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Methodenartikel

In vitro Analyse der E3-Ubiquitin-Ligase-Funktion

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DOI:

10.3791/62393

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14. Mai 2021

 ,  ,  , 
1Institute for Genetics and Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging Associated Diseases (CECAD), University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die vorliegende Studie liefert detaillierte In-vitro-Ubiquitylierungs-Assay-Protokolle für die Analyse der katalytischen Aktivität der E3-Ubiquitin-Ligase. Rekombinante Proteine wurden mit prokaryotischen Systemen wie der Escherichia coli-Kultur exprimiert.

Zusammenfassung

Die kovalente Bindung von Ubiquitin (Ub) an interne Lysinreste eines Substratproteins, ein Prozess, der als Ubiquitylierung bezeichnet wird, stellt eine der wichtigsten posttranslationalen Modifikationen in eukaryotischen Organismen dar. Die Ubiquitylierung wird durch eine sequentielle Kaskade von drei Enzymklassen vermittelt, darunter Ubiquitin-aktivierende Enzyme (E1-Enzyme), Ubiquitin-konjugierende Enzyme (E2-Enzyme) und Ubiquitin-Ligasen (E3-Enzyme) und manchmal Ubiquitin-Ketten-Dehnungsfaktoren (E4-Enzyme). Hier werden In-vitro-Protokolle für Ubiquitylierungsassays bereitgestellt, die die Beurteilung der E3-Ubiquitin-Ligase-Aktivität, die Zusammenarbeit zwischen E2-E3-Paaren und die Substratauswahl ermöglichen. Kooperierende E2-E3-Paare können durch Überwachung der Erzeugung freier Poly-Ubiquitin-Ketten und/oder der Autoubiquitylierung der E3-Ligase gescreent werden. Die Substratubiquitylierung wird durch selektive Bindung der E3-Ligase definiert und kann durch Western Blotting der In-vitro-Reaktion nachgewiesen werden. Weiterhin wird ein E2~Ub Entladungsassay beschrieben, der ein nützliches Werkzeug zur direkten Beurteilung der funktionellen E2-E3 Kooperation ist. Dabei folgt der E3-abhängige Transfer von Ubiquitin aus dem entsprechenden E2-Enzym auf freie Lysin-Aminosäuren (Nachahmung der Substrat-Ubiquitylierung) oder interne Lysine der E3-Ligase selbst (Auto-Ubiquitylierung). Zusammenfassend werden drei verschiedene In-vitro-Protokolle bereitgestellt, die schnell und einfach durchzuführen sind, um die katalytische Funktionalität der E3-Ligase zu adressieren.

Einleitung

Ubiquitylierung ist der Prozess, bei dem Ub kovalent an einSubstratprotein 1gebunden ist. Die Ub-Modifikation wird durch aufeinanderfolgende enzymatische Reaktionen katalysiert, die die Wirkung von drei verschiedenen Enzymklassen beinhalten, d.h.Ub-aktivierende Enzyme (E1s), Ub-konjugierende Enzyme (E2s), Ub-Ligasen (E3s) und möglicherweise Ub-Ketten-Dehnungsfaktoren (E4s)2,3,4,5. Nach Adenosintriphosphat (ATP)- undMagnesium (Mg2+)-abhängiger Aktivierung von Ub durch E1 greift das aktive Zentrum Cystein von E1 das C-terminale Glycin von Ub an und bildet einen Thioesterkomplex (Ub~E1). Die aus der ATP-Hydrolyse gewonnene Energie bewirkt, dass der Ub einen hochenergetischen Übergangszustand erreicht, der während der folgenden Enzymkaskade aufrechterhalten wird. Als nächstes überträgt das E2-Enzym das aktivierte Ub auf sein internes katalytisches Cystein und bildet dadurch eine transiente Ub~ E2-Thioesterbindung. Anschließend wird Ub auf das Substratprotein übertragen.

