Summary
La preparazione polmonare di coniglio isolata è uno strumento gold standard nella ricerca polmonare. Questa pubblicazione si propone di descrivere la tecnica sviluppata per lo studio dei meccanismi fisiologici e patologici coinvolti nella reattività delle vie aeree, nella conservazione polmonare e nella ricerca preclinica nel trapianto di polmone e nell'edema polmonare.
Abstract
Il sistema di perfusione polmonare isolato è stato ampiamente utilizzato nella ricerca polmonare, contribuendo a chiarire il funzionamento interno dei polmoni, sia micro che macroscopicamente. Questa tecnica è utile nella caratterizzazione della fisiologia e della patologia polmonare misurando le attività metaboliche e le funzioni respiratorie, comprese le interazioni tra sostanze circolatorie e gli effetti di sostanze inalate o perfuse, come nei test antidroga. Mentre i metodi in vitro prevedono l'affettamento e la coltura dei tessuti, il sistema di perfusione polmonare ex vivo isolato permette di lavorare con un organo funzionale completo rendendo possibile lo studio di una funzione fisiologica continua durante la ricreazione della ventilazione e della perfusione. Tuttavia, va notato che gli effetti dell'assenza di innervazione centrale e drenaggio linfatico devono ancora essere pienamente valutati. Questo protocollo ha lo scopo di descrivere l'assemblaggio dell'apparato polmonare isolato, seguito dall'estrazione chirurgica e dalla cannulazione di polmoni e cuore da animali da laboratorio sperimentali, nonché di visualizzare la tecnica di perfusione e l'elaborazione del segnale dei dati. La vitalità media del polmone isolato varia tra 5-8 ore; durante questo periodo, la permeabilità capillare polmonare aumenta, causando edema e lesioni polmonari. La funzionalità del tessuto polmonare conservato è misurata dal coefficiente di filtrazione capillare (Kfc), utilizzato per determinare l'entità dell'edema polmonare nel tempo.
Introduction
Brodie e Dixon descrissero per la prima volta il sistema di perfusione polmonare ex-vivo nel 1903 1. Da allora, è diventato uno strumento gold standard per lo studio della fisiologia, della farmacologia, della tossicologia e della biochimica dei polmoni2,3. La tecnica offre un modo coerente e riproducibile per valutare la fattibilità dei trapianti di polmone e per determinare l'effetto dei mediatori infiammatori come l'istamina, i metaboliti dell'acido arachidonico e la sostanza P, tra gli altri, nonché le loro interazioni durante fenomeni polmonari come broncocostrizione, atelettasia ed edema polmonare. Il sistema polmonare isolato è stato una tecnica chiave per svelare l'importante ruolo dei polmoni nell'eliminazione delle ammine biogeniche dalla circolazione generale4,5. Inoltre, il sistema è stato utilizzato per valutare la biochimica del tensioattivo polmonare6. Negli ultimi decenni, il sistema di perfusione polmonare ex-vivo è diventato una piattaforma ideale per la ricerca sui trapianti di polmone7. Nel 2001 un team guidato da Stig Steen ha descritto la prima applicazione clinica del sistema di perfusione polmonare ex-vivo utilizzandolo per ricondizionare i polmoni di un donatore di 19 anni, che inizialmente è stato respinto dai centri di trapianto a causa delle sue lesioni. Il polmone sinistro è stato raccolto e perfuso per 65 minuti; in seguito, è stato trapiantato con successo in un uomo di 70 anni con BPCO8. Ulteriori ricerche sul ricondizionamento polmonare utilizzando la perfusione ex-vivo hanno portato allo sviluppo della tecnica di Toronto per la perfusione polmonare estesa per valutare e trattare i polmoni dei donatori feriti9,10. Clinicamente, il sistema di perfusione polmonare ex-vivo ha dimostrato di essere una strategia sicura per aumentare i pool di donatori trattando e ricondizionando i polmoni dei donatori al di sotto degli standard, non presentando differenze significative nei rischi o negli esiti rispetto ai donatori di criteri standard10.
Il vantaggio principale del sistema di perfusione polmonare isolato è che i parametri sperimentali possono essere valutati in un organo funzionale completo che conserva la sua funzione fisiologica sotto un allestimento di laboratorio artificiale. Inoltre, consente la misurazione e la manipolazione della ventilazione meccanica polmonare per analizzare le componenti della fisiologia polmonare come la resistenza delle vie aeree, la resistenza vascolare totale, lo scambio di gas e la formazione di edema, che ad oggi non possono essere misurati con precisione in vivo su animali da laboratorio2. In particolare, la composizione della soluzione con cui viene perfuso il polmone può essere completamente controllata, consentendo l'aggiunta di sostanze per valutarne gli effetti in tempo reale e la raccolta di campioni dalla perfusione per ulteriori studi11. I ricercatori che lavorano con il sistema polmonare isolato dovrebbero tenere presente che la ventilazione meccanica provoca il decadimento del tessuto polmonare accorciando il suo tempo utile. Questa progressiva caduta dei parametri meccanici può essere significativamente ritardata ipergonfiando i polmoni occasionalmente durante il periodo dell'esperimento4. Tuttavia, la preparazione di solito non può durare più di otto ore. Un'altra considerazione per il sistema di perfusione polmonare ex-vivo è l'assenza di regolazione nervosa centrale e drenaggio linfatico. Gli effetti della loro assenza non sono ancora completamente compresi e potrebbero potenzialmente essere una fonte di pregiudizi in alcuni esperimenti.
