Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

الالتقاط بمساعدة الراتنج إلى جانب وضع علامات الكتلة الترادفية متساوية الضغط من أجل القياس الكمي المضاعف لأكسدة ثيول البروتين

Published: June 21, 2021 doi: 10.3791/62671
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Integrative Omics, Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, 2Bioproducts Sciences and Engineering Laboratory, Department of Biological Systems Engineering, Washington State University

Summary

أكسدة ثيول البروتين لها آثار كبيرة في ظل الظروف الفسيولوجية والفيزيولوجية الطبيعية الطبيعية. وصفنا تفاصيل طريقة البروتينات الأكسدة والاختزال الكمية ، والتي تستخدم الالتقاط بمساعدة الراتنج ، ووضع العلامات متساوية الضغط ، وقياس الطيف الكتلي ، مما يتيح التحديد والقياس الكمي لبقايا السيستين المؤكسدة عكسيا من البروتينات.

Abstract

ظهرت مؤخرا تعديلات مؤكسدة عكسية على ثيول البروتين كوسطاء مهمين للوظيفة الخلوية. فيما يلي وصف الإجراء التفصيلي لطريقة البروتينات الكمية للأكسدة والاختزال التي تستخدم الالتقاط بمساعدة الراتنج (RAC) بالاشتراك مع وضع العلامات متساوية الضغط لعلامة الكتلة الترادفية (TMT) وقياس الطيف الكتلي الترادفي اللوني السائل (LC-MS / MS) للسماح بالقياس الكمي العشوائي المتعدد لثيول البروتين المؤكسد على مستوى البروتين. توفر المعلومات الكمية الخاصة بالموقع حول بقايا السيستين المؤكسدة نظرة ثاقبة إضافية للتأثيرات الوظيفية لهذه التعديلات.

سير العمل قابل للتكيف عبر العديد من أنواع العينات ، بما في ذلك الخلايا المستزرعة (على سبيل المثال ، الثدييات ، بدائية النواة) والأنسجة الكاملة (مثل القلب والرئة والعضلات) ، والتي يتم تحللها / تجانسها في البداية ومع ألكيلات الثيول الحرة لمنع الأكسدة الاصطناعية. ثم يتم تقليل ثيول البروتين المؤكسد والتقاطه بواسطة راتنج تقارب الثيول ، والذي يبسط ويبسط خطوات سير العمل من خلال السماح بإجراء إجراءات الهضم ووضع العلامات والغسيل دون نقل إضافي للبروتينات / الببتيدات. أخيرا ، يتم استخلاص الببتيدات الموسومة وتحليلها بواسطة LC-MS / MS للكشف عن التغيرات المتكافئة الشاملة المتعلقة بأكسدة الثيول عبر البروتين بأكمله. تعمل هذه الطريقة على تحسين فهم دور التنظيم المعتمد على الأكسدة والاختزال بشكل كبير في ظل الحالات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية المتعلقة بأكسدة ثيول البروتين.

Introduction

في ظل ظروف الاستتباب ، تولد الخلايا أنواعا تفاعلية من الأكسجين أو النيتروجين أو الكبريت تساعد على تسهيل العمليات ، مثل التمثيل الغذائي والإشارات1،2،3 ، وتمتد إلى كل من بدائيات النوى وحقيقيات النوى. المستويات الفسيولوجية لهذه الأنواع التفاعلية ضرورية للوظيفة الخلوية المناسبة ، والمعروفة أيضا باسم "eustress"1,4. في المقابل ، يمكن أن تؤدي زيادة المؤكسدات التي تؤدي إلى اختلال التوازن بين المؤكسدات ومضادات الأكسدة إلى الإجهاد التأكسدي ، أو "الضيق"1 ، مما يؤدي إلى تلف الخلايا. تقوم المواد المؤكسدة بتحويل الإشارات إلى مسارات بيولوجية عن طريق تعديل الجزيئات الحيوية المختلفة ، بما في ذلك البروتين والحمض النووي والحمض النووي الريبي والدهون. على وجه الخصوص ، بقايا السيستين من البروتينات هي مواقع شديدة التفاعل عرضة للأكسدة بسبب مجموعة الثيول على السيستين ، والتي تتفاعل مع أنواع مختلفة من المؤكسدات5. وهذا يؤدي إلى مجموعة متنوعة من التعديلات اللاحقة للترجمة القائمة على الأكسدة والاختزال (PTMs) للسيستين ، بما في ذلك النيتروسيل (SNO) ، والغلوتاثيونيل (SSG) ، والسلفنيل (SOH) ، والكبريت (SSH) ، والكبريت (SSnH) ، والأسيلة ، وثاني كبريتيد. تشمل الأشكال التي لا رجعة فيها من أكسدة السيستين الكبريتنيل (SO2H) والسلفونيل (SO3H).

قد تؤدي التعديلات المؤكسدة القابلة للانعكاس لبقايا السيستين أدوارا وقائية تمنع المزيد من الأكسدة التي لا رجعة فيها أو تعمل كجزيئات إشارات للمسارات الخلوية في اتجاه مجرى النهر 6,7. تسمح قابلية انعكاس بعض PTMs الأكسدة والاختزال ثيول لمواقع السيستين بالعمل ك "مفاتيح أكسدة"8,9 ، حيث تؤدي التغييرات في حالة الأكسدة والاختزال لهذه المواقع إلى تغيير وظيفة البروتين لتنظيم دورها في العمليات العابرة. لوحظت التأثيرات التعديلية ل PTMs10 الأكسدة والاختزال في العديد من جوانب وظيفة البروتين11 ، بما في ذلك الحفز 12 ، تفاعلات البروتين والبروتين13 ، تغيير التشكيل14 ، تنسيق أيون المعادن 15 ، أو ربط المثبط الدوائي16. بالإضافة إلى ذلك ، تشارك PTMs الأكسدة والاختزال في مواقع السيستين للبروتينات التي تنظم المسارات مثل النسخ17 أو الترجمة 18 أو التمثيل الغذائي19. بالنظر إلى تأثير الأكسدة والاختزال PTMs على وظيفة البروتين والعمليات البيولوجية ، من المهم تحديد مدى الأكسدة التي يخضع لها موقع السيستين استجابة لاضطراب حالة الأكسدة والاختزال.

يركز تحديد مواقع السيستين ذات حالات الأكسدة والاختزال المتغيرة على مقارنة حالة الأكسدة على المستوى الخاص بالموقع بين الظروف الطبيعية والمضطربة. غالبا ما تستخدم قياسات تغيير الطيات لتحديد المواقع التي تم تغييرها بشكل كبير لأن هذا يساعد المستخدمين على تفسير مواقع السيستين التي قد تكون ذات أهمية فسيولوجية للدراسة. بدلا من ذلك ، تعطي القياسات المتكافئة لأكسدة الثيول القابلة للانعكاس عبر نوع معين من العينة صورة عامة للحالة الفسيولوجية فيما يتعلق بالأكسدة الخلوية ، وهو قياس مهم غالبا ما يتم تجاهله وعدم استخدامه. يعتمد القياس الكيميائي للتعديل على تحديد النسبة المئوية للثيول المعدل كنسبة إلى إجمالي ثيول البروتين (المعدل وغير المعدل)20,21. نتيجة لذلك ، توفر القياسات المتكافئة قياسا أكثر دقة من تغيير الطي ، خاصة عند استخدام مطياف الكتلة. يمكن التحقق من أهمية الزيادة في الأكسدة بسهولة أكبر باستخدام القياس المتكافئ لتحديد إشغال PTM لموقع سيستين معين. على سبيل المثال ، يمكن أن تنتج زيادة 3 أضعاف في أكسدة الثيول عن انتقال أقل من 1٪ إلى 3٪ أو ما يصل إلى 30٪ إلى 90٪. قد يكون لزيادة الأكسدة بمقدار 3 أضعاف لموقع بنسبة إشغال 1٪ فقط تأثير ضئيل على وظيفة البروتين. ومع ذلك ، فإن زيادة 3 أضعاف لموقع مع إشغال 30 ٪ في حالة الراحة قد تتأثر بشكل كبير. يمكن أن تكشف القياسات المتكافئة ، عند إجراؤها بين إجمالي الثيول المؤكسد والتعديلات المؤكسدة المحددة ، بما في ذلك الجلوتاثيونيل البروتيني (SSG) والنيتروسيل (SNO) ، عن النسب والمعلومات الكمية فيما يتعلق بأنواع تعديل محددة.

