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Neuroscience

Un test sur plaque pour la mesure de la libération endogène de monoamine dans les tranches cérébrales aiguës

Published: August 11, 2021 doi: 10.3791/62127
Automatic Translation
*1, *2, 3, 2
1Department of Medicine, School of Medicine, Universidad de Atacama, 2Department of Molecular, Cellular, and Biomedical Sciences, City University of New York School of Medicine at City College, 3Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Cette méthode introduit une technique simple pour la détection de la libération endogène de monoamine à l’aide de tranches cérébrales aiguës. La configuration utilise une plaque de 48 puits contenant un support de tissu pour la libération de monoamine. La monoamine libérée est analysée par CLHP couplée à une détection électrochimique. De plus, cette technique fournit une méthode de dépistage pour la découverte de médicaments.

Abstract

Les neurotransmetteurs monoamines sont associés à de nombreuses affections neurologiques et psychiatriques. Des modèles animaux de telles conditions ont montré des altérations de la libération de neurotransmetteurs monoamines et de la dynamique d’absorption. Des méthodes techniquement complexes telles que l’électrophysiologie, la voltampérométrie cyclique à balayage rapide (FSCV), l’imagerie, la microdialyse in vivo, l’optogénétique ou l’utilisation de la radioactivité sont nécessaires pour étudier la fonction de la monoamine. La méthode présentée ici est une approche optimisée en deux étapes pour détecter la libération de monoamine dans les tranches cérébrales aiguës à l’aide d’une plaque de 48 puits contenant des supports de tissu pour examiner la libération de monoamine, et la chromatographie liquide à haute performance couplée à la détection électrochimique (HPLC-ECD) pour la mesure de la libération de monoamine. En bref, des coupes cérébrales de rats contenant des régions d’intérêt, y compris le cortex préfrontal, l’hippocampe et le striatum dorsal, ont été obtenues à l’aide d’un slicer tissulaire ou d’un vibratome. Ces régions d’intérêt ont été disséquées de tout le cerveau et incubées dans un tampon physiologique oxygéné. La viabilité a été examinée tout au long de la période expérimentale, par un essai de bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT). Les régions cérébrales disséquées de manière aiguë ont été incubées dans diverses conditions médicamenteuses connues pour induire la libération de monoamine par le transporteur (amphétamine) ou par l’activation de la libération vésiculeuse exocytotique (KCl). Après l’incubation, les produits libérés dans le surnageant ont été collectés et analysés à l’aide d’un système HPLC-ECD. Ici, la libération de monoamine basale est détectée par HPLC à partir de tranches cérébrales aiguës. Ces données corroborent les résultats in vivo et in vitro antérieurs montrant que l’AMPH et le KCl induisent la libération de monoamines. Cette méthode est particulièrement utile pour étudier les mécanismes associés à la libération dépendante du transporteur de monoamine et offre la possibilité de filtrer les composés affectant la libération de monoamine de manière rapide et peu coûteuse.

Introduction

Une pléthore de maladies neurologiques et psychiatriques sont associées à un dérèglement ou à un entretien insuffisant du neurotransmetteur monoamine (dopamine [DA], sérotonine [5-HT], noradrénaline [NE]) homéostasie1,2,3. Ces conditions comprennent, sans toutefois s’y limiter, la dépression1,2, la schizophrénie2, l’anxiété2, la dépendance4, la ménopause5,6,7, la douleur8 et la maladie de Parkinson3. Par exemple, plusieurs modèles de ménopause chez le rat ont montré que le dérèglement ou la réduction des monoamines dans l’hippocampe, le cortex préfrontal et le striatum peut être associé à la dépression et au déclin cognitif, ce qui est observé chez les femmes ménopausées. La dérégulation des monoamines dans ces modèles a été largement examinée à l’aide de HPLC-ECD, bien que les études n’aient pas fait de distinction entre la teneur mesurée en neurotransmetteurs et la libération de neurotransmetteurs5,6,7. Les monoamines sont classiquement libérées dans l’espace extracellulaire par libération vésiculeuse dépendante du Ca2+9 et sont recyclées par leur système de recapture de la membrane plasmique respectif (transporteur de dopamine, DAT; transporteur de sérotonine, SERT; transporteur de noradrénaline, NET)10,11. Inversement, les données suggèrent que ces transporteurs sont capables de libérer ou d’efflux des monoamines, puisque les drogues d’abus telles que l’amphétamine (AMPH) et la 3,4-méthylènedioxyméthamphétamine (MDMA) sont connues pour libérer du DA et du 5-HT, respectivement par le biais de leurs systèmes de transport12,13,14,15,16,17 . Ainsi, une bonne compréhension mécaniste de la dynamique de libération de monoamine est cruciale pour développer des pharmacothérapies spécifiques et ciblées.

Un large éventail de techniques ont été utilisées pour étudier la libération de monoamines telles que la voltampérométrie cyclique à balayage rapide (FSCV)18, la microdialyse in vivo13, l’imagerie19, la préincubation avec des monoamines radiomarquées20, l’optogénétique et, plus récemment, les capteurs fluorescents et la photométrie génétiquement codés21,22 . Le FSCV et la microdialyse in vivo sont les principales techniques utilisées pour étudier la libération de monoamines. Le FSCV est utilisé pour étudier la libération exocytotique stimulée de DA principalement dans les tranches cérébrales aiguës et in vivo23. Étant donné que le FSCV utilise des électrodes pour stimuler ou évoquer la libération, la principale source de libération de neurotransmetteurs est la libération vésiculeuse dépendante du Ca2+18,24,25,26,27,28,29,30,31 . La microdialyse in vivo couplée à la CLHP mesure les changements dans les niveaux de neurotransmetteurs extracellulaires à l’aide d’une sonde placée dans une zone d’intérêt cérébral13,32. Comme pour le FSCV, une limitation majeure de la microdialyse in vivo est la difficulté de déterminer la source de libération de neurotransmetteurs: libération vésiculeuse dépendante de Ca2+ ou dépendante du transporteur. Il convient de noter que les deux méthodes permettent de mesurer directement la libération de monoamine. Grâce aux progrès récents de l’optogénétique, la recherche démontre la détection de la libération de 5-HT et de DA dans un court laps de temps avec une spécificité de type cellulaire exquise21,22. Cependant, ces stratégies nécessitent des techniques et de l’équipement complexes et coûteux, et mesurent indirectement la libération de monoamine, en particulier par la liaison de la monoamine aux récepteurs. En outre, les monoamines radiomarquées sont également utilisées pour étudier la dynamique des monoamines. Les monoamines radiomarquées peuvent être préchargées dans divers systèmes modèles tels que les cellules hétérologues surexprimant chaque transporteur de monoamine20,33,34,35,36,37,38,39,40, les neurones primaires20, les synaptosomes33,39,41, 42, et des tranches de cerveau aiguës43,44. Cependant, la radioactivité présente des dommages potentiels pour l’expérimentateur, et les analytes marqués au tritium peuvent ne pas récapituler fidèlement la dynamique endogène de la monoamine45,46. Les systèmes de superfusion combinés à des méthodes de détection hors ligne telles que HPLC-ECD ont permis la détection de monoamines provenant de sources tissulaires multiples. Ici, ce protocole fournit une méthode optimisée et peu coûteuse, simple et précise utilisant des tranches cérébrales aiguës pour mesurer directement la libération endogène basale et stimulée de monoamine.

