Summary
L’oxydation des protéines thiols a des implications significatives dans des conditions physiologiques et physiopathologiques normales. Nous décrivons les détails d’une méthode quantitative de protéomique redox, qui utilise la capture assistée par résine, le marquage isobare et la spectrométrie de masse, permettant l’identification et la quantification spécifiques au site des résidus de cystéine oxydés de protéines de manière réversible.
Abstract
Les modifications oxydatives réversibles sur les thiols protéiques sont récemment apparues comme des médiateurs importants de la fonction cellulaire. Nous décrivons ici la procédure détaillée d’une méthode quantitative de protéomique redox qui utilise la capture assistée par résine (RAC) en combinaison avec le marquage isobare par étiquette de masse en tandem (TMT) et la chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS / MS) pour permettre la quantification stochiométrique multiplexée des thiols de protéines oxydées au niveau du protéome. Les informations quantitatives spécifiques au site sur les résidus oxydés de cystéine fournissent des informations supplémentaires sur les impacts fonctionnels de ces modifications.
Le flux de travail est adaptable à de nombreux types d’échantillons, y compris les cellules en culture (par exemple, mammifères, procaryotes) et les tissus entiers (par exemple, le cœur, les poumons, les muscles), qui sont initialement lysés / homogénéisés et avec des thiols libres alkylés pour empêcher l’oxydation artificielle. Les thiols de protéines oxydées sont ensuite réduits et capturés par une résine d’affinité thiol, qui rationalise et simplifie les étapes du flux de travail en permettant aux procédures de digestion, d’étiquetage et de lavage d’être effectuées sans transfert supplémentaire de protéines / peptides. Enfin, les peptides marqués sont élués et analysés par LC-MS/MS pour révéler des changements stœchiométriques complets liés à l’oxydation du thiol sur l’ensemble du protéome. Cette méthode améliore considérablement la compréhension du rôle de la régulation redox-dépendante dans les états physiologiques et physiopathologiques liés à l’oxydation des protéines thiol.
Introduction
Dans des conditions homéostatiques, les cellules génèrent des espèces réactives d’oxygène, d’azote ou de soufre qui aident à faciliter les processus, tels que le métabolisme et la signalisation 1,2,3, s’étendant à la fois aux procaryotes et aux eucaryotes. Les niveaux physiologiques de ces espèces réactives sont nécessaires au bon fonctionnement cellulaire, également connu sous le nom d'«eustress»1,4. En revanche, une augmentation des oxydants qui entraîne un déséquilibre entre les oxydants et les antioxydants peut provoquer un stress oxydatif, ou « détresse »1, qui entraîne des dommages cellulaires. Les oxydants transduisent les signaux aux voies biologiques en modifiant différentes biomolécules, y compris les protéines, l’ADN, l’ARN et les lipides. En particulier, les résidus de cystéine des protéines sont des sites très réactifs sujets à l’oxydation en raison du groupe thiol sur la cystéine, qui est réactif envers différents types d’oxydants5. Cela donne lieu à une gamme variée de modifications post-traductionnelles réversibles à base de redox (PTM) pour la cystéine, y compris la nitrosylation (SNO), la glutathionylation (SSG), la sulfénylation (SOH), la persulfidation (SSH), la polysulfuration (SSnH), l’acylation et les disulfures. Les formes irréversibles d’oxydation de la cystéine comprennent la sulfinylation (SO2H) et la sulfonylation (SO3H).
Les modifications oxydatives réversibles des résidus de cystéine peuvent jouer un rôle protecteur empêchant une oxydation irréversible ultérieure ou servir de molécules de signalisation pour les voies cellulaires en aval 6,7. La réversibilité de certains PTM redox thiol permet aux sites cystéine de fonctionner comme des « commutateurs redox»8,9, dans lesquels les changements dans l’état redox de ces sites modifient la fonction protéique pour réguler leur rôle dans les processus transitoires. Les effets modulateurs des PTM redox 10 ont été observés dans de nombreux aspects de la fonction protéique11, notamment la catalyse 12, les interactions protéine-protéine 13, le changement de conformation 14, la coordination des ions métalliques 15 ou la liaison inhibitrice pharmacologique 16. De plus, les PTM redox sont impliqués dans les sites cystéine des protéines qui régulent des voies telles que la transcription17, la traduction 18 ou le métabolisme19. Compte tenu de l’impact que les PTM redox ont sur la fonction protéique et les processus biologiques, il est important de quantifier l’étendue de l’oxydation qu’un site cystéine subit en réponse à une perturbation de l’état redox.