نظرا لأن أكسدة الثيول العكسية عادة ما تكون تعديلا ما بعد الترجمة منخفض الوفرة ، فقد تم تطوير طرق متعددة لإثراء البروتينات التي تحتوي على هذه التعديلات من العينات البيولوجية. يتضمن النهج المبكر الذي ابتكره جافري وآخرون ، المسمى تقنية تبديل البيوتين (BST)22 ، خطوات متعددة حيث يتم حظر الثيول غير المعدل من خلال الألكلة ، ويتم تقليل الثيول المعدل بشكل عكسي إلى ثيول حر ناشئ ، ويتم تمييز الثيول الحر الناشئ بالبيوتين ، ويتم إثراء البروتينات الموسومة عن طريق سحب تقارب الستربتافيدين إلى أسفل. تم استخدام هذه التقنية لتحديد SNO و SSG في العديد من الدراسات ويمكن تكييفها للتحقيق في أشكال أخرى من أكسدة الثيول القابلة للانعكاس23,24. بينما تم استخدام BST للتحقيق في أشكال مختلفة من أكسدة الثيول القابلة للانعكاس ، فإن أحد المخاوف في هذا النهج هو أن التخصيب يتأثر بالارتباط غير المحدد للبروتينات غير الحيوية بالستربتافيدين. نهج بديل تم تطويره في مختبرنا ، يسمى الالتقاط بمساعدة الراتنج (RAC) 25،26 (الشكل 1) ، يتحايل على مسألة إثراء مجموعات الثيول عبر نظام البيوتين ستربتافيدين.

بعد الحد من الثيول المؤكسد عكسيا ، يتم إثراء البروتينات ذات الثيول الحرة الوليدة بواسطة راتنج تقارب الثيول ، الذي يلتقط تساهميا مجموعات الثيول الحرة ، مما يسمح بتخصيب أكثر تحديدا للبروتينات المحتوية على السيستين من BST. إن اقتران RAC مع قوة تعدد الإرسال للتطورات الحديثة في وضع العلامات متساوية الضغط وقياس الطيف الكتلي يخلق سير عمل قويا وحساسا لإثراء وتحديد وقياس بقايا السيستين المؤكسدة بشكل عكسي على مستوى البروتين. مكنت التطورات الحديثة في قياس الطيف الكتلي من التنميط الأعمق بكثير لبروتين الأكسدة والاختزال الثيول ، مما زاد من فهم كل من سبب وتأثير أكسدة ثيول البروتين27. تسمح المعلومات المكتسبة من البيانات الكمية الخاصة بالموقع بإجراء مزيد من الدراسات للتأثيرات الميكانيكية والآثار النهائية للتعديلات المؤكسدة العكسية28. وقد وفر استخدام سير العمل هذا نظرة ثاقبة للتأثيرات الفسيولوجية لأكسدة السيستين القابلة للانعكاس فيما يتعلق بالأحداث الفسيولوجية الطبيعية مثل الشيخوخة ، حيث اختلفت مستويات SSG فيما يتعلق بالعمر. تم عكس تأثيرات الشيخوخة على SSG جزئيا باستخدام SS-31 (elamipretide) ، وهو ببتيد جديد يعزز وظيفة الميتوكوندريا ويقلل من مستويات SSG في الفئران المسنة ، مما يتسبب في أن يكون لديهم ملف تعريف SSG أكثر تشابها مع الفئران الصغيرة29.

وقد تبين أن الظروف الفيزيولوجية المرضية المنسوبة إلى التعرض للجسيمات النانوية تنطوي على SSG في نموذج البلاعم الفئرانية. باستخدام RAC إلى جانب قياس الطيف الكتلي ، أظهر المؤلفون أن مستويات SSG كانت مرتبطة ارتباطا مباشرا بدرجة الإجهاد التأكسدي وضعف وظيفة البلعمة البلاعمية. كشفت البيانات أيضا عن اختلافات خاصة بالمسار استجابة للمواد النانوية الهندسية المختلفة التي تحفز درجات مختلفة من الإجهاد التأكسدي30. أثبتت الطريقة أيضا فائدتها في الأنواع بدائية النواة ، حيث تم تطبيقها لدراسة تأثيرات الدورات النهارية في البكتيريا الزرقاء الضوئية فيما يتعلق بأكسدة الثيول. لوحظت تغيرات واسعة في أكسدة الثيول عبر العديد من العمليات البيولوجية الرئيسية ، بما في ذلك نقل الإلكترون ، وتثبيت الكربون ، وتحلل السكر. علاوة على ذلك ، من خلال التحقق المتعامد ، تم تأكيد تعديل العديد من المواقع الوظيفية الرئيسية ، مما يشير إلى الأدوار التنظيمية لهذه التعديلات المؤكسدة6.

هنا ، نصف تفاصيل سير العمل الموحد (الشكل 1) ، مما يدل على فائدة نهج RAC لإثراء إجمالي ثيول السيستين المؤكسد للبروتينات ووضع العلامات اللاحقة والقياس الكمي المتكافئ. تم تنفيذ سير العمل هذا في دراسات حالة الأكسدة والاختزال في أنواع مختلفة من العينات ، بما في ذلك مزارع الخلايا27،30 والأنسجة الكاملة (على سبيل المثال ، العضلات الهيكلية والقلب والرئة)29،31،32،33. على الرغم من عدم تضمينه هنا ، إلا أن بروتوكول RAC يمكن تكييفه بسهولة للتحقيق في أشكال محددة من تعديلات الأكسدة والاختزال القابلة للانعكاس ، بما في ذلك SSG و SNO و S-acylation ، كما ذكرنا سابقا25،29،34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة في البروتوكول المتعلقة بالعينات / الأنسجة الحيوانية أو البشرية من قبل لجنة أخلاقيات البحوث البشرية والحيوانية واتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية.