Les tranches cérébrales aiguës permettent de tester des hypothèses mécanistes, principalement car elles préservent le microenvironnement anatomique in vivo et maintiennent intactes les synapses47,48,49,50,51,52. Dans quelques études, des tranches cérébrales aiguës ou du tissu cérébral haché ont été utilisés en conjonction avec une technique de superfusion utilisant KCl pour stimuler la libération médiée par Ca2+53,54,55,56. Les systèmes de superfusion ont été essentiels pour faire progresser la compréhension du domaine des mécanismes de libération de neurotransmetteurs, y compris les monoamines. Cependant, ces systèmes sont relativement coûteux et le nombre de chambres disponibles pour l’analyse des tissus varie de 4 à 12. En comparaison, la méthode présentée ici est peu coûteuse, permet la mesure de 48 échantillons de tissus et peut être affinée pour utiliser jusqu’à 96 échantillons de tissus. Chaque puits dans la plaque de 48 puits contient des porte-tissus qui utilisent des filtres pour séparer le produit libéré du tissu, et les monoamines libérées sont ensuite collectées et analysées par HPLC-ECD. Il est important de noter que cette méthode permet de mesurer simultanément la libération de 5-HT, DA et NE de différentes zones du cerveau telles que le cortex préfrontal, l’hippocampe et le striatum dorsal après traitement avec des agents pharmacologiques qui modulent la libération de monoamine. Ainsi, l’expérimentateur peut répondre à plusieurs questions à l’aide d’un système multi-puits peu coûteux qui augmente le nombre d’échantillons testés et réduit ainsi le nombre d’animaux utilisés.

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Protocol

Toutes les expériences, y compris la manipulation des animaux et la collecte de tissus, ont été menées conformément à l’Université de Floride et au City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), conformément aux protocoles approuvés 201508873 (UF) et 1071 (CCNY). Pour les réactifs et la mémoire tampon, reportez-vous au fichier supplémentaire.

1. Préparez des tranches de cerveau de rat aiguës

REMARQUE: Dans cette expérience, des rats mâles adultes (250-350 g) ont été utilisés. Cependant, cette configuration est fonctionnelle pour différents points de développement, les rats femelles et d’autres espèces. Si vous utilisez un animal plus petit, comme des souris, l’expérimentateur peut s’ajuster pour optimiser le protocole en utilisant un nombre différent de tranches de cerveau ou de coups de poing par condition. Le tampon de dissection sera appelé tampon 1; Le tampon d’efflux sera appelé tampon 2.

  1. Préparez le tampon 1 comme indiqué dans le fichier supplémentaire. Saturer le tampon 1 avec de l’oxygène en bouillonnant à 95%/5% (O2/CO2) pendant 20 min sur glace. Retirer 50 mL de tampon 1 et laisser refroidir sur la glace dans un petit bécher ou une boîte de Pétri. Ce tampon est utilisé pour maintenir le cerveau entier récolté de manière aiguë.
  2. Anesthésiez un ou deux rats adultes (250-350 g) avec 1% à 2% d’isoflurane, décapitez-les à l’aide d’une guillotine et retirez rapidement leur cerveau. Placez immédiatement le cerveau dans le tampon oxygéné 1 glacé dans le récipient à partir de l’étape 1.1.
    REMARQUE: Assurez-vous que l’isoflurane et la guillotine sont utilisés en toute sécurité. Ouvrez l’isoflurane sous une hotte aspirante.
  3. À l’aide d’un vibratome ou d’un compresstome, coupez 300 μm de sections coronales du cerveau de chaque région d’intérêt (Figure 1). Le tampon bouillonnant 1 doit être présent pendant la fabrication des sections. À l’aide d’une spatule en acier inoxydable, transférez soigneusement et immédiatement les tranches de cerveau dans une nouvelle boîte de Pétri remplie de tampon 1 oxygéné glacé (Figure 2).
  4. Disséquez davantage les tranches de cerveau (p. ex., poinçons, découpes) en déplaçant soigneusement les tranches sur des lames de verre (figure 1G) à l’aide de l’atlas du cerveau de rat57. Par exemple, identifiez le striatum dorsal en fonction de sa structure sombre et striée, et identifiez l’hippocampe en fonction de sa proximité avec le cortex et de sa structure spirale unique. Les hémisphères droit et gauche peuvent être séparés pour être utilisés comme tranches témoins et expérimentales (figures 2G - H). Ici, le striatum dorsal a ensuite été disséqué en poinçons de 2 mm (Figure 1G).
  5. À l’aide d’une pipette de transfert en plastique avec la pointe coupée, transférez des tranches ou des poinçons cérébraux dans de petits récipients immergés dans le tampon 1 oxygéné glacé avec bouillonnement d’oxygène. Ces récipients peuvent être en treillis d’acier inoxydable ou de petites boîtes de Petri remplies de tampon (Figure 1H).

2. Libération ex-vivo de monoamine endogène à partir de tranches de cerveau ou de poinçons

REMARQUE : Le dispositif utilisé pour cette section se compose d’une plaque de 48 puits et d’un porte-tissu composé de six unités de filtre de microcentrifugation sans les filtres encastrés reliés à une ligne de carbogène (Figure 2). Pour fabriquer le support, utilisez une tige en plastique robuste (par exemple, d’un grattoir à cellules) et super collez les unités de filtre de microcentrifugation sans les filtres encastrés. Laissez sécher pendant 1-2 jours. Le temps nécessaire à l’expérience de libération endogène de monoamine et les concentrations d’amphétamine, de fluoxétine et de cocaïne sont basés sur la littérature actuelle et les protocoles précédents13,20,58.

