugetieren, die durch Aminosäuren wie Glutamat, Glycin und D-Serin im Nervensystem von Säugetieren aktiviert werden³⁷. Tatsächlich haben wir gezeigt, dass die Anwendung von 100 mM Glutamat, aber nicht anderer Aminosäuren, an der Wundstelle ein schnelles, fernförmiges Ca²⁺ Signal in Arabidopsisinduziert, was darauf hindeutet, dass extrazelluläres Glutamat wahrscheinlich als Wundsignal in Pflanzen wirkt⁶. Diese Reaktion wird in der glr3.3/glr3.6-Mutante aufgehoben, was darauf hindeutet, dass Glutamat durch einen oder beide dieser rezeptorähnlichen Kanäle wirken könnte, und tatsächlich wurde kürzlich gezeigt, dass AtGLR3.6 durch diese Glutamatspiegel³⁸eingezäunt wird.

In Pflanzen wurde Glutamat neben seiner Rolle als strukturelle Aminosäure auch als wichtiger Entwicklungsregulator vorgeschlagen³⁹; seine räumliche und zeitliche Dynamik ist jedoch wenig verstanden. Genau wie für Ca²⁺wurden mehrere genetisch kodierte Indikatoren für Glutamat entwickelt, um die Dynamik dieser Aminosäure in lebenden Zellen zu überwachen^40,41. iGluSnFR ist ein GFP-basierter Single-FP-Glutamat-Biosensor, der aus cpGFP und einem Glutamat-bindenden Protein (GltI) aus Escherichia coli^42,43besteht. Die Konformationsänderung von iGluSnFR, die durch Glutamatbindung an GltI induziert wird, führt zu einer verstärkten GFP-Fluoreszenzemission. Um zu untersuchen, ob extrazelluläres Glutamat als Signalmolekül in der pflanzlichen Wundantwort wirkt, haben wir die iGluSnFR-Sequenz mit der grundlegenden Chitinase-Signalpeptidsekretionssequenz (CHIB-iGluSnFR) verbunden, um diesen Biosensor im apoplastischen Raum zu lokalisieren⁶. Dieser Ansatz ermöglichte die Abbildung von Veränderungen der apoplastischen Glutamatkonzentration ([Glu]_apo) mit transgenen Arabidopsis-Pflanzen, die diesen Sensor exprimieren. Wir haben einen schnellen Anstieg des iGluSnFR-Signals an der Wundstelle festgestellt. Diese Daten unterstützen die Idee, dass Glutamat bei der Verwundung aus den beschädigten Zellen / Geweben in den Apoplast austritt und als Schadenssignal wirkt, das die GLRs aktiviert und zum Fernsignal Ca²⁺ in Pflanzen⁶führt.

Hier beschreiben wir ein pflanzenweites Echtzeit-Bildgebungsverfahren mit genetisch kodierten Biosensoren zur Überwachung und Analyse der Dynamik von Fernsignalen von Ca²⁺ und extrazellulärem Glutamat als Reaktion auf Diebstwunden⁶. Die Verfügbarkeit von Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie und transgenen Pflanzen, die genetisch kodierte Biosensoren exprimieren, bietet einen leistungsstarken, aber leicht zu implementierenden Ansatz zur Erkennung schnell übertragener Fernsignale wie Ca²⁺ Wellen.