1. عينة التجانس / التحلل

  1. عينات الأنسجة المجمدة
    1. فرم الأنسجة المجمدة (~ 30 مجم) على مجهر زجاجي على الثلج الجاف باستخدام شفرة حلاقة مبردة مسبقا وملقط. انقل المنديل المفروم إلى أنبوب بوليسترين دائري القاع سعة 5 مل مبرد مسبقا يحتوي على 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت A (انظر الجدول 1) واحتضانه على الثلج لمدة 30 دقيقة ، محميا من الضوء.
    2. قم بتعطيل الأنسجة لمدة 30 ثانية أو حتى يتم تجانسها تماما باستخدام خالط الأنسجة المحمول باليد. ضع العينات على الثلج واترك الرغوة تهدأ لمدة 10 دقائق أخرى.
      ملاحظة: توفر صفيحة الخبز المصنوعة من الألومنيوم الموضوعة على الثلج الجاف سطح عمل مستقرا ومنصة للمعالجة الأولية / فرم الأنسجة.
  2. بدلا من ذلك ، استخدم مزارع الخلايا الملتصقة في أطباق الاستزراع 100 مم كمادة أولية.
    1. احتفظ بالخلايا على الجليد واستخدم ماصة مصلية لشطف الخلايا مرتين باستخدام 10 مل من PBS المثلج الذي يحتوي على 100 mM NEM.
    2. قم بتحليل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من التجانس البارد / محلول التحلل وكشطها بقوة باستخدام مكشطة خلية صلبة. انقل المحللة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل باستخدام ماصة دقيقة.
      ملاحظة: يمكن تحجيم عازلة الشطف ومخزن التحلل وفقا لأوعية الاستزراع ذات الأحجام المختلفة. عادة ، هناك حاجة إلى 2-5 مليون خلية. ومع ذلك ، يختلف هذا اعتمادا على كفاءة التحلل وإنتاجية البروتين لأنواع معينة من الخلايا. يمكن تحضير مخزن التجانس بدون NEM للعينات التي يتم تحليلها بحثا عن إجمالي الثيول.
  3. انقل التجانس الناتج (الخطوة 1.1.2 أو 1.2.2) إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل باستخدام ماصة دقيقة ، وأجهزة طرد مركزي بأقصى سرعة (≥16000 × جم) عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
  4. انقل المادة الطافية (~ 700 ميكرولتر أو ~ 1 مل لزراعة الخلايا) باستخدام ماصة دقيقة إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 5 مل واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 55 درجة مئوية في الظلام مع الاهتزاز عند 850 دورة في الدقيقة.
  5. باستخدام ماصة مصلية زجاجية ، أضف 4 مل من الأسيتون المثلج إلى العينات واحتضانها عند -20 درجة مئوية طوال الليل لترسيب البروتين وإزالة N-ethylmaleimide الزائد.

2. التقاط بمساعدة الراتنج

  1. اغسل كريات البروتين المترسبة مرتين باستخدام الأسيتون عن طريق الطرد المركزي عند 20500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، وصب الأسيتون ، وإزالة أي أسيتون متبقي باستخدام ماصة دقيقة ، وإضافة 3 مل من الأسيتون الطازج المثلج باستخدام ماصة مصلية زجاجية. عكس عدة مرات لخلط. بعد الغسيل الثاني ، اترك الكريات تجف في الهواء لمدة 1-2 دقيقة ، مع الحرص على عدم الإفراط في الجفاف لأن إعادة التعليق قد تصبح صعبة.
  2. باستخدام micropipette ، أضف 1 مل من المخزن المؤقت B (انظر الجدول 1) وقم بإذابة البروتين باستخدام صوتنة متكررة لمدة 15-30 ثانية في المرة الواحدة باستخدام سونيكاتور حمام بإخراج 250 واط ودوامة قصيرة. قم بقياس تركيز البروتين باستخدام مقايسة حمض البيسينشونينيك (BCA) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  3. لتوحيد تركيزات البروتين عبر العينات لمزيد من المعالجة وضمان الإزالة الكاملة ل NEM ، انقل 500 ميكروغرام من البروتين إلى مرشح طرد مركزي 0.5 مل 10 كيلو دالتون باستخدام ماصة دقيقة واضبطه على الحجم النهائي البالغ 500 ميكرولتر مع إعادة تعليق عازلة.
  4. جهاز طرد مركزي عند 14000 × جم في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح الحجم في مرشح الطرد المركزي أقل من 100 ميكرولتر. اجمع العينات عن طريق قلب المرشح في أنبوب التجميع. جهاز طرد مركزي عند 1000 × جم لمدة دقيقتين وضبطه على الحجم النهائي البالغ 500 ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت C (انظر الجدول 1).
  5. قلل من ثيول البروتين بإضافة 20 ميكرولتر من 500 مللي مول ثنائي ثيوثريتول (DTT) باستخدام ماصة دقيقة إلى تركيز نهائي قدره 20 مللي مول واحتضان العينات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية أثناء الاهتزاز عند 850 دورة في الدقيقة.
  6. بعد التخفيض ، انقل العينات باستخدام micropipette إلى 0.5 مل 10 كيلو دالتون مرشحات الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 14000 × جم في درجة حرارة الغرفة أو حتى يصبح الحجم في مرشح الطرد المركزي أقل من 100 ميكرولتر. أضف المخزن المؤقت D (انظر الجدول 1) لتعويض الحجم في مرشح الطرد المركزي إلى 500 ميكرولتر.
    1. كرر جهاز الطرد المركزي وإضافته إلى 500 ميكرولتر في الخطوة 2.6 ثلاث مرات ، وبعد الطرد المركزي الرابع ، اجمع العينات عن طريق قلب المرشح في أنبوب تجميع والطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة دقيقتين.
  7. قم بقياس تركيز البروتين باستخدام مقايسة BCA وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  8. خلال هذا التبادل المؤقت ، قم بإعداد راتنج تقارب الثيول عن طريق وزن الكمية المناسبة من الراتنج (30 مجم / عينة) باستخدام ميزان دقيق ونقله إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. ثم ، باستخدام ماصة مصلية ، أضف الماء لتركيز نهائي قدره 30 مجم / مل من الراتنج واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة مع التقليب من أجل الترطيب المناسب للراتنج.
    ملاحظة: تم إيقاف راتنج تقارب الثيول المذكور أعلاه من قبل الشركة المصنعة. يتوفر بديل محتمل لراتنج تقارب الثيول تجاريا. ومع ذلك ، فإن هذا البديل لديه قدرة ربط أقل بنحو 5 أضعاف (انظر المعلومات التكميلية). بدلا من ذلك ، يمكن تصنيع راتنج تقارب الثيول باستخدام 2- (بيريديلديثيو) إيثيل أمين هيدروكلوريد وراتنج N-hydroxysuccinimide المنشط (انظر المعلومات التكميلية).
    1. بعد ترطيب الراتنج ، ضع أعمدة الدوران على مشعب فراغ وانقل 500 ميكرولتر من ملاط الراتنج باستخدام ماصة دقيقة إلى كل عمود. تطبيق فراغ لإزالة المياه. كرر هذه الخطوة مرة واحدة للحصول على ما مجموعه 30 ملغ من الراتنج لكل عمود. بدلا من ذلك ، جهاز طرد مركزي عند 1000 × جم لمدة 2 دقيقة بدلا من استخدام مشعب الفراغ لهذا وجميع خطوات الغسيل والشطف بالراتنج.
      ملاحظة: يساعد قطع طرف ماصة 1000 ميكرولتر لزيادة حجم التجويف في نقل الراتنج. من المهم التكسير بين السحب لضمان بقاء الراتنج معلقا ونقل كميات متجانسة ومتساوية من الراتنج إلى كل عمود.
    2. اغسل الراتنج بإضافة 500 ميكرولتر من الماء عالي النقاء باستخدام ماصة دقيقة وتطبيق فراغ لإزالة الماء ؛ كرر هذا 5 مرات. ثم اغسل الراتنج 5 مرات ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت E (انظر الجدول 1).
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة 2 دقيقة بدلا من مشعب الفراغ لجميع خطوات الغسيل اللاحقة. يتم تنفيذ جميع خطوات غسل الإجراءات بحجم 500 ميكرولتر. عند إضافة مخازن الغسيل المؤقتة إلى العمود ، أضف بعناية بقوة كافية لإعادة تعليق الراتنج بالكامل مع تجنب الرش وفقدان الراتنج ؛ هذا يسمح بالغسيل الكامل والفعال للراتنج.
  9. باستخدام micropipette ، انقل 150 ميكروغرام من البروتين من كل عينة مخفضة إلى أنبوب جديد واضبط على الحجم النهائي البالغ 120 ميكرولتر من المخزن المؤقت C (انظر الجدول 1). انقل محلول البروتين باستخدام micropipette إلى عمود دوران موصول يحتوي على الراتنج ، ضع الغطاء على العمود ، واحتضانه لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الاهتزاز عند 850 دورة في الدقيقة.
  10. اغسل الراتنج خمس مرات باستخدام 25 mM HEPES ، درجة الحموضة 7.0 ؛ 8 م اليوريا تليها خمس مرات مع 2 M كلوريد الصوديوم ؛ تليها خمس مرات مع 80 ٪ أسيتونيتريل (ACN) مع 0.1 ٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) ؛ وأخيرا خمس مرات مع 25 mM HEPES ، الرقم الهيدروجيني 7.7 ، كما هو موضح في الخطوة 2.8.2 واستبدال القابس.
    ملاحظة: يمكن استخلاص العينات هنا للتحليل على مستوى البروتين (على سبيل المثال ، الرحلان الكهربائي لهلام SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) ، اللطخة الغربية) كما هو موضح في الخطوة 4.1.