La tecnica del sistema di perfusione polmonare isolata può essere eseguita nel modello di coniglio con un alto grado di consistenza e riproducibilità. Questo lavoro descrive le procedure tecniche e chirurgiche per l'implementazione della tecnica di perfusione polmonare isolata ex-vivo sviluppata per il modello di coniglio presso l'Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias di Città del Messico, con l'intenzione di condividere le intuizioni e fornire una guida chiara sui passaggi chiave nell'applicazione di questo modello sperimentale.
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Protocol
Il sistema di perfusione isolato nel modello di coniglio è stato ampiamente utilizzato nel laboratorio di iperreattività bronchiale presso l'Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias. Il protocollo include conigli neozelandesi con un peso approssimativo di 2,5-3 kg. Tutti gli animali sono stati tenuti in condizioni standard di vivaio e alimentazione ad libitum in conformità con le linee guida ufficiali messicane per gli animali da laboratorio (NOM 062-ZOO-1999) e sotto la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (8a edizione, 2011). Tutte le procedure e i metodi di cura degli animali presentati in questo protocollo sono stati precedentemente approvati dal Comitato Etico dell'Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias.
NOTA: La preparazione del sistema di perfusione polmonare isolato comporta la morte deliberata di un animale in anestesia e tramite eutanasia.
1. Attrezzatura e preparazione degli apparecchi.
- Disposizione dell'attrezzatura:
- Impostare un tavolo operatorio con dimensioni in base al peso del coniglio.
- Montare il coperchio del torace artificiale sulla colonna di acciaio con la camera di vetro sottostante e il ventilatore con una pompa a rulli ai lati.
- Assicurarsi che il coperchio sia facilmente inclinato per avere la cannula tracheale in linea con la trachea per consentire un collegamento più veloce.
- Torace artificiale:
NOTA: è una parte essenziale del sistema. È costituito da una camera di vetro rivestita d'acqua sigillata da una copertura speciale. La copertura funziona come il supporto dell'organo con le connessioni per cannulare la trachea e i vasi incorporati in essa.- Impostare un getto venturi azionato da aria compressa per generare la pressione negativa all'interno del torace artificiale.
NOTA: Il modulo di controllo della ventilazione (VCM) consente regolazioni separate delle pressioni inspiratorie e di fine espirazione, nonché della frequenza respiratoria e del rapporto tra durata inspiratoria e durata totale del ciclo.
- Impostare un getto venturi azionato da aria compressa per generare la pressione negativa all'interno del torace artificiale.
- Apparecchio:
- Assicurarsi che un apparecchio normalmente funzionante sia costituito da una colonna principale in acciaio montata su una piastra di base che contiene il torace artificiale, con lo pneumotachometro e il trasduttore di peso situati sopra di esso e dietro la bobina di preriscaldamento con una trappola a bolle.
- Collegare un trasduttore di pressione differenziale allo pneumotachometro e un altro alla pressione della camera. Impostare un diverso paio di trasduttori di pressione dietro il torace per misurare la perfusione e le pressioni venose.
- Collegare il calcio di commutazione sotto l'ossigenatore con un elettrodo di livello e il sistema di ventilazione accanto all'apparecchio.
2. Estrazione chirurgica del blocco cardiopolmonare.
- Anestesia:
- Utilizzare una combinazione di un sedativo (xilazina) e un barbiturico (pentobarbital).
NOTA: diversi cocktail anestetici possono essere utilizzati senza alcun effetto sui risultati sperimentali. - In primo luogo, sedare i conigli sani della Nuova Zelanda con una singola iniezione intramuscolare di xilazina cloridrato (3-5 mg / kg). Assicurarsi che i conigli rimangano calmi e rilassati per consentire un'ulteriore manipolazione dopo pochi minuti dall'iniezione.
- Dopo la sedazione, utilizzare le vene marginali (laterali) dell'orecchio come accesso per anestetizzare i conigli con un'iniezione endovenosa di pentobarbital sodico (28 mg / kg).
- Utilizzare una combinazione di un sedativo (xilazina) e un barbiturico (pentobarbital).