  1. Activation tissulaire
    1. Transférer le tissu cérébral de l’étape 1.1.5 à chaque puits de la chambre d’efflux et permettre la récupération pendant 30 à 50 min à 37 °C sur un slide warmer dans 0,5-1 mL de tampon oxygéné 2, avec un bouillonnement constant et doux (Figure 2B1).
    2. Au cours de cette incubation, diluer les médicaments à la concentration souhaitée pour l’expérience. Tous les médicaments doivent être dissous dans le tampon 2, et les concentrations sont basées sur la littérature actuelle.
  2. Première incubation
    1. Déplacez le porte-tissu avec du tissu cérébral vers des puits contenant 500 μL de tampon oxygéné 2 et incubez pendant 20 min à 37 °C. Assurez-vous que peu ou pas de tampon est transporté en tapotant le support sur le bord du puits jusqu’à ce qu’aucun tampon excédentaire ne soit dans le support.
    2. Dans les expériences avec des agents pharmacologiques tels que les inhibiteurs du transporteur de monoamine, incuber les échantillons de tissus avec les médicaments dilués dans le tampon oxygéné 2 (par exemple, 10 μM de fluoxétine, 40 μM de cocaïne; voir la figure 2B2). Le volume final dans chaque puits sera de 500 μL.
  3. Deuxième incubation
    1. Déplacez le support avec le tissu vers un nouvel ensemble de puits contenant 500 μL de tampon 2 total avec ou sans la concentration souhaitée de chaque médicament. Assurez-vous qu’il ne reste pas de tampon en excès. Chaque puits représente un n = 1 pour les conditions expérimentales. Chaque condition expérimentale est réalisée en trois exemplaires.
    2. Un puits comprend un tampon oxygéné 2, le prochain AMPH de 10 à 30 μM et le puits final comprend un AMPH de 10 à 30 μM plus des inhibiteurs de transporteur de monoamine. Chaque médicament est dissous dans le tampon oxygéné 2.
    3. Incuber le tissu pendant 20 min à 37 °C avec 500 μL de la condition médicamenteuse.
      REMARQUE: Des puits supplémentaires peuvent inclure un tampon K + élevé oxygéné 2 avec ou sans les inhibiteurs du transporteur de monoamine. Dissoudre chaque médicament dans le tampon oxygéné 2 (500 μL).
    4. Au cours de cette deuxième incubation de 20 min, prélever la solution des puits de la première incubation à l’étape 2.2.1 et la transférer dans des tubes microcentrifuges contenant 50 μL d’acide perchlorique 1 N ou d’acide phosphorique (selon le type de CLHP, concentration finale 0,1 N). Le volume final de l’échantillon sera de 550 μL. Maintenir les tubes de microcentrifugation sur la glace et étiqueter les tubes #1.
    5. Après la deuxième incubation de 20 min, déplacez le porte-tissu avec des sections cérébrales ou des poinçons vers un puits vide et maintenez la plaque sur de la glace. Transférer le surnageant dans des tubes de microcentrifugation contenant 50 μL d’acide perchlorique 1 N ou d’acide phosphorique. Le volume final de l’échantillon sera de 550 μL. Maintenir les tubes de microcentrifugation sur la glace et étiqueter les tubes #2.
    6. Ajouter 1 mL de tampon glacé 1 à chaque puits contenant du tissu. Prélever tout le tissu à l’aide d’une petite pince à épiler et le transférer dans des tubes de microcentrifugation propres.
    7. Maintenir les tubes avec du tissu cérébral à -80 °C. Jetez les 1 mL de tampon 1 (Figure 2B4).
    8. Solutions filtrantes obtenues à partir de chaque incubation à l’aide de tubes filtrants en microcentrifugeuse (0,22 μm) à 2 500 x g pendant 2 min. Utilisez le filtrat pour déterminer la teneur en monoamine à l’aide de la CLHP avec détection électrochimique (Figure 2B5).

3. Viabilité des tissus

  1. Essai MTT
    REMARQUE: Une préoccupation importante concernant cette configuration expérimentale est la viabilité des tissus, car le tissu peut être utilisé jusqu’à plusieurs heures59. Un test MTT60,61 est utilisé pour déterminer la viabilité des tissus à la fin de l’expérimentation. Ce dosage est basé sur la conversion du sel de tétrazolium jaune MTT (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-bromure de diphényltétrazolium) en cristaux de formazan violet par des cellules viables ayant un métabolisme adéquat.
    1. Après l’expérience, maintenez un groupe distinct d’échantillons de tissus et séparez-les en deux groupes.
    2. Incuber un groupe pendant 20 min à 37 °C dans du Triton X-100 (1 %) dissous dans le tampon 2 comme témoin. Le traitement par Triton X-100 entraîne la mort cellulaire. Maintenir le deuxième groupe dans le tampon 2 et ne pas incuber dans Triton X-100 (contrôle de la viabilité tissulaire).
    3. Ajouter mtT (solution mère 5 mg/mL dans pbS, pH 7,4) aux deux groupes dans le tampon oxygéné 2 jusqu’à une concentration finale de 0,5 mg/mL.
    4. Incuber les échantillons de tissus pendant 20 min à 37 °C, laver avec du PBS et transférer dans des tubes de microcentrifugation contenant 250 μL d’un mélange de FDS (10 %, p/v), de DMF (25 %, v/v) et d’eau pour dissoudre les cristaux de formazan.
    5. Incuber les échantillons pendant 24 h.
    6. Centrifuger les tubes à 10 000 x g pendant 10 min et mesurer l’absorbance du surnageant (200 μL) à 562 nm et 690 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. La viabilité tissulaire est calculée comme suit : (A562-A690)/poids des tissus.

4. Analyse CLHP des monoamines

  1. Quantifier les rejets de monoamine de chaque condition expérimentale à l’aide de HPLC-ECD selon les protocoles précédents13,44, à l’aide d’une colonne de phase inverse.
    1. Préparez la phase mobile requise pour la détection. Il s’agit de 100 mM d’acide phosphorique, 100 mM d’acide citrique, 0,1 mM d’EDTA-Na2, 600 mg/L d’acide octanesulfonique, 8 % v/v d’acétonitrile (pH final de 6,0). La composition de la phase mobile dépend du type de CLHP et de la colonne utilisée.
    2. Réglez le potentiel du détecteur électrochimique (électrode de carbone vitreuse de 2 mm) sur 0,46 V et réglez le débit à 0,05 mL/ min.
    3. Chargez 5 μL de chaque échantillon, y compris les étalons de neurotransmetteurs, dans la CLHP pour l’auto-injection et la détection. La quantité de chaque échantillon ajouté dépend du type de CLHP utilisé.
    4. Une fois l’exécution de la CLHP terminée, utilisez le logiciel d’analyse HPLC donné pour acquérir et analyser les données du chromatographe.
    5. Analyser la teneur en monoamine à l’aide d’une courbe standard composée de chaque monoamine (Dopamine: DA, Noradrénaline: NE et Sérotonine: 5-HT; Figure 2C). Utilisez les chromatogrammes résultants pour obtenir l’aire sous la courbe (ASC) en fonction des directives du fabricant.