1. Pflanzenmaterialaufbereitung

1. In einer 1,5 ml Mikroröhrchen sterilisieren Sie die Samen der Arabidopsis thaliana (Col-0 Accession) Pflanze, die entweder GCaMP3 oder CHIB-iGluSnFR exprimiert, indem Sie mit 20% (v / v) NaClO für 3 min schütteln und dann 5 mal mit sterilem destilliertem Wasser waschen.
   HINWEIS: Die transgenen Linien von Arabidopsis, die GCaMP3 oder CHIB-iGluSnFR exprimieren, wurden zuvor beschrieben⁶.
2. Säen Sie in einer sterilen Haube 13 oberflächensterilisierte Samen auf einer 10 cm großen quadratischen Kunststoff-Petrischale, die mit 30 ml sterilem (autoklaviertem) Murashige und Skoog (MS) Medium gefüllt ist [1x MS-Salze, 1% (w/v) Saccharose, 0,01% (w/v) Myoinositol, 0,05% (w/v) MES und 0,5% (w/v) Gellangummi; pH 5,7 eingestellt mit 1N KOH]. Ersetzen Sie den Deckel und wickeln Sie ihn mit chirurgischem Klebeband ein.
3. Nach der Inkubation im Dunkeln bei 4 °C für 2 Tage die Platten horizontal bei 22 °C in eine Wachstumskammer unter Dauerlicht (90-100 μmol m^-2 s^-1) für ca. 2 Wochen vor Gebrauch legen. Zählen Sie nach 2 Wochen die Anzahl der Arabidopsis-Blätter von den ältesten bis zu den jüngsten⁴⁴ (Abbildung 1). Wundreaktionen bewegen sich vorzugsweise vom beschädigten Blatt (n) zu Blättern mit den Nummern n ± 3 und n ± 5⁶.
   HINWEIS: In diesem Protokoll wird die Petrischale geöffnet, um die Wund- und Glutamateffekte unter einem Fluoreszenzmikroskop abbilden zu können. Daher sollten nachfolgende Schritte in diesem Experiment unter temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten Raumbedingungen durchgeführt werden. Dies liegt daran, dass Ca²⁺ Signale auch durch Veränderungen dieser Umgebungsbedingungen ausgelöst werden. Es ist auch bekannt, dass das blaue Licht, das während der Aufzeichnung zur Anregung der Fluoreszenz des Biosensorproteins vom Mikroskop emittiert wird, eine Erhöhung der zytosolischen Ca²⁺ Konzentration⁴⁵ hervorrufen kann und daher die Pflanze vor Beginn des Experiments einige Minuten an die Blaulichtbestrahlung gewöhnt werden sollte.

2. Chemische Zubereitung

1. L-Glutamat in einem flüssigen Wachstumsmedium [1/2x MS-Salze, 1% (w/v) Saccharose und 0,05% (w/v) MES; pH 5,1 mit 1N KOH eingestellt] auflösen, um eine 100 mM Arbeitslösung herzustellen.
   HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von Glutamatsalzen wie Natriumglutamat, um mögliche kationenbedingte Auswirkungen auf die Ca²⁺ Dynamik zu verhindern.

3. Mikroskopeinstellung und Durchführung von Echtzeit-Bildgebung

1. Schalten Sie das motorisierte Fluoreszenz-Stereomikroskop ein, das mit einem 1x Objektiv (NA = 0,156) und einer sCMOS-Kamera(Abbildung 2)ausgestattet ist, und konfigurieren Sie die Geräteeinstellungen so, dass es mit einem 470/40 nm Anregungslicht bestrahlt und ein Emissionslicht durch einen 535/50 nm Filter erhält.
   HINWEIS: Jedes GFP-empfindliche Fluoreszenzmikroskop kann verwendet werden, um GCaMP3- und iGluSnFR-Signale in Echtzeit zu detektieren, aber ein Objektiv mit geringem Stromverbrauch und eine hochempfindliche Kamera mit einem breiten sCMOS-Chip werden empfohlen, um Signale von der gesamten Anlage zu erfassen. Das Low-Power-Objektiv ermöglicht die Abbildung der Reaktion einer gesamten Arabidopsis-Anlage und die Verwendung einer hochempfindlichen Kamera ermöglicht die schnelle Datenerfassung, die erforderlich ist, um den schnellen Zeitverlauf der wundauslösenden Ca²⁺ Welle zu erfassen. Für das in dieser Studie verwendete Fluoreszenzmikroskop betragen die maximalen Werte des Sichtfeldes und der zeitlichen Auflösung 3 cm x 3 cm bzw. 30 Bilder pro Sekunde (fps).
2. Entfernen Sie den Deckel und stellen Sie die Schüssel unter die Objektivlinse.
3. Überprüfen Sie das Fluoreszenzsignal der Pflanze und warten Sie dann ca. 30 Min im Dunkeln, bis die Pflanzen an die neuen Umweltbedingungen angepasst sind. Dieser Anpassungsschritt ist erforderlich, da Feuchtigkeitsänderungen [Ca²⁺]_{zytenerhöhungen} in Pflanzen hervorrufen, die alle wundbedingten Ereignisse stören können.
4. Stellen Sie den Fokus und die Vergrößerung ein, um die gesamte Pflanze im Sichtfeld zu sehen. Im aktuellen Protokoll wurde eine 0,63-fache Vergrößerung verwendet.
5. Bevor Sie mit der Echtzeit-Bildgebung beginnen, richten Sie die Erfassungsparameter ein, um die Fluoreszenzsignale mit einer Mikroskop-Bildgebungssoftware zu erkennen. Die Einstellungen für die Bildgebung im aktuellen Protokoll sind: Belichtungs- und Intervallzeiten auf 1,8 s bzw. 2 s (d. h. 0,5 fps) eingestellt. Stellen Sie die Aufnahmezeit auf 11 min ein.
6. Bild für 5 Minuten vor Beginn des Experiments, um die Pflanze an die Blaulichtbestrahlung des Mikroskops zu gewöhnen, und starten Sie dann die Aufnahme, indem Sie auf Jetzt ausführenoder den entsprechenden Befehl in der verwendeten Mikroskopsoftware verwenden. Um die durchschnittliche Ausgangsfluoreszenz zu bestimmen, zeichnen Sie mindestens 10 Frames (d. h. mindestens 20 s im aktuellen Protokoll) auf, bevor Sie gewickelt oder Glutamat auftragen (siehe Abschnitt 4).
   1. Zur Echtzeit-Bildgebung von wundinduzierten [Ca²⁺]_Zyt- und [Glu]_{Apo-Veränderungen} schneiden Sie den Blattstiel oder den mittleren Bereich des Blattes L1 mit einer Schere ab (Abbildung 3 und Abbildung 4).
   2. Für die Echtzeit-Bildgebung von Glutamat-ausgelösten [Ca²⁺]_{Zytveränderungen} schneiden Sie den Rand (ca. 1 mm von der Spitze entfernt) von Blatt 1 über die Hauptvene mit einer Schere. Nach mindestens 20 Minuten Erholungsphase 10 μL 100 mM Glutamat auf die Schnittfläche des Blattes auftragen (Abbildung 5).
      HINWEIS: Dieses Vorschneiden war notwendig, um Glutamat den Zugang zum Blattapoplasten zu ermöglichen, um Reaktionen auszulösen. Darüber hinaus erwies sich das Auftragen eines Tropfens destilliertem Wasser auf die Schnittoberfläche des Blattes L1 als kritisch, um zu verhindern, dass die Proben während der Erholung vor dem Auftragen von Glutamat austrocknen.
7. Nachdem Sie die 11-minütige Aufzeichnung abgeschlossen haben, speichern Sie die Daten.