L’identification des sites de cystéine avec des états redox altérés est axée sur la comparaison de l’état d’oxydation au niveau spécifique du site entre les conditions normales et perturbées. Les mesures de changement de pli sont souvent utilisées pour déterminer quels sites sont significativement modifiés, car cela aide les utilisateurs à interpréter quels sites de cystéine peuvent être physiologiquement significatifs pour l’étude. Alternativement, les mesures stœchiométriques de l’oxydation réversible du thiol sur un type d’échantillon spécifique donnent une image générale de l’état physiologique par rapport à l’oxydation cellulaire, une mesure importante qui est souvent négligée et sous-utilisée. La stœchiométrie de modification est basée sur la quantification du pourcentage de thiol modifié par rapport au thiol protéique total (modifié et non modifié)20,21. En conséquence, les mesures stœchiométriques offrent une mesure plus précise que le changement de pli, en particulier lors de l’utilisation de la spectrométrie de masse. L’importance de l’augmentation de l’oxydation peut être plus facilement déterminée en utilisant la stœchiométrie pour déterminer l’occupation PTM d’un site particulier de cystéine. Par exemple, une multiplication par 3 de l’oxydation du thiol pourrait résulter d’une transition d’aussi peu que 1% à 3% ou aussi grande que 30% à 90%. Une multiplication par 3 de l’oxydation pour un site qui n’est occupé qu’à 1% peut avoir peu d’impact sur la fonction d’une protéine; Cependant, une multiplication par 3 pour un site avec un taux d’occupation de 30% à l’état de repos peut être plus substantiellement affectée. Les mesures stœchiométriques, lorsqu’elles sont effectuées entre les thiols oxydés totaux et des modifications oxydatives spécifiques, y compris la glutathionylation des protéines (SSG) et la nitrosylation (SNO), peuvent révéler des ratios et des informations quantitatives par rapport à des types de modification spécifiques.
Étant donné que l’oxydation réversible du thiol est généralement une modification post-traductionnelle de faible abondance, de multiples approches ont été développées pour l’enrichissement des protéines contenant ces modifications à partir d’échantillons biologiques. Une première approche conçue par Jaffrey et d’autres, appelée la technique de commutation de la biotine (BST)22, implique plusieurs étapes dans lesquelles les thiols non modifiés sont bloqués par alkylation, les thiols modifiés de manière réversible sont réduits en thiols libres naissants, les thiols libres naissants sont marqués avec de la biotine et les protéines marquées sont enrichies par la pulldown d’affinité de streptavidine. Cette technique a été utilisée pour établir le profil de l’ONS et de la SSG dans de nombreuses études et peut être adaptée pour sonder d’autres formes d’oxydation réversible du thiol23,24. Bien que la BST ait été utilisée pour sonder différentes formes d’oxydation réversible du thiol, l’une des préoccupations de cette approche est que l’enrichissement est affecté par la liaison non spécifique de protéines non biotinylées à la streptavidine. Une autre approche développée dans notre laboratoire, appelée capture assistée par résine (RAC)25,26 (Figure 1), contourne la question de l’enrichissement des groupes thiol via le système biotine-streptavidine.
Après la réduction des thiols oxydés de manière réversible, les protéines avec des thiols libres naissants sont enrichies par la résine d’affinité thiol, qui capture de manière covalente les groupes thiols libres, permettant un enrichissement plus spécifique des protéines contenant de la cystéine que la BST. Le couplage du RAC avec la puissance de multiplexage des progrès récents du marquage isobare et de la spectrométrie de masse crée un flux de travail robuste et sensible pour l’enrichissement, l’identification et la quantification des résidus de cystéine oxydés de manière réversible au niveau du protéome. Les progrès récents de la spectrométrie de masse ont permis un profilage beaucoup plus approfondi du protéome thiol redox, améliorant ainsi la compréhension de la cause et de l’effet de l’oxydation des protéines thiol27. Les informations obtenues à partir de données quantitatives spécifiques au site permettent d’étudier plus avant les impacts mécanistes et les effets en aval des modifications oxydatives réversibles28. L’utilisation de ce flux de travail a permis de mieux comprendre les impacts physiologiques de l’oxydation réversible de la cystéine par rapport aux événements physiologiques normaux tels que le vieillissement, dans lesquels les niveaux de SSG différaient en fonction de l’âge. Les effets du vieillissement sur la SSG ont été partiellement inversés à l’aide de SS-31 (élamipretide), un nouveau peptide qui améliore la fonction mitochondriale et réduit les niveaux de SSG chez les souris âgées, ce qui leur donne un profil SSG plus similaire à celui des jeunes souris29.
Il a été démontré que les conditions physiopathologiques attribuées à l’exposition aux nanoparticules impliquent la SSG dans un modèle de macrophage murin. En utilisant RAC couplé à la spectrométrie de masse, les auteurs ont montré que les niveaux de SSG étaient directement corrélés au degré de stress oxydatif et à l’altération de la fonction phagocytaire des macrophages. Les données ont également révélé des différences spécifiques à la voie dans la réponse à différents nanomatériaux manufacturés qui induisent différents degrés de stress oxydatif30. La méthode a également prouvé son utilité chez les espèces procaryotes, où elle a été appliquée pour étudier les effets des cycles diurnes chez les cyanobactéries photosynthétiques en ce qui concerne l’oxydation du thiol. De vastes changements dans l’oxydation du thiol à travers plusieurs processus biologiques clés ont été observés, y compris le transport d’électrons, la fixation du carbone et la glycolyse. De plus, grâce à la validation orthogonale, plusieurs sites fonctionnels clés ont été confirmés comme étant modifiés, suggérant des rôles régulateurs de ces modifications oxydatives6.
Nous décrivons ici les détails d’un flux de travail standardisé (Figure 1), démontrant l’utilité de l’approche RAC pour l’enrichissement des thiols de cystéine oxydés totaux des protéines et leur marquage ultérieur et leur quantification stœchiométrique. Ce flux de travail a été mis en œuvre dans des études de l’état redox dans différents types d’échantillons, y compris les cultures cellulaires27,30 et les tissus entiers (par exemple, muscle squelettique, cœur, poumon)29,31,32,33. Bien qu’il ne soit pas inclus ici, le protocole RAC est également facilement adapté à l’étude de formes spécifiques de modifications redox réversibles, y compris SSG, SNO et S-acylation, comme mentionné précédemment25,29,34.
