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Biochemistry

प्रोटीन थिओल ऑक्सीकरण के मल्टीप्लेक्स परिमाणीकरण के लिए आइसोबेरिक टेंडम मास टैग लेबलिंग के साथ युग्मित राल-असिस्टेड कैप्चर

Published: June 21, 2021 doi: 10.3791/62671
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Integrative Omics, Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, 2Bioproducts Sciences and Engineering Laboratory, Department of Biological Systems Engineering, Washington State University

Summary

प्रोटीन थिओल ऑक्सीकरण में सामान्य शारीरिक और पैथोफिजियोलॉजिकल स्थितियों के तहत महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं। हम एक मात्रात्मक रेडॉक्स प्रोटिओमिक्स विधि के विवरण का वर्णन करते हैं, जो राल-सहायता प्राप्त कैप्चर, आइसोबेरिक लेबलिंग और मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करता है, जिससे साइट-विशिष्ट पहचान और प्रोटीन के विपरीत ऑक्सीकृत सिस्टीन अवशेषों का परिमाणीकरण सक्षम होता है।

Abstract

प्रोटीन थिओल पर प्रतिवर्ती ऑक्सीडेटिव संशोधन हाल ही में सेलुलर फ़ंक्शन के महत्वपूर्ण मध्यस्थों के रूप में उभरे हैं। यहां हम एक मात्रात्मक रेडॉक्स प्रोटिओमिक्स विधि की विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन करते हैं जो प्रोटिओम स्तर पर ऑक्सीकृत प्रोटीन थिओल के मल्टीप्लेक्स स्टोचियोमेट्रिक परिमाणीकरण की अनुमति देने के लिए टेंडम मास टैग (टीएमटी) आइसोबेरिक लेबलिंग और तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस / एमएस) के साथ संयोजन में राल-असिस्टेड कैप्चर (आरएसी) का उपयोग करता है। ऑक्सीकृत सिस्टीन अवशेषों पर साइट-विशिष्ट मात्रात्मक जानकारी ऐसे संशोधनों के कार्यात्मक प्रभावों में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान करती है।

वर्कफ़्लो कई नमूना प्रकारों में अनुकूलनीय है, जिसमें सुसंस्कृत कोशिकाएं (जैसे, स्तनधारी, प्रोकैरियोटिक) और पूरे ऊतक (जैसे, हृदय, फेफड़े, मांसपेशी) शामिल हैं, जिन्हें शुरू में लाइस्ड / होमोजिनाइज्ड किया जाता है और कृत्रिम ऑक्सीकरण को रोकने के लिए मुक्त थिओल को अल्काइलेटेड किया जाता है। ऑक्सीकृत प्रोटीन थिओल को तब कम किया जाता है और एक थिओल-आत्मीयता राल द्वारा कैप्चर किया जाता है, जो प्रोटीन / पेप्टाइड्स के अतिरिक्त हस्तांतरण के बिना पाचन, लेबलिंग और धोने की प्रक्रियाओं को आगे बढ़ाने की अनुमति देकर वर्कफ़्लो चरणों को सुव्यवस्थित और सरल बनाता है। अंत में, लेबल किए गए पेप्टाइड्स को एलसी-एमएस / एमएस द्वारा पूरे प्रोटिओम में थिओल ऑक्सीकरण से संबंधित व्यापक स्टोइकोमेट्रिक परिवर्तनों को प्रकट करने के लिए एल्यूट और विश्लेषण किया जाता है। यह विधि प्रोटीन थिओल ऑक्सीकरण से संबंधित शारीरिक और पैथोफिजियोलॉजिकल राज्यों के तहत रेडॉक्स-निर्भर विनियमन की भूमिका की समझ में काफी सुधार करती है।

Introduction

होमियोस्टैटिक स्थितियों के तहत, कोशिकाएं प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन, नाइट्रोजन या सल्फर प्रजातियां उत्पन्न करती हैं जो प्रक्रियाओं को सुविधाजनक बनाने में मदद करती हैं, जैसे कि चयापचय और सिग्नलिंग 1,2,3, प्रोकैरियोट्स और यूकेरियोट्स दोनों तक फैली हुई हैं। इन प्रतिक्रियाशील प्रजातियों के शारीरिक स्तर उचित सेलुलर फ़ंक्शन के लिए आवश्यक हैं, जिन्हें 'यूस्ट्रेस' 1,4 के रूप में भी जाना जाता है। इसके विपरीत, ऑक्सीडेंट में वृद्धि जो ऑक्सीडेंट और एंटीऑक्सिडेंट के बीच असंतुलन की ओर ले जाती है, ऑक्सीडेटिव तनाव, या 'संकट' 1 का कारण बन सकती है, जो सेलुलर क्षति की ओर ले जाती है। ऑक्सीडेंट प्रोटीन, डीएनए, आरएनए और लिपिड सहित विभिन्न बायोमोलेक्यूल्स को संशोधित करके जैविक मार्गों पर संकेतों को ट्रांसड्यूस करते हैं। विशेष रूप से, प्रोटीन के सिस्टीन अवशेष अत्यधिक प्रतिक्रियाशील साइटें हैं जो सिस्टीन पर थिओल समूह के कारण ऑक्सीकरण के लिए प्रवण हैं, जो विभिन्न प्रकार के ऑक्सीडेंट5 के प्रति प्रतिक्रियाशील है। यह सिस्टीन के लिए प्रतिवर्ती रेडॉक्स-आधारित पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) की एक विविध श्रृंखला को जन्म देता है, जिसमें नाइट्रोसिलेशन (एसएनओ), ग्लूटाथियोनाइलेशन (एसएसजी), सल्फेनाइलेशन (एसओएच), परसल्फिडेशन (एसएसएच), पॉलीसल्फाइडेशन (एसएसएनएच), एसाइलेशन और डाइसल्फ़ाइड शामिल हैं। सिस्टीन ऑक्सीकरण के अपरिवर्तनीय रूपों में सल्फिनाइलेशन (एसओ2एच) और सल्फोनाइलेशन (एसओ3एच) शामिल हैं।

सिस्टीन अवशेषों के प्रतिवर्ती ऑक्सीडेटिव संशोधन आगे अपरिवर्तनीय ऑक्सीकरण को रोकने के लिए सुरक्षात्मक भूमिका निभा सकते हैं या डाउनस्ट्रीम सेलुलरमार्गों के लिए सिग्नलिंग अणुओं के रूप में काम कर सकते हैं। कुछ थिओल रेडॉक्स पीटीएम की रिवर्सबिलिटी सिस्टीन साइटों को "रेडॉक्स स्विच" 8,9 के रूप में कार्य करने की अनुमति देती है, जिसमें इन साइटों की रेडॉक्स स्थिति में परिवर्तन क्षणिक प्रक्रियाओं में उनकी भूमिका को विनियमित करने के लिए प्रोटीन फ़ंक्शन को बदल देता है। रेडॉक्स पीटीएम10 के मॉड्यूलेटरी प्रभावप्रोटीन फ़ंक्शन 11 के कई पहलुओं में देखे गए हैं, जिसमें उत्प्रेरण12, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन13, रचना परिवर्तन14, धातु आयन समन्वय15, या औषधीय अवरोधक बाइंडिंग16 शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, रेडॉक्स पीटीएम प्रोटीन के सिस्टीन साइटों में शामिल होते हैं जो प्रतिलेखन17, अनुवाद18, या चयापचय19 जैसे मार्गों को नियंत्रित करते हैं। प्रोटीन फ़ंक्शन और जैविक प्रक्रियाओं पर रेडॉक्स पीटीएम के प्रभाव को देखते हुए, ऑक्सीकरण की सीमा को निर्धारित करना महत्वपूर्ण है जो एक सिस्टीन साइट रेडॉक्स अवस्था के गड़बड़ी के जवाब में गुजरती है।