4. Datenanalyse

1. Für die Analyse der Fluoreszenzintensität im Zeitverlauf definieren Sie einen Bereich von Interesse (ROI) an der Stelle, an der die Fluoreszenzintensität analysiert werden soll (Abbildung 6 und Abbildung 7). Definieren Sie für die Geschwindigkeitsberechnung der Ca²⁺ Welle 2 ROIs (ROI1 und ROI2) für die Analyse. Klicken Sie in der Bildgebungssoftware auf Zeitmessung | definieren | Kreis. Messen Sie den Abstand zwischen ROI1 und ROI2, indem Sie auf Anmerkungen und | Länge | Einfache Linie (Abbildung 6).
2. Messen Sie die Rohfluoreszenzwerte (F) in jedem ROI im Laufe der Zeit, indem Sie auf Messenklicken. Exportieren Sie Rohdaten in eine Tabellenkalkulationssoftware, um das Fluoreszenzsignal zu jedem Zeitpunkt in Zahlen umzuwandeln, indem Sie auf All to Excel | Exportieren.
3. Bestimmen Sie den Ausgangsfluoreszenzwert, der als F₀definiert ist, indem Sie den Durchschnitt von F über die ersten 10 Frames (d. h. vor der Behandlung) in den aufgezeichneten Daten berechnen.
4. Normalisieren Sie die F-Daten (durch Berechnung von ΔF/F) mit der Gleichung ΔF/F = (F−F₀)/F₀, wobei ΔF die zeitabhängige Änderung der Fluoreszenz ist.
5. Definieren Sie für die Ca²⁺ Wellengeschwindigkeitswellenanalyse einen signifikanten Signalanstiegspunkt über den vorstimulierten Werten als Nachweis einer Ca²⁺ Erhöhung in jedem ROI (t₁ und t₂) unter Verwendung des Kriteriums eines Anstiegs auf 2× der Standardabweichung (2x SD), die aus den F_0-Daten mit statistischer Software berechnet wird. 95% der F_0-Daten liegen innerhalb von 2x SD vom Mittelwert, was darauf hindeutet, dass ein Anstieg des Signals über diesem Niveau zufällig ≤5% beträgt. Berechnen Sie die Zeitdifferenz der Ca²⁺ Erhöhung zwischen ROI1 und ROI2 [t₂- t₁ Time-Lag (Δt)] und messen Sie den Abstand zwischen ROI1 und ROI2, dann bestimmen Sie die Geschwindigkeiten jeder Ca²⁺ Welle.