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Protocol
Toutes les procédures décrites dans le protocole concernant les échantillons/tissus animaux ou humains ont été approuvées et suivies par les lignes directrices institutionnelles du comité d’éthique de la recherche sur les humains et les animaux.
1. Homogénéisation/lyse des échantillons
- Échantillons de tissus congelés
- Hacher du tissu congelé (~30 mg) sur une lame de microscope en verre sur de la glace sèche à l’aide d’une lame de rasoir prérefroidie et d’une pince. Transférer le tissu haché dans un tube de polystyrène à fond rond prérefroidi de 5 mL contenant 700 μL de tampon A (voir le tableau 1) et incuber sur de la glace pendant 30 minutes, à l’abri de la lumière.
- Perturber le tissu pendant 30 s ou jusqu’à ce qu’il soit complètement homogénéisé à l’aide d’un homogénéisateur de tissu portatif. Placez les échantillons sur de la glace et laissez la mousse s’affaisser pendant encore 10 minutes.
REMARQUE: Une plaque à pâtisserie en aluminium placée sur de la glace sèche fournit une surface de travail stable et une plate-forme pour le traitement initial / hachage du tissu.
- Alternativement, utilisez des cultures cellulaires adhérentes dans des boîtes de culture de 100 mm comme matière première.
- Gardez les cellules sur de la glace et utilisez une pipette sérologique pour rincer les cellules deux fois avec 10 ml de PBS glacé contenant 100 mM NEM.
- Lyser les cellules en ajoutant 1 mL de tampon d’homogénéisation/lyse à froid et en grattant vigoureusement avec un racleur cellulaire rigide. Transférer le lysat dans un tube centrifuge de 2 mL à l’aide d’une micropipette.
REMARQUE : Le tampon de rinçage et le tampon de lyse peuvent être adaptés aux récipients de culture de différentes tailles. En règle générale, 2 à 5 millions de cellules sont nécessaires; Cependant, cela varie en fonction de l’efficacité de la lyse et du rendement en protéines pour des types de cellules spécifiques. Un tampon d’homogénéisation peut être préparé sans NEM pour les échantillons analysés pour les thiols totaux.
- Transvaser l’homogénat résultant (étape 1.1.2 ou 1.2.2) dans un tube à centrifuger de 2 mL à l’aide d’une micropipette et centrifuger à pleine vitesse (≥16 000 × g) à 4 °C pendant 10 min.
- Transférer le surnageant (~700 μL ou ~1 mL pour la culture cellulaire) à l’aide d’une micropipette dans un tube de microcentrifugation conique de 5 mL et incuber pendant 30 min à 55 °C dans l’obscurité en agitant à 850 tr/min.
- À l’aide d’une pipette sérologique en verre, ajouter 4 mL d’acétone glacée aux échantillons et incuber à -20 °C pendant la nuit pour la précipitation des protéines et l’élimination de l’excès de N-éthylmaléimide.
2. Capture assistée par résine
- Laver deux fois les pastilles de protéines précipitées avec de l’acétone en centrifugeant à 20 500 × g à 4 °C pendant 10 min, en décantant l’acétone, en éliminant toute acétone restante à l’aide d’une micropipette et en ajoutant 3 ml d’acétone fraîche et glacée à l’aide d’une pipette sérologique en verre. Inversez plusieurs fois pour mélanger. Après le deuxième lavage, laissez les granulés sécher à l’air pendant 1-2 minutes, en prenant soin de ne pas trop sécher car la remise en suspension peut devenir difficile.
- À l’aide d’une micropipette, ajouter 1 mL de tampon B (voir le tableau 1) et solubiliser la protéine en utilisant une sonication répétée pendant 15 à 30 s à la fois à l’aide d’un sonicateur de bain avec une sortie de 250 W et un bref tourbillon. Mesurer la concentration en protéines à l’aide du dosage de l’acide bicinchoninique (BCA) conformément au protocole du fabricant.
- Pour normaliser les concentrations de protéines dans les échantillons en vue d’un traitement ultérieur et assurer l’élimination complète de la NEM, transférer 500 μg de protéines dans un filtre centrifuge de 0,5 mL et 10 kDa à l’aide d’une micropipette et ajuster à un volume final de 500 μL avec tampon de remise en suspension.
- Centrifuger à 14 000 × g à température ambiante jusqu’à ce que le volume dans le filtre centrifuge soit inférieur à 100 μL. Prélever les échantillons en inversant le filtre dans un tube de collecte. Centrifuger à 1 000 × g pendant 2 min et ajuster à un volume final de 500 μL à l’aide du tampon C (voir tableau 1).
- Réduire les thiols protéiques en ajoutant 20 μL de dithiothréitol (DTT) à 500 mM à l’aide d’une micropipette jusqu’à une concentration finale de 20 mM et en incubant les échantillons pendant 30 min à 37 °C tout en agitant à 850 tr/min.
- Après réduction, transférer les échantillons à l’aide d’une micropipette dans des filtres centrifuges de 0,5 mL 10 kDa et centrifuger pendant 15 min à 14 000 × g à température ambiante ou jusqu’à ce que le volume dans le filtre centrifuge soit inférieur à 100 μL. Ajouter le tampon D (voir le tableau 1) pour porter le volume dans le filtre centrifuge à 500 μL.