3. الهضم التربتيك على الراتنج ووضع العلامات TMT

  1. قم بإعداد ما يكفي من محلول التربسين المعدل بدرجة التسلسل ل 6-8 ميكروغرام لكل عينة عن طريق إذابته بتركيز 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر في المخزن المؤقت C (انظر الجدول 1) بحيث يسمح الحجم النهائي بما لا يقل عن 120 ميكرولتر لكل عينة. باستخدام micropipette ، أضف 120 ميكرولتر من محلول التربسين هذا إلى العينات واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 850 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: لزيادة كفاءة الهضم ، يمكن تضمين خطوة هضم إضافية في اليوم التالي عن طريق إزالة محلول التربسين واستبداله بمحلول جديد ، ومواصلة عملية الهضم لمدة 2 ساعة.
  2. اغسل الراتنج خمس مرات باستخدام 25 mM HEPES ، درجة الحموضة 7.0 ؛ تليها خمس مرات 2 م كلوريد الصوديوم ؛ تليها خمس مرات مع 80٪ ACN مع 0.1٪ TFA ؛ تليها ثلاث مرات مع 25 mM HEPES ، درجة الحموضة 7.7. أخيرا ، اغسل الراتنج مرتين باستخدام محلول بيكربونات الأمونيوم ثلاثي إيثيل 50 مللي مول (TEAB) واستبدل القابس.
  3. قم بإعداد كواشف وضع العلامات TMT عن طريق السماح لها أولا بالتسخين إلى درجة حرارة الغرفة قبل الدوران لفترة وجيزة باستخدام جهاز طرد مركزي بسرعة 16000 × جم. أضف 150 ميكرولتر من ACN اللامائي إلى كل قارورة من كاشف وضع العلامات TMT باستخدام ماصة دقيقة. احتضان القوارير في درجة حرارة الغرفة على خلاط حراري مضبوط على 850 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق لإذابة الكاشف تماما. دوامة لفترة وجيزة وتدور لأسفل في 16000 × غرام لجمع الكاشف.
  4. باستخدام micropipette ، أضف 40 ميكرولتر من 100 mM TEAB إلى الراتنج المغسول ، ثم أضف 70 ميكرولتر من كاشف TMT المذاب واحتضانه لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الاهتزاز عند 850 دورة في الدقيقة. قم بتخزين أي كاشف TMT متبقي في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: لاحظ ملصقات TMT الفردية المخصصة لكل عينة بيولوجية (الشكل 1).
  5. اغسل الراتنج خمس مرات باستخدام 80٪ ACN مع 0.1٪ TFA ، وثلاث مرات باستخدام 100 mM من محلول بيكربونات الأمونيوم (ABC) ، ودرجة الحموضة 8.0 ، ومرتين بالماء كما هو موضح سابقا واستبدل القابس.

4. شطف الببتيد

  1. قم بتخفيف الببتيدات الموسومة بإضافة 100 ميكرولتر من 20 mM DTT في 100 mM ABC ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، إلى كل عمود باستخدام micropipette واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على خلاط حراري مضبوط على 850 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: بعد إضافة DTT ، سوف يتكتل الراتنج. يمكن تعطيل الراتنج بطرف ماصة لتفتيت الكتل وضمان الشطف الكامل للببتيدات.
  2. بعد هذه الحضانة ، ضع العمود على مشعب فراغ مخصص لاستخراج الطور الصلب (SPE) ، وقم بتطبيق الفراغ ، وقم بإخراج العينات في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 5 مل. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
  3. أخيرا ، أضف 100 ميكرولتر من 80٪ ACN مع 0.1٪ TFA ، واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وقم بتلويثها في نفس أنبوب الطرد المركزي سعة 5 مل. اجمع كل الكسور في نفس أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 5 مل.
    ملاحظة: لمنع فقدان العينة ، يجب استخدام أنابيب ربط منخفضة للشطف ، ويجب الاحتفاظ بالأحجام عند أو أقل من حجم 4.0 مل لأنبوب واحد سعة 5 مل.
  4. ضع العينات المستخلصة في مكثف فراغ حتى تجف. قم بتخزين الببتيدات الجافة في -80 درجة مئوية وأعد تعليقها لاحقا.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخلاص العينات بشكل منفصل ، ويمكن إزالة القسمة وتحليلها بواسطة SDS-PAGE لتحليلها على مستوى الببتيد قبل دمج العينات.

5. ألكلة الببتيد وتحلية / تنظيف

  1. أعد تعليق الببتيدات المجففة بإضافة حجم صغير من 100 mM ABC buffer ، درجة الحموضة 8.0 (لا تزيد عن 500 ميكرولتر) ، باستخدام micropipette. استخدم صوتنة متكررة لمدة 15-30 ثانية في وقت واحد باستخدام سونيكاتور حمام بإخراج 250 واط ودوامة للذوبان والنقل إلى أنبوب 2 مل.
    ملاحظة: يعتمد حجم 100 mM ABC ، الرقم الهيدروجيني 8.0 المراد إضافته على الحجم اللازم لإعادة تعليق DTT عند مولارية 150 mM. سيحتاج المستخدمون إلى تحديد مقدار DTT الموجود في عينتهم بناء على ما تمت إضافته في الأصل في الخطوة 4.1.
  2. أضف ما يكفي من محلول المخزون المركز (600 مللي مول) من يودواسيتاميد (IAA) المذاب في ABC باستخدام ماصة دقيقة لتحقيق نسبة مولار 1: 4 من DTT: IAA واحتضان العينات في RT لمدة 1 ساعة مع الاهتزاز عند 850 دورة في الدقيقة.
  3. قم بتحمض العينات إلى درجة الحموضة < 3 عن طريق إضافة TFA المركز (10٪) باستخدام ماصة دقيقة وإجراء تحلية العينة باستخدام تنظيف المرحلة العكسية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  4. ضع الببتيدات النظيفة في مكثف فراغ حتى تجف. قم بتخزين الببتيدات الجافة في -80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.