परिवर्तित रेडॉक्स अवस्थाओं के साथ सिस्टीन साइटों की पहचान सामान्य और परेशान स्थितियों के बीच साइट-विशिष्ट स्तर पर ऑक्सीकरण स्थिति की तुलना पर केंद्रित है। फोल्ड परिवर्तन माप का उपयोग अक्सर यह निर्धारित करने के लिए किया जाता है कि कौन सी साइटें काफी बदल गई हैं क्योंकि इससे उपयोगकर्ताओं को यह व्याख्या करने में मदद मिलती है कि अध्ययन के लिए सिस्टीन साइटें शारीरिक रूप से महत्वपूर्ण हो सकती हैं। वैकल्पिक रूप से, एक विशिष्ट नमूना प्रकार में प्रतिवर्ती थिओल ऑक्सीकरण के स्टोइकोमेट्रिक माप सेलुलर ऑक्सीकरण के संबंध में शारीरिक स्थिति की एक सामान्य तस्वीर देते हैं, एक महत्वपूर्ण माप जिसे अक्सर अनदेखा और कम उपयोग किया जाता है। संशोधन स्टोइकोमेट्री कुल प्रोटीन थिओल (संशोधित और असंशोधित) 20,21 के अनुपात के रूप में संशोधित थिओल के प्रतिशत को निर्धारित करने पर आधारित है। नतीजतन, स्टोइकोमेट्रिक माप फोल्ड परिवर्तन की तुलना में अधिक सटीक माप प्रदान करते हैं, खासकर जब मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करते हैं। ऑक्सीकरण में वृद्धि के महत्व को एक विशेष सिस्टीन साइट के पीटीएम अधिभोग को निर्धारित करने के लिए स्टोइकोमेट्री का उपयोग करके अधिक आसानी से पता लगाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, थिओल ऑक्सीकरण में 3 गुना वृद्धि 1% से 3% या 30% से 90% जितनी बड़ी संक्रमण के परिणामस्वरूप हो सकती है। एक साइट के लिए ऑक्सीकरण में 3 गुना वृद्धि जो केवल 1% अधिभोग पर है, प्रोटीन के कार्य पर बहुत कम प्रभाव डाल सकती है; हालांकि, आराम करने की स्थिति में 30% अधिभोग वाली साइट के लिए 3 गुना वृद्धि अधिक प्रभावित हो सकती है। स्टोइकोमेट्रिक माप, जब प्रोटीन ग्लूटाथियोनाइलेशन (एसएसजी) और नाइट्रोसिलेशन (एसएनओ) सहित कुल ऑक्सीकृत थिओल और विशिष्ट ऑक्सीडेटिव संशोधनों के बीच किया जाता है, तो विशिष्ट संशोधन प्रकारों के संबंध में अनुपात और मात्रात्मक जानकारी प्रकट कर सकता है।

क्योंकि प्रतिवर्ती थिओल ऑक्सीकरण आम तौर पर एक कम-बहुतायत पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन है, जैविक नमूनों से इन संशोधनों वाले प्रोटीन के संवर्धन के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। जाफरी और अन्य द्वारा तैयार किए गए एक प्रारंभिक दृष्टिकोण, जिसे बायोटिन स्विच तकनीक (बीएसटी) 22 नाम दिया गया है, में कई चरण शामिल हैं, जिसमें अपरिवर्तित थिओल को क्षारीयीकरण के माध्यम से अवरुद्ध किया जाता है, विपरीत रूप से संशोधित थिओल को नवजात मुक्त थिओल में कम कर दिया जाता है, नवजात मुक्त थिओल को बायोटिन के साथ लेबल किया जाता है, और लेबल किए गए प्रोटीन को स्ट्रेप्टाविडिन आत्मीयता पुलडाउन द्वारा समृद्ध किया जाता है। इस तकनीक का उपयोग कई अध्ययनों में एसएनओ और एसएसजी को प्रोफाइल करने के लिए किया गया है और इसे प्रतिवर्ती थिओल ऑक्सीकरण23,24 के अन्य रूपों के लिए जांच के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। जबकि बीएसटी का उपयोग प्रतिवर्ती थिओल ऑक्सीकरण के विभिन्न रूपों की जांच के लिए किया गया है, इस दृष्टिकोण के साथ एक चिंता यह है कि संवर्धन स्ट्रेप्टाविडिन के लिए अनबायोटिनाइलेटेड प्रोटीन के गैर-विशिष्ट बंधन से प्रभावित होता है। हमारी प्रयोगशाला में विकसित एक वैकल्पिक दृष्टिकोण, जिसका नाम राल-असिस्टेड कैप्चर (आरएसी) 25,26 (चित्रा 1) है, बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन प्रणाली के माध्यम से थिओल समूहों के संवर्धन के मुद्दे को दरकिनार करता है।

विपरीत रूप से ऑक्सीकृत थिओल की कमी के बाद, नवजात मुक्त थिओल वाले प्रोटीन थिओल-आत्मीयता राल द्वारा समृद्ध होते हैं, जो सहसंयोजक रूप से मुक्त थिओल समूहों को पकड़ता है, जिससे बीएसटी की तुलना में सिस्टीन युक्त प्रोटीन के अधिक विशिष्ट संवर्धन की अनुमति मिलती है। आइसोबेरिक लेबलिंग और मास स्पेक्ट्रोमेट्री में हालिया प्रगति की मल्टीप्लेक्सिंग शक्ति के साथ आरएसी को जोड़ना प्रोटिओम-वाइड स्तर पर विपरीत रूप से ऑक्सीकृत सिस्टीन अवशेषों के संवर्धन, पहचान और परिमाणीकरण के लिए एक मजबूत और संवेदनशील वर्कफ़्लो बनाता है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री में हालिया प्रगति ने थिओल रेडॉक्स प्रोटिओम की बहुत गहरी प्रोफाइलिंग को सक्षम किया है, जिससे प्रोटीन थिओल ऑक्सीकरण27 के कारण और प्रभाव दोनों की समझ बढ़ गई है। साइट-विशिष्ट मात्रात्मक डेटा से प्राप्त जानकारी प्रतिवर्ती ऑक्सीडेटिव संशोधनों के यांत्रिक प्रभावों और डाउनस्ट्रीम प्रभावों के आगे के अध्ययन की अनुमति देतीहै। इस वर्कफ़्लो का उपयोग करने से उम्र बढ़ने जैसी सामान्य शारीरिक घटनाओं के संबंध में प्रतिवर्ती सिस्टीन ऑक्सीकरण के शारीरिक प्रभावों में अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है, जिसमें एसएसजी का स्तर उम्र के संबंध में भिन्न होता है। एसएसजी पर उम्र बढ़ने के प्रभाव को एसएस -31 (एलामिप्रेटाइड) का उपयोग करके आंशिक रूप से उलट दिया गया था, एक नया पेप्टाइड जो माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को बढ़ाता है और वृद्ध चूहों में एसएसजी के स्तर को कम करता है, जिससे उनके पास युवा चूहों के समान एसएसजी प्रोफाइल होताहै।