- Répéter la centrifugation et l’ajouter à 500 μL à l’étape 2.6 trois fois, et après la quatrième centrifugation, prélever les échantillons en inversant le filtre dans un tube de collecte et en centrifugeant à 1 000 × g pendant 2 min.
- Mesurer la concentration en protéines à l’aide du dosage BCA selon le protocole du fabricant.
- Au cours de cet échange tampon, préparer la résine d’affinité thiol en pesant la quantité appropriée de résine (30 mg/échantillon) à l’aide d’une microbalance et en la transférant dans un tube à centrifuger de 50 mL. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique, ajouter de l’eau pour une concentration finale de 30 mg/mL de résine et incuber à température ambiante pendant 1 h en agitant pour une bonne hydratation de la résine.
REMARQUE: La résine d’affinité thiol mentionnée ci-dessus a été abandonnée par le fabricant. Un remplacement possible de cette résine d’affinité thiol est disponible dans le commerce. Cependant, ce remplacement a une capacité de liaison presque 5 fois inférieure (voir Informations supplémentaires). Alternativement, la résine thiol-affinité peut être synthétisée à l’aide de chlorhydrate de 2-(pyridyldithio) éthylamine et de résine activée par N-hydroxysuccinimide (voir Informations supplémentaires).- Après hydratation de la résine, placer les colonnes de spin sur un collecteur à vide et transférer 500 μL de la boue de résine à l’aide d’une micropipette à chaque colonne. Appliquer le vide pour éliminer l’eau; Répétez cette étape une fois pour obtenir un total de 30 mg de résine par colonne. Sinon, centrifuger à 1 000 × g pendant 2 minutes au lieu d’utiliser le collecteur à vide pour cela et toutes les étapes de lavage et d’élution de la résine.
REMARQUE: Couper l’extrémité d’une pointe de pipette de 1000 μL pour augmenter la taille de l’alésage aide au transfert de la résine. Il est important de triturer entre le pipetage pour s’assurer que la résine reste en suspension et que des quantités homogènes et égales de résine sont transférées à chaque colonne. - Laver la résine en ajoutant 500 μL d’eau ultrapure avec une micropipette et en appliquant le vide pour éliminer l’eau; Répétez cette opération 5 fois. Ensuite, lavez la résine 5 fois avec 500 μL de tampon E (voir Tableau 1).
NOTA: Une autre solution peut être utilisée par centrifugation à 1 000 x g pendant 2 minutes à la place d’un collecteur à vide pour toutes les étapes de lavage ultérieures. Toutes les étapes de lavage sont effectuées avec un volume de 500 μL. Lors de l’ajout de tampons de lavage à la colonne, ajoutez soigneusement avec suffisamment de force pour remettre complètement la résine en suspension tout en évitant les éclaboussures et la perte de résine; Cela permet un lavage complet et efficace de la résine.
- Après hydratation de la résine, placer les colonnes de spin sur un collecteur à vide et transférer 500 μL de la boue de résine à l’aide d’une micropipette à chaque colonne. Appliquer le vide pour éliminer l’eau; Répétez cette étape une fois pour obtenir un total de 30 mg de résine par colonne. Sinon, centrifuger à 1 000 × g pendant 2 minutes au lieu d’utiliser le collecteur à vide pour cela et toutes les étapes de lavage et d’élution de la résine.
- À l’aide d’une micropipette, transférer 150 μg de protéines de chaque échantillon réduit dans un nouveau tube et ajuster à un volume final de 120 μL de tampon C (voir le tableau 1). Transférer la solution protéique à l’aide d’une micropipette dans une colonne d’essorage bouché contenant la résine, placer le bouchon sur la colonne et incuber pendant 2 h à température ambiante en agitant à 850 tr/min.
- Laver la résine cinq fois avec 25 mM HEPES, pH 7,0; 8 M d’urée; suivi de cinq fois avec 2 M NaCl; suivi de cinq fois avec 80% d’acétonitrile (ACN) avec 0,1% d’acide trifluoroacétique (TFA); et enfin cinq fois avec 25 mM HEPES, pH 7,7, comme décrit à l’étape 2.8.2 et remplacer le bouchon.
REMARQUE : Les échantillons peuvent être élués ici pour analyse au niveau de la protéine (p. ex. électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE), transfert Western) comme décrit à l’étape 4.1.
3. Digestion tryptique sur résine et marquage TMT
- Préparer suffisamment de solution de trypsine modifiée de qualité séquentielle pour 6 à 8 μg par échantillon en la solubilisant à une concentration de 0,5 μg/μL dans le tampon C (voir le tableau 1) de sorte que le volume final permette d’obtenir au moins 120 μL par échantillon. À l’aide d’une micropipette, ajouter 120 μL de cette solution de trypsine aux échantillons et incuber pendant une nuit à 37 °C en agitant à 850 tr/min.
REMARQUE: Pour augmenter l’efficacité de la digestion, une étape de digestion supplémentaire peut être incluse le lendemain en retirant la solution de trypsine et en la remplaçant par une solution fraîche, et continuer la digestion pendant 2 h. - Laver la résine cinq fois avec 25 mM HEPES, pH 7,0; suivi de cinq fois 2 M NaCl; suivi de cinq fois avec 80% ACN avec 0,1% TFA; suivi de trois fois avec 25 mM HEPES, pH 7,7. Enfin, lavez la résine deux fois avec un tampon de bicarbonate de triéthylammonium 50 mM (TEAB) et replacez le bouchon.
- Préparer les réactifs de marquage TMT en les laissant d’abord se réchauffer à température ambiante avant de les faire tourner brièvement à l’aide d’une centrifugeuse à 16 000 × g. Ajouter 150 μL d’ACN anhydre à chaque flacon de réactif de marquage TMT à l’aide d’une micropipette. Incuber les flacons à température ambiante sur un thermomélangeur réglé à 850 tr/min pendant 5 min pour solubiliser complètement le réactif. Vortex brièvement et rotation vers le bas à 16 000 × g pour recueillir le réactif.
- À l’aide d’une micropipette, ajouter 40 μL de TEAB 100 mM à la résine lavée, puis ajouter 70 μL du réactif TMT dissous et incuber pendant 1 h à température ambiante en agitant à 850 tr/min. Conserver tout réactif TMT restant à -80 °C.
REMARQUE : Prenez note des étiquettes TMT individuelles attribuées à chaque échantillon biologique (Figure 1). - Lavez la résine cinq fois avec 80% d’ACN avec 0,1% de TFA, trois fois avec un tampon de bicarbonate d’ammonium (ABC) de 100 mM, pH 8,0 et deux fois avec de l’eau comme décrit précédemment et remplacez le bouchon.
4. Élution peptidique
- Éluder les peptides marqués en ajoutant 100 μL de DTT 20 mM dans 100 mM ABC, pH 8,0, à chaque colonne à l’aide d’une micropipette et incuber à température ambiante pendant 30 min sur un thermomélangeur réglé à 850 tr/min.
REMARQUE: Après l’ajout de TNT, la résine s’agglutine. La résine peut être perturbée avec une pointe de pipette pour briser les amas et assurer l’élution complète des peptides. - Après cette incubation, placer la colonne sur un collecteur à vide destiné à l’extraction en phase solide (SPE), appliquer le vide et éluer les échantillons dans un tube microcentrifuge de 5 mL. Répétez cette étape une fois.
- Enfin, ajouter 100 μL d’ACN à 80 % avec 0,1 % de TFA, incuber pendant 10 min à température ambiante et éluer dans le même tube à centrifuger de 5 mL. Recueillir toutes les fractions dans le même tube microcentrifuge de 5 mL.
REMARQUE : Pour éviter la perte d’échantillon, des tubes à faible liaison doivent être utilisés pour l’élution et les volumes doivent être maintenus à un volume égal ou inférieur à un volume de 4,0 mL pour un seul tube de 5 mL. - Placer les échantillons élués dans un concentrateur sous vide jusqu’à ce qu’ils soient secs. Conservez les peptides secs à -80 °C et remettez-les en suspension plus tard.
NOTE: Les échantillons peuvent également être élués séparément, et une partie aliquote peut être retirée et analysée par SDS-PAGE pour analyse au niveau peptidique avant de combiner les échantillons.
5. Alkylation peptidique et dessalage/nettoyage
- Remettez en suspension les peptides séchés en ajoutant un petit volume de tampon ABC de 100 mM, pH 8,0 (pas plus de 500 μL), à l’aide d’une micropipette. Utilisez une sonication répétée pendant 15 à 30 s à la fois à l’aide d’un sonicateur de bain d’une puissance de 250 W et d’un vortex pour solubiliser et transférer dans un tube de 2 mL.
NOTE: Le volume de 100 mM ABC, pH 8,0 à ajouter est basé sur le volume nécessaire pour remettre en suspension le DTT à une molarité de 150 mM. Les utilisateurs devront déterminer la quantité de TNT présente dans leur échantillon en fonction de ce qui a été ajouté à l’origine à l’étape 4.1. - Ajouter suffisamment de solution mère concentrée (600 mM) d’iodoacétamide (IAA) dissous dans ABC à l’aide d’une micropipette pour obtenir un rapport molaire de DTT:IAA de 1:4 et incuber les échantillons à TA pendant 1 h en agitant à 850 tr/min.
- Acidifier les échantillons à pH < 3 en ajoutant du TFA concentré (10%) à l’aide d’une micropipette et effectuer le dessalage de l’échantillon en utilisant le nettoyage en phase inverse selon les instructions du fabricant.
- Placez les peptides propres dans un concentrateur sous vide jusqu’à ce qu’ils soient secs. Conservez les peptides secs à -80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie.
6. Chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem
- Remettez en suspension les peptides séchés par sonication répétée pendant 15-30 s à la fois en utilisant un sonicateur de bain avec une sortie de 250 W et en vortex dans 20-40 μL d’eau contenant 3% d’ACN. Déterminer la concentration de peptides en effectuant un test BCA selon le protocole du fabricant.
- Séparer les échantillons par phase inverse LC et MS/MS comme décrit précédemment6 et enregistrer les spectres MS1 sur la plage m/z de 400-2000. S’assurer que la dissociation collisionnelle à haute énergie (HCD) est utilisée pour obtenir des informations sur l’intensité des ions rapporteurs pour l’analyse de peptides marqués isobarement. Voir les sections méthodes des rapports précédents pour plus de détails sur les conditions de fonctionnement des instruments 27,30 et l’analyse des données MS27,31.
REMARQUE: Différents systèmes ou paramètres LC-MS / MS peuvent être utilisés pour analyser les échantillons de peptides. La couverture et la sensibilité de l’identification peptidique dépendront du système particulier et des paramètres utilisés.