Dies kann auf zwei Arten geschehen. Entweder kann die E3-Ligase zuerst an E2 binden, oder die E3-Ligase kann Ub direkt binden. Der letztere Weg führt zur Bildung eines E3 ~ Ub-Zwischenprodukts. In beiden Fällen ist Ub mit dem Substratprotein durch Bildung einer Isopeptidbindung zwischen der C-terminalen Carboxylgruppe von Ub und der Lysin-Ɛ-Aminogruppe desSubstrats 6verbunden. Das menschliche Genom kodiert für zwei E1s, etwa 40 E2s und mehr als 600 mutmaßliche Ubiquitinligosen7. Basierend auf dem Ub-Transfermechanismus des E3 werden Ub-Ligasen in drei Kategorien unterteilt, darunter Homolog zum E6AP C-Terminus (HECT)-Typ, Really Interesting New Gene (RING) / U-Box-Typ und RING zwischen RING (RBR) -TypLigasen 8. In dieser Studie wird die Ligase enthaltende U-Box, Carboxyl Terminus of HSC70-interacting Protein (CHIP), als repräsentatives E3-Enzym verwendet. Im Gegensatz zu E3-Enzymen vom HECT-Typ, die Ub~E3-Thioester bilden, bindet die U-Box-Domäne von CHIP E2~Ub und fördert den anschließenden Ub/Substrat-Transfer direkt vom E2-Enzym8,9. Basierend auf der Bedeutung der U-Box für die enzymatische Funktion wird eine inaktive CHIP U-Box-Mutante, CHIP(H260Q), als Kontrolle verwendet. CHIP(H260Q) bindet nicht an seine verwandten E2s und verliert somit seine E3-Ligaseaktivität10.

Die Proteinubiquitylierung spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung einer Vielzahl zellulärer Ereignisse in eukaryotischen Zellen. Die Vielfalt der zellulären Ergebnisse, die durch die reversible Bindung von Ub-Molekülen an Substratproteine gefördert werden, kann auf die molekularen Eigenschaften von Ub zurückgeführt werden. Da Ub selbst sieben Lysin (K)-Reste zur weiteren Ubiquitylierung enthält, gibt es eine reiche Vielfalt an Ub-Kettentypen mit unterschiedlichen Größen und/oder Topologien11. Zum Beispiel können Substrate durch ein einzelnes Ub-Molekül an einem (Mono-Ubiquitylierung) oder mehreren Lysinen (Multi-Mono-Ubiquitylierung) und sogar durch Ub-Ketten (Poly-Ubiquitylierung) modifiziert werden11. Ub-Ketten werden entweder homo- oder heterotypisch über die gleichen oder unterschiedliche Lysinreste von Ub gebildet, was sogar zu verzweigten Ub-Ketten führen könnte9. Somit führt die Proteinubiquitylierung zu vielfältigen Anordnungen von Ub-Molekülen, die spezifische Informationen liefern, z.B.für den Abbau, die Aktivierung oder die Lokalisation konjugierter Proteine12,13. Diese unterschiedlichen Ub-Signale ermöglichen eine schnelle Reprogrammierung zellulärer Signalwege, was eine wichtige Voraussetzung für die Fähigkeit der Zelle ist, auf sich ändernde Umweltbedürfnisse zu reagieren.

Ein zentraler Aspekt der Ubiquitylierung bezieht sich auf die Proteinqualitätskontrolle. Fehlgefaltete oder irreversibel geschädigte Proteine müssen abgebaut und durch neu synthetisierte Proteine ersetzt werden, um die Proteinhomöostase oder Proteostase aufrechtzuerhalten14. Die Qualitätskontrolle E3 Ligase, CHIP, arbeitet mit molekularen Chaperonen beim Ub-abhängigen Abbau geschädigter Proteine9,15,16,17. Darüber hinaus reguliert CHIP die Stabilität des Myosin-gerichteten Chaperons UNC-45B (Unc-45 Homolog B), das eng auf die Muskelfunktion abgestimmt ist und Abweichungen von den optimalen Werten führen zur menschlichen Myopathie18,19,20,21. Der Abbau von UNC-45B durch das 26S-Proteasom wird durch Anheftung einer K48-verknüpften Poly-Ub-Kette9vermittelt. In Abwesenheit von Substratproteinen führt CHIP eine Autoubiquitylierung10,22,23durch,die für die RING/ U-Box E3-Ubiquitinligosen24,25 charakteristisch ist und die Ligaseaktivitätreguliert 26. Die Anwendung der in diesem Artikel beschriebenen In-vitro-Ubiquitylierungs-Assay-Methoden trug dazu bei, E2-Enzyme systematisch zu identifizieren, die sich mit CHIP zusammenschließen, um die Bildung freier Poly-Ub-Ketten und/oder die Autoubiquitylierung von CHIP zu fördern (Protokollabschnitt 2). Weiterhin wurde eine CHIP-abhängige Ubiquitylierung von UNC-45B beobachtet, welches ein bekanntes Substrat der E3-Ligase18,19 ist (Protokollabschnitt 3). Letztlich wurde die CHIP-abhängige Übertragung von aktiviertem Ub vom Ub~E2-Thioester überwacht (Protokollabschnitt 4).