Die Signalausbreitung von [Ca2+]cyt und [Glu]apo als Reaktion auf Wunden ist in Abbildung 3, Abbildung 4, Movie S1und Movie S2dargestellt. Das Schneiden des Blattstiels 1 in Pflanzen, die GCaMP3 (bei 0 s) exprimierten, führte zu einem signifikanten Anstieg des [Ca2+]Zyts, der schnell lokal durch das Gefäß (bei 40 s) induziert wurde (Abbildung 3 und Film S1). Anschließend wurde das Signal innerhalb weniger Minuten (bei 80 s) schnell auf benachbarte Blätter (Blatt 3 und 6) übertragen(Abbildung 3 und Film S1).

Beim Schneiden von Blatt 1 in Pflanzen, die CHIB-iGluSnFR exprimieren, wurde ein schneller [Glu]Apo-Anstieg um die Schnittregion (bei 2 s) beobachtet. Dieses Signal wurde innerhalb weniger Minuten (bei 160 s) lokal durch das Gefäß übertragen, aber in systemischen Blättern nicht beobachtet (Abbildung 4 und Film S2).

Für die Echtzeit-Bildgebung der Ca 2+-Signalausbreitung, die durch die Anwendung von Glutamat ausgelöst wird, wurde der Rand (ca. 1 mm von der Spitze entfernt) von Blatt 1 in Pflanzen, die GCaMP3 exprimieren, wie in Abbildung 5A und Film S3gezeigt geschnitten. Das Schneiden der Kante von Blatt 1 verursachte einen lokalen [Ca2+]Zytanstieg (bei 40 s), aber dieses Signal verschwand innerhalb weniger Minuten (bei 124 s). Nach etwa 10 Minuten Wartezeit bis zur Erholung der Pflanze wurden 10 μL 100 mM Glutamat auf die Schnittfläche von Blatt 1 aufgetragen, was lokal (bei 56 s) zu einem schnellen, signifikanten Anstieg des [Ca2+]Cyt führte und eine Ausbreitung auf distale Blätter (bei 104 s) signalisierte(Abbildung 5B und Film S4).

Um die Veränderungen des [Ca2+]Zyts zu messen, die durch Eineundung im systemischen Blatt induziert werden, wurden zwei ROIs (ROI1 und ROI2) im Basisbereich und an der Blattspitze 6 in Pflanzen festgelegt, die GCaMP3 exprimieren, wie in Abbildung 6Agezeigt. Die zeitliche Verlaufsänderung der GCaMP3-Signalintensität in ROI1 und ROI2 beim Schneiden des Blattstiels von Blatt 1 wurde gemessen (Abbildung 6B). Ein signifikanter Anstieg des [Ca2+]Cyt bei ROI1 wurde früher als der roi2 festgestellt (Abbildung 6B). [Ca2+] Cyt erreichte nach der Verwundung einen Höhepunkt von etwa 100 s, dauerte über 10 Minuten und zeigte zwei Phasen (Abbildung 6B).

Zur Bestimmung der Geschwindigkeiten der Ca2+-Welle bei mechanischer Verwundung wurde der Zeitpunkt eines signifikanten Signalanstiegs über die vorstimulierten Werte in ROI1 und ROI2 bestimmt (Zeitverzögerung; siehe Abschnitt 4) (Abbildung 6C). Da der Abstand zwischen ROI1 und ROI2 in diesem Fall 2,7 mm betrug (Abbildung 6A), wurde die Ca2+ Signalgeschwindigkeit in Blatt 6 mit 0,15 mm/s berechnet. Um die[Glu]-Apo-Veränderungen als Reaktion auf die mechanische Beschädigung zu messen, wurde ROI1 in der Nähe der Schnittstelle des als L1 gekennzeichneten Blattes eingestellt, wie in Abbildung 7Agezeigt. [Glu] Die Apo-Signatur bei ROI1 hat einen einzigen Peak von etwa 100 s nach der Verwundung gezeigt (Abbildung 7B).