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Representative Results
L’achèvement du protocole entraînera un enrichissement hautement spécifique de peptides contenant de la cystéine anciennement oxydés, souvent avec une spécificité de >95% 27,35,36. Cependant, plusieurs étapes clés du protocole nécessitent une attention particulière, par exemple le blocage initial des thiols libres avant la lyse/homogénéisation de l’échantillon, qui interdit l’oxydation artificielle et l’enrichissement non spécifique des thiols oxydés artificiellement25. Les échantillons peuvent être analysés à plusieurs étapes du protocole et par différentes méthodes, y compris l’analyse SDS-PAGE des protéines et des peptides. SDS-PAGE permet l’analyse qualitative des échantillons dans laquelle les échantillons de thiol total permettent des comparaisons ratio-métrique entre les échantillons pour déterminer différents niveaux d’oxydation dus aux traitements / stimuli (Figure 2A). Pour étudier plus avant les niveaux d’oxydation de protéines individuelles, les gels SDS-PAGE peuvent être soumis au Western blot36 (Figure 2B). Cela permet d’analyser le système modèle plus en détail, générant des données à l’appui et d’autres hypothèses sur les réseaux et les voies biologiques. Ces méthodes/données à l’appui peuvent également être utilisées comme contrôle de la qualité pour confirmer les réponses attendues avant une analyse plus approfondie telle que LC-MS/MS. Les intensités d’ions rapporteur des peptides contenant de la cystéine analysés par LC-MS/MS peuvent être utilisées pour quantifier la stœchiométrie d’oxydation thiol au niveau du site Cys individuel (Figure 2C, D).
Figure 1 : Exemple de flux de travail de traitement. Le flux de travail de traitement des échantillons est adaptable pour étudier l’oxydation du thiol dans différents types d’échantillons et systèmes biologiques. Le flux de travail permet d’étudier l’oxydation aux niveaux des protéines et des peptides (par exemple, SDS-PAGE, Western blot) ainsi que la couverture profonde pour l’identification quantitative et spécifique au site des sites individuels de cystéine à l’aide de la CLHP couplée à la spectrométrie de masse. Le traitement des échantillons peut être effectué en aussi peu que trois jours, y compris l’achèvement de plusieurs étapes critiques pour la génération de données cohérentes et de qualité. Le multiplexage d’échantillons via l’étiquetage TMT permet le traitement simultané de plusieurs échantillons en parallèle. Le schéma représentatif d’étiquetage TMT 10-plex illustre comment les échantillons peuvent être organisés en tenant compte de la diaphonie potentielle du canal thiol total. Avec les impuretés isotopiques des réactifs TMT, l’intensité du signal d’un canal de haute intensité (comme le thiol total) peut contribuer à un autre canal à faible intensité de signal et influencer sa quantification37. Dans le schéma, un canal thiol total regroupé (une combinaison d’échantillons témoins et expérimentaux) devrait contenir des niveaux élevés de Cys-peptides et est marqué avec 131N, qui aura un signal dans le canal 130N. Ainsi, le canal 130N n’est pas utilisé dans l’expérience. La quantité de diaphonie de canal créée par les étiquettes TMT peut être trouvée dans les certificats d’analyse du fabricant pour un lot correspondant du réactif. Cette figure a été adaptée de Guo et al., Nature Protocols, 201425. Abréviations : NEM = N-éthylmaléimide; DTT = dithiothréitol; SDS-PAGE = électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium polyacrylamide; SPE = extraction en phase solide; LC-MS/MS = chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem; TMT = étiquette de masse en tandem. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Analyse des peptides issus de l’enrichissement RAC. (A) Analyse SDS-PAGE de peptides oxydés à partir de cellules RAW 264.7 traitées avec l’oxydant chimique, le diamide, pendant 30 minutes à des concentrations croissantes (0,1 et 0,5 mM) et de thiols peptidiques totaux. Cette sous-figure et cette sous-figure D sont adaptées de Guo et al., Nature Protocols, 2014 25. Les peptides ont été visualisés par coloration à l’argent. (B) Les cellules RAW 264,7 ont été traitées avec des oxydants exogènes (peroxyde d’hydrogène et diamide) à des concentrations croissantes. L’éluat de protéines enrichi en SSG qui en a résulté a été séparé par SDS-PAGE et sondé par transfert Western pour des protéines individuelles (GAPDH, TXN, PRDX3 et ANXA1). Cette sous-figure est adaptée de Su et al., Free Radical Biology and Medicine, 201436. (C) Données représentatives du spectre MS/MS d’un peptide contenant de la cystéine visualisées dans le logiciel Xcalibur. L’image MS/MS en médaillon montre les intensités d’ions rapporteurs correspondantes pour le même peptide dans chaque canal TMT. Dans cette expérience, l’échantillon de thiol total a été attribué au marqueur TMT 131N, qui a l’intensité la plus élevée de tous les canaux utilisés dans l’expérience. (D) Stœchiométrie de peptides marqués iTRAQ, enrichis et oxydés mesurés par LC-MS/MS. Le canal thiol total a été utilisé comme référence pour calculer la stœchiométrie de l’oxydation basée sur le rapport de l’intensité des ions rapporteurs de chaque échantillon par rapport à celle du canal thiol total. Abréviations : RAC = capture assistée par résine; SDS-PAGE = électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium polyacrylamide; Ctrl = contrôle; GAPDH = glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase; TXN = thiorédoxine; PRDX3 = peroxyde réductase dépendante de la thiorédoxine; ANXA1 = annexine A1; LC-MS/MS = chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem; MS/SM = spectrométrie de masse en tandem; TMT = étiquette de masse en tandem; iTRAQ = étiquette isobare pour la quantification relative et absolue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Nom de la mémoire tampon | But | Contenu |