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Protokoll

1. Herstellung von Puffern und Reagenzien

HINWEIS: Puffer und Reagenzien, die manuell im Labor hergestellt wurden, sind unten aufgeführt. Alle anderen Puffer und Reagenzien, die in den Protokollen verwendet wurden, wurden aus verschiedenen Quellen gekauft und gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet.

  1. 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x PBS) zubereiten. Zu diesem Zweck mischen Sie 1,37 M Natriumchlorid (NaCl), 27 mM Kaliumchlorid (KCl), 80 mM Dinatrium-Wasserstoffphosphat-Dihydrat(Na2HPO4,2H2O) und 20 mM Kaliumdihydrogenphosphat(KH2PO4) in 1 L doppeldestilliertemH2O(ddH2O). Autoklavieren Sie die 10x PBS und bereiten Sie eine 1x PBS-Lösung in ddH2O vor.
    1. Das Autoklavieren wird für 15 min bei 121 °C und 98,9 kPa durchgeführt.
      HINWEIS: Das Autoklavieren wird unter diesen Bedingungen für alle Puffer und Lösungen durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, werden Lösungen bei Raumtemperatur (RT) gelagert.
  2. Bereiten Sie 1 L PBS-Tween (PBS-T) Lösung vor, indem Sie 0,1% Tween zu 1 L 1x PBS hinzufügen.
  3. 10 mL einer 0,5 M L-Lysin-Stammlösung durch Lösen von L-Lysin in ddH2O. Aliquot L-Lysin in 1 ml Portionen herstellen und bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung lagern.
    HINWEIS: L-Lysin kann eingefroren und wiederholt aufgetaut werden.
  4. Herstellen einer 0,25 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung durch Lösen von EDTAin 200 ml ddH2O.
    1. Stellen Sie den pH-Wert mit Natriumhydroxid (NaOH) auf 8,0 ein.
    2. Stellen Sie die Lautstärke mit ddH 2 O auf250ml ein.
    3. Autoklavieren Sie die Lösung.
  5. 10 ml einer 20 mg/ml Rinderserumalbuminlösung (BSA) durch Lösen von BSA in ddH2O herstellen. Bei -20 °C in 200 μL Aliquots lagern.
    HINWEIS: BSA kann wiederholt eingefroren und aufgetaut werden.
  6. 1 l 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES)Laufpuffer durch Lösen von 50 mM MES, 50 mM Tris-Base, 3,47 mM Natriumdodecylsulfat (SDS) und 1,03 mM EDTA in 0,9 lddH2O herstellen. Stellen Sie nach dem richtigen Mischen die Lautstärke auf 1 L ein.
    1. Der pH-Wert des 1x-Puffers beträgt 7,6. Stellen Sie den pH-Wert nicht mit Säure oder Base ein.
  7. Bereiten Sie 200 ml Blocklösung (5% Milch) vor, indem Sie 10 g Milchpulver in 1x PBS-T auflösen. Lagern Sie die Sperrlösung bei 4 °C bis zu einer Woche.
  8. Bereiten Sie 1 L Transferpuffer (siehe Materialtabelle)gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
  9. 2x SDS-Probenpuffer durch Lösen von 125 mM Tris-Base, 4% SDS, 4% Glycerin, 0,03% Bromphenolblau und 50 μL/ml β-Mercaptoethanol in 50 mLddH2O. Aliquot in 1 ml Portionen auflösen und bei -20 °C bis zur Verwendung lagern.