6. الكروماتوغرافيا السائلة - مطياف الكتلة الترادفية

  1. إعادة تعليق الببتيدات المجففة عن طريق صوتنة متكررة لمدة 15-30 ثانية في وقت واحد باستخدام سونيكاتور الحمام مع إخراج 250 واط ودوامة في 20-40 ميكرولتر من الماء الذي يحتوي على 3 ٪ ACN. تحديد تركيز الببتيد عن طريق إجراء اختبار BCA وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  2. افصل العينات حسب LC و MS / MS في المرحلة العكسية كما هو موضح سابقا6 وسجل أطياف MS1 على مدى m / z من 400-2000. تأكد من استخدام تفكك تصادم عالي الطاقة (HCD) للحصول على معلومات شدة أيون المراسل لتحليل الببتيدات ذات العلامات المتساوية. راجع أقسام الأساليب في التقارير السابقة لمزيد من التفاصيل حول ظروف تشغيل الأداة 27,30 وتحليل بيانات MS27,31.
    ملاحظة: يمكن استخدام أنظمة أو إعدادات LC-MS / MS مختلفة لتحليل عينات الببتيد. تعتمد تغطية وحساسية تحديد الببتيد على النظام والإعدادات المستخدمة المعينة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

سيؤدي إكمال البروتوكول إلى إثراء محدد للغاية للببتيدات المحتوية على السيستين المؤكسدة سابقا ، غالبا مع خصوصية >95٪27،35،36. ومع ذلك، تتطلب عدة خطوات رئيسية للبروتوكول اهتماما خاصا، على سبيل المثال، الحجب الأولي للثيول الحر قبل تحلل العينة/التجانس، الذي يحظر الأكسدة الاصطناعية والتخصيب غير النوعي للثيول المؤكسد صناعيا25. يمكن تحليل العينات في عدة مراحل من البروتوكول وبطرق مختلفة ، بما في ذلك تحليل SDS-PAGE لكل من البروتينات والببتيدات. يسمح SDS-PAGE بالتحليل النوعي للعينات حيث تتيح عينات الثيول الكلي مقارنات النسبة المترية بين العينات لتحديد مستويات مختلفة من الأكسدة بسبب العلاجات / المحفزات (الشكل 2 أ). لمزيد من التحقيق في مستويات أكسدة البروتينات الفردية ، قد تتعرض المواد الهلامية SDS-PAGE للنشاف الغربي36 (الشكل 2 ب). يتيح ذلك تحليل نظام النموذج بمزيد من التفصيل ، وتوليد بيانات داعمة وفرضيات أخرى حول الشبكات والمسارات البيولوجية. يمكن أيضا استخدام هذه الطرق / البيانات الداعمة كمراقبة للجودة لتأكيد الاستجابات المتوقعة قبل إجراء مزيد من التحليل المتعمق مثل LC-MS / MS. يمكن استخدام كثافة أيون المراسل للببتيدات المحتوية على السيستين التي تم تحليلها بواسطة LC-MS / MS لتحديد القياس الكيميائي لأكسدة الثيول على مستويات موقع Cys الفردية (الشكل 2C ، D).

Figure 1
الشكل 1: سير عمل معالجة العينات. سير عمل معالجة العينات قابل للتكيف للتحقيق في أكسدة الثيول في أنواع العينات المختلفة والأنظمة البيولوجية. يسمح سير العمل بالتحقيق في الأكسدة على كل من مستويات البروتين والببتيد (على سبيل المثال ، SDS-PAGE ، اللطخة الغربية) بالإضافة إلى التغطية العميقة لتحديد كمي خاص بالموقع لمواقع السيستين الفردية باستخدام HPLC إلى جانب قياس الطيف الكتلي. يمكن إكمال معالجة العينات في أقل من ثلاثة أيام ، بما في ذلك إكمال العديد من الخطوات الحاسمة لتوليد بيانات عالية الجودة ومتسقة. يسمح تعدد إرسال العينات عبر وضع العلامات TMT بمعالجة عينات متعددة بالتوازي في نفس الوقت. يوضح مخطط وضع العلامات التمثيلي 10-plex TMT كيف يمكن ترتيب العينات مع الأخذ في الاعتبار الحديث المتبادل المحتمل من قناة الثيول الكلي. مع الشوائب النظيرية لكواشف TMT ، يمكن أن تساهم شدة إشارة قناة واحدة ذات كثافة عالية (مثل الثيول الكلي) في قناة أخرى ذات كثافة إشارة منخفضة وتؤثر على قياسهاالكمي 37. في المخطط ، من المتوقع أن تحتوي قناة الثيول الكلي المجمعة (مزيج من العينات الضابطة والتجريبية) على مستويات عالية من ببتيدات Cys ويتم تمييزها ب 131N ، والتي سيكون لها إشارة في القناة 130N. وبالتالي ، لا يتم استخدام القناة 130N في التجربة. يمكن العثور على مقدار الحديث المتبادل للقناة الذي تم إنشاؤه بواسطة ملصقات TMT في شهادات تحليل الشركة المصنعة لمجموعة مقابلة من الكاشف. تم تكييف هذا الرقم من Guo et al. ، بروتوكولات الطبيعة ، 201425. الاختصارات: NEM = N-إيثيل ماليميد ؛ DTT = ديثيوثريتول ؛ SDS-PAGE = الصوديوم دوديسيل سلفات بولي أكريلاميد هلام الكهربائي. SPE = استخراج المرحلة الصلبة ؛ LC-MS / MS = مطياف الكتلة الترادفي اللوني السائل ؛ TMT = علامة الكتلة الترادفية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: تحليل الببتيدات من إثراء RAC. (أ) تحليل SDS-PAGE للببتيدات المؤكسدة من خلايا RAW 264.7 المعالجة بالمؤكسد الكيميائي ، دياميد ، لمدة 30 دقيقة بتركيزات متزايدة (0.1 و 0.5 مللي مول) وثيول الببتيد الكلي. تم تكييف هذا الشكل الفرعي والشكل الفرعي D من Guo et al. ، Nature Protocols ، 2014 25. تم تصور الببتيدات عن طريق تلطيخ الفضة. (ب) عولجت خلايا RAW 264.7 بمؤكسدات خارجية (بيروكسيد الهيدروجين ودياميد) بتركيزات متزايدة. تم فصل شطف البروتين المخصب SSG الناتج بواسطة SDS-PAGE وتم فحصه لاحقا بواسطة اللطخة الغربية للبروتينات الفردية (GAPDH و TXN و PRDX3 و ANXA1). هذا الرقم الفرعي مقتبس من Su et al. ، بيولوجيا وطب الجذور الحرة ، 201436. (ج) بيانات طيف MS / MS التمثيلية للببتيد المحتوي على السيستين التي يتم عرضها في برنامج Xcalibur. تظهر الصورة الداخلية MS / MS شدة أيون المراسل المقابلة لنفس الببتيد في كل قناة TMT. في هذه التجربة ، تم تعيين عينة الثيول الكلي لملصق TMT 131N ، والذي يحتوي على أعلى كثافة من جميع القنوات المستخدمة في التجربة. (د) القياس المتكافئ للببتيدات الموسومة والمخصيبة والمؤكسدة الموسومة ب iTRAQ كما تم قياسها بواسطة LC-MS/MS. تم استخدام قناة الثيول الكلي كمرجع لحساب القياس الكيميائي للأكسدة بناء على نسبة شدة أيون المراسل لكل عينة مقارنة بقناة الثيول الكلية. الاختصارات: RAC = الالتقاط بمساعدة الراتنج ؛ SDS-PAGE = الصوديوم دوديسيل سلفات بولي أكريلاميد هلام الكهربائي. السيطرة = التحكم ؛ GAPDH = ديهيدروجيناز الجليسرالدهيد 3-فوسفات. TXN = ثيوريدوكسين ؛ PRDX3 = اختزال بيروكسيد يعتمد على ثيوريدوكسين ؛ ANXA1 = الملحق A1 ؛ LC-MS / MS = مطياف الكتلة الترادفي اللوني السائل ؛ MS / MS = قياس الطيف الكتلي الترادفي ؛ TMT = علامة الكتلة الترادفية ؛ iTRAQ = علامة متساوية الضغط للقياس الكمي النسبي والمطلق. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