नैनोपार्टिकल एक्सपोजर के लिए जिम्मेदार पैथोफिजियोलॉजिकल स्थितियों को माउस मैक्रोफेज मॉडल में एसएसजी को शामिल करने के लिए दिखाया गया है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ युग्मित आरएसी का उपयोग करते हुए, लेखकों ने दिखाया कि एसएसजी स्तर सीधे ऑक्सीडेटिव तनाव की डिग्री और मैक्रोफेज फागोसाइटिक फ़ंक्शन की हानि से संबंधित थे। डेटा ने विभिन्न इंजीनियर नैनोमैटेरियल्स के जवाब में मार्ग-विशिष्ट अंतर का भी खुलासा किया जो ऑक्सीडेटिव तनाव30 के विभिन्न डिग्री को प्रेरित करते हैं। विधि ने प्रोकैरियोटिक प्रजातियों में भी अपनी उपयोगिता साबित की है, जहां इसे थिओल ऑक्सीकरण के संबंध में प्रकाश संश्लेषक साइनोबैक्टीरिया में दैनिक चक्रों के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया था। इलेक्ट्रॉन परिवहन, कार्बन निर्धारण और ग्लाइकोलाइसिस सहित कई प्रमुख जैविक प्रक्रियाओं में थिओल ऑक्सीकरण में व्यापक परिवर्तन देखे गए। इसके अलावा, ऑर्थोगोनल सत्यापन के माध्यम से, कई प्रमुख कार्यात्मक साइटों को संशोधित करने की पुष्टि की गई, जो इन ऑक्सीडेटिव संशोधनों की नियामक भूमिकाओं का सुझावदेते हैं।

यहां, हम एक मानकीकृत वर्कफ़्लो (चित्रा 1) के विवरण का वर्णन करते हैं, जो प्रोटीन के कुल ऑक्सीकृत सिस्टीन थिओल के संवर्धन के लिए आरएसी दृष्टिकोण की उपयोगिता और उनके बाद के लेबलिंग और स्टोइकोमेट्रिक परिमाणीकरण का प्रदर्शन करता है। इस वर्कफ़्लो को विभिन्न नमूना प्रकारों में रेडॉक्स अवस्था के अध्ययन में लागू किया गया है, जिसमें सेल कल्चर27,30 और पूरे ऊतक (जैसे, कंकाल की मांसपेशी, हृदय, फेफड़े) 29,31,32,33 शामिल हैं। हालांकि यहां शामिल नहीं है, आरएसी प्रोटोकॉल को एसएसजी, एसएनओ और एस-एसाइलेशन सहित प्रतिवर्ती रेडॉक्स संशोधनों के विशिष्ट रूपों की जांच के लिए आसानी से अनुकूलित किया गया है, जैसा कि पहले उल्लेख किया गयाथा 25,29,34।

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Protocol

पशु या मानव नमूने / ऊतकों से संबंधित प्रोटोकॉल में वर्णित सभी प्रक्रियाओं को मानव और पशु अनुसंधान नैतिकता समिति के संस्थागत दिशानिर्देशों द्वारा अनुमोदित और पालन किया गया था।

1. नमूना समरूपीकरण /

  1. जमे हुए ऊतक के नमूने
    1. ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर कीमा जमे हुए ऊतक (~ 30 मिलीग्राम) सूखी बर्फ पर एक प्रीकिल्ड रेजर ब्लेड और फोर्सप्स का उपयोग करके। कीमा ऊतक को 700 μL बफर A ( तालिका 1 देखें) युक्त एक प्रीचिल्ड 5 एमएल गोल-बॉटम पॉलीस्टाइनिन ट्यूब में स्थानांतरित करें और प्रकाश से सुरक्षित 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    2. ऊतक को 30 सेकंड के लिए बाधित करें या जब तक हाथ से पकड़े गए ऊतक होमोजेनाइज़र के साथ पूरी तरह से समरूप न हो जाए। नमूने को बर्फ पर रखें और फोम को 10 मिनट के लिए कम होने दें।
      नोट: सूखी बर्फ पर रखी एक एल्यूमीनियम बेकिंग शीट ऊतक के प्रारंभिक प्रसंस्करण / कीमा के लिए एक स्थिर कामकाजी सतह और मंच प्रदान करती है।
  2. वैकल्पिक रूप से, प्रारंभिक सामग्री के रूप में 100 मिमी संस्कृति व्यंजनों में अनुयायी सेल संस्कृतियों का उपयोग करें।
    1. कोशिकाओं को बर्फ पर रखें और कोशिकाओं को 100 मिलीमीटर एनईएम युक्त 10 एमएल बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ दो बार कुल्ला करने के लिए सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें।
    2. लाइसिस बफर के 1 एमएल को जोड़कर और कठोर सेल स्क्रैपर के साथ सख्ती से स्क्रैप करके कोशिकाओं को लाइस करें। माइक्रोपिपेट का उपयोग करके लाइसेट को 2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: कुल्ला बफर और लाइसिस बफर को विभिन्न आकार के संस्कृति जहाजों के अनुसार स्केल किया जा सकता है। आमतौर पर, 2-5 मिलियन कोशिकाओं की आवश्यकता होती है; हालांकि, यह विशिष्ट सेल प्रकारों के लिए लाइसिस दक्षता और प्रोटीन उपज के आधार पर भिन्न होता है। कुल थिओल के लिए विश्लेषण किए जा रहे नमूनों के लिए एनईएम के बिना होमोजेनाइजेशन बफर तैयार किया जा सकता है।
  3. परिणामी होमोजेनेट (चरण 1.1.2 या 1.2.2) को माइक्रोपिपेट का उपयोग करके 2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्ण गति (≥16,000 × ग्राम) पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. सुपरनैटेंट (~ 700 μL या ~ 1 mL सेल कल्चर के लिए) को माइक्रोपिपेट का उपयोग करके 5 mL शंक्वाकार माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 850 आरपीएम पर झटकों के साथ अंधेरे में 55 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. ग्लास सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, नमूनों में 4 एमएल बर्फ-ठंडा एसीटोन जोड़ें और प्रोटीन की वर्षा और अतिरिक्त एन-एथिलमलीमाइड को हटाने के लिए रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