5. Préparation des lysats tissulaires pour la quantification des protéines

  1. Dosage des protéines
    1. Ajouter un tampon de lyse glacé et des inhibiteurs de la protéase (0,1 g/1 mL) à chaque tube de microcentrifugation contenant des sections cérébrales / poinçons et homogénéiser à l’aide d’un homogénéisateur de pilon. Les tubes de microcentrifugation doivent être maintenus sur la glace tout en homogénéisant pour éviter la dégradation des protéines.
    2. Incuber les homogénats tissulaires pendant 1 h à 4 °C avec une légère rotation.
    3. Le tissu centrifuge homogénéise à 16 000 x g pendant 15 min à 4 °C et récupère le surnageant.
    4. Déterminer la concentration en protéines dans les surnageants, avec l’albumine sérique bovine (BSA) comme norme.
    5. Normaliser la teneur en monoamine de chaque échantillon de cerveau à la teneur totale en protéines (μg) mesurée dans 250 μL de tissu cérébral lysé. Utilisez la formule ci-dessous pour déterminer la monoamine nmol / g de protéine. df = facteur de dilution.

Equation 1

6. Analyse statistique

  1. Analyser la libération de monoamine (nmol / g) à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle, suivie du test de comparaisons multiples de Sidak pour les comparaisons post-hoc.
  2. Analyser la viabilité des tissus à l’aide d’un test t de Unpaired Student pour des groupes indépendants (Contrôle vs 1% Triton X-100).
  3. Pour toutes les analyses statistiques, définissez le niveau alpha sur ≤ 0,05.

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Representative Results

Cette technique décrit l’utilisation de tranches cérébrales pour mesurer la libération de monoamines endogènes à l’aide de la CLHP avec détection électrochimique basée sur une plaque de 48 puits avec un support de tissu interne. La configuration expérimentale est illustrée à la figure 1 et à la figure 2. Initialement, pour assurer la viabilité des tissus à la fin de l’expérimentation, un essai MTT (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium bromure, un tétrazole) a été effectué. Après des expériences fonctionnelles, les tranches cérébrales aiguës sont métaboliquement actives et restent viables par rapport à celles qui sont incubées avec 1% de Triton X-100, une condition de mort cellulaire (Figure 3).

Le traitement aigu, 20 min, des sections cérébrales de l’hippocampe et du cortex préfrontal avec AMPH induit une augmentation significative des niveaux extracellulaires de chaque monoamine (Figure 4A,B). L’AMPH (30 μM) a augmenté le niveau de 5-HT extracellulaire des tranches de l’hippocampe et des tranches de cortex préfrontal de 220 fois et 64 fois, le NE extracellulaire de 19 fois et 8 fois, et le DA extracellulaire de 8 fois et 7 fois, respectivement. Des expériences similaires ont été réalisées en présence de fluoxétine (10 μM), un inhibiteur sélectif du recaptage de la sérotonine. L’inhibition du SERT avec la fluoxétine empêche l’augmentation du 5-HT extracellulaire induite par l’AMPH dans l’hippocampe et le cortex préfrontal. En revanche, la fluoxétine n’a pas d’impact sur l’effet de l’AMPH sur la DA extracellulaire ou le NE dans les mêmes zones du cerveau, ce qui correspond à sa sélectivité pour le SERT (Figure 4A,B). Toutes les conditions expérimentales ont été réalisées en trois exemplaires.

La libération de monoamines par des poinçons de striatum dorsaux de 2 mm a ensuite été mesurée. Le traitement aigu, 20 min, des poinçons de striatum dorsal avec AMPH (10 μM) induit une augmentation de 35 fois des niveaux extracellulaires de DA (Figure 4C) par rapport aux niveaux basaux. La détection de DA s’est concentrée dans le striatum dorsal en raison des niveaux basaux plus faibles de 5-HT et de NE précédemment signalés dans cette région62,63. Ainsi, l’AMPH induit une augmentation dose-dépendante mineure du 5-HT extracellulaire par rapport aux niveaux de DA extracellulaire induits par l’AMPH (données non montrées). L’incubation de poinçons de striatum dorsaux avec de la cocaïne (40 μM), un bloqueur de transport de monoamine, a entraîné une inhibition significative de la DA extracellulaire induite par l’AMPH par rapport aux poinçons incubés uniquement avec de l’AMPH (Figure 4C). Ces données corroborent en outre les résultats antérieurs indiquant que l’AMPH a induit l’efflux de DA par le biais de DAT16.

Enfin, pour démontrer la libération exocytotique de monoamines, des coupes cérébrales ont été incubées avec du KCl (40 mM). L’augmentation de la concentration de KCl extracellulaire pour évoquer la dépolarisation membranaire par incubation avec 40 mM de KCl est suffisante pour induire la libération exocytotique de monoamines par rapport aux conditions de contrôle (Figure 5). Ni la fluoxétine ni la cocaïne ne bloquent l’augmentation des niveaux extracellulaires de monoamines induite par la dépolarisation de la membrane KCl.

Figure 1
Figure 1: Préparation aiguë de tranches cérébrales et de sectionnement de rats. (A) Un cerveau de rat est placé dans une matrice cérébrale. Une coupe supérieure désigne le sommet du chiasme optique; la coupe inférieure est de 3 mm postérieure de la base de l’hypothalamus. Des coupes ont été faites pour enlever l’hippocampe et le striatum, et pour assurer une base horizontale pour coller l’échantillon à la compresse ou au vibratome en toute sécurité avant le tranchage. (B-D) La super colle a été étalée autour de la base de la scène, les cerveaux ont été collés, immédiatement recouverts d’agarose, et l’agarose a été solidifiée à l’aide de la pince congelée (D). (E-F) Un compresstome a été utilisé pour fabriquer des tranches de 300 μm pour le cerveau du rat, et les tranches ont été placées dans un tampon oxygéné jusqu’à leur utilisation. (G) Des sections ont été placées sur une glissière et des poinçons de 2 mm du striatum dorsal ont été effectués. (G) Les coups de poing du striatum dorsal (en haut), les découpes de l’hippocampe (au milieu) et les découpes du cortex (en bas) sont maintenus à 4 °C dans un tampon de dissection oxygéné avant de lancer des expériences fonctionnelles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Installation expérimentale pour l’expérience d’efflux. (A) La chambre d’efflux se compose d’une plaque de culture tissulaire de 48 puits et d’un plateau de support de tissu relié à la ligne de carbogène. (B) Un diagramme montrant la conception expérimentale de l’expérience d’efflux de monoamine endogène dans laquelle l’activation tissulaire (B1), la pré-incubation avec/sans inhibiteurs de transporteur de monoamine (B2), l’expérience d’efflux (B3) et le traitement final de l’échantillon sont présentés (B4-B5). (C) Le panneau de gauche représente un expérimentateur chargeant le perfusat dans la CLHP en préparation de l’auto-injection. Le panneau de droite montre un chromatogramme représentatif indiquant les pics standard de monoamine. L’aire sous la courbe (ASC) est mesurée pour chaque étalon de monoamine et échantillons de cerveau. Après étalonnage, l’ASC mesurée pour chaque échantillon de cerveau est convertie en concentration de nM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Les tranches cérébrales aiguës étaient viables à la fin de l’expérimentation. Un test MTT a été effectué pour déterminer la viabilité des tissus et comparé à Triton X-100 1%, qui induit la mort cellulaire. Le résultat du test MTT a montré qu’au bout de 6 h, les échantillons de tissus étaient toujours viables. Les résultats sont exprimés comme la moyenne ± SEM (N = 6). P < 0,0001, test t non apparié. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : L’amphétamine induit la libération de monoamine dans les tranches cérébrales aiguës de l’hippocampe, du cortex préfrontal et des coups de poing du striatum dorsal. (A-B) Les tranches de cortex hippocampique et préfrontal incubées dans 30 μM d’AMPH entraînent une augmentation significative de la libération de 5-HT, DA et NE. La fluoxétine inhibe de manière significative la libération de 5-HT, mais n’a aucun impact sur la libération de DA ou de NE dans ces régions. (C) Des poinçons de striatum dorsal de 2 mm ont été incubés dans de la cocaïne (40 μM) ou de l’AMPH (30 μM). La libération de DA stimulée par l’AMPH et le prétraitement avec de la cocaïne ont entraîné une réduction significative de la libération de DA induite par l’AMPH. Toutes les mesures sont exprimées en nmol/g de protéines. Les statistiques représentent une ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple de Sidak. Les résultats sont exprimés comme la moyenne ± SEM (N = 6). Les statistiques représentent une ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaison multiple de Sidak (** p = 0,01, *** p = 0,001, **** p = 0,0001). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Un K+ extracellulaire élevé entraîne la libération de monoamine par dépolarisation de la membrane. (A-B) KCl (40 mM) induit la dépolarisation membranaire et la libération des trois monoamines dans le HPC et le PFC. Dans les deux zones du cerveau, le prétraitement par la fluoxétine (10 μM) n’affecte pas l’effet du KCl sur la libération extracellulaire de monoamine. (C) Le KCl (40 mM) induit la dépolarisation membranaire et la libération de DA dans le striatum dorsal, et le prétraitement avec de la cocaïne (40 μM) n’affecte pas l’effet du KCl sur la libération de DA. Les statistiques représentent une ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple de Sidak. Les résultats sont exprimés comme la moyenne ± SEM (N = 6). Les statistiques représentent une ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaison multiple de Sidak (***p < 0,001, ****p < 0,0001). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire : Recettes de tampons et de solutions. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. 

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Discussion

Des mesures de libération de monoamine ont été effectuées pendant des années dans un certain nombre de systèmes tels que les cellules hétérologues, les cultures neuronales, les synaptosomes cérébraux, les tranches cérébrales aiguës ex vivo et les animaux entiers13,20,41,42,58,64,65,66,67,68 . De telles préparations ont permis au domaine des neurosciences d’explorer les mécanismes de libération de neurotransmetteurs de base qui pourraient conduire à la découverte de nouveaux agents pharmacologiques pour les troubles neurologiques et psychiatriques où les monoamines jouent un rôle. Malgré l’utilisation généralisée de ces méthodes, il existe certaines limites concernant la source et/ou la quantité de monoamine endogène libérée, en particulier dans les procédures radioactives. En outre, les préparations de tranches cérébrales aiguës ex vivo ont été largement utilisées en conjonction avec des approches électrophysiologiques, pharmacologiques, génétiques, moléculaires, immunocytochimiques et autres18,24,25,47,50,51,59,69,70 , car ils préservent l’architecture tissulaire et conservent à la fois l’activité neuronale et les connexions synaptiques. Ainsi, les tranches de cerveau offrent des avantages exceptionnels par rapport à d’autres modèles in vitro tels que les systèmes hétérologues, les neurones de culture primaire et les synaptosomes. En grande partie, leur avantage est que ces systèmes peuvent reproduire de nombreux aspects de l’environnement in vivo.

Les capteurs électrophysiologiques, optogénétiques, fluorescents et voltamétriques offrent une résolution temporelle et spatiale exquise pour examiner les mécanismes associés à la libération de monoamine, en particulier le DA. Cependant, la prémisse de base pour l’utilisation de ces approches est que la stimulation électrique ou induite par la lumière des neurones induit la libération vésiculaire exocytotique classique et bien documentée et bien documentée des neurotransmetteurs 18,21,22,24,27,30. L’une des limites les plus perceptibles de ces approches est que les monoamines libérées par d’autres mécanismes (c.-à-d. la libération non vésiculeuse) ne sont pas détectées par ces techniques. Des molécules de neurotransmetteurs radiomarquées ont également été utilisées pour étudier la libération de monoamines, mais cette approche présente des limites importantes. Les échantillons de cellules ou de tissus sont chargés de concentrations non physiologiques de neurotransmetteurs marqués qui ne récapitulent pas fidèlement l’environnement natif20,42,46. Fait intéressant, quelques études documentent l’utilisation de tranches de cerveau dans les systèmes de superfusion pour examiner la libération endogène de monoamine53,54,56. Cependant, ces études utilisent des neurotransmetteurs radioactifs, et celles qui examinent le neurotransmetteur endogène se concentrent uniquement sur K+ et les conditions non physiologiques pour induire la libération de neurotransmetteurs.

La méthode actuellement présentée peut être utilisée pour examiner la libération de monoamine médiée par le transporteur à partir de tissus natifs. Cela permet à l’expérimentateur de surmonter les limites des neurotransmetteurs tritiés. En outre, cette approche fournit une configuration simple pour mesurer plus précisément la libération endogène de monoamine grâce à une détection directe des monoamines plutôt qu’à la mesure indirecte lors de l’utilisation de capteurs fluorescents ou de monoamine radiomarquée. Il est bien établi que l’amphétamine agit comme un agent de libération transporteur de monoamine dans le cortex préfrontal71, le striatum dorsal56,72 et les régions cérébrales de l’hippocampe39. Ces résultats ont été confirmés à l’aide de ce système de plaques à 48 puits. En outre, cette méthode peut s’avérer être un complément aux méthodes actuellement utilisées qui mesurent la teneur totale en monoamine à l’aide de HPLC-ECD mais n’ont pas examiné la libération de monoamine5,6,7. Cette méthode fournit un nouvel aérateur conçu pour mesurer la libération endogène de monoamines à partir de tranches cérébrales aiguës en utilisant la CLHP couplée à la détection électrochimique.

Lors de l’utilisation de cette méthode, il est essentiel que les tissus cérébraux soient maintenus au froid dans un tampon oxygéné pendant l’expérience pour prévenir la détérioration. De plus, il est crucial que les tissus utilisés soient activés dans un tampon contenant de la pargyline pour empêcher la dégradation de la monoamine. En outre, l’expérimentateur peut avoir à dépanner plusieurs aspects de cette méthode. Tout d’abord, selon le point temporel de développement ou l’espèce de l’animal, il peut être nécessaire de créer des sections plus petites ou plus grandes ou d’utiliser plus ou moins de sections, de tranches ou de poinçons par condition. Deuxièmement, selon la région du cerveau d’intérêt, il y aura des quantités variables de chaque neurotransmetteur. Troisièmement, bien qu’il soit essentiel d’assurer un bouillonnement constant de l’oxygène lorsqu’il est noté, l’expérimentateur doit veiller à ne pas fournir d’oxygénation excessive, car cela pourrait entraîner l’enlèvement accidentel de tissus du puits. Enfin, comme il existe différents types de dispositifs HPLC et différentes colonnes de séparation, l’expérimentateur devra déterminer, sur la base de la littérature, quel dispositif ou colonne fonctionnerait le mieux pour son expérience.

Bien que cette méthode permette à l’expérimentateur d’obtenir rapidement et précisément des données ex vivo sur la libération de monoamines endogènes, il existe des limites à garder à l’esprit. Comme il s’agit d’une approche ex vivo, les réseaux et les connexions sont coupés, de sorte que les tranches ou les poinçons ne sont pas représentatifs d’un système intact. Une autre limitation importante de cette approche est l’absence de résolution temporelle et spatiale, car la libération de monoamine est mesurée sur une échelle de temps de quelques minutes et à partir d’une population de sites de libération. Le raffinement futur de l’approche pourrait permettre une optimisation de la résolution temporelle et spatiale. D’autres expériences examineront également les mécanismes associés aux événements de libération. Après avoir démontré la validité de la méthode actuelle, les expériences futures nécessiteront de disséquer les événements moléculaires conduisant à la libération de monoamine. D’autres expériences incluront un tampon d’efflux sans Ca2+ et des inhibiteurs sélectifs de la libération vésiculeuse comme témoins supplémentaires. Comme la distribution régionale des monoamines et de leurs transporteurs sont trois événements indépendants, les expériences futures doivent intégrer une pharmacologie plus étendue et une étude de cours dans le temps, car différentes conditions médicamenteuses peuvent nécessiter des temps d’incubation plus courts ou plus longs. Par exemple, en fonction de la distribution régionale ou du type de tissu utilisé, d’autres expériences peuvent utiliser des bloqueurs pharmacologiques plus spécifiques pour la TNE, le SERT ou le DAT, tels que la désipramine, la fluoxétine et le GBR12909, respectivement. De plus, bien que le tissu soit resté viable tout au long de l’expérience, l’expérimentateur n’est pas en mesure d’exclure la possibilité que la fonction de transporteur de monoamine ait pu être affectée pendant toute la durée du processus. L’équipement requis pour cette méthode est peu coûteux, cependant, il est nécessaire d’avoir accès à un HPLC-ECD coûteux. Cela peut être atténué par les installations de base, car beaucoup ont actuellement accès à des DPE HPLC pour un usage communautaire. Malgré ces limitations, la méthode actuelle fournit une procédure fondamentale, qui peut être manipulée davantage pour étudier la libération de monoamine.

En général, cette méthode fournit une procédure simple, à haut débit et à faible coût en deux étapes pour évaluer la libération simultanée de monoamines par les neurones de rongeurs adultes en utilisant des tranches cérébrales aiguës ex vivo de différentes régions du cerveau. Idéalement, cette méthode peut être combinée avec des protocoles in vivo, et elle fournit des données préliminaires permettant ainsi à l’expérimentateur de diminuer le nombre d’animaux requis dans les modèles in vivo, comme recommandé dans les « trois R » (remplacement, réduction et raffinement) du bien-être animal. Ainsi, il est possible de mettre en œuvre cette plateforme ex vivo pour le criblage de molécules potentiellement thérapeutiques dans le but de découvrir de nouveaux agents pharmacologiques pour le traitement des affections associées à la dérégulation de l’homéostasie de la monoamine.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucune divulgation.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions Fondecyt Initiation Fund N 11191049 à J.A.P. et niH grant DA038598 à G.E.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48 Well plate NA NA Assay
Acetonitrile Fischer Scientific A998-1 Mobile Phase
Calcium Chloride Ahydrous Sigma Aldrich C1016 Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Clarity Software Anetc
Citric Acid Sigma Aldrich Mobile Phase
D-(+)-Glucose Sigma 1002608421 Dissection Buffer
DMF Sigma Aldrich D4551 MTT Assay
EDTA-Na2 Sigma Aldrich Mobile Phase
GraphPad Software Graphpad Software, Inc Statistical Analysis
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Lysis buffer
HEPES Sigma Aldrich H3375 Lysis buffer
HPLC, Decade Amperometric Anetc HPLC, LC-EC system
HPLC Amuza HPLC HTEC-510.
L-Asrobic Acid Sigma Aldrich A5960 Dissection Buffer
Magnesium Sulfate Sigma 7487-88-9 KH Buffer
Microcentrifuge Filter Units UltraFree Millipore C7554 Assay - 6 to fit in 48 well plate
MTT Thermo Fisher M6494 MTT Assay
Nanosep VWR 29300-606 Assay; protein assay
Octanesulfonic acid Sigma Aldrich V800010 Mobile Phase
Pargyline Clorohydrate Sigma Aldrich P8013 Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Phosphoric Acid Sigma Aldrich Mobile Phase
Potassium Chloride Sigma 12636 KH Buffer
Potassium Phosphate Monobasic Sigma 1001655559 KH Buffer
Precisonary VF-21-0Z Precissonary Compresstome
Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich P2714 Lysis buffer.
Sodium Bicarbonate Sigma S5761 Dissection Buffer
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761 Dissection Buffer
Sodium Chloride Sigma S3014 KH Buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma Aldrich L3771 Lysis buffer
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787 MTT Assay / Lysis buffer