- Monitoraggio:
- Per evitare un'anestesia insufficiente o un'eccessiva depressione delle funzioni cardiache e respiratorie, monitorare i seguenti parametri. Per valutare la profondità dell'anestesia, eseguire un test di pizzicamento delle dita dei piedi.
- Assicurarsi che la mucosa sia rosa. Le sfumature blu o grigie indicano ipossia.
- Assicurarsi che la frequenza cardiaca sia compresa tra 120-135 battiti / min e che la temperatura corporea non scenda al di sotto di 36,5 ° C.
- Posizionamento degli animali:
- Radere il busto del coniglio e posizionare l'animale sul tavolo operatorio in posizione supina. Posizionare il sistema di ventilazione vicino al tavolo, dietro la testa del coniglio, per consentire di collegare rapidamente le cannule dopo la tracheotomia per evitare danni tissulari.
- Incisione e tracheotomia:
- Sezionare la pelle con un'incisione della linea mediana ventrale di 3-5 cm dal diaframma fino al collo.
- Con le forbici operanti, tagliare i 2/3 anteriori della trachea tra due anelli cartilaginei per inserire la cannula tracheale attraverso la membrana fibrosa tracheale.
- Inserire un 5 mm (diametro esterno; OD) cannula tracheale attraverso la membrana fibrosa tracheale e utilizzare una sutura di seta 4-0 per fissarla con cura.
- Posizionare una pinza o una pinzetta sotto la trachea per assicurarsi che la cannula non si pieghi contro la trachea.
- Ventilazione a pressione positiva:
- Finché i polmoni rimangono al di fuori del torace artificiale, utilizzare una pompa di respirazione di piccole specie per ventilare una pressione positiva al fine di evitare il collasso polmonare durante l'intervento chirurgico.
- Avviare la ventilazione attraverso la cannula tracheale collegata alla pompa respiratoria rapidamente dopo la tracheotomia e prima che il torace venga aperto.
- Impostare il volume di marea a 10 ml/kg.
NOTA: A seconda della configurazione dell'esperimento e del modello di torace artificiale, fornire una ventilazione a pressione positiva dalla stessa pompa di ventilazione utilizzata per fornire una pressione negativa o da una diversa, garantendo una rapida ri-cannulazione.
- Toracotomia ed dissanguamento:
- Per accedere alla cavità toracica, utilizzare un bisturi o forbici per aprire la parete toracica ed eseguire una sternotomia mediale fino al terzo superiore del torace.
- Tenere le metà del torace aperte da due riavvolgitori. Diversi lembi polmonari di solito circondano il cuore.
- Localizzare la vena cava superiore e inferiore e riferirle con fili.
- Prima del dissanguamento dell'animale, identificare il ventricolo destro e iniettare 1000 UI/kg di eparina.
- Subito dopo l'iniezione, ligare la vena cava superiore e inferiore con il filo pre-looped ed eseguire il dissanguamento.
- Raccolta cuore-polmone:
- Raccogli il blocco cardiopolmonare delicatamente e rapidamente. Utilizzare la dissezione digitale diretta o le forbici a molla per separare il tessuto connettivo in modo da rimuovere i polmoni dal torace.
- Sezionare la vascolarizzazione nell'area e l'esofago.
- Tagliare il manubrium sterni per estendere la sternotomia mediale verso la cannula tracheale, rilasciando la trachea su entrambi i lati dal tessuto di collegamento.
- Ora, resettare la trachea sopra la cannula tracheale. Tirare delicatamente la cannula in un asse craniocaudale mentre la fissazione dorsale della trachea e dei polmoni viene resecata.
- Cannulazione:
- Sollevare i polmoni isolati dal torace e posizionarli con cura su una garza sterile su una capsula di Petri.
- Per prevenire l'atelettasia, ventilare i polmoni utilizzando la ventilazione a pressione positiva con pressione positiva di fine espirazione (PEEP) impostata a 2 cmH2O.
- Rimuovere i ventricoli tagliandoli dal cuore a livello del solco atrioventricolare.
- Dopo aver aperto i due ventricoli, introdurre la cannula dell'arteria polmonare OD da 4,6 mm per il coniglio con un cesto attraverso l'arteria polmonare e introdurre la cannula dell'atrio sinistro OD 5,9 mm per il coniglio con il cestello attraverso la valvola mitrale nell'atrio sinistro.
- Utilizzare una sutura di seta 4-0 nell'arteria polmonare e nell'atrio sinistro per fissare le cannule. Includere i tessuti circostanti nelle legature dell'arteria polmonare e dell'atrio sinistro per evitare la distensione di queste strutture.
- Iniettare 250 mL di soluzione isotonica salina attraverso le cannule arteriose per lavare il sangue rimanente dal letto vascolare.