اسم المخزن المؤقت قصد المحتويات
المخزن المؤقت أ التحلل / التجانس 250 مللي متر 2- (N- مورفولينو) حمض الإيثان سلفونيك (MES) ، درجة الحموضة 6.0 ؛ 1 ٪ دوديسيل سلفات الصوديوم (SDS) ؛ 1٪ تريتون X-100 ؛ و 100 mM N-إيثيل ماليميد (NEM)
المخزن المؤقت ب إعادة التعليق بعد ترسيب البروتين وأول تبادل مؤقت 250 مللي متر 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازين إيثان سلفونيك حمض (HEPES) ، درجة الحموضة 7.0 ؛ 8 م اليوريا 0.1٪ SDS
العازلة ج تقليل / إثراء / هضم البروتينات المحتوية على السيستين 25 mM HEPES ، درجة الحموضة 7.7 ؛ 1 م اليوريا 0.1٪ SDS
العازلة د التبادل المؤقت الثاني بعد التخفيض 25 mM HEPES ، درجة الحموضة 7.0 ، 8 M اليوريا ؛ 0.1٪ SDS
العازلة E غسل الراتنج بعد الترطيب 25 مللي متر HEPES ، درجة الحموضة 7.7

الجدول 1.  قائمة المخازن المؤقتة

معلومات تكميلية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم استخدام الالتقاط بمساعدة الراتنج عبر مجموعة متنوعة من أنواع العينات والأنظمة البيولوجية للتحقيق في التعديلات التأكسدية لبقايا السيستين25،29،30. تسمح هذه الطريقة بتقييم العينات على مستويات وقراءات متعددة ، بما في ذلك البروتينات والببتيدات باستخدام SDS-PAGE وتحليل اللطخة الغربية ، وكذلك مواقع السيستين الفردية باستخدام قياس الطيف الكتلي. بغض النظر عن نوع العينة أو نقطة النهاية النهائية ، تسمح الطريقة في النهاية بتخصيب عالي الكفاءة ومحدد للبروتينات والببتيدات المحتوية على السيستين38. باستخدام RAC ، حددنا التغييرات في حالة الأكسدة لما يصل إلى عدة آلاف من مواقع السيستين في أنظمة نموذجية مختلفة بعد الاضطراب.

في الفئران التي تعرضت لتقلصات العضلات المرهقة ، تم تحديد 2200 موقع S-glutathionylation ، مع أكثر من نصفها قد تغير بشكل كبير في مستويات S-glutathionylation 32. كما تم استخدام RAC لتحديد أكسدة الثيول القابلة للانعكاس لمواقع >2,100 في البكتيريا الزرقاء بعد التعرض لمثبط التمثيل الضوئي أو ظروف الإضاءة المختلفة6. في الآونة الأخيرة ، قمنا بتعريف أكسدة الثيول الكلية القابلة للانعكاس و S-glutathionylation ل >4000 موقع سيستين في خلايا البلاعم RAW 264.7 في ظل ظروف الراحة27. وبالمثل ، قام Behring et al. بتحديد أكسدة ~ 4200 موقع سيستين في خلايا A431 بعد تحفيز عامل نمو البشرة39. توضح هذه الدراسات متانة RAC لتحديد العديد من مواقع السيستين (عدة آلاف على الأقل) التي تخضع لأكسدة ثيول عكسية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تعزز تجزئة العينات تغطية الببتيدات المستعادة من التجربة.

وخارج نطاق الضوابط التجريبية، حيث يمكن استخدام عينات مراقبة إيجابية أو سلبية لتأكيد الاستجابات البيولوجية للنظام النموذجي، يمكن إجراء الإثراء الكلي للثيول بالتوازي مع أكسدة الثيول. توفر عينة الثيول الكلي هذه كلا من المقارنات المتكافئة وخط الأساس الذي يمكن من خلاله مقارنة العينات التجريبية أو المعالجة. باختصار ، توفر عينة الثيول الكلي هذه قياسا للعدد الإجمالي لثيول السيستين لموقع Cys معين في عينة معينة. تم اعتماد هذا المفهوم أيضا بواسطة طريقة OxiTMT ، التي تولد عينات تحتوي على ثيول منخفض تماما يمثل "محتوى السيستين الكلي" للمقارنة مع السيستينالمؤكسد 40.

على عكس OxiTMT ، فإن RAC غير مقيد بعدد plex من iodoTMT وبالتالي يمكنه دمج المزيد من قنوات الثيول الإجمالية لتمثيل محتوى الثيول لأنواع العينات المتعددة المستخدمة في الدراسة بشكل أفضل. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى إعداد عينة عالمية (غير خاضعة للإثراء) بالتوازي مع سير عمل بروتينات الأكسدة والاختزال للثيول للتحقق مما إذا كانت وفرة البروتين قد تغيرت في أنواع مختلفة من العينات. نظرا لأن الطريقة قابلة للتكيف مع أنواع متعددة من تعديلات الأكسدة والاختزال ، يجب مراعاة الضوابط المناسبة للتعديل المحدد للاهتمام. على سبيل المثال ، الأشعة فوق البنفسجية وكلوريد الزئبق كلاهما فعال في شق SNO من البروتينات ، مما يخلق تحكما سلبيا فعالا لقياس SNO 7,25. التحكم الفعال في فحص البروتينات المعدلة SSG هو إغفال إنزيم الجلوتاريدوكسين من كوكتيل الاختزال أثناء خطوة الاختزال. نظرا للخصوصية العالية نسبيا للجلوتاريدوكسين ، فإن إغفاله يلغي تقليل البروتينات المعدلة SSG ويمنعها من الخضوع لتبادل ثاني كبريتيد وفي النهاية من الإثراء في التحليل النهائي36.

هناك العديد من الخطوات داخل سير العمل ل RAC والتي تعتبر أساسية لتوليد بيانات عالية الجودة وقابلة للتكرار. واحدة من الخطوات الحاسمة الأولى ، والأهم من ذلك ، هي ألكلة / حجب الثيول الحر باستخدام عامل الألكلة المنفذ للغشاء ، N-ethylmaleimide (NEM) ، والذي يتفاعل بسرعة عبر نطاق واسع من الأس الهيدروجيني41,42. وتحظر هذه الخطوة أكسدة الثيول الوليدة أثناء معالجة العينات وتخفف من الإثراء غير النوعي لهذه الثيولات المؤكسدة صناعيا أثناء التخصيب بتبادل ثاني كبريتيد. سيؤدي عدم كفاية الألكلة إلى زيادة الخلفية وإشارة إيجابية كاذبة ، كما تم تحديده في تقرير سابق6.

