Eine einfache und effektive Methode zur konsistenten Isolierung von Maus-Kardiomyozyten

Zusammenfassung

Der Goldstandard in der Kardiologie für zelluläre und molekulare Funktionsexperimente sind Kardiomyozyten. Dieser Artikel beschreibt Anpassungen an die Nicht-Langendorff-Technik zur Isolierung von Maus-Kardiomyozyten.

Zusammenfassung

Der Bedarf an reproduzierbaren und technisch einfachen Methoden, die qualitativ hochwertige Kardiomyozyten liefern, ist für die Forschung in der Herzbiologie von entscheidender Bedeutung. Zelluläre und molekulare funktionelle Experimente (z. B. Kontraktion, Elektrophysiologie, Kalziumzyklus usw.) an Kardiomyozyten sind der Goldstandard für die Etablierung von Krankheitsmechanismen. Die Maus ist die Spezies der Wahl für funktionelle Experimente und die beschriebene Technik ist speziell für die Isolierung von Maus-Kardiomyozyten. Bisherige Methoden, die einen Langendorff-Apparat erfordern, erfordern ein hohes Maß an Training und Präzision für die Aortenkanülierung, was häufig zu einer Ischämie führt. Das Feld verlagert sich hin zu Langendorff-freien Isolationsmethoden, die einfach und reproduzierbar sind und lebensfähige Myozyten für die physiologische Datenerfassung und Kultur liefern. Diese Methoden verkürzen die Ischämiezeit im Vergleich zur Aortenkanülierung erheblich und führen zu zuverlässig erhaltenen Kardiomyozyten. Unsere Anpassung an die Langendorff-freie Methode umfasst eine initiale Perfusion mit eiskalter Clearing-Lösung, die Verwendung einer stabilisierenden Plattform, die eine stabile Nadel während der Perfusion gewährleistet, und zusätzliche Verdauungsschritte, um zuverlässig gewonnene Kardiomyozyten für den Einsatz in funktionellen Messungen und Kulturen zu gewährleisten. Diese Methode ist einfach und schnell durchzuführen und erfordert wenig technisches Geschick.

Einleitung

Eine wesentliche Idee in der herzbiologischen Literatur ist seit Jahrzehnten der molekulare Wirkmechanismus. Der Wirkmechanismus muss etabliert sein, um verlässliche Studien zu veröffentlichen. Eine gut etablierte Strategie zur Bestimmung molekularer Mechanismen sind isolierte Kardiomyozytenstudien, die qualitativ hochwertige Kardiomyozyten benötigen, um vertrauenswürdige Daten zu erhalten. Zelluläre und molekulare Experimente, die an Kardiomyozyten durchgeführt werden, um den Wirkmechanismus zu bestimmen, sind der Goldstandard für die Untersuchung von Kontraktion¹, Elektrophysiologie², Calcium (Ca 2+) -Zyklus

Protokoll

Alle in dieser Studie durchgeführten Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Ohio State University in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien genehmigt.

1. Vorbereitung der Lösung

ANMERKUNG: Die Pufferkonzentrationen sind Tabelle 2 zu entnehmen.

1. Präisolation (bis zu 2 Wochen vor der Myozytenisolierung)
   1. Perfusionspufferbasis: Bereiten Sie 1 l Perfusionspufferbasis (NaCl, KCl,_NaH2PO4, HEPES, Glucose und BDM) in 1 l hochreinen 18,2 MΩ·cm H₂O vor. Stellen Sie vor der 0,22 μm Sterilfiltration einen pH-Wert von 7,4 ein....

Ergebnisse

Es gibt einige Elemente, die bei der Bestimmung des Erfolgs einer Isolation zu berücksichtigen sind. Erstens müssen die Kardiomyozyten stäbchenförmig sein und keine Membranbläschen aufweisen, wie die in Abbildung 1 isolierten Zellen. Eine typische Isolierung ergibt ~80% der Myozyten, die stäbchenförmig sind. Wenn die Isolierung weniger als 50% stäbchenförmige Zellen ergibt, wird dies als erfolglose Isolierung angesehen und Kardiomyozyten werden nicht verwendet. Schließlich sollten die Kardio.......

Diskussion

Der Hauptvorteil unserer Langendorff-freien Kardiomyozyten-Isolationstechnik besteht darin, dass sie Hypoxie und ischämische Zeit begrenzt, da keine Kanülierung an einem Langendorff-Gerät erforderlich ist. Alternativ zu den klassischen Langendorff-Techniken, die mehrere Minuten benötigen, um das Herz zu entfernen, zu reinigen und aufzuhängen, was oft zu einer ischämischen Schädigung der Myozyten führt, beinhaltet unsere Methode eine In-vivo-Reinigung des Blutes über eine eiskalte Reinigungslösung. Der e.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 cc Bd Luer-Lok Spritze	Fisher Sci	14-827-52
10 mL Pyrex Becherglas	Cole-Palmer	UX-34502-01
100 mL Polypropylen-Verschluss Glas-Medienaufbewahrungsflasche	DWK Life Sciences	UX-34523-00
14 mL Reagenzgläser aus Polypropylen mit rundem Boden und Kappe	Fisher Sci	14-959-11B
2,3-Butandion-Monoxim	Sigma	B0753>	98%
3 cc BD Luer-Lok Spritze	Fisher Sci	14-823-435
35 mm Glasbodenschalen	MatTek Corporation	P35G-1.0-20-C
50 mL BD Spritze ohne Nadel	Fisher Sci	13-689-8
50 mL konische Zentrifugenröhrchen	Cole-Palmer	EW-22999-84
95% O2 5% CO2
AIMS Space Gel Heizkissen	Fisher Sci	14-370-223
BD PrecisionGlide 27 g x 1/2" Injektionsnadeln	Becton Dickinson	305109
Rinderserum Albumin	Sigma	A3803	