2. राल-असिस्टेड कैप्चर

  1. अवक्षेपित प्रोटीन छर्रों को एसीटोन के साथ दो बार धोएं, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 20,500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजिंग करें, एसीटोन को डीकैंट करें, माइक्रोपिपेट का उपयोग करके किसी भी शेष एसीटोन को हटा दें, और ग्लास सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके 3 एमएल ताजा, बर्फ-ठंडा एसीटोन जोड़ें। मिश्रण करने के लिए कई बार पलटें। दूसरे धोने के बाद, छर्रों को 1-2 मिनट के लिए हवा में सूखने दें, सावधान रहें कि अधिक न सूखें क्योंकि पुन: निलंबन मुश्किल हो सकता है।
  2. एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, बफर बी के 1 एमएल जोड़ें ( तालिका 1 देखें) और 250 डब्ल्यू के आउटपुट और संक्षिप्त भंवर के साथ बाथ सोनिकेटर का उपयोग करके एक बार में 15-30 सेकंड के लिए बार-बार सोनिकेशन का उपयोग करके प्रोटीन को घुलनशील करें। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार बिसिनकोनिनिक एसिड (बीसीए) परख का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता को मापें।
  3. आगे की प्रक्रिया के लिए नमूनों में प्रोटीन सांद्रता को मानकीकृत करने और एनईएम को पूरी तरह से हटाने के लिए, 500 μg प्रोटीन को माइक्रोपिपेट का उपयोग करके 0.5 mL 10 kDA केन्द्रापसारक फ़िल्टर में स्थानांतरित करें और रीसस्पेंशन बफर के साथ 500 μL की अंतिम मात्रा में समायोजित करें।
  4. कमरे के तापमान पर 14,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज जब तक कि केन्द्रापसारक फिल्टर में मात्रा 100 μL से कम न हो। एक संग्रह ट्यूब में फ़िल्टर को रोककर नमूने एकत्र करें। सेंट्रीफ्यूज 2 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर और बफर सी का उपयोग करके 500 μL की अंतिम मात्रा में समायोजित करें ( तालिका 1 देखें)।
  5. 20 mM की अंतिम सांद्रता के लिए एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके 500 mM dithiotheritol (DTT) के 20 μL जोड़कर प्रोटीन थिओल को कम करें और 850 आरपीएम पर हिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
  6. कमी के बाद, माइक्रोपिपेट का उपयोग करके नमूनों को कमरे के तापमान पर 14,000 × ग्राम पर 15 मिनट के लिए 0.5 एमएल 10 केडीए केन्द्रापसारक फिल्टर और सेंट्रीफ्यूज में स्थानांतरित करें या जब तक केन्द्रापसारक फिल्टर में मात्रा 100 μL से कम न हो।
    1. चरण 2.6 में सेंट्रीफ्यूजिंग और 500 μL के अतिरिक्त को तीन बार दोहराएं, और चौथे सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, फ़िल्टर को एक संग्रह ट्यूब में उलटकर और 2 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके नमूने एकत्र करें।
  7. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार बीसीए परख का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता को मापें।
  8. इस बफर एक्सचेंज के दौरान, माइक्रोबैलेंस का उपयोग करके राल (30 मिलीग्राम / नमूना) की उचित मात्रा का वजन करके थिओल-आत्मीयता राल तैयार करें और इसे 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। फिर, सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, 30 मिलीग्राम / एमएल राल की अंतिम सांद्रता के लिए पानी जोड़ें और राल के उचित जलयोजन के लिए आंदोलन के साथ 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: ऊपर उल्लिखित थिओल-आत्मीयता राल निर्माता द्वारा बंद कर दिया गया है। इस थिओल-आत्मीयता राल के लिए एक संभावित प्रतिस्थापन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है। हालांकि, इस प्रतिस्थापन में लगभग 5 गुना कम बाध्यकारी क्षमता है (पूरक जानकारी देखें)। वैकल्पिक रूप से, थिओल-आत्मीयता राल को 2-(पाइरिडिलडिथियो) एथिलमाइन हाइड्रोक्लोराइड और एन-हाइड्रॉक्सीसुकिनिमाइड-सक्रिय राल का उपयोग करके संश्लेषित किया जा सकता है (पूरक जानकारी देखें)।
    1. राल के जलयोजन के बाद, स्पिन कॉलम को वैक्यूम पर कई गुना रखें और प्रत्येक कॉलम में माइक्रोपिपेट का उपयोग करके राल घोल के 500 μL को स्थानांतरित करें। पानी को हटाने के लिए वैक्यूम लागू करें; प्रति कॉलम कुल 30 मिलीग्राम राल प्राप्त करने के लिए इस चरण को एक बार दोहराएं। वैकल्पिक रूप से, इसके लिए वैक्यूम का कई गुना उपयोग करने के बजाय 2 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज और सभी राल धोने और क्षालन चरणों का उपयोग करें।
      नोट: बोर के आकार को बढ़ाने के लिए 1000 μL पिपेट टिप के अंत को काटने से राल के हस्तांतरण में मदद मिलती है। यह सुनिश्चित करने के लिए पाइपिंग के बीच ट्राइट्यूरेट करना महत्वपूर्ण है कि राल निलंबित रहे और प्रत्येक कॉलम में समान मात्रा में राल स्थानांतरित हो।
    2. राल को माइक्रोपिपेट के साथ अल्ट्राप्योर पानी के 500 μL जोड़कर और पानी को हटाने के लिए वैक्यूम लगाकर धोएं; इसे 5 बार दोहराएं। फिर, राल को बफर ई के 500 μL के साथ 5 बार धोएं ( तालिका 1 देखें)।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, 2 मिनट के लिए 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग वैक्यूम के स्थान पर बाद के सभी धोने के चरणों के लिए कई गुना किया जा सकता है। सभी आगे के धोने के चरण 500 μL की मात्रा के साथ किए जाते हैं। कॉलम में वॉश बफर जोड़ते समय, राल के छींटे और नुकसान से बचते हुए राल को पूरी तरह से पुन: निलंबित करने के लिए पर्याप्त बल के साथ सावधानीपूर्वक जोड़ें; यह राल की पूर्ण और कुशल धुलाई की अनुमति देता है।
  9. एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक कम नमूने से 150 μg प्रोटीन को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें और बफर सी के 120 μL की अंतिम मात्रा में समायोजित करें ( तालिका 1 देखें)। माइक्रोपिपेट का उपयोग करके प्रोटीन समाधान को राल युक्त प्लग किए गए स्पिन कॉलम में स्थानांतरित करें, कॉलम पर टोपी रखें, और 850 आरपीएम पर झटकों के साथ कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  10. राल को 25 mM HEPES, pH 7.0 के साथ पांच बार धोएं; 8 एम यूरिया; इसके बाद 2 एम एनएसीएल के साथ पांच बार; इसके बाद 0.1% ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड (टीएफए) के साथ 80% एसिटोनिट्राइल (एसीएन) के साथ पांच बार; और अंत में 25 mM HEPES, pH 7.7 के साथ पांच बार, जैसा कि चरण 2.8.2 में वर्णित है और प्लग को बदलें।
    नोट: चरण 4.1 में वर्णित प्रोटीन स्तर (जैसे, एसडीएस-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज), पश्चिमी धब्बा) पर विश्लेषण के लिए नमूने यहां भेजे जा सकते हैं।

3. ऑन-राल ट्राइप्टिक पाचन और टीएमटी लेबलिंग

  1. बफर सी में 0.5 μg/μL की सांद्रता पर घुलनशील करके प्रति नमूने 6-8 μg के लिए पर्याप्त अनुक्रमण-ग्रेड संशोधित ट्रिप्सिन समाधान तैयार करें ( तालिका 1 देखें) ताकि अंतिम मात्रा प्रति नमूने कम से कम 120 μL की अनुमति दे। एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, नमूनों में इस ट्रिप्सिन समाधान का 120 μL जोड़ें और 850 आरपीएम पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    नोट: पाचन दक्षता बढ़ाने के लिए, ट्रिप्सिन समाधान को हटाकर और इसे ताजा समाधान के साथ बदलकर अगले दिन एक अतिरिक्त पाचन चरण शामिल किया जा सकता है, और 2 घंटे तक पाचन जारी रख सकता है।
  2. राल को 25 mM HEPES, pH 7.0 के साथ पांच बार धोएं; इसके बाद पांच गुना 2 एम एनएसीएल; इसके बाद 0.1% टीएफए के साथ 80% एसीएन के साथ पांच बार; इसके बाद 25 mM HEPES, pH 7.7 के साथ तीन बार। अंत में, राल को 50 एमएम ट्राइइथाइल अमोनियम बाइकार्बोनेट बफर (टीईएबी) के साथ दो बार धोएं और प्लग को बदलें।
  3. टीएमटी लेबलिंग अभिकर्मकों को तैयार करें, पहले उन्हें 16,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके संक्षेप में घूमने से पहले कमरे के तापमान पर गर्म करने की अनुमति दें। माइक्रोपिपेट का उपयोग करके टीएमटी लेबलिंग अभिकर्मक की प्रत्येक शीशी में 150 μL निर्जल ACN जोड़ें। अभिकर्मक को पूरी तरह से घुलनशील करने के लिए 5 मिनट के लिए 850 आरपीएम पर सेट थर्मोमिक्सर पर कमरे के तापमान पर शीशियों को इनक्यूबेट करें। अभिकर्मक को इकट्ठा करने के लिए संक्षेप में भंवर और 16,000 × ग्राम पर घूमते हैं।
  4. एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, धुले हुए राल में 100 mM TEAB का 40 μL जोड़ें, फिर घुलित TMT अभिकर्मक का 70 μL जोड़ें और 850 आरपीएम पर झटकों के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। किसी भी शेष टीएमटी अभिकर्मक को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: प्रत्येक जैविक नमूने (चित्रा 1) को सौंपे गए व्यक्तिगत टीएमटी लेबल पर ध्यान दें।
  5. राल को 0.1% टीएफए के साथ 80% एसीएन के साथ पांच बार, 100 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट बफर (एबीसी), पीएच 8.0 के साथ तीन बार और पानी के साथ दो बार धोएं जैसा कि पहले वर्णित है और प्लग को बदलें।