3. Tecnica di perfusione.
- Apparecchio:
- Posizionare accuratamente i polmoni isolati nella camera polmonare.
- Attaccare la trachea al trasduttore sul coperchio della camera.
- Collegare i vasi cannulati al sistema di perfusione.
- Chiudere la camera e fissarla con la serratura rotante.
NOTA: Il circuito di perfusione a ricircolo è costituito da un serbatoio venoso aperto, una pompa peristaltica, uno scambiatore di calore e una trappola a bolle. - A questo punto, collegare il coperchio della camera e passare da un rubinetto per passare dalla ventilazione a pressione positiva a quella negativa. Per controllare la ventilazione a pressione negativa dei polmoni e la chiusura ermetica della camera, ispezionare l'escursione respiratoria del polmone e la pressione della camera sul manometro.
- Perfondere i polmoni con 200 ml di perfusato artificiale privo di sangue (un tampone di bicarbonato Krebs-Ringer contenente il 2,5% di albumina bovina).
- Avviare il flusso di perfusato a 3 ml / min / kg, quindi aumentare lentamente il flusso in un periodo di 5 minuti a 5 ml / min / kg. Raggiungere una portata di 8 mL/min/kg nei successivi 5 min e poi dopo un altro periodo di 5 min raggiungere un flusso massimo di 10 mL/min/kg. Fare attenzione a evitare che l'aria entri nel circuito.
NOTA: Mantenere il pH e la temperatura del perfusato entro intervalli fisiologici (pH 7,4-7,5; temperatura, 37 °C-38 °C). Per regolare il pH, aggiungere NaHCO3 (1N) o aumentare il flusso di anidride carbonica. In alternativa, utilizzare HCl (0.1N) per acidificare.
- Parametri:
- Verificare se i parametri di perfusione e ventilazione predeterminati sono impostati come richiesto.
- Ventilare i polmoni con aria umidificata ad una frequenza di 30 bpm, un volume di marea di 10 ml/kg e una pressione espiratoria finale (Pe) di 2 cmH2O.
NOTA: La pressione arteriosa polmonare (0-20 mmHg) corrisponde all'altezza del livello del liquido nell'ossigenatore o nel serbatoio in centimetri sopra il tronco polmonare, mentre la pressione venosa polmonare corrisponde all'altezza della camera di equilibrio della pressione sopra l'atrio sinistro. Entrambi i valori possono essere modificati. Si noti che anche la pressione dell'atrio sinistro è 0-20 mmHg.
- Raggiungimento delle condizioni della zona 3:
- Utilizzare i due cateteri collegati alle porte laterali delle cannule fissate nell'arteria polmonare, nell'atrio sinistro e nei trasduttori di pressione per misurare le pressioni arteriose (Pa) e venose (Pv).
- Impostare le pressioni basali a livello dell'ilo polmonare (riferimento zero).
- Condurre gli esperimenti in condizioni di ventilazione della zona 3. Per raggiungere questo obiettivo, attendere 10-15 minuti per ottenere un equilibrio caratterizzato da uno stato isogravimetrico.
- Assicurarsi che la pressione venosa sia superiore alla pressione alveolare (Palv) e che la pressione arteriosa rimanga superiore a entrambe (Pa > Pv > Palv) affinché si verifichino condizioni di Zona 3.
- Assicurarsi che il peso dei polmoni rimanga costante e che le pressioni arteriose e atriali sinistre siano stabili per raggiungere le condizioni della zona 3 per aprire un numero massimo di vasi polmonari e mantenere il contenuto del letto microvascolare durante l'esperimento.
NOTA: La misurazione di Kfc come indicatore di edema polmonare non ha variazioni tra un sistema di perfusione manuale e uno automatico.
- Controllo elettronico ed elaborazione del segnale: assicurarsi che il flusso respiratorio, le variazioni di peso, la pressione microvascolare, il volume delle maree, la resistenza vascolare, tra gli altri, siano registrati su un'unità elettronica centrale multipla che integra i segnali provenienti dai trasduttori e li visualizza sul sistema di valutazione.
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Representative Results
Il sistema di perfusione polmonare isolato consente la manipolazione degli organi per la biopsia, la raccolta di campioni dalla perfusione e la raccolta di dati in tempo reale dei parametri fisiologici. Il sistema isolato può essere utilizzato per testare molte ipotesi che coinvolgono diverse funzioni e fenomeni polmonari, dall'attività metabolica ed enzimatica alla formazione dell'edema e ai periodi di conservazione per i trapianti polmonari.