ومع ذلك ، نظرا لتفاعله العالي وقدرته على منع الثيول الحر ، يجب أيضا توخي الحذر لضمان إزالته الكاملة من العينات قبل التخصيب ، حيث يمكن لأي NEM متبقي أن يرتبط ويتداخل مع اقتران الراتنج ، مما يؤدي في النهاية إلى فقدان الإشارة بسبب انخفاض في ارتباط البروتين. يتم تحقيق ذلك عن طريق إجراء ترسيب الأسيتون وعدة جولات من التبادل المؤقت باستخدام مرشحات قطع الوزن الجزيئي. مراقبة والحفاظ على درجة الحموضة المناسبة في جميع أنحاء البروتوكول أمر بالغ الأهمية أيضا. يتم الحفاظ على درجة حموضة 6.0 للتخفيف من خلط ثاني كبريتيد وتشكيل ثاني كبريتيد مختلط قبل التخصيب. تشمل الخطوات الأخرى التي يجب توخي الحذر الشديد فيها خطوات التخصيب والشطف ، حيث تكون قيم الأس الهيدروجيني 7.7 و 8.0 مطلوبة للتخصيب والشطف المناسبين ، على التوالي. ستؤدي قيم الأس الهيدروجيني الخاطئة خلال هذه الخطوات إلى انخفاض أو فقدان الإشارة.

حتى الآن ، هناك العديد من الطرق القائمة على الكيمياء بخلاف RAC التي تستخدم على نطاق واسع لدراسة أكسدة ثيول السيستين ، بما في ذلك الطريقة الأكثر استخداما ، تقنية تبديل البيوتين43,44. الشيء الوحيد الذي تشترك فيه كل هذه الطرق ، بما في ذلك RAC ، هو أنها تستند إلى طرق غير مباشرة للكشف عن السيستين المؤكسد. يعتمدون على مواد وسيطة معدلة كيميائيا من الثيول المؤكسد الأصلي للكشف. ومع ذلك ، فإن السمة الرئيسية التي تميز RAC عن الطرق الأخرى هي القدرة على جمع بيانات كمية متعددة الإرسال عن مواقع سيستين محددة من الثيول المؤكسد.

يتم تنفيذ الطريقة باستخدام البروتينات / الببتيدات المرتبطة تساهميا بالراتنج ، مما يسمح بتنفيذ خطوات المتابعة (على سبيل المثال ، الاختزال ، ووضع العلامات ، والغسيل ، والهضم) دون مزيد من المناولة. من خلال إجراء LC-MS / MS على عينات متعددة الإرسال ، يتم إنشاء مجموعات البيانات التي تمكن من الاكتشافات على مستوى البروتين. لوحظت آثار علاج أو محفزات محددة عبر مجموعات عينات متعددة على المستوى العالمي ، مما يتيح اكتشاف آليات ومسارات جديدة. سير العمل الأساسي قابل للتكيف بشكل كبير مع الاحتياجات المحددة للمستخدمين النهائيين ومجالات اهتمامهم. لا يزال التحقق المتعامد من النتائج التي لوحظت في بيانات قياس الطيف الكتلي يمثل تحديا. يعد الطفرات الموجهة للموقع لموقع معين واستخدام المقايسات التي تحقق في الآثار المترتبة على ذلك نهجا شائعا ولكنه كثيف العمالة.

لفحص المواقع المرشحة التي قد تكون ذات أهمية بيولوجية ، يمكن استخدام دراسات المعلوماتية الحيوية لمعرفة المزيد عن خصائص موقع بمستوى عال من الأكسدة ، مثل قرب الموقع من موقع نشط أو هيكل ثانوي27. قد تثبت محاكاة الديناميات الجزيئية أنها ذات قيمة كبيرة في الدراسات المستقبلية لأنها يمكن أن تكون نموذجا لآثار تعديلات الأكسدة والاختزال على بنية البروتين وتوفر نظرة ثاقبة حول كيفية تأثر وظيفة البروتين13,45. من خلال تنفيذ هذه الاستراتيجية القوية ، نأمل أن يستفيد المجتمع العلمي من تكييف هذه الطريقة مع نظام النموذج الفريد الخاص بهم وتوسيع المعرفة الحالية لبيولوجيا الأكسدة والاختزال عبر العديد من النماذج والأنظمة البيولوجية المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح ، مالي أو غير ذلك.

Acknowledgments

تم دعم أجزاء من العمل من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة R01 DK122160 و R01 HL139335 و U24 DK112349

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride Med Chem Express HY-101794 Reagent for in-house resin synthesis
2.0 mL LoBind centrifuge tubes Eppendorf 22431048
5.0 mL LoBind centrifuge tubes Eppendorf 30108310
5.0 mL round bottom tubes Falcon 352054
Acetone Fisher Scientific A949-1
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998
Activated Thiol–Sepharose 4B Sigma Aldrich T8512 Potential replacement for thiol-affinity resin
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter Millipore Sigma UFC5010BK
Ammonium bicarbonate Sigma Aldrich 09830
Bicinchonicic acid (BCA) Thermo Scientific 23227 Protein Assay Reagent
Centrifuge Eppendorf 5810R
Centrifuge Eppendorf 5415R
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific 20291
EDTA Sigma Aldrich E5134
HEPES buffer Sigma Aldrich H4034
Homogenizer BioSpec Products 985370
Iodoacetimide (IAA) Sigma Aldrich I1149
N-ethylmaleimide Sigma Aldrich 4259
NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow Cytiva 17-0906-01 Reagent for in-house resin synthesis
QIAvac 24 Plus vacuum manifold Qiagen 19413
Sodium chloride Sigma Aldrich S3014
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma Aldrich L6026
Sonicator Branson 1510R-MT
Spin columns Thermo Scientific 69705
Strata C18-E reverse phase columns Phenomenex 8B-S001-DAK Peptide desalting
Thermomixer Eppendorf 5355
Thiopropyl Sepharose 6B GE Healthcare 17-0420-01 Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).
TMT isobaric labels (16 plex) Thermo Scientific A44522 Peptide labeling reagent; available in multiple formats
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB) Sigma Aldrich T7408
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma Aldrich T6508
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
Trypsin Promega V5820
Urea Sigma Aldrich U5378
Vacufuge Plus speedvac Eppendorf 22820001 vacuum concentrator
Vortex mixer Scientific Industries SI-0236