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References

  1. Jesulola, E., Micalos, P., Baguley, I. J. Understanding the pathophysiology of depression: From monoamines to the neurogenesis hypothesis model - are we there yet. Behavioural Brain Research. 341, 79-90 (2018).
  2. Krystal, J. H., D'Souza, D. C., Sanacora, G., Goddard, A. W., Charney, D. S. Current perspectives on the pathophysiology of schizophrenia, depression, and anxiety disorders. Medical Clinics of North America. 85 (3), 559-577 (2001).
  3. Barone, P. Neurotransmission in Parkinson's disease: beyond dopamine. European Journal of Neurology. 17 (3), 364-376 (2010).
  4. Howell, L. L., Kimmel, H. L. Monoamine transporters and psychostimulant addiction. Biochemical Pharmacology. 75 (1), 196-217 (2008).
  5. Kirshner, Z. Z., et al. Impact of estrogen receptor agonists and model of menopause on enzymes involved in brain metabolism, acetyl-CoA production and cholinergic function. Life Sciences. 256, 117975 (2020).
  6. Long, T., et al. Comparison of transitional vs surgical menopause on monoamine and amino acid levels in the rat brain. Molecular and Cellular Endocrinology. 476, 139-147 (2018).
  7. Long, T., et al. Estradiol and selective estrogen receptor agonists differentially affect brain monoamines and amino acids levels in transitional and surgical menopausal rat models. Molecular and Cellular Endocrinology. 496, 110533 (2019).
  8. Burke, N. N., et al. Enhanced nociceptive responding in two rat models of depression is associated with alterations in monoamine levels in discrete brain regions. Neuroscience. 171 (4), 1300-1313 (2010).
  9. Lane, J. D., Aprison, M. H. Calciumm-dependent release of endogenous serotonin, dopamine and norepinephrine from nerve endings. Life Sciences. 20 (4), 665-671 (1977).
  10. Ramamoorthy, S., Shippenberg, T. S., Jayanthi, L. D. Regulation of monoamine transporters: Role of transporter phosphorylation. Pharmacology and Therapeutics. 129 (2), 220-238 (2011).
  11. Torres, G. E., Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Plasma membrane monoamine transporters: structure, regulation and function. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (1), 13-25 (2003).
  12. Hilber, B., et al. Serotonin-transporter mediated efflux: A pharmacological analysis of amphetamines and non-amphetamines. Neuropharmacology. 49 (6), 811-819 (2005).
  13. Mauna, J. C., et al. G protein βγ subunits play a critical role in the actions of amphetamine. Translational Psychiatry. 9 (1), 81 (2019).
  14. Sitte, H. H., Freissmuth, M. Amphetamines, new psychoactive drugs and the monoamine transporter cycle. Trends in Pharmacological Sciences. 36 (1), 41-50 (2015).
  15. Johnson, L. A., Guptaroy, B., Lund, D., Shamban, S., Gnegy, M. E. Regulation of amphetamine-stimulated dopamine efflux by protein kinase C β. Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 10914-10919 (2005).
  16. Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (9), 3495-3500 (2005).
  17. Kantor, L., Hewlett, G. H. K., Gnegy, M. E. Enhanced amphetamine- and K+ -mediated dopamine release in rat striatum after repeated amphetamine: differential requirements for Ca 2+ - and calmodulin-dependent phosphorylation and synaptic vesicles. The Journal of Neuroscience. 19 (10), 3801-3808 (2018).
  18. Brodnik, Z. D., et al. Susceptibility to traumatic stress sensitizes the dopaminergic response to cocaine and increases motivation for cocaine. Neuropharmacology. 125, 295-307 (2017).
  19. Henke, A., et al. Toward serotonin fluorescent false neurotransmitters: development of fluorescent dual serotonin and vesicular monoamine transporter substrates for visualizing serotonin neurons. ACS Chemical Neuroscience. 9 (5), 925-934 (2018).
  20. Garcia-Olivares, J., et al. Gβγ subunit activation promotes dopamine efflux through the dopamine transporter. Molecular Psychiatry. 22 (12), 1673-1679 (2017).
  21. Xiao, N., Privman, E., Venton, B. J. Optogenetic control of serotonin and dopamine release in Drosophila larvae. ACS Chemical Neuroscience. 5 (8), 666-673 (2014).
  22. Bass, C. E., et al. Optogenetic control of striatal dopamine release in rats. Journal of Neurochemistry. 114 (5), 1344-1352 (2010).
  23. Stamford, J. A. Fast cyclic voltammetry: measuring transmitter release in "real time". Journal of Neuroscience Methods. 34 (1-3), 67-72 (1990).
  24. Brodnik, Z. D., Ferris, M. J., Jones, S. R., España, R. A. Reinforcing doses of intravenous cocaine produce only modest dopamine uptake inhibition. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 281-289 (2017).
  25. Brodnik, Z. D., España, R. A. Dopamine uptake dynamics are preserved under isoflurane anesthesia. Neuroscience Letters. 606, 129-134 (2015).
  26. Ferris, M. J., Calipari, E. S., Yorgason, J. T., Jones, S. R. Examining the complex regulation and drug-induced plasticity of dopamine release and uptake using voltammetry in brain slices. ACS Chemical Neuroscience. 4 (5), 693-703 (2013).
  27. Siciliano, C. A., Calipari, E. S., Ferris, M. J., Jones, S. R. Biphasic mechanisms of amphetamine action at the dopamine terminal. The Journal of Neuroscience The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (16), 5575-5582 (2014).
  28. Rice, M. E., et al. Direct monitoring of dopamine and 5-HT release in substantia nigra and ventral tegmental area in vitro. Experimental Brain Research. 100 (3), 395-406 (1994).
  29. Bunin, M. A., Prioleau, C., Mailman, R. B., Wightman, R. M. Release and uptake rates of 5-hydroxytryptamine in the dorsal raphe and substantia nigra reticulata of the rat brain. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1077-1087 (1998).
  30. Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).
  31. Park, J., Bhimani, R. V., Bass, C. E. In vivo electrochemical measurements of norepinephrine in the brain: current status and remaining challenges. Journal of the Electrochemical Society. 165 (12), 3051-3056 (2018).
  32. Butcher, S. P., Fairbrother, I. S., Kelly, J. S., Arbuthnott, G. W. Amphetamine-induced dopamine release in the rat striatum: an in vivo microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 50 (2), 346-355 (1988).
  33. Garcia-Olivares, J., et al. Inhibition of dopamine transporter activity by G protein βγ subunits. PLoS One. 8 (3), 1-9 (2013).
  34. Carneiro, A. M. D., Blakely, R. D. Serotonin-, protein kinase C-, and Hic-5-associated redistribution of the platelet serotonin transporter. Journal of Biological Chemistry. 281 (34), 24769-24780 (2006).
  35. Rajamanickam, J., et al. Akt-mediated regulation of antidepressant-sensitive serotonin transporter function, cell-surface expression and phosphorylation. The Biochemical Journal. 468 (1), 177-190 (2015).
  36. Egaña, L. A., et al. Physical and functional interaction between the dopamine transporter and the synaptic vesicle protein synaptogyrin-3. The Journal of Neuroscience The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (14), 4592-4604 (2009).