4. पेप्टाइड क्षालन

  1. माइक्रोपिपेट का उपयोग करके प्रत्येक कॉलम में 100 एमएम एबीसी, पीएच 8.0 में 20 एमएम डीटीटी के 100 μL जोड़कर लेबल पेप्टाइड्स को हटा दें और 850 आरपीएम पर सेट थर्मोमिक्सर सेट पर 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: डीटीटी के अतिरिक्त, राल सिकुड़ जाएगा। झुरमुट को तोड़ने और पेप्टाइड्स के पूर्ण क्षालन को सुनिश्चित करने के लिए राल को पिपेट टिप के साथ बाधित किया जा सकता है।
  2. इस इनक्यूबेशन के बाद, कॉलम को ठोस-चरण निष्कर्षण (एसपीई) के लिए एक वैक्यूम मैनिफोल्ड पर रखें, वैक्यूम लागू करें, और नमूनों को 5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें। इस चरण को एक बार दोहराएं।
  3. अंत में, 0.1% टीएफए के साथ 80% एसीएन का 100 μL जोड़ें, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और उसी 5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें। सभी अंशों को एक ही 5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें।
    नोट: नमूना हानि को रोकने के लिए, क्षालन के लिए कम बाध्यकारी ट्यूबों का उपयोग किया जाना चाहिए, और वॉल्यूम को एकल 5 एमएल ट्यूब के लिए 4.0 एमएल की मात्रा पर या उससे नीचे रखा जाना चाहिए।
  4. सूखे होने तक वैक्यूम कंसंट्रेटर में इल्यूटेड नमूने रखें। शुष्क पेप्टाइड्स को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और बाद में उन्हें फिर से निलंबित करें।
    नोट: नमूने को अलग से भी अलग किया जा सकता है, और नमूनों के संयोजन से पहले पेप्टाइड स्तर पर विश्लेषण के लिए एसडीएस-पेज द्वारा एक एलिकोट को हटाया और विश्लेषण किया जा सकता है।

5. पेप्टाइड एल्काइलेशन और डिसाल्टिंग /

  1. माइक्रोपिपेट का उपयोग करके 100 एमएम एबीसी बफर, पीएच 8.0 (500 μL से अधिक नहीं) की एक छोटी मात्रा जोड़कर सूखे पेप्टाइड्स को फिर से निलंबित करें। 2 एमएल ट्यूब में घुलनशील और स्थानांतरित करने के लिए 250 डब्ल्यू और भंवर के आउटपुट के साथ स्नान सोनिकेटर का उपयोग करके एक समय में 15-30 सेकंड के लिए बार-बार सोनिकेशन का उपयोग करें।
    नोट: 100 mM ABC की मात्रा, pH 8.0 जोड़ा जाना 150 mM की दाढ़ता पर DTT को फिर से निलंबित करने के लिए आवश्यक मात्रा पर आधारित है। उपयोगकर्ताओं को चरण 4.1 में मूल रूप से जोड़े गए डीटीटी के आधार पर अपने नमूने में मौजूद डीटीटी की मात्रा निर्धारित करने की आवश्यकता होगी।
  2. डीटीटी: आईएए के 1: 4 मोलर अनुपात को प्राप्त करने के लिए माइक्रोपिपेट का उपयोग करके एबीसी में घुले हुए आयोडोसेटामाइड (आईएए) के पर्याप्त केंद्रित स्टॉक समाधान (600 एमएम) जोड़ें और 850 आरपीएम पर झटकों के साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
  3. माइक्रोपिपेट का उपयोग करके केंद्रित टीएफए (10%) जोड़कर नमूनों को पीएच < 3 में अम्लीय करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार रिवर्स-फेज क्लीन-अप का उपयोग करके नमूना डीसाल्टिंग करें।
  4. साफ पेप्टाइड्स को वैक्यूम कंसंट्रेटर में सूखने तक रखें। आगे के विश्लेषण तक शुष्क पेप्टाइड्स को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

6. तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री

  1. सूखे पेप्टाइड्स को 250 डब्ल्यू के आउटपुट के साथ बाथ सोनिकेटर का उपयोग करके एक बार में 15-30 सेकंड के लिए बार-बार सोनिकेशन द्वारा पुन: निलंबित किया जाता है और 3% एसीएन युक्त 20-40 μL पानी में भंवर होता है। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार बीसीए परख करके पेप्टाइड एकाग्रता निर्धारित करें।
  2. नमूनों को रिवर्स-फेज एलसी और एमएस / एमएस द्वारा अलग करें जैसा कि पहले वर्णित6 था और एमएस 1 स्पेक्ट्रा को 400-2000 की एम / जेड रेंज पर रिकॉर्ड करें। सुनिश्चित करें कि आइसोबेरिक रूप से लेबल पेप्टाइड्स के विश्लेषण के लिए रिपोर्टर आयन तीव्रता जानकारी प्राप्त करने के लिए उच्च ऊर्जा टकराव पृथक्करण (एचसीडी) का उपयोग किया जाता है। उपकरण चलाने की स्थिति 27,30 और एमएस डेटा 27,31 के विश्लेषण के बारे में अधिक जानकारी के लिए पिछली रिपोर्टके विधि अनुभाग देखें।
    नोट: पेप्टाइड नमूने का विश्लेषण करने के लिए विभिन्न एलसी-एमएस / एमएस सिस्टम या सेटिंग्स का उपयोग किया जा सकता है। पेप्टाइड पहचान की कवरेज और संवेदनशीलता उपयोग की जाने वाली विशेष प्रणाली और सेटिंग्स पर निर्भर करेगी।

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Representative Results

प्रोटोकॉल के पूरा होने से पूर्व में ऑक्सीकृत सिस्टीन युक्त पेप्टाइड्स का अत्यधिक विशिष्ट संवर्धन होगा, अक्सर >95% विशिष्टता 27,35,36 के साथ। हालांकि, प्रोटोकॉल के कई प्रमुख चरणों पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए, नमूना लाइसिस / होमोजेनाइजेशन से पहले मुक्त थिओल का प्रारंभिक अवरोध, जो कृत्रिम ऑक्सीकरण और कृत्रिम रूप से ऑक्सीकृत थिओल25 के गैर-विशिष्ट संवर्धन को प्रतिबंधित करता है। नमूने प्रोटोकॉल के कई चरणों में और विभिन्न तरीकों से विश्लेषण किया जा सकता है, जिसमें प्रोटीन और पेप्टाइड्स दोनों के एसडीएस-पेज विश्लेषण शामिल हैं। एसडीएस-पेज नमूनों के गुणात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है जिसमें कुल-थिओल नमूने उपचार / उत्तेजनाओं के कारण ऑक्सीकरण के विभिन्न स्तरों को निर्धारित करने के लिए नमूनों के बीच अनुपात-मीट्रिक तुलना को सक्षम करते हैं (चित्रा 2 ए)। व्यक्तिगत प्रोटीन के ऑक्सीकरण स्तरों की जांच करने के लिए, एसडीएस-पेज जैल को पश्चिमी सोख्ता36 (चित्रा 2 बी) के अधीन किया जा सकता है। यह मॉडल प्रणाली को अधिक विस्तार से विश्लेषण करने में सक्षम बनाता है, जिससे नेटवर्क और जैविक मार्गों के बारे में सहायक डेटा और आगे की परिकल्पना उत्पन्न होती है। इन विधियों/सहायक डेटा का उपयोग गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में भी किया जा सकता है ताकि एलसी-एमएस/एमएस जैसे आगे के गहन विश्लेषण से पहले अपेक्षित प्रतिक्रियाओं की पुष्टि की जा सके। एलसी-एमएस/एमएस द्वारा विश्लेषण किए गए सिस्टीन युक्त पेप्टाइड्स की रिपोर्टर आयन तीव्रता का उपयोग अलग-अलग साइस साइट स्तरों पर थिओल ऑक्सीकरण स्टोइकोमेट्री को मापने के लिए किया जा सकता है (चित्रा 2 सी, डी)।