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sies, H., Jones, D. P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).
  2. Adams, L., Franco, M. C., Estevez, A. G. Reactive nitrogen species in cellular signaling. Experimental Biology and Medicine. 240 (6), 711-717 (2015).
  3. Olson, K. R. The biological legacy of sulfur: A roadmap to the future. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 252, 110824 (2021).
  4. Sies, H. Oxidative eustress: on constant alert for redox homeostasis. Redox Biology. 41, 101867 (2021).
  5. Poole, L. B. The basics of thiols and cysteines in redox biology and chemistry. Free Radical Biology & Medicine. 80, 148-157 (2015).
  6. Guo, J., et al. Proteome-wide light/dark modulation of thiol oxidation in cyanobacteria revealed by quantitative site-specific redox proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (12), 3270-3285 (2014).
  7. Shi, X., Qiu, H. Post-translational S-nitrosylation of proteins in regulating cardiac oxidative stress. Antioxidants. 9 (11), 1051 (2020).
  8. Fra, A., Yoboue, E. D., Sitia, R. Cysteines as redox molecular switches and targets of disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 167 (2017).
  9. Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. Cysteine-based redox switches in enzymes. Antioxidants & Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).
  10. Go, Y. M., Jones, D. P. The redox proteome. Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26512-26520 (2013).
  11. Bak, D. W., Bechtel, T. J., Falco, J. A., Weerapana, E. Cysteine reactivity across the subcellular universe. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 96-105 (2019).
  12. Skryhan, K., et al. The role of cysteine residues in redox regulation and protein stability of Arabidopsis thaliana starch synthase 1. PLoS One. 10 (9), 0136997 (2015).
  13. Su, Z., et al. Global redox proteome and phosphoproteome analysis reveals redox switch in Akt. Nature Communications. 10 (1), 5486 (2019).
  14. Liebthal, M., Schuetze, J., Dreyer, A., Mock, H. -P., Dietz, K. -J. Redox conformation-specific protein-protein interactions of the 2-cysteine peroxiredoxin in Arabidopsis. Antioxidants. 9 (6), 515 (2020).
  15. Pace, N. J., Weerapana, E. Zinc-binding cysteines: diverse functions and structural motifs. Biomolecules. 4 (2), 419-434 (2014).
  16. Schwartz, P. A., et al. Covalent EGFR inhibitor analysis reveals importance of reversible interactions to potency and mechanisms of drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 173 (2014).
  17. Sevilla, E., Bes, M. T., González, A., Peleato, M. L., Fillat, M. F. Redox-based transcriptional regulation in prokaryotes: revisiting model mechanisms. Antioxidants & Redox Signaling. 30 (13), 1651-1696 (2018).
  18. Topf, U., et al. Quantitative proteomics identifies redox switches for global translation modulation by mitochondrially produced reactive oxygen species. Nature Communications. 9 (1), 324 (2018).
  19. Gao, X. -H., et al. Discovery of a redox thiol switch: implications for cellular energy metabolism. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (5), 852-870 (2020).
  20. Prus, G., Hoegl, A., Weinert, B. T., Choudhary, C. Analysis and interpretation of protein post-translational modification site stoichiometry. Trends in Biochemical Sciences. 44 (11), 943-960 (2019).
  21. Zhang, T., Gaffrey, M. J., Li, X., Qian, W. J. Characterization of cellular oxidative stress response by stoichiometric redox proteomics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (2), 182-194 (2021).
  22. Jaffrey, S. R., Erdjument-Bromage, H., Ferris, C. D., Tempst, P., Snyder, S. H. Protein S-nitrosylation: a physiological signal for neuronal nitric oxide. Nature Cell Biology. 3 (2), 193-197 (2001).
  23. Alcock, L. J., Perkins, M. V., Chalker, J. M. Chemical methods for mapping cysteine oxidation. Chemical Society Reviews. 47 (1), 231-268 (2018).
  24. Li, R., Kast, J. Biotin switch assays for quantitation of reversible cysteine oxidation. Methods in Enzymology. 585, 269-284 (2017).
  25. Guo, J., et al. Resin-assisted enrichment of thiols as a general strategy for proteomic profiling of cysteine-based reversible modifications. Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).
  26. Liu, T., et al. High-throughput comparative proteome analysis using a quantitative cysteinyl-peptide enrichment technology. Analytical Chemistry. 76 (18), 5345-5353 (2004).
  27. Duan, J., et al. Stochiometric quantification of the thiol redox proteome of macrophages reveals subcellular compartmentalization and susceptibility to oxidative perturbations. Redox Biology. 36, 101649 (2020).
  28. Mitchell, A. R., et al. Redox regulation of pyruvate kinase M2 by cysteine oxidation and S-nitrosation. Biochemical Journal. 475 (20), 3275-3291 (2018).
  29. Campbell, M. D., et al. Improving mitochondrial function with SS-31 reverses age-related redox stress and improves exercise tolerance in aged mice. Free Radical Biology & Medicine. 134, 268-281 (2019).
  30. Duan, J., et al. Quantitative profiling of protein S-glutathionylation reveals redox-dependent regulation of macrophage function during nanoparticle-induced oxidative stress. ACS Nano. 10 (1), 524-538 (2016).
  31. Wang, J., et al. Protein thiol oxidation in the rat lung following e-cigarette exposure. Redox Biology. 37, 101758 (2020).
  32. Kramer, P. A., et al. Fatiguing contractions increase protein S-glutathionylation occupancy in mouse skeletal muscle. Redox Biology. 17, 367-376 (2018).
  33. Chiao, Y. A., et al. Late-life restoration of mitochondrial function reverses cardiac dysfunction in old mice. Elife. 9, 55513 (2020).
  34. Forrester, M. T., et al. Site-specific analysis of protein S-acylation by resin-assisted capture. Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).
  35. Su, D., et al. Quantitative site-specific reactivity profiling of S-nitrosylation in mouse skeletal muscle using cysteinyl peptide enrichment coupled with mass spectrometry. Free Radical Biology & Medicine. 57, 68-78 (2013).
  36. Su, D., et al. Proteomic identification and quantification of S-glutathionylation in mouse macrophages using resin-assisted enrichment and isobaric labeling. Free Radical Biology & Medicine. 67, 460-470 (2014).
  37. Searle, B. C., Yergey, A. L. An efficient solution for resolving iTRAQ and TMT channel cross-talk. Journal of Mass Spectrometry. 55 (8), 4354 (2020).
  38. Duan, J., Gaffrey, M. J., Qian, W. J. Quantitative proteomic characterization of redox-dependent post-translational modifications on protein cysteines. Molecular BioSystems. 13 (5), 816-829 (2017).
  39. Behring, J. B., et al. Spatial and temporal alterations in protein structure by EGF regulate cryptic cysteine oxidation. Science Signaling. 13 (615), 7315 (2020).
  40. Shakir, S., Vinh, J., Chiappetta, G. Quantitative analysis of the cysteine redoxome by iodoacetyl tandem mass tags. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (15), 3821-3830 (2017).
  41. Gorin, G., Martic, P. A., Doughty, G. Kinetics of the reaction of N-ethylmaleimide with cysteine and some congeners. Archives of Biochemistry and Biophysics. 115 (3), 593-597 (1966).
  42. Hsu, M. -F., et al. Distinct effects of N-ethylmaleimide on formyl peptide- and cyclopiazonic acid-induced Ca2+ signals through thiol modification in neutrophils. Biochemical Pharmacology. 70 (9), 1320-1329 (2005).
  43. Li, R., Huang, J., Kast, J. Identification of total reversible cysteine oxidation in an atherosclerosis model using a modified biotin switch assay. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2026-2035 (2015).
  44. Wang, J., et al. Integrated dissection of cysteine oxidative post-translational modification proteome during cardiac hypertrophy. Journal of Proteome Research. 17 (12), 4243-4257 (2018).
  45. Patra, K. K., Bhattacharya, A., Bhattacharya, S. Molecular dynamics investigation of a redox switch in the anti-HIV protein SAMHD1. Proteins. 87 (9), 748-759 (2019).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 172 ، RAC ، TMT ، بروتينات الأكسدة والاختزال الثيول ، السيستين ، القياس الكيميائي PTM ، تعديلات الأكسدة والاختزال
الالتقاط بمساعدة الراتنج إلى جانب وضع علامات الكتلة الترادفية متساوية الضغط من أجل القياس الكمي المضاعف لأكسدة ثيول البروتين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gaffrey, M. J., Day, N. J., Li, X.,… More

Gaffrey, M. J., Day, N. J., Li, X., Qian, W. J. Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation. J. Vis. Exp. (172), e62671, doi:10.3791/62671 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter