Methodenartikel

In vitro Analyse der E3-Ubiquitin-Ligase-Funktion

DOI:

10.3791/62393

⸱

14. Mai 2021

 ,  ,  , 
1Institute for Genetics and Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging Associated Diseases (CECAD), University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die vorliegende Studie liefert detaillierte In-vitro-Ubiquitylierungs-Assay-Protokolle für die Analyse der katalytischen Aktivität der E3-Ubiquitin-Ligase. Rekombinante Proteine wurden mit prokaryotischen Systemen wie der Escherichia coli-Kultur exprimiert.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die kovalente Bindung von Ubiquitin (Ub) an interne Lysinreste eines Substratproteins, ein Prozess, der als Ubiquitylierung bezeichnet wird, stellt eine der wichtigsten posttranslationalen Modifikationen in eukaryotischen Organismen dar. Die Ubiquitylierung wird durch eine sequentielle Kaskade von drei Enzymklassen vermittelt, darunter Ubiquitin-aktivierende Enzyme (E1-Enzyme), Ubiquitin-konjugierende Enzyme (E2-Enzyme) und Ubiquitin-Ligasen (E3-Enzyme) und manchmal Ubiquitin-Ketten-Dehnungsfaktoren (E4-Enzyme). Hier werden In-vitro-Protokolle für Ubiquitylierungsassays bereitgestellt, die die Beurteilung der E3-Ubiquitin-Ligase-Aktivität, die Zusammenarbeit zwischen E2-E3-Paaren und die Substratauswahl ermöglichen. Kooperierende E2-E3-Paare können durch Überwachung der Erzeugung freier Poly-Ubiquitin-Ketten und/oder der Autoubiquitylierung der E3-Ligase gescreent werden. Die Substratubiquitylierung wird durch selektive Bindung der E3-Ligase definiert und kann durch Western Blotting der In-vitro-Reaktion nachgewiesen werden. Weiterhin wird ein E2~Ub Entladungsassay beschrieben, der ein nützliches Werkzeug zur direkten Beurteilung der funktionellen E2-E3 Kooperation ist. Dabei folgt der E3-abhängige Transfer von Ubiquitin aus dem entsprechenden E2-Enzym auf freie Lysin-Aminosäuren (Nachahmung der Substrat-Ubiquitylierung) oder interne Lysine der E3-Ligase selbst (Auto-Ubiquitylierung). Zusammenfassend werden drei verschiedene In-vitro-Protokolle bereitgestellt, die schnell und einfach durchzuführen sind, um die katalytische Funktionalität der E3-Ligase zu adressieren.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ubiquitylierung ist der Prozess, bei dem Ub kovalent an einSubstratprotein 1gebunden ist. Die Ub-Modifikation wird durch aufeinanderfolgende enzymatische Reaktionen katalysiert, die die Wirkung von drei verschiedenen Enzymklassen beinhalten, d.h.Ub-aktivierende Enzyme (E1s), Ub-konjugierende Enzyme (E2s), Ub-Ligasen (E3s) und möglicherweise Ub-Ketten-Dehnungsfaktoren (E4s)2,3,4,5. Nach Adenosintriphosphat (ATP)- undMagnesium (Mg2+)-abhängiger Aktivierung von Ub durch E1 greift das aktive Zentrum Cy....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Herstellung von Puffern und Reagenzien

HINWEIS: Puffer und Reagenzien, die manuell im Labor hergestellt wurden, sind unten aufgeführt. Alle anderen Puffer und Reagenzien, die in den Protokollen verwendet wurden, wurden aus verschiedenen Quellen gekauft und gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet.