2. In-vitro-Autoubiquitylierungsassayt

  1. Assay-Vorbereitung und -Durchführung
    1. Berechnen Sie das Volumen jedes Reagenzes, das pro Reaktion benötigt wird, basierend auf den gegebenen Molaritäten der Proteine und den Proteinkonzentrationen der Proteinlösungen. Verwenden Sie pro Autoubiquitylierungsreaktion 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3 und 50 μM Ub. Stellen Sie das Volumen der Reaktion mit ddH 2 O auf20 μLein.
      HINWEIS: ATP-Lösung und Ubiquitylierungspuffer wurden als 10x Stammlösungen gekauft und bei 1x verwendet.
    2. Bereiten Sie ein Pipettierschema für alle Reaktionen vor. Testen Sie neun verschiedene E2-Enzyme auf ihre Funktionsfähigkeit (I) mit CHIP, (II) mit einer katalytisch inaktiven CHIP(H260Q)-Mutante und (III) ohne CHIP in einzelnen Ubiquitylierungsreaktionen.
    3. Um Pipettierfehler zu vermeiden, bereiten Sie eine Mastermischung auf Eis vor, die das für alle Reaktionen erforderliche Volumen plus eine zusätzliche Reaktion enthält. Berechnen Sie die Menge an Master-Mix, die pro Reaktion benötigt wird.
      HINWEIS: Master-Mix-Komponenten sind Reagenzien, die für jede Reaktion gleichermaßen benötigt werden, d. H.E1, E3, Ub, ATP und Ubiquitylierungspuffer.
    4. DdH2O und Mastermischung in die Polymerase-Kettenreaktionsröhrchen (PCR) geben. Halten Sie die Röhren auf Eis.
    5. Bevor Sie mit den Ubiquitylierungsreaktionen durch Zugabe der E2-Enzyme beginnen, richten Sie einen PCR-Thermocycler mit folgendem Programm ein: 2 h, 37 °C gefolgt von 4 °C, unendlich.
    6. 1 μM der E2-Enzyme in die jeweiligen Röhrchen geben und die Proben im PCR-Thermocycler für den angegebenen Zeitraum inkubieren.
    7. Nach 2 h SDS-Probenpuffer zu jeder Reaktion hinzufügen und durch mehrmaliges Pipettieren nach oben und unten mischen.
      HINWEIS: Das erforderliche Volumen des Probenpuffers hängt von der Stammkonzentration des Probenpuffers ab. Hier wurden jeder Reaktion 20 μL 2x SDS Probenpuffer zugesetzt.
    8. Kochen Sie die Proben sofort bei 95 °C für 5 min und fahren Sie mit der Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) fort. Lagern Sie die denaturierten Proteine bei -20 °C.
  2. Gelelektrophorese und Western Blot
    1. Nach dem Auftauen die Proben für ca. 10 s herunterdrehen und das SDS-PAGE Gel laden. Verwenden Sie eine Proteinleiter als Größenreferenz.
      HINWEIS: Hier wurden 4-12% Bis-Tris Gradientengele und 3 μL Proteinleiter verwendet. Teilen Sie die Probenvolumina auf und laden Sie zwei Gele gleichmäßig mit 20 μL jeder Probe.
    2. Führen Sie das Gel bei 160-200 V für ca. 30-45 min, so dass die Probenfront den Boden des Gels erreicht.
    3. Übertragen Sie jedes Gel in einen Kunststoffbehälter, der mit halbtrockenem Löschpuffer gefüllt ist, und inkubieren Sie es für 2-5 min bei RT. Entfernen Sie das Stapelgel.
    4. Bereiten Sie zwei Stücke gelgroßes Löschpapier und eine gelgroße Nitrocellulosemembran pro SDS-Gel vor und weichen Sie sie in halbtrockenem Löschpuffer ein. Montieren Sie das Western Blot (WB) Sandwich in einer WB-Kammer von unten nach oben in der folgenden Reihenfolge: Löschpapier, Nitrocellulosemembran, SDS-PAGE Gel, Löschpapier.
    5. Entfernen Sie Luftblasen, die möglicherweise zwischen den Sandwichschichten eingeschlossen waren. Verwenden Sie zu diesem Zweck eine Walze, um das Sandwich einige Male vorsichtig zu rollen.
    6. Schließen Sie die Kammer und lassen Sie überschüssigen Blot-Puffer abfließen.
    7. Legen Sie die Kammer in die jeweilige Löschvorrichtung und verwenden Sie für das halbtrockene Blotting folgendes Programm: 25 V, 1,0 A, 30 min.
    8. Die abgefleckte Membran in einen mit Blocklösung gefüllten Kunststoffbehälter geben und 30 Minuten bei RT inkubieren.
    9. Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung vor, indem Sie den Antikörper zu 10 ml PBS-T hinzufügen, das ein blockierendes Reagenz enthält (siehe Tabelle der Materialien).
      HINWEIS: Die Arbeitskonzentration des Antikörpers ist antikörperspezifisch. In diesem Fall wurde ein monoklonaler Maus-Anti-Ubiquitin-Antikörper in einer Verdünnung von 1:5.000 verwendet. Für das zweite Gel wurde ein monoklonaler Kaninchen-Anti-CHIP-Antikörper bei 1:5.000 in PBS-T/Blocking-Reagenz verwendet.
    10. Ersetzen Sie die Blocklösung durch die primäre Antikörperlösung und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C auf einer Wippe.
    11. Waschen Sie die Membran dreimal für 10 min mit PBS-T.
    12. Bereiten Sie die sekundäre Antikörperlösung vor, indem Sie den jeweiligen Antikörper zu 10 ml PBS-T hinzufügen.
      HINWEIS: Hier werden Ziegen-Anti-Maus- und Maus-Anti-Kaninchen-Antikörper in einer Verdünnung von 1:10.000 verwendet.
    13. Inkubieren Sie die Membran mit dem sekundären Antikörper für 1 h bei RT auf einer Wippe.
    14. Waschen Sie die Membran dreimal für 5 min mit PBS-T.
  3. Datenanalyse
    1. Western-Blot-Nachweisreagenzien für Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierte Antikörper gemäß den Anweisungen des Herstellers in die gewaschene Membran geben und das HRP-Signal mithilfe von Röntgenfilmen oder einer ladungsgekoppelten Gerätekamera erfassen (Abbildung 1).

3. In-vitro-Substrat-Ubiquitylierungsassayt

  1. Assay-Vorbereitung und -Durchführung
    1. Berechnen Sie das Volumen jedes Reagenzes, das pro Reaktion benötigt wird, basierend auf den gegebenen Molaritäten der Proteine und den Proteinkonzentrationen der Proteinlösungen. Pro Substratubiquitylierungsreaktion verwenden Sie 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3, 1 μM Substrat und 50 μM Ub. Verwenden Sie 10x ATP-Lösung und 10x Ubiquitylierungspuffer bei 1x. Stellen Sie das Volumen der Substratubiquitylierungsreaktion mit ddH 2 O auf20 μLein.
    2. Bereiten Sie ein Pipettierschema für alle Reaktionen vor. Fügen Sie geeignete Kontrollreaktionen hinzu, die überprüfen, ob die Substratubiquitylierung E3-spezifisch ist. Verwenden Sie das Protein UNC-45B als repräsentatives Substrat von CHIP und eine katalytisch inaktive CHIP-Mutante (H260Q) als Kontrolle. Bereiten Sie die folgenden Reaktionen vor: E1, E2, Ub-Mix (einschließlich Ub, ATP, Ubiquitylierungspuffer); E1, E2, Ub mix, UNC-45B; E1, E2, Ub-Mix, CHIP (H260Q), UNC-45B; und E1, E2, Ub Mix, CHIP, UNC-45B.
    3. Um Pipettierfehler zu vermeiden, bereiten Sie eine Mastermischung auf Eis vor, die das für alle Reaktionen erforderliche Volumen plus eine zusätzliche Reaktion enthält. Berechnen Sie das Volumen der Mastermischung, das pro Reaktion benötigt wird.
      HINWEIS: Zu den Master-Mix-Komponenten für diesen Assay gehören E1, E2, Ub, ATP und Ubiquitylierungspuffer.
    4. Fügen Sie Reaktionskomponenten in der folgenden Reihenfolge hinzu: ddH2O, Substrat, E3-Ligase.
    5. Bevor Sie mit der Ubiquitylierungsreaktion durch Zugabe der Mastermischung beginnen, richten Sie einen PCR-Thermocycler mit folgendem Programm ein: 2 h, 37 °C gefolgt von 4 °C, unendlich.
    6. Fügen Sie die Mastermischung zu jedem Röhrchen hinzu und inkubieren Sie die Proben im PCR-Thermocycler für den angegebenen Zeitraum.
    7. Nach 2 h 2x SDS-Probenpuffer zu jeder Reaktion hinzufügen und durch mehrmaliges Pipettieren nach oben und unten mischen.
    8. Nach dem Durchlauf die Proben sofort bei 95 °C für 5 min kochen und mit PAGE fortfahren. Alternativ lagern Sie die denaturierten Proteine bei -20 °C.
  2. Gelelektrophorese und Western Blot
    1. Führen Sie Gelelektrophorese und Western Blot wie in Abschnitt 2.2 beschrieben durch. Verwenden Sie spezifische Antikörper für den Nachweis des Substrats bzw. der E3-Ligase.
      HINWEIS: Hier wird UNC-45B mit einem Polypeptid-Protein-Tag fusioniert, das aus dem c-myc-Genprodukt gewonnen wird und die Verwendung eines monoklonalen Maus-Anti-MYC-Antikörpers ermöglicht. Anti-MYC wird bei 1:10.000 verwendet.
  3. Datenanalyse
    1. Führen Sie die Datenanalyse wie in Abschnitt 2.3 (Abbildung 2) beschrieben durch.

4. Lysin-Entladungsassay

  1. Assay-Vorbereitung und -Durchführung
    1. Aufladung des E2-Enzyms mit Ub durch E1
      1. Berechnen Sie das Volumen jedes Reagenzes, das pro Reaktion benötigt wird, basierend auf den gegebenen Molaritäten der Proteine und den Proteinkonzentrationen der Proteinlösungen. Verwenden Sie pro Ladereaktion 2 μM E1, 4 μM E2 und 4 μM Lysinfreies Ubiquitin (Ub K0). Verwenden Sie 10x ATP und 10x Ubiquitylierungspuffer bei 1x. Stellen Sie das Volumen der Ladereaktion mit ddH 2 0 auf20 μLein.
        HINWEIS: Die lysinfreie Ub K0-Mutante wird verwendet, um die ausschließliche Produktion von mono-ubiquityliertem E2 durchzusetzen. Wildtyp Ub kann auch verwendet werden; Dies kann jedoch zu verschiedenen E2 ~ Ub-Modifikationen(z. B.Polyubiquitylierung von E2) führen, die schwieriger zu analysieren sind. Bestimmen Sie bei der erstmaligen Verwendung oder bei Verwendung eines neuen E2-Enzyms den Grad der Ub-Ladung auf E2, der durch E1 erreicht werden kann. Um die Ausbeute des Ladens zu bestimmen, visualisieren Sie ungeladenes vs. geladenes E2 über Coomassie-Färbung. Hier wurde etwa die Hälfte von Ub K0 zuverlässig in UBE2D2 ~ Ub umgewandelt, wenn äquimolare Verhältnisse von UBE2D2 und Ub K0 verwendet wurden (ergänzende Abbildung S2A).
      2. Bereiten Sie ein Pipettierschema für die Ladereaktion vor. Stellen Sie das Volumen der Ladereaktion auf die nachfolgenden Entladungsreaktionen Ihrer Wahl ein, z. B.verwenden Sie CHIP und CHIP (H260Q) in einzelnen Entladungsreaktionen. Bereiten Sie also das doppelte Volumen einer Ladereaktion vor.
        HINWEIS: Testen Sie für den erstmaligen Gebrauch verschiedene Konzentrationen der E3-Ligase Ihrer Wahl, um optimale Entladungsbedingungen zu überwachen, und analysieren Sie sie durch Western Blotting. In einem idealen Zustand nimmt der Ausfluss von Ub aus E2 im Laufe der Zeit zu, bis die jeweilige E2 ~ Ub-Proteinbande verschwindet.
      3. Inkubieren Sie die Chargierreaktion für 15 min bei 37 °C.
    2. Beendigung der Ladereaktion
      1. Stoppen Sie die Ladereaktion durch Zugabe von Apyrase in einer Endkonzentration von 1,8 U / ml. Führen Sie die Inkubation mit Apyrase für 5 min bei RT durch, gefolgt von Zugabe von EDTA in einer Endkonzentration von 30 mM. Stellen Sie das Volumen der Ladereaktion mit ddH2O auf 30 μL ein.
        HINWEIS: Apyrase wird verwendet, um ATP-Moleküle in ADP-Moleküle (Adenosindiphosphat) umzuwandeln. Da die Aktivität des E1-Enzyms ATP-abhängig ist, kann E1 E2 nicht mehr laden. EDTA wird zusätzlich verwendet, um sicherzustellen, dass E1 gehemmt wird, indem Mg2+ Ionen abgeschreckt werden, die notwendige Co-Faktoren für E1 sind. Das Volumen der Apyrase, das erforderlich ist, um die Reaktion zu stoppen, kann je nach Assay-Bedingungen variieren. Obwohl Apyrase allein bereits verfügbare ATP-Moleküle löscht, war eine Kombination aus Apyrase und EDTA effektiver, um die Ladereaktion für das E1-UBE2D2-Paar zu stoppen. Da das Stoppen