| Tampon A | Lyse/homogénéisation | 250 mM d’acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (MES), pH 6,0; dodécylsulfate de sodium (SDS) à 1 %); 1% Triton X-100; et 100 mM de N-éthylmaléimide (NEM) |
| Tampon B | Resuspension après précipitation des protéines et premier échange tampon | 250 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinééthanésulfonique (HEPES), pH 7,0; 8 M d’urée; FDS de 0,1 % |
| Tampon C | Réduction/ Enrichissement/ Digestion des protéines contenant de la cystéine | 25 mM HEPES, pH 7,7; 1 M d’urée; FDS de 0,1 % |
| Tampon D | Deuxième échange de coussins après réduction | 25 mM HEPES, pH 7,0, 8 M d’urée; FDS de 0,1 % |
| Tampon E | Lavage de la résine après hydratation | 25 mM HEPES, pH 7,7 |
Tableau 1. Liste des tampons
Renseignements supplémentaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
La capture assistée par résine a été utilisée dans divers types d’échantillons et systèmes biologiques pour étudier les modifications oxydatives des résidus de cystéine25,29,30. Cette méthode permet d’évaluer des échantillons à plusieurs niveaux et lectures, y compris des protéines et des peptides à l’aide de SDS-PAGE et de Western blot, ainsi que des sites individuels de cystéine à l’aide de la spectrométrie de masse. Quel que soit le type d’échantillon ou le critère d’évaluation final, la méthode permet finalement un enrichissement très efficace et spécifique des protéines et peptides contenant de la cystéine38. À l’aide de RAC, nous avons identifié des changements dans l’état d’oxydation de plusieurs milliers de sites de cystéine dans différents systèmes modèles à la suite d’une perturbation.
Chez les souris soumises à des contractions musculaires fatigantes, 2 200 sites de S-glutathionylation ont été identifiés, dont plus de la moitié présentaient des niveaux significativement modifiés de S-glutathionylation32. Le RAC a également été utilisé pour établir le profil de l’oxydation réversible du thiol de >2 100 sites chez les cyanobactéries à la suite d’une exposition à un inhibiteur de la photosynthèse ou à différentes conditions lumineuses6. Récemment, nous avons profilé l’oxydation totale réversible du thiol et la S-glutathionylation de >4 000 sites de cystéine dans des cellules de macrophages RAW 264,7 dans des conditions de repos27. De même, Behring et al. ont quantifié l’oxydation de ~4 200 sites de cystéine dans les cellules A431 après la stimulation du facteur de croissance épidermique39. Ces études démontrent la robustesse du RAC pour identifier de nombreux sites cystéine (au moins plusieurs milliers) qui subissent une oxydation réversible des thiols. De plus, le fractionnement des échantillons peut améliorer la couverture des peptides récupérés lors d’une expérience.
En dehors des contrôles expérimentaux, dans lesquels des échantillons témoins positifs ou négatifs peuvent être utilisés pour confirmer les réponses biologiques du système modèle, l’enrichissement total en thiol peut être effectué parallèlement à l’oxydation des thiols. Cet échantillon de thiol total fournit à la fois des comparaisons stœchiométriques et une base de référence à partir de laquelle des échantillons expérimentaux ou traités peuvent être comparés. En bref, cet échantillon de thiol total fournit une mesure du nombre total de thiols de cystéine pour un site Cys donné dans un échantillon donné. Ce concept a également été adopté par la méthode OxiTMT, qui génère des échantillons contenant des thiols totalement réduits qui représentent la « teneur totale en cystéine » pour comparaison avec les cystéines oxydées40.
Contrairement à l’OxiTMT, le RAC n’est pas limité par le nombre plex d’iodoTMT et peut donc incorporer plus de canaux thiols totaux pour mieux représenter la teneur en thiol de plusieurs types d’échantillons utilisés dans une étude. De plus, la préparation d’un échantillon global (non soumis à enrichissement) parallèlement au flux de travail protéomique thiol redox peut être nécessaire pour vérifier si l’abondance des protéines est modifiée dans différents types d’échantillons. Comme la méthode est adaptable à plusieurs types de modifications redox, des contrôles appropriés pour la modification spécifique d’intérêt doivent être envisagés. Par exemple, la lumière ultraviolette et le chlorure de mercure sont tous deux efficaces pour cliver l’ONS des protéines, créant ainsi un contrôle négatif efficace pour la mesure de l’ONS 7,25. Un contrôle efficace pour étudier les protéines modifiées par SSG est l’omission de l’enzyme glutarédoxine du cocktail de réduction pendant l’étape de réduction. En raison de la spécificité relativement élevée de la glutarédoxine, son omission élimine la réduction des protéines modifiées par la SSG et les empêche de subir un échange disulfure et finalement d’être enrichies en analyse finale36.
Plusieurs étapes du flux de travail pour RAC sont fondamentales pour la génération de données de qualité et reproductibles. L’une des premières étapes cruciales, et la plus importante, est l’alkylation/blocage des thiols libres à l’aide de l’agent alkylant perméable à la membrane, le N-éthylmaléimide (NEM), qui réagit rapidement sur une large plage de pH 41,42. Cette étape interdit l’oxydation des thiols naissants pendant le traitement des échantillons et atténue l’enrichissement non spécifique de ces thiols oxydés artificiellement lors de l’enrichissement par échange de disulfure. Une alkylation inadéquate entraînera une augmentation du bruit de fond et des signaux faussement positifs, comme cela a été identifié dans un rapport précédent6.