La Figura 1 mostra un diagramma del sistema di perfusione polmonare isolato completamente assemblato insieme al sistema di ventilazione e all'acquisizione dei dati calcolati. La componente di perfusione del sistema assicura che il perfusato fluisca costantemente attraverso i polmoni isolati. L'arteria polmonare è cannulata per fornire la perfusione di afflusso, mentre il deflusso di perfusato è fornito dalla cannulazione dell'atrio sinistro del cuore. Il perfusato viene fatto passare utilizzando la pompa a rulli in modo che il perfusato passi attraverso lo scambiatore di calore, quindi attraverso la trappola a bolle nell'arteria polmonare e infine nel letto vascolare polmonare. La componente di ventilazione del sistema consente al mezzo di ventilazione di fluire costantemente oltre l'estremità distale dello pneumotachometro direttamente attraverso la cannula tracheale nei polmoni.
La Figura 2 mostra la concentrazione di MAO (Figura 2A) e 5-HT (Figura 2B) in un polmone isolato conservato a 4 °C fino a 24 ore. I livelli di serotonina e monoamino ossidasi sono stati determinati da campioni di fluido intravascolare ottenuti in momenti diversi e analizzati da ELISA. La concentrazione di 5-HT ha raggiunto il picco dopo 15 minuti di conservazione e poi è diminuita durante le successive 6 ore. Successivamente, i livelli di perfusione hanno mostrato un aumento non statisticamente significativo fino alla 24a ora. I livelli di MAO hanno mostrato un comportamento simile, con un picco dopo 15 minuti di conservazione, per poi diminuire durante le successive sei ore fino alla 24a ora12. La figura 3 mostra i tassi di rilascio di 5-HT e MAO, espressi in percentuale del valore iniziale, misurati attraverso 24 ore in una preparazione polmonare isolata a 4 °C. Durante la prima ora di conservazione, i livelli di 5-HT sono aumentati più in alto rispetto all'MAO e sono diminuiti entro 6 ore dopo essere stati ricatturati da cellule endoteliali e piastrine, nonché dal catabolismo mediato da MAO12.
La Figura 4 mostra l'attività enzimatica NEP (densità ottiche/mg proteina/min) e ACE (densità ottiche/mg proteina/min) nel tempo in una preparazione polmonare isolata. L'attività della NEP (Figura 4A) è stata determinata mediante analisi spettrofotometrica utilizzando N-Dansyl-D-Ala-Gly-pnitro-Phe-Gly come substrato NEP seguito dall'aggiunta di enalapril per inibire l'ACE. L'attività ACE (Figura 4B) è stata determinata mediante analisi spettrofotometrica utilizzando enalapril come substrato ACE, seguita dall'aggiunta di fosforamidone per inibire la NEP. Poiché entrambe le soluzioni contenevano enalapril, l'attività ace è stata calcolata come differenza di fluorescenza tra campioni con e senza enalapril13.
La Figura 5 mostra l'effetto della conservazione polmonare nella permeabilità capillare (mKfc) attraverso un periodo di 24 ore nel sistema di perfusione polmonare isolato nel modello di coniglio. Un gruppo di controllo (n = 6), valutato immediatamente dopo la raccolta, ha avuto un mKfc di 2,8 ± errore standard di 0,8 (mL / min / cmH2O / g), al contrario, il polmone perfuso ha subito un aumento progressivo sul punteggio mKfc 7,5 ± 1,4 (n = 6) a 6 ore, 10,8 ± 2,3 (n = 6) a 12 ore e ha raggiunto 16,3 ± 2,5 (n = 6) dopo 24 ore di conservazione13.
La Figura 6 mostra l'effetto di diversi additivi nella permeabilità capillare del sistema di perfusione polmonare isolato in diverse condizioni. Un improvviso incremento di pressione di 10 cmH2O è generato da una parziale ostruzione del deflusso venoso per misurare la permeabilità del letto capillare attraverso il coefficiente di filtrazione capillare (Kfc). Per misurare il Kfc, il tubo di deflusso che esce dal ventricolo sinistro al serbatoio di Krebs è stato parzialmente bloccato. Quindi, il morsetto parziale è stato mantenuto per 3 minuti assicurandosi che l'incremento di pressione raggiungesse i 10 cmH2O. Il serraggio è stato rilasciato e il flusso normale è continuato. Questa manovra è stata registrata come un incremento della pressione arteriosa e un aumento del peso polmonare. Quest'ultimo parametro è considerato il Kfc.