Abbildung 1: Nummerierung der Arabidopsis-Rosettenblätter. Arabidopsis Blätter sind von den ältesten bis zu den jüngsten nummeriert (linke Tafel). Ein schematisches Diagramm der Position der Blätter ist im rechten Feld angezeigt. L: Blatt, C: Keimblätter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Ein in dieser Studie verwendetes Fluoreszenzmikroskop. [Ca2+]Zyt- und [Glu]-Apodynamik wurden mit einem Weitfeld-Fluoreszenz-Stereomikroskop abgebildet. R: Fernbedienung, O: 1x Objektiv, C: sCMOS Kamera, T: Trinokular Kipprohr, S: Bühne, P: Pflanzenmaterial. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Wundinduzierte Fernsignalübertragung Ca2+. Das Schneiden des Blattstiels (weißer Pfeil, 0 s) von Blatt 1 (L1) in pflanzenexpressierendem GCaMP3 löste eine lokale [Ca2+]Zytenzunahme (roter Pfeil, 40 s) aus, die auf systemische Blätter [Blatt 3 (L3) und Blatt 6 (L6)] übertragen wurde (orange Pfeile, 80 s). Maßstabsleiste, 5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Wundauslösende [Glu]Apo-Erhöhung. Das Schneiden des Blattes 1 (L1) (weißer Pfeil, 0 s) in Pflanzen, die CHIB-iGluSnFR exprimieren, verursachte eine schnelle Erhöhung von [Glu]apo (roter Pfeil, 80 s), die sich durch das Gefäßsystem ausbreitete (oranger Pfeil, 160 s). Maßstabsleiste, 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Glutamat-ausgelöste Fernsignalübertragung Ca2+. (A) Schneiden der Kante (ca. 1 mm von der Spitze entfernt) von Blatt 1 (L1) in Pflanzen, die GCaMP3 (weißer Pfeil, 0 s) exprimieren, verursachte eine [Ca2+]Zyterhöhung (roter Pfeil, 40 s). (B) Die Anwendung von 100 mM Glutamat auf die Schnittfläche von L1 (weißer Pfeil, 0 s) verursachte eine lokale [Ca2+]Zytenzunahme (roter Pfeil, 56 s), die sich schnell auf distale Blätter [z. B. Blatt 3 (L3), Blatt 4 (L4) und Blatt 6 (L6)] ausbreitete (orange Pfeile, 104 s). Maßstabsbalken, 5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: [Ca2+]Zytensignatur in systemischen Blättern als Reaktion auf mechanische Wunden. (A) Ein erweitertes Bild von Blatt 6 (L6) in Pflanzen, die GCaMP3 exprimieren, ist in Abbildung 3dargestellt. ROI1 (blauer Kreis) und ROI2 (rosa Kreis) wurden an der Basis bzw. im Spitzenbereich festgelegt. Weißer Pfeil zeigt die Schnittstelle des Blattstiels 1 (L1) an. In diesem Fall betrug der Abstand zwischen ROI1 und ROI2 2,7 mm. (B) Quantifizierung der [Ca2+]Zytsignaturen in ROI1 und ROI2. Fluoreszenzintensitätsänderungen wurden mit Hilfe einer Bildgebungssoftware analysiert. (C) Eine erweiterte Spur von Daten in (B) zwischen 0 s und 80 s. Detektionspunkte einer Ca2+ Erhöhung des ROI1 und ROI2 wurden als t1 bzw.t2definiert, wobei als Kriterium ein Anstieg auf das 2-fache der Standardabweichung der Vorstimulationswerte (2x SD, gestrichelte Linie) herangezogen wurde. Der Wert von t2 - t1 wurde im aktuellen Protokoll als Time-Lag (Δt) definiert. Schwarzer Pfeil zeigt die Schnittzeit an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: [Glu]apo-Signatur als Reaktion auf mechanische Wunden. (A) Ein erweitertes Bild von Blatt 1 (L1) in Pflanzen, die CHIB-iGluSnFR exprimieren, ist in Abbildung 4 dargestellt. ROI1 wurde in der Nähe der Cut-Site eingestellt. Der weiße Pfeil zeigt den Schnittbereich an. (B) Die Quantifizierung der [Glu]Apo-Signatur im ROI1 wird mit Hilfe einer Bildgebungssoftware überwacht. Schwarzer Pfeil zeigt die Schnittzeit an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Film S1: Fernübertragung Ca2+ nach mechanischer Verwundung. Mechanische Wunden am Blattstiel von Blatt 1 (L1) verursachten einen [Ca2+]Zytanstieg, der auf distale Blätter übertragen wurde [z. B. Blatt 3 (L3) und Blatt 6 (L6)]. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Film S2: Erhöhung des apoplastischen Glutamatspiegels als Reaktion auf das Schneiden. Mechanische Verwundung des Blattes 1 (L1) verursachte eine sofortige Zunahme von [Glu]apo. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Film S3: Erhöhung der [Ca2+]Zytpegel als Reaktion auf das Schneiden. Mechanische Verwundungen am Rand von Blatt 1 (L1) verursachten eine sofortige, lokale [Ca2+]Zytenerhöhung. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Film S4: Anwendung von Glutamat löst systemische [Ca2+]Zyterhöhungen aus. Die Anwendung von 100 mM Glutamat löste eineCa2+-Übertragung auf systemische Blätter aus [z. B. Blatt 3 (L3), Blatt 4 (L4) und Blatt 6 (L6)]. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.