Cependant, en raison de sa réactivité élevée et de sa capacité à bloquer les thiols libres, des précautions doivent également être prises pour assurer son élimination complète des échantillons avant l’enrichissement, où tout NEM restant peut se lier et interférer avec le couplage de la résine, entraînant finalement la perte de signal due à une diminution de la liaison aux protéines. Ceci est accompli en effectuant la précipitation de l’acétone et plusieurs cycles d’échange tampon à l’aide de filtres de coupure de poids moléculaire. La surveillance et le maintien d’un pH approprié tout au long du protocole sont également cruciaux. Un pH de 6,0 est maintenu pour atténuer le brassage du disulfure et la formation de disulfures mixtes avant l’enrichissement. D’autres étapes où des précautions supplémentaires doivent être prises comprennent les étapes d’enrichissement et d’élution, dans lesquelles des valeurs de pH de 7,7 et 8,0 sont requises pour un enrichissement et une élution appropriés, respectivement. Des valeurs de pH erronées au cours de ces étapes entraîneront une diminution ou une perte de signal.
À ce jour, il existe de nombreuses méthodes basées sur la chimie en dehors de RAC qui sont largement utilisées pour étudier l’oxydation de la cystéine thiol, y compris la méthode la plus utilisée, la technique de commutation de biotine43,44. Une chose que toutes ces méthodes ont en commun, y compris RAC, est qu’elles sont basées sur des méthodes indirectes pour la détection des cystéines oxydées. Ils s’appuient sur des intermédiaires chimiquement modifiés du thiol oxydé d’origine pour la détection. Cependant, un attribut clé qui distingue RAC des autres méthodes est la capacité de collecter des données quantitatives multiplexées sur des sites spécifiques de cystéine de thiols oxydés.
La méthode est réalisée avec des protéines/peptides liés de manière covalente à la résine, ce qui permet d’effectuer les étapes suivantes (par exemple, réduction, étiquetage, lavage, digestion) sans autre manipulation. En effectuant des LC-MS/MS sur des échantillons multiplexés, des ensembles de données sont générés qui permettent des découvertes à l’échelle du protéome. Les effets d’un traitement ou de stimuli spécifiques sur plusieurs groupes d’échantillons sont observés au niveau mondial, ce qui permet la découverte de nouveaux mécanismes et voies. Le flux de travail fondamental est hautement adaptable aux besoins spécifiques et aux domaines d’intérêt des utilisateurs finaux. La validation orthogonale des résultats observés dans les données de spectrométrie de masse reste un défi. La mutagénèse dirigée d’un site spécifique et l’utilisation de tests qui étudient les effets qui en découlent constituent une approche courante mais exigeante en main-d’œuvre.
Pour sélectionner les sites candidats qui peuvent être biologiquement significatifs, des études bioinformatiques peuvent être utilisées pour en apprendre davantage sur les caractéristiques d’un site présentant un niveau élevé d’oxydation, telles que la proximité d’un site à un site actif ou à une structure secondaire27. Les simulations de dynamique moléculaire peuvent s’avérer d’une grande valeur dans les études futures, car elles peuvent modéliser les effets des modifications redox sur la structure des protéines et fournir un aperçu de la façon dont la fonction d’une protéine peut être affectée13,45. En mettant en œuvre cette stratégie robuste, nous espérons que la communauté scientifique bénéficiera de l’adaptation de cette méthode à son propre système de modèle unique et élargira les connaissances actuelles de la biologie redox à de nombreux modèles et systèmes biologiques différents.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts, financier ou autre.
Acknowledgments
Certaines parties du travail ont été soutenues par les subventions NIH R01 DK122160, R01 HL139335 et U24 DK112349
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride | Med Chem Express | HY-101794 | Reagent for in-house resin synthesis |
| 2.0 mL LoBind centrifuge tubes | Eppendorf | 22431048 | |
| 5.0 mL LoBind centrifuge tubes | Eppendorf | 30108310 | |
| 5.0 mL round bottom tubes | Falcon | 352054 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
| Activated Thiol–Sepharose 4B | Sigma Aldrich | T8512 | Potential replacement for thiol-affinity resin |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter | Millipore Sigma | UFC5010BK | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Bicinchonicic acid (BCA) | Thermo Scientific | 23227 | Protein Assay Reagent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Homogenizer | BioSpec Products | 985370 | |
| Iodoacetimide (IAA) | Sigma Aldrich | I1149 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma Aldrich | 4259 | |
| NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow | Cytiva | 17-0906-01 | Reagent for in-house resin synthesis |
| QIAvac 24 Plus vacuum manifold | Qiagen | 19413 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L6026 | |
| Sonicator | Branson | 1510R-MT | |
| Spin columns | Thermo Scientific | 69705 | |
| Strata C18-E reverse phase columns | Phenomenex | 8B-S001-DAK | Peptide desalting |
| Thermomixer | Eppendorf | 5355 | |
| Thiopropyl Sepharose 6B | GE Healthcare | 17-0420-01 | Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details). |
| TMT isobaric labels (16 plex) | Thermo Scientific | A44522 | Peptide labeling reagent; available in multiple formats |
| Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin | Promega | V5820 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Vacufuge Plus speedvac | Eppendorf | 22820001 | vacuum concentrator |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 |
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