Figura 1: Diagramma per il sistema di perfusione polmonare isolato. Questa cifra è stata modificata da Hugo Sachs Elektronik (HSE), Harvard Apparatus14. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Concentrazione di serotonina (5-HT) e monoamino ossidasi (MAO) coinvolte nel metabolismo polmonare e nella permeabilità vascolare. La concentrazione di (A) MAO e (B) 5-HT in un polmone isolato conservato a 4°C fino a 24 h. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Tassi di rilascio di serotonina (5-HT) e monoamino ossidasi (MAO). I tassi di rilascio di 5-HT e MAO, espressi come percentuale del valore iniziale, misurati attraverso 24 ore in una preparazione polmonare isolata a 4 °C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Attività enzimatica dell'endopeptidasi neutra (NEP) e dell'enzima di conversione dell'angiotensina (ACE). Attività enzimatica di (A) NEP e (B) ACE nel tempo in un polmone isolato conservato a 4 °C fino a 24 ore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Effetto della conservazione polmonare nella permeabilità capillare (mKfc). I dati mostrano l'effetto della conservazione polmonare nella permeabilità capillare (mKfc) attraverso un periodo di 24 ore nel sistema di perfusione polmonare isolato nel modello di coniglio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Effetto di diversi additivi nella permeabilità capillare. L'effetto di diversi additivi nella permeabilità capillare del sistema di perfusione polmonare isolato in diverse condizioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo lavoro mostra una visione generale del sistema di perfusione polmonare isolato, una tecnica essenziale nella ricerca sulla fisiologia polmonare. Il sistema di perfusione polmonare isolato offre un grande grado di versatilità nei suoi usi e consente la valutazione di diversi parametri rilevanti nella sperimentazione di una vasta gamma di ipotesi15. Un sistema polmonare isolato è uno strumento con presenza mondiale che, nell'ultimo decennio, ha ulteriormente stabilito la sua rilevanza per le valutazioni organo-specifiche e ha anche ampliato la sua utilità come estensione di tecnologie all'avanguardia e nuove terapie che coinvolgono cellule staminali mesenchimali16 e ingegneria del genoma CRISPR / Cas917, tra gli altri. Le attuali aree di ricerca sulla perfusione polmonare ex vivo coprono ampiamente le strategie antinfiammatorie, la gestione e la prevenzione delle lesioni da ventilazione, il trattamento anti-rigetto e le prestazioni anti-edema polmonare15.
È necessario un corretto assemblaggio dell'apparecchio per garantire la corretta raccolta dei dati. Come mostrato nella Figura 1 , l'intero sistema è costituito da una camera umida a pressione negativa collegata a un sistema di ventilazione e da un sistema di perfusione che imita rispettivamente le funzioni respiratorie e circolatorie dei polmoni. Entrambi i sistemi sono collegati ad un sistema di acquisizione dati che consente l'aggiunta di dispositivi di misura che possono essere adattati alle esigenze di qualsiasi protocollo. Il processo chirurgico di raccolta del blocco cardio-polmonare deve essere eseguito rapidamente, preferibilmente da personale esperto, per evitare ulteriori lesioni tissutali per mantenere il polmone il più intatto possibile in modo che la funzione fisiologica possa continuare senza ulteriori interferenze durante l'esperimento. Il sistema consente inoltre la raccolta di campioni di perfusione in tempo reale che possono essere utilizzati per determinare l'effetto di determinate molecole in diverse funzioni polmonari (ad esempio, l'effetto dell'eparina sulla conservazione polmonare).
Al fine di ottenere una corretta distribuzione del flusso di perfusione tra i vasi polmonari, vale a dire i capillari, è necessario procurarsi le condizioni della zona 3. Le condizioni della zona 1 sono definite come la regione in cui la pressione arteriosa scende al di sotto della pressione alveolare, in genere avvicinandosi alla pressione atmosferica. Quando ciò accade, i capillari si appiattiscono, rendendo impossibile il flusso di sangue o di perfusione. In circostanze normali la zona 1 non può esistere poiché la pressione arteriosa è sufficiente a garantire la distribuzione del flusso. Tuttavia, le condizioni della zona 1 possono apparire se la pressione arteriosa diminuisce o la pressione alveolare aumenta (come fa durante la ventilazione a pressione positiva). Le condizioni della zona 1 portano a un polmone ventilato non perfuso che non è in grado di eseguire uno scambio di gas. In condizioni di zona 2, la pressione arteriosa è superiore alla pressione alveolare. Tuttavia, la pressione venosa rimane al di sotto della pressione alveolare risultante in un flusso di perfusione determinato dalla differenza tra pressione arteriosa e alveolare. Questo comportamento può essere modellato utilizzando un resistore Starling. Le condizioni della zona 3 sono determinate dalla differenza tra pressione arteriosa e venosa. L'aumento del flusso di perfusione nella zona 3 si verifica perché i capillari si distendono, condizionando l'apertura di un numero massimo di vasi polmonari.