  37. Guptaroy, B., Fraser, R., Desai, A., Zhang, M., Gnegy, M. E. Site-directed mutations near transmembrane domain 1 alter conformation and function of norepinephrine and dopamine transporters. Molecular Pharmacology. 79 (3), 520-532 (2011).
  38. Ordway, G. A., et al. Norepinephrine transporter function and desipramine: Residual drug effects versus short-term regulation. Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 217-225 (2005).
  39. Steinkellner, T., et al. Amphetamine action at the cocaine- and antidepressant-sensitive serotonin transporter is modulated by CaMKII. Journal of Neuroscience. 35 (21), 8258-8271 (2015).
  40. Guptaroy, B., et al. A juxtamembrane mutation in the N terminus of the dopamine transporter induces preference for an inward-facing conformation. Molecular Pharmacology. 75 (3), 514-524 (2009).
  41. Carpenter, C., et al. Direct and systemic administration of a CNS-permeant tamoxifen analog reduces amphetamine-induced dopamine release and reinforcing effects. Neuropsychopharmacology. 42 (10), 1940-1949 (2017).
  42. Aquino-Miranda, G., Escamilla-Sánchez, J., González-Pantoja, R., Bueno-Nava, A., Arias-Montaño, J. -A. Histamine H3 receptor activation inhibits dopamine synthesis but not release or uptake in rat nucleus accumbens. Neuropharmacology. 106, 91-101 (2016).
  43. Reddy, I. A., et al. Glucagon-like peptide 1 receptor activation regulates cocaine actions and dopamine homeostasis in the lateral septum by decreasing arachidonic acid levels. Translational Psychiatry. 6 (5), 809 (2016).
  44. Koutzoumis, D. N., et al. Alterations of the gut microbiota with antibiotics protects dopamine neuron loss and improve motor deficits in a pharmacological rodent model of Parkinson's disease. Experimental Neurology. 325, 113159 (2020).
  45. Herdon, H., Strupish, J., Nahorski, S. R. Differences between the release of radiolabelled and endogenous dopamine from superfused rat brain slices: Effects of depolarizing stimuli, amphetamine and synthesis inhibition. Brain Research. 348 (2), 309-320 (1985).
  46. Thongsaard, W., Kendall, D. A., Bennett, G. W., Marsden, C. A. A simple method for measuring dopamine release from rat brain slices. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 37 (3), 143-148 (1997).
  47. Dorris, D. M., Hauser, C. A., Minnehan, C. E., Meitzen, J. An aerator for brain slice experiments in individual cell culture plate wells. Journal of Neuroscience Methods. 238, 1-10 (2014).
  48. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  49. Papouin, T., Haydon, P. Obtaining acute brain slices. BIO-PROTOCOL. 8 (2), 477-491 (2018).
  50. Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 5-9 (1995).
  51. Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. Journal of Neurochemistry. 13 (12), 1333-1343 (1966).
  52. Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4, 4-10 (2014).
  53. Kako, H., Fukumoto, S., Kobayashi, Y., Yokogoshi, H. Effects of direct exposure of green odour components on dopamine release from rat brain striatal slices and PC12 cells. Brain Research Bulletin. 75 (5), 706-712 (2008).
  54. McBride, W. J., Murphy, J. M., Lumeng, L., Li, T. -K. Effects of ethanol on monoamine and amino acid release from cerebral cortical slices of the alcohol-preferring P line of rats. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 10 (2), 205-208 (1986).
  55. Chen, J. C., Turiak, G., Galler, J., Volicer, L. Effect of prenatal malnutrition on release of monoamines from hippocampal slices. Life Sciences. 57 (16), 1467-1475 (1995).
  56. Becker, J. B., Castañeda, E., Robinson, T. E., Beer, M. E. A simple in vitro technique to measure the release of endogenous dopamine and dihydroxyphenylacetic acid from striatal tissue using high performance liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of Neuroscience Methods. 11 (1), 19-28 (1984).
  57. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. London. (2007).
  58. Dailey, J. W., Reith, M. E. A., Steidley, K. R., Milbrandt, J. C., Jobe, P. C. Carbamazepine-induced release of serotonin from rat hippocampus in vitro. Epilepsia. 39 (10), 1054-1063 (1998).
  59. Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4, 5309 (2014).
  60. Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice-A model for tauopathy studies. PLoS One. 7 (9), (2012).
  61. Rönicke, R., et al. AB mediated diminution of MTT reduction - An artefact of single cell culture. PLoS One. 3 (9), (2008).
  62. Ihalainen, J. A., Riekkinen, P., Feenstra, M. G. P. Comparison of dopamine and noradrenaline release in mouse prefrontal cortex, striatum and hippocampus using microdialysis. Neuroscience Letters. 277 (2), 71-74 (1999).
  63. Richards, D. A., Obrenovitch, T. P., Symon, L., Curzon, G. Extracellular dopamine and serotonin in the rat striatum during transient ischaemia of different severities: a microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 60 (1), 128-136 (1993).
  64. Fog, J. U., et al. Calmodulin kinase II interacts with the dopamine transporter C terminus to regulate amphetamine-induced reverse transport. Neuron. 51 (4), 417-429 (2006).
  65. Balázsa, T., Bíró, J., Gullai, N., Ledent, C., Sperlágh, B. CB1-cannabinoid receptors are involved in the modulation of non-synaptic [3H]serotonin release from the rat hippocampus. Neurochemistry International. 52 (1), 95-102 (2008).
  66. Schechter, L. E. The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 282 (1), 262-270 (1997).
  67. Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization. Molecular and Cellular Neuroscience. 39 (2), 211-217 (2008).
  68. Bowyer, J. F., et al. Interactions of MK-801 with glutamate-, glutamine- and methamphetamine-evoked release of [3H]dopamine from striatal slices. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 257 (1), 262-270 (1991).
  69. Perszyk, R. E., et al. GluN2D-containing N-methyl-D-aspartate receptors mediate synaptic transmission in hippocampal interneurons and regulate interneuron activity. Molecular Pharmacology. 90 (6), 689-702 (2016).
  70. Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 4029-4034 (1998).
  71. Jedema, H. P., Narendran, R., Bradberry, C. W. Amphetamine-induced release of dopamine in primate prefrontal cortex and striatum: striking differences in magnitude and timecourse. Journal of Neurochemistry. 130, 490-497 (2014).
  72. Buchmayer, F., et al. Amphetamine actions at the serotonin transporter rely on the availability of phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11642-11647 (2013).

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Un test sur plaque pour la mesure de la libération endogène de monoamine dans les tranches cérébrales aiguës
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Pino, J. A., Awadallah, N., Norris, A. M., Torres, G. E. A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices. J. Vis. Exp. (174), e62127, doi:10.3791/62127 (2021).

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