Figure 1
चित्रा 1: नमूना प्रसंस्करण वर्कफ़्लो। नमूना प्रसंस्करण वर्कफ़्लो विभिन्न नमूना प्रकारों और जैविक प्रणालियों में थिओल ऑक्सीकरण की जांच के लिए अनुकूलनीय है। वर्कफ़्लो प्रोटीन और पेप्टाइड दोनों स्तरों (जैसे, एसडीएस-पेज, वेस्टर्न ब्लॉट) पर ऑक्सीकरण की जांच के साथ-साथ मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ युग्मित एचपीएलसी का उपयोग करके व्यक्तिगत सिस्टीन साइटों की मात्रात्मक, साइट-विशिष्ट पहचान के लिए गहरी कवरेज की अनुमति देता है। नमूना प्रसंस्करण को तीन दिनों से कम समय में पूरा किया जा सकता है, जिसमें गुणवत्ता, सुसंगत डेटा के उत्पादन के लिए कई महत्वपूर्ण चरणों का पूरा होना शामिल है। टीएमटी लेबलिंग के माध्यम से नमूना मल्टीप्लेक्सिंग एक ही समय में समानांतर में कई नमूनों के प्रसंस्करण की अनुमति देता है। प्रतिनिधि 10-प्लेक्स टीएमटी लेबलिंग योजना दिखाती है कि कुल-थिओल चैनल से संभावित क्रॉसस्टॉक पर विचार करते हुए नमूने कैसे व्यवस्थित किए जा सकते हैं। टीएमटी अभिकर्मकों की समस्थानिक अशुद्धियों के साथ, उच्च तीव्रता (जैसे कुल-थिओल) वाले एक चैनल की सिग्नल तीव्रता कम सिग्नल तीव्रता वाले दूसरे चैनल में योगदान कर सकती है और इसकी मात्रा को प्रभावित कर सकतीहै। इस योजना में, एक पूल किए गए कुल-थिओल चैनल (नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूनों का एक संयोजन) में साइस-पेप्टाइड्स के उच्च स्तर होने की उम्मीद है और इसे 131 एन के साथ लेबल किया जाता है, जिसमें चैनल 130 एन में एक संकेत होगा। इस प्रकार, चैनल 130 एन प्रयोग में उपयोग नहीं किया जाता है। टीएमटी लेबल द्वारा बनाए गए चैनल क्रॉसस्टॉक की मात्रा अभिकर्मक के संबंधित बैच के लिए निर्माता के विश्लेषण के प्रमाण पत्र में पाई जा सकती है। इस आंकड़े को गुओ एट अल, नेचर प्रोटोकॉल, 201425 से अनुकूलित किया गया है। संक्षेप: एनईएम = एन-एथिलमेलीमाइड; डीटीटी = डिथियोथ्रेइटोल; एसडीएस-पेज = सोडियम डोडेसिलसल्फेट पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन; एसपीई = ठोस चरण निष्कर्षण; एलसी-एमएस / एमएस = तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री; टीएमटी = अग्रानुक्रम द्रव्यमान टैग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
(ए) रासायनिक ऑक्सीडेंट, डायमाइड के साथ इलाज किए गए रॉ 264.7 कोशिकाओं से ऑक्सीकृत पेप्टाइड्स का एसडीएस-पेज विश्लेषण, बढ़ती सांद्रता (0.1 और 0.5 एमएम) और कुल पेप्टाइड थिओल पर 30 मिनट के लिए। यह उप-आंकड़ा और उप-आंकड़ा डी गुओ एट अल, नेचर प्रोटोकॉल, 2014 25 से अनुकूलित हैं। पेप्टाइड्स को चांदी के धुंधलापन द्वारा कल्पना की गई थी। (बी) रॉ 264.7 कोशिकाओं को बढ़ती सांद्रता पर बहिर्जात ऑक्सीडेंट (हाइड्रोजन पेरोक्साइड और डायमाइड) के साथ इलाज किया गया था। परिणामस्वरूप एसएसजी-समृद्ध प्रोटीन एलुएट को एसडीएस-पेज द्वारा अलग किया गया था और बाद में व्यक्तिगत प्रोटीन (जीएपीडीएच, टीएक्सएन, पीआरडीएक्स 3, और एएनएक्सए 1) के लिए पश्चिमी धब्बा द्वारा जांच की गई थी। यह उप-आंकड़ा सू एट अल, फ्री रेडिकल बायोलॉजी एंड मेडिसिन, 201436 से अनुकूलित है। (सी) एक्सकैलिबर सॉफ्टवेयर में देखे गए सिस्टीन युक्त पेप्टाइड का प्रतिनिधि एमएस / एमएस स्पेक्ट्रम डेटा। एमएस छवि प्रत्येक टीएमटी चैनल में एक ही पेप्टाइड के लिए संबंधित रिपोर्टर आयन तीव्रता दिखाती है। इस प्रयोग में, कुल-थिओल नमूना टीएमटी लेबल 131 एन को सौंपा गया था, जिसमें प्रयोग में उपयोग किए गए सभी चैनलों की उच्चतम तीव्रता है। (डी) एलसी-एमएस / एमएस द्वारा मापा गया आईटीआरएक्यू-लेबल, समृद्ध, ऑक्सीकृत पेप्टाइड्स का स्टोइकोमेट्री। कुल-थिओल चैनल का उपयोग कुल-थिओल चैनल की तुलना में प्रत्येक नमूने के रिपोर्टर आयन तीव्रता के अनुपात के आधार पर ऑक्सीकरण के स्टोइकोमेट्री की गणना करने के लिए एक संदर्भ के रूप में किया गया था। संक्षेप: आरएसी = राल-सहायक कैप्चर; एसडीएस-पेज = सोडियम डोडेसिलसल्फेट पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन; Ctrl = नियंत्रण; जीएपीडीएच = ग्लिसराल्डिहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज; टीएक्सएन = थायोरेडॉक्सिन; पीआरडीएक्स 3 = थायोरेडॉक्सिन-निर्भर पेरोक्साइड रिडक्टेस; ANXA1 = अनुलग्नक A1; एलसी-एमएस / एमएस = तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री; एमएस = अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री; टीएमटी = अग्रानुक्रम द्रव्यमान टैग; सापेक्ष और पूर्ण मात्रा के लिए iTRAQ = आइसोबेरिक टैग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