der Reaktion ein kritischer Faktor für die Reproduzierbarkeit des Assays ist, sollte ein effizientes Stoppen für neue E1-E2-Paare getestet werden. Richten Sie dazu eine Ladereaktion ein, stoppen Sie sie und sammeln Sie Proben zu bestimmten Zeitpunkten, z. B.nach 2, 5, 10 und 15 minuten. Sich nicht ändernde Werte von E2 ~ Ub zeigen an, dass die Reaktion gestoppt wurde und dass der Thioester während dieses Zeitraums stabil war (Ergänzende Abbildung S2B).
    3. Entladung von E2~Ub durch E3
      1. Bereiten Sie vier Röhrchenvor, die den verschiedenen Zeitpunkten entsprechen (t0, t 1, t2, t3); Zu jedem Röhrchen wird ein nicht reduzierender Probenpuffer (6,7 μL 4x Lithiumdodecylsulfat (LDS)-Puffer) hinzugefügt.
        HINWEIS: Verwenden Sie kein Reduktionsmittel im Probenpuffer.
      2. Entfernen Sie 6 μL aus der gestoppten Ladereaktion für t0und stellen Sie das Volumen auf 20 μL mit ddH2O ein.
      3. Die t0-Probe wird für 10 min bei 70 °C inkubiert.
        HINWEIS: Kochen Sie die Probe nicht, indem Sie die Inkubationszeit verlängern, da Thioester bei höheren Temperaturen labil sind.
      4. Berechnen Sie das Volumen jedes Reagenzes, das pro Entladungsreaktion benötigt wird. Verwenden Sie die restlichen 24 μL des geladenen E2 und fügen Sie 10 mM L-Lysin, 1 mg / ml BSA und 500 nM der E3-Ligase hinzu. Verwenden Sie den Ubiquitylierungspuffer bei 1x und stellen Sie das Volumen mit ddH2O auf 80 μL ein.
      5. Bereiten Sie ein Pipettierschema für alle Entladungsreaktionen vor und verwenden Sie zusätzlich zu CHIP (WT) CHIP (H260Q) als Steuerung.
      6. Richten Sie Entladungsreaktionen auf Eis ein, indem Sie die erforderlichen Komponenten in der folgenden Reihenfolge hinzufügen: ddH2O, Ubiquitylierungspuffer, BSA, Lysin, E3-Ligase und das geladene E2, um die Reaktion zu starten.
      7. Inkubieren Sie die Entladungsreaktion bei RT.
      8. Entnehmen Sie die Proben nach 5, 30 und 60 min, indem Sie 20 μL der Entladungsreaktion in die jeweiligen Probenröhrchen überführen.
        HINWEIS: Geeignete Zeitpunkte, die eine ordnungsgemäße Überwachung der Entladung ermöglichen, können zwischen E2-E3-Paaren variieren.
      9. Wirbeln Sie die Probe sofort vor und inkubieren Sie sie bei 70 °C für 10 min.
      10. Fahren Sie direkt mit PAGE fort.
        HINWEIS: E2~Ub-Thioester können auch nach der Denaturierung im Probenpuffer labil sein. Daher sollte die Gelelektrophorese direkt nach der Durchführung des Assays durchgeführt werden.
  2. Gelelektrophorese und Western Blot
    1. Führen Sie die Gelelektrophorese und das Western Blotting wie in Abschnitt 2.2 beschrieben durch. Verwenden Sie einen Ub-spezifischen Antikörper und, falls verfügbar, auch einen E3-spezifischen Antikörper, der in einer anderen Spezies aufgezogen wurde, um den gleichzeitigen Nachweis des Ub- und E3-Ligasesignals zu ermöglichen.
  3. Datenanalyse
    1. Führen Sie eine Datenanalyse wie in Abschnitt 2.3 (Abbildung 3) beschrieben durch.