  1. 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x PBS) zubereiten. Zu diesem Zweck mischen Sie 1,37 M Natriumchlorid (NaCl), 27 mM Kaliumchlorid (KCl), 80 mM Dinatrium-Wasserstoffphosphat-Dihydrat(Na2HPO4,2H2O) und 20 mM Kaliumdihydrogenphosphat(KH2PO4) in 1 L doppeldestilliertemH2O

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um E2-Enzyme zu identifizieren, die mit dem Ubiquitin-Ligase-CHIP zusammenarbeiten, wurde ein Satz von E2-Kandidaten in einzelnen In-vitro-Ubiquitylierungsreaktionen getestet. Kooperierende E2-E3-Paare wurden durch die Bildung von E3-abhängigen Ubiquitylierungsprodukten, d.h.Autoubiquitylierung der E3-Ligase und die Bildung von freien Ub-Polymeren, überwacht. Die Ubiquitylierungsprodukte wurden durch Western Blotting analysiert. Die Dateninterpretation basiert auf dem Größenvergleich der resultierenden .......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Beitrag beschreibt grundlegende In-vitro-Ubiquitylierungsmethoden für die Analyse der E3-Ligasefunktion. Bei der Durchführung von In-vitro-Ubiquitylierungsassayles sollte berücksichtigt werden, dass einige E2-Enzyme aufgrund des Angriffs ihres aktiven Cysteins auf ihre eigenen Lysinreste, die sich in unmittelbarer Nähe des aktiven Zentrums befinden, eine Autoubiquitylierung durchführen können30. Um dieses Problem zu umgehen, empfiehlt sich der Einsatz einer E2-Mutante, be.......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken den Mitgliedern unseres Labors für die kritische Diskussion und hilfreiche Beratung zum Manuskript. Wir entschuldigen uns dafür, dass wir aufgrund von Größenbeschränkungen keine wertvollen Beiträge zitiert haben. Diese Arbeit wird gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - SFB 1218 - Projektnummer 269925409 und Exzellenzcluster EXC 229/ CECAD bis TH. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer 269925409 to T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 39....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Amershan Protran 0.1 & Mikro; m NCGE Healthcare10600000Nitrozellulosemembran
Anti-CHIPCell Signaling2080Monoklonaler Kaninchen-Anti-CHIP-Antikörper, Klon C3B6
Anti-MYCRocheOP10Monoklonaler Maus-Anti-MYC-Antikörper, Klon 9E10
Anti-UbiquitinUpstate05-944Monoklonaler Maus-Anti-Ub-Antikörper, Klon P4D1-A11
ApyraseSigmaA6535-100UN
ATP (10x)Enzo12091903
BSASigmaA6003-10G
EDTARoth8043.2
KClRoth6781.1
K2HPO4RothP749.2
KH2PO4Roth3904.1
LDS Probenpuffer (4x)novexB0007
L-LysinSigmaL5501-5G
MESRoth4256.4
MeOHVWR Chemicals2,08,47,307100%
MilchpulverRothT145.3
NaClRothP029.3
NuPAGE AntioxidationsmittelInvitrogenNP0005
NuPAGE Transfer Puffer (20x)NovexNP0006-1
Seitenlineal plusThermo Fisher26619Proteinleiter
RotiBlockRothA151.1Blockierungsreagenz
SDS (20%)Roth1057.1
S1000 ThermocyclerBio Rad1852196
Trans-Blot TurboBio Rad1704150EDUTransfersystem
Tris-BaseRoth4855.3
Tween 20Roth9127.2
UbcH EnzymsatzBostonBiochemK-980BE2
Enzyme UbiquitinBostonBiochemU-100H
Ubiquitin-aktivierendes Enzym E1EnzoBML-UW941U-0050
Ubiquitylierungspuffer (10x)EnzoBML-KW9885-001
Whatman LöschpapierBio Rad1703969Extra dickes Filterpapier

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains. Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).
  2. Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3),....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

In vitro UbiquitinierungUbiquitin TransferE2 Enzymspezifit tSubstrat UbiquitinierungAuto Ubiquitinierungs AssayLysin Entladungs AssayWestern BlottingPolyubiquitinkettenUbiquitin Ligase Aktivit t

Verwandte Artikel