बफर नाम लक्ष्य सामग्री
बफर ए लाइसिस/होमोजेनाइजेशन 250 एमएम 2-(एन-मोर्फोलिनो) ईथेनसल्फोनिक एसिड (एमईएस), पीएच 6.0; 1% सोडियम डोडेसिलसल्फेट (एसडीएस); 1% ट्राइटन एक्स -100; और 100 mM N-ethylmaleimide (NEM)
बफर बी प्रोटीन वर्षा और पहले बफर एक्सचेंज के बाद पुन: निलंबन 250 एमएम 4-(2-हाइड्रॉक्सीइथिल)-1-पिपेराजिनिथेनसल्फोनिक एसिड (एचईपीईएस), पीएच 7.0; 8 एम यूरिया; 0.1% एसडीएस
बफर सी सिस्टीन युक्त प्रोटीन की कमी / संवर्धन / पाचन 25 mM HEPES, pH 7.7; 1 एम यूरिया; 0.1% एसडीएस
बफर डी कटौती के बाद दूसरा बफर एक्सचेंज 25 एमएम एचईपीईएस, पीएच 7.0, 8 एम यूरिया; 0.1% एसडीएस
बफर ई हाइड्रेशन के बाद राल को धोना 25 mM HEPES, pH 7.7

तालिका 1.  बफर की सूची

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Discussion

सिस्टीन अवशेषों25,29,30 के ऑक्सीडेटिव संशोधनों की जांच के लिए विभिन्न प्रकार के नमूना प्रकारों और जैविक प्रणालियों में राल-सहायता प्राप्त कैप्चर का उपयोग किया गया है। यह विधि एसडीएस-पेज और वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण का उपयोग करके प्रोटीन और पेप्टाइड्स सहित कई स्तरों और रीडआउट पर नमूनों के मूल्यांकन की अनुमति देती है, साथ ही मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके व्यक्तिगत सिस्टीन साइटें भी शामिल हैं। नमूना प्रकार या अंतिम समापन बिंदु के बावजूद, विधि अंततः सिस्टीन युक्त प्रोटीन और पेप्टाइड्स38 के अत्यधिक कुशल और विशिष्ट संवर्धन की अनुमति देती है। आरएसी का उपयोग करते हुए, हमने एक गड़बड़ी के बाद विभिन्न मॉडल प्रणालियों में कई हजारों सिस्टीन साइटों के ऑक्सीकरण अवस्था में परिवर्तन की पहचान की है।

मांसपेशियों के संकुचन के अधीन चूहों में, 2,200 एस-ग्लूटाथियोनाइलेशन साइटों की पहचान की गई, जिनमें से आधे से अधिक ने एस-ग्लूटाथियोनाइलेशन 32 के स्तर को काफी बदल दिया। आरएसी का उपयोग प्रकाश संश्लेषण अवरोधक या विभिन्न प्रकाश स्थितियों के संपर्क में आने के बाद साइनोबैक्टीरिया में >2,100 साइटों के प्रतिवर्ती थिओल ऑक्सीकरण को प्रोफाइल करने के लिए भीकिया गया है। हाल ही में, हमने आराम की स्थिति 27 के तहत रॉ 264.7 मैक्रोफेज कोशिकाओं में >4,000 सिस्टीन साइटों के कुल प्रतिवर्ती थिओल ऑक्सीकरण और एस-ग्लूटाथियोनाइलेशन को प्रोफाइलकिया। इसी तरह, बेहरिंग एट अल ने एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर उत्तेजना39 के बाद ए 431 कोशिकाओं में ~ 4,200 सिस्टीन साइटों के ऑक्सीकरण को निर्धारित किया। ये अध्ययन कई सिस्टीन साइटों (कम से कम कई हजार) की पहचान करने के लिए आरएसी की मजबूती को प्रदर्शित करते हैं जो प्रतिवर्ती थिओल ऑक्सीकरण से गुजरते हैं। इसके अतिरिक्त, नमूनों का विभाजन एक प्रयोग से बरामद पेप्टाइड्स के कवरेज को बढ़ा सकता है।

प्रयोगात्मक नियंत्रणों के बाहर, जिसमें मॉडल प्रणाली की जैविक प्रतिक्रियाओं की पुष्टि करने के लिए सकारात्मक या नकारात्मक नियंत्रण नमूने नियोजित किए जा सकते हैं, कुल-थिओल संवर्धन थिओल के ऑक्सीकरण के समानांतर किया जा सकता है। यह कुल-थिओल नमूना स्टोइकोमेट्रिक तुलना और एक आधार रेखा दोनों प्रदान करता है जिसमें से प्रयोगात्मक या उपचारित नमूनों की तुलना की जा सकती है। संक्षेप में, यह कुल-थिओल नमूना किसी दिए गए नमूने में किसी दिए गए साइस साइट के लिए सिस्टीन थिओल की कुल संख्या का माप प्रदान करता है। इस अवधारणा को ऑक्सीटीएमटी विधि द्वारा भी अपनाया गया था, जो ऐसे नमूने उत्पन्न करता है जिनमें पूरी तरह से कम थिओल होते हैं जो ऑक्सीकृत सिस्टीन40 के खिलाफ तुलना के लिए "कुल सिस्टीन सामग्री" का प्रतिनिधित्व करते हैं।

ऑक्सीटीएमटी के विपरीत, आरएसी आयोडोटीएमटी की प्लेक्स संख्या से बाधित नहीं है और इस प्रकार एक अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले कई नमूना प्रकारों की थिओल सामग्री का बेहतर प्रतिनिधित्व करने के लिए अधिक कुल थिओल चैनलों को शामिल कर सकता है। इसके अतिरिक्त, थिओल रेडॉक्स प्रोटिओमिक्स वर्कफ़्लो के समानांतर एक वैश्विक नमूना (संवर्धन के अधीन नहीं) तैयार करने की आवश्यकता हो सकती है ताकि यह जांचा जा सके कि विभिन्न नमूना प्रकारों में प्रोटीन बहुतायत बदल गई है या नहीं। चूंकि विधि कई प्रकार के रेडॉक्स संशोधनों के लिए अनुकूलनीय है, इसलिए ब्याज के विशिष्ट संशोधन के लिए उचित नियंत्रण पर विचार किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, पराबैंगनी प्रकाश और पारा क्लोराइड दोनों प्रोटीन से एसएनओ को छोड़ने में प्रभावी हैं, जिससे एसएनओ 7,25 के माप के लिए एक प्रभावी नकारात्मक नियंत्रण बनता है। एसएसजी-संशोधित प्रोटीन की जांच के लिए एक प्रभावी नियंत्रण कमी चरण के दौरान कमी कॉकटेल से ग्लूटारेडॉक्सिन एंजाइम की चूक है। ग्लूटारेडॉक्सिन की अपेक्षाकृत उच्च विशिष्टता के कारण, इसकी चूक एसएसजी-संशोधित प्रोटीन की कमी को समाप्त करती है और उन्हें डाइसल्फ़ाइड विनिमय से गुजरने और अंततः अंतिम विश्लेषण में समृद्ध होने से रोकतीहै।

आरएसी के लिए वर्कफ़्लो के भीतर कई चरण हैं जो गुणवत्ता, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा की पीढ़ी के लिए मौलिक हैं। पहले महत्वपूर्ण चरणों में से एक, और सबसे महत्वपूर्ण, झिल्ली-पारगम्य एल्काइलेटिंग एजेंट, एन-एथिलमेलीमाइड (एनईएम) का उपयोग करके मुक्त थिओल का क्षारीकरण / ब्लॉकिंग है, जो एक व्यापक पीएच रेंज41,42 में तेजी से प्रतिक्रिया करता है। यह कदम नमूना प्रसंस्करण के दौरान नवजात थिओल को ऑक्सीकरण होने से रोकता है और डाइसल्फ़ाइड विनिमय संवर्धन के दौरान इन कृत्रिम रूप से ऑक्सीकृत थिओल के गैर-विशिष्ट संवर्धन को कम करता है। अपर्याप्त क्षारीकरण के परिणामस्वरूप एक बढ़ी हुई पृष्ठभूमि और गलत-सकारात्मक संकेत होगा, जैसा कि पिछली रिपोर्ट6 में पहचाना गया था।