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Ergebnisse

Um E2-Enzyme zu identifizieren, die mit dem Ubiquitin-Ligase-CHIP zusammenarbeiten, wurde ein Satz von E2-Kandidaten in einzelnen In-vitro-Ubiquitylierungsreaktionen getestet. Kooperierende E2-E3-Paare wurden durch die Bildung von E3-abhängigen Ubiquitylierungsprodukten, d.h.Autoubiquitylierung der E3-Ligase und die Bildung von freien Ub-Polymeren, überwacht. Die Ubiquitylierungsprodukte wurden durch Western Blotting analysiert. Die Dateninterpretation basiert auf dem Größenvergleich der resultierenden ...

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Diskussion

Dieser Beitrag beschreibt grundlegende In-vitro-Ubiquitylierungsmethoden für die Analyse der E3-Ligasefunktion. Bei der Durchführung von In-vitro-Ubiquitylierungsassayles sollte berücksichtigt werden, dass einige E2-Enzyme aufgrund des Angriffs ihres aktiven Cysteins auf ihre eigenen Lysinreste, die sich in unmittelbarer Nähe des aktiven Zentrums befinden, eine Autoubiquitylierung durchführen können30. Um dieses Problem zu umgehen, empfiehlt sich der Einsatz einer E2-Mutante, be...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir danken den Mitgliedern unseres Labors für die kritische Diskussion und hilfreiche Beratung zum Manuskript. Wir entschuldigen uns dafür, dass wir aufgrund von Größenbeschränkungen keine wertvollen Beiträge zitiert haben. Diese Arbeit wird gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - SFB 1218 - Projektnummer 269925409 und Exzellenzcluster EXC 229/ CECAD bis TH. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer 269925409 to T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 an T.H. gefördert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Amershan Protran 0.1 & Mikro; m NCGE Healthcare10600000Nitrozellulosemembran
Anti-CHIPCell Signaling2080Monoklonaler Kaninchen-Anti-CHIP-Antikörper, Klon C3B6
Anti-MYCRocheOP10Monoklonaler Maus-Anti-MYC-Antikörper, Klon 9E10
Anti-UbiquitinUpstate05-944Monoklonaler Maus-Anti-Ub-Antikörper, Klon P4D1-A11
ApyraseSigmaA6535-100UN
ATP (10x)Enzo12091903
BSASigmaA6003-10G
EDTARoth8043.2
KClRoth6781.1
K2HPO4RothP749.2
KH2PO4Roth3904.1
LDS Probenpuffer (4x)novexB0007
L-LysinSigmaL5501-5G
MESRoth4256.4
MeOHVWR Chemicals2,08,47,307100%
MilchpulverRothT145.3
NaClRothP029.3
NuPAGE AntioxidationsmittelInvitrogenNP0005
NuPAGE Transfer Puffer (20x)NovexNP0006-1
Seitenlineal plusThermo Fisher26619Proteinleiter
RotiBlockRothA151.1Blockierungsreagenz
SDS (20%)Roth1057.1
S1000 ThermocyclerBio Rad1852196
Trans-Blot TurboBio Rad1704150EDUTransfersystem
Tris-BaseRoth4855.3
Tween 20Roth9127.2
UbcH EnzymsatzBostonBiochemK-980BE2
Enzyme UbiquitinBostonBiochemU-100H
Ubiquitin-aktivierendes Enzym E1EnzoBML-UW941U-0050
Ubiquitylierungspuffer (10x)EnzoBML-KW9885-001
Whatman LöschpapierBio Rad1703969Extra dickes Filterpapier

Referenzen

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