L'unità del sistema è composta da sette moduli: due moduli amplificatori trasduttori analogici (TAM-A) dotati di un segnale analogico LED a barre grafico per monitorare i segnali dinamici (pressione sanguigna, flusso d'aria respiratorio, forza di contrazione, ecc.), un modulo amplificatore trasduttore digitale (TAM-D) con display numerico digitale progettato per monitorare segnali pulsatili a variazione lenta; un servocontrollore per modulo di perfusione (SCP) che funziona insieme agli amplificatori TAM-A e TAM-D per il controllo della perfusione di perfusioni di organi isolati utilizzando la pompa peristaltica, la velocità della pompa può essere impostata in modalità a pressione costante o controllata manualmente attraverso l'SCP; un modulo di equilibrio dell'edema (EBM) che misura il peso polmonare; un modulo di controllo della ventilazione (VCM) per controllare la ventilazione a pressione positiva e negativa e un modulo contatore timer (TCM) che può essere impostato per attivare il VCM per eseguire cicli di aspirazione profondi.
L'elevata prevalenza globale di affezioni polmonari e respiratorie e le limitazioni delle attuali opzioni terapeutiche stanno costringendo a una maggiore domanda di trapianti di polmone, in quanto rimane il trattamento gold standard per i pazienti con malattia polmonare terminale18. Il sistema di perfusione polmonare ex-vivo rappresenta un'ottima piattaforma per testare terapie mirate sia nella ricerca di base che in quella clinica. A livello clinico, il sistema di perfusione ex-vivo può essere utilizzato per valutare il tessuto del trapianto al di fuori del corpo, consentendo di testare l'organo isolato prima del trapianto, contribuendo a raccogliere dati clinici per una prognosi più precisa sull'efficacia del trapianto. L'uso razionale del sistema di perfusione polmonare isolato potrebbe aiutare a ottimizzare la chirurgia del trapianto di polmone, rendendoli una procedura più sicura e più elettiva. Il modello polmonare isolato è utile anche nella ricerca di base di tecniche avanzate di diagnosi e terapia come l'instillazione di cellule staminali mesenchimali e altre terapie immuno-mediate; molti rapporti hanno dimostrato il potenziale della tecnica di perfusione ex-vivo come piattaforma per effettuare ulteriori ricerche sulla conservazione polmonare nello sviluppo di tecniche per evitare lesioni da ischemia-riperfusione ed edema polmonare, prolungando la vitalità degli organi15. Alcuni passaggi di risoluzione dei problemi e limitazioni associati al modello polmonare isolato sono principalmente il breve tempo disponibile di questa tecnica per la possibile generazione di edema indotta dalla limitazione del drenaggio linfatico e l'effetto sistemico della tecnica. La determinazione del coefficiente di filtrazione capillare (Kfc) è un criterio affidabile per misurare la funzionalità del tessuto polmonare conservato e stabilire l'entità dell'edema nel tempo. Non è stata riscontrata alcuna differenza tra le determinazioni manuali e automatiche di Kfc19.
Mentre l'uso del sistema di perfusione polmonare isolato si diffonde e le nuove terapie cambiano il panorama clinico, la tecnica di perfusione ex-vivo sta diventando una scelta elettiva per migliorare gli esiti dei pazienti in diverse patologie polmonari, nonché per aumentare il pool di potenziali donatori polmonari senza compromettere la sicurezza del ricevente, promettendo una nuova era nella conservazione polmonare e nel trapianto di polmone. L'emergere della pandemia di Covid-19 e l'aumento della prevalenza della BPCO18,20 nella popolazione globale evidenzia la necessità di ulteriori ricerche di base sulla fisiologia polmonare, la conservazione polmonare e il trapianto di polmone, nonché la ricerca preclinica di nuove terapie con prospettive verso la medicina traslazionale. Inoltre, il modello di coniglio ex-vivo è un modello accessibile e pratico per formare residenti e studenti nell'area della pneumologia, in particolare quelli coinvolti nella chirurgia toracica e nell'ECMO. Qualsiasi laboratorio coinvolto in protocolli di ricerca respiratoria o toracopolmonare è incoraggiato a considerare il sistema di perfusione polmonare isolato come parte dei loro strumenti quotidiani per i loro esperimenti.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare la dottoressa Bettina Sommer Cervantes per il suo sostegno nella scrittura di questo manoscritto e Kitzia Elena Lara Safont per il suo supporto con le illustrazioni.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1864 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4309 | |
| Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4138 | |
| Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder | sigma | 3912 | 500 g |
| Calcium chloride, CaCl2·2H2O. | JT Baker | 10035-04-8 | |
| Cryogenic vials | Corning | 430659 | 2 mL |
| D-glucosa, C6H12O6. | sigma | G5767 | |
| Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-3882 | |
| Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0064 | |
| Eppendorf tubes | |||
| Ethanol absolute HPLC grade | Caledon | ||
| Falcon tubes | 14 mL | ||
| Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 70-7001 | |
| Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9349 | |
| Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9703 | |
| Heparin | PISA | 5000 UI | |
| HPLC Column (C18 100A 5U) | Alltech | 98121213 | 150 mm x 4.6 mm |
| Hydrophilic Syringe Filter | Millex | SLLGR04NL | 4 mm |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0322 | |
| Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0125 | |
| Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4162 | |
| Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0020 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O | JT Baker | 10034-99-8 | |
| Microcentrifuge Tube | Corning | 430909 | |
| Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4298 | |
| New Zeland rabbits | |||
| PISABENTAL (Pentobarbital sodium) | PISA | Q-7833-215 | |
| PLUGSYS Case, Type 603* 7 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0045 | |
| PLUGSYS TCM Time Counter Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1750 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0065 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1793 | |
| PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1755 | |
| Potassium chloride, KCl. | JT Baker | 3040-01 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 7778-77-0 | |
| PROCIN (Xylacine clorhydrate) | PISA | Q-7833-099 | |
| Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4161 | |
| Scalpel knife | |||
| Serotonin 5-HT | |||
| Servo Controller for Perfusion (SCP | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-2806 | |
| Snap Cap Microcentrifuge Tube | Costar | 3620 | 1.7 mL |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| Sodium chloride, NaCl. | sigma | S9888 | |
| Surgical gloves No. 7 1/2 | |||
| Surgical gloves No. 8 | |||
| Taygon tubes | Masterflex | ||
| Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4163 |
References
- Dixon, W. E. Contributions to the physiology of the lungs: Part I. The bronchial muscles, their innervation, and the action of drugs upon them. The Journal of Physiology. 29 (2), 97-173 (1903).
- Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
- Roman, M. A., Nair, S., Tsui, S., Dunning, J., Parmar, J. S. Ex vivo lung perfusion: a comprehensive review of the development and exploration of future trends. Transplantation. 96 (6), 509-518 (2013).
- Delaunois, A., Gustin, P., Ansay, M. Multiple muscarinic receptor subtypes mediating pulmonary oedema in the rabbit. Pulmonary Pharmacology. 7 (3), 185-193 (1994).
- Delaunois, A., Gustin, P., Vargas, M., Ansay, M. Protective effect of various antagonists of inflammatory mediators against paraoxon-induced pulmonary edema in the rabbit. Toxicology and Applied Pharmacology. 132 (2), 343-345 (1995).
- Barr, H. A., Nicholas, T. E., Power, J. H. Control of alveolar surfactant in rats at rest and during prolonged hyperpnoea: pharmacological evidence for two tissue pools of surfactant. British Journal of Pharmacology. 93 (3), 473-482 (1988).
- Machuca, T. N., Cypel, M.
- Steen, S., et al. First human transplantation of a nonacceptable donor lung after reconditioning ex vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (6), 2191-2194 (2007).
- Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 27 (12), 1319-1325 (2008).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. New England Journal of Medicine. 364 (15), 1431-1440 (2011).
- Kao, C. C., Parulekar, A. D.
- Alquicira-Mireles, J. Participación de la serotonina en los cambios de permeabilidad vascular en la preservación pulmonar en conejo. , Universidad Nacional Autónoma de México. Biología thesis (2013).
- Arreola-Ramírez, J. L. Papel de la liberación de acetilcolina y sustancia P en el deterioro de la función pulmonar en un modelo experimental de preservación pulmonar en conejo. , Universidad Nacional Autónoma de México. Doctorado en Ciencias Biomédicas thesis (2009).
- Isolated lung perfusion systems for small to large animal models. Harvard Apparatus. Hugo Sachs Elektronik (HSE). , Available from: https://www.harvardapparatus.com/media/harvard/pdf/Isolated%20Lung%20Perfusion%20Systems%20Brochure.pdf (2021).
- Jiao, G. Evolving trend of EVLP: Advancements and emerging pathways. SN Comprehensive Clinical Medicine. 1 (4), 287-303 (2019).
- Mordant, P., et al. Mesenchymal stem cell treatment is associated with decreased perfusate concentration of interleukin-8 during ex vivo perfusion of donor lungs after 18-hour preservation. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1245-1254 (2016).
- Cowan, P. J., Hawthorne, W. J., Nottle, M. B. Xenogeneic transplantation and tolerance in the era of CRISPR-Cas9. Current Opinion in Organ Transplantation. 24 (1), 5-11 (2019).
- Collaborators, G. C. R. D. Prevalence and attributable health burden of chronic respiratory diseases, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet Respiratory Medicine. 8 (6), 585-596 (2020).
- Bravo-Reyna, C. C., Torres-Villalobos, G., Aguilar-Blas, N., Frías-Guillén, J., Guerra-Mora, J. R. Comparative study of capillary filtration coefficient (Kfc) determination by a manual and automatic perfusion system. Step by step technique review. Physiological Research. 68 (6), 901-908 (2019).
- Pereira, M. R., et al. COVID-19 in solid organ transplant recipients: Initial report from the US epicenter. American Journal of Transplantation. 20 (7), 1800-1808 (2020).