हालांकि, इसकी उच्च प्रतिक्रिया और मुक्त थिओल को अवरुद्ध करने की क्षमता के कारण, संवर्धन से पहले नमूनों से इसे पूरी तरह से हटाने के लिए सावधानी बरतनी चाहिए, जहां कोई भी शेष एनईएम राल युग्मन के साथ बांध और हस्तक्षेप कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप अंततः प्रोटीन बाइंडिंग में कमी के कारण सिग्नल का नुकसान होता है। यह आणविक भार कट-ऑफ फिल्टर का उपयोग करके एसीटोन वर्षा और बफर एक्सचेंज के कई दौर करके पूरा किया जाता है। पूरे प्रोटोकॉल में उचित पीएच की निगरानी और रखरखाव भी महत्वपूर्ण है। संवर्धन से पहले डाइसल्फ़ाइड फेरबदल और मिश्रित डाइसल्फ़ाइड के गठन को कम करने के लिए 6.0 का पीएच बनाए रखा जाता है। अन्य कदम जहां अतिरिक्त देखभाल की जानी चाहिए, उनमें संवर्धन और क्षालन चरण शामिल हैं, जिसमें उचित संवर्धन और क्षालन के लिए क्रमशः 7.7 और 8.0 के पीएच मान की आवश्यकता होती है। इन चरणों के दौरान गलत पीएच मान सिग्नल की कमी या हानि का परिणाम होगा।

आज तक, आरएसी के अलावा कई रसायन विज्ञान-आधारित विधियां हैं जो व्यापक रूप से सिस्टीन थिओल ऑक्सीकरण का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाती हैं, जिसमें सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली विधि, बायोटिन स्विच तकनीक43,44 शामिल है। एक बात जो आरएसी सहित इन सभी विधियों में आम है, वह यह है कि वे ऑक्सीकृत सिस्टीन का पता लगाने के लिए अप्रत्यक्ष तरीकों पर आधारित हैं। वे पहचान के लिए मूल ऑक्सीकृत थिओल के रासायनिक रूप से संशोधित मध्यवर्ती पर भरोसा करते हैं। हालांकि, एक प्रमुख विशेषता जो आरएसी को अन्य तरीकों से अलग करती है, ऑक्सीकृत थिओल के विशिष्ट सिस्टीन साइटों पर मल्टीप्लेक्स, मात्रात्मक डेटा एकत्र करने की क्षमता है।

पेप्टाइड्स सहसंयोजक रूप से राल से बंधे होते हैं, जो आगे के हैंडलिंग के बिना आगे के चरणों (जैसे, कमी, लेबलिंग, धोने, पाचन) को आगे बढ़ाने की अनुमति देता है। मल्टीप्लेक्स नमूनों पर एलसी-एमएस / एमएस का प्रदर्शन करके, डेटासेट उत्पन्न होते हैं जो प्रोटिओम-वाइड खोजों को सक्षम करते हैं। कई नमूना समूहों में एक विशिष्ट उपचार या उत्तेजनाओं के प्रभाव वैश्विक स्तर पर देखे जाते हैं, जो नए तंत्र और मार्गों की खोज को सक्षम बनाता है। मौलिक वर्कफ़्लो अंतिम उपयोगकर्ताओं की विशिष्ट आवश्यकताओं और रुचि के क्षेत्रों के लिए अत्यधिक अनुकूलनीय है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा में देखे गए निष्कर्षों का ऑर्थोगोनल सत्यापन एक चुनौती बना हुआ है। एक विशिष्ट साइट का साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस और परिणामी प्रभावों की जांच करने वाले परखों का उपयोग एक सामान्य लेकिन श्रम-गहन दृष्टिकोण है।

उम्मीदवार साइटों को स्क्रीन करने के लिए जो जैविक रूप से महत्वपूर्ण हो सकते हैं, जैव सूचना विज्ञान अध्ययन का उपयोग उच्च स्तर के ऑक्सीकरण वाली साइट की विशेषताओं के बारे में अधिक जानने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि एक सक्रिय साइट या माध्यमिक संरचना27 के लिए साइट की निकटता। आणविक गतिशीलता सिमुलेशन भविष्य के अध्ययनों में बहुत मूल्य साबित हो सकते हैं क्योंकि वे प्रोटीन संरचना पर रेडॉक्स संशोधनों के प्रभावों को मॉडल कर सकते हैं और इस बात की अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं कि प्रोटीन का कार्य कैसे प्रभावित हो सकता है। इस मजबूत रणनीति को लागू करके, हम आशा करते हैं कि वैज्ञानिक समुदाय इस पद्धति को अपनी अनूठी मॉडल प्रणाली के अनुकूल बनाकर लाभान्वित होगा और कई अलग-अलग मॉडल और जैविक प्रणालियों में रेडॉक्स जीव विज्ञान के वर्तमान ज्ञान का विस्तार करेगा।

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Disclosures

लेखक ों ने वित्तीय या अन्यथा हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

काम के कुछ हिस्सों को एनआईएच ग्रांट्स आर01 डीके122160, आर01 एचएल139335 और यू24 डीके112349 द्वारा समर्थित किया गया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride Med Chem Express HY-101794 Reagent for in-house resin synthesis
2.0 mL LoBind centrifuge tubes Eppendorf 22431048
5.0 mL LoBind centrifuge tubes Eppendorf 30108310
5.0 mL round bottom tubes Falcon 352054
Acetone Fisher Scientific A949-1
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998
Activated Thiol–Sepharose 4B Sigma Aldrich T8512 Potential replacement for thiol-affinity resin
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter Millipore Sigma UFC5010BK
Ammonium bicarbonate Sigma Aldrich 09830
Bicinchonicic acid (BCA) Thermo Scientific 23227 Protein Assay Reagent
Centrifuge Eppendorf 5810R
Centrifuge Eppendorf 5415R
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific 20291
EDTA Sigma Aldrich E5134
HEPES buffer Sigma Aldrich H4034
Homogenizer BioSpec Products 985370
Iodoacetimide (IAA) Sigma Aldrich I1149
N-ethylmaleimide Sigma Aldrich 4259
NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow Cytiva 17-0906-01 Reagent for in-house resin synthesis
QIAvac 24 Plus vacuum manifold Qiagen 19413
Sodium chloride Sigma Aldrich S3014
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma Aldrich L6026
Sonicator Branson 1510R-MT
Spin columns Thermo Scientific 69705
Strata C18-E reverse phase columns Phenomenex 8B-S001-DAK Peptide desalting
Thermomixer Eppendorf 5355
Thiopropyl Sepharose 6B GE Healthcare 17-0420-01 Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details).
TMT isobaric labels (16 plex) Thermo Scientific A44522 Peptide labeling reagent; available in multiple formats
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB) Sigma Aldrich T7408
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma Aldrich T6508
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
Trypsin Promega V5820
Urea Sigma Aldrich U5378
Vacufuge Plus speedvac Eppendorf 22820001 vacuum concentrator
Vortex mixer Scientific Industries SI-0236

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Gaffrey, M. J., Day, N. J., Li, X., Qian, W. J. Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation. J. Vis. Exp. (172), e62671, doi:10.3791/62671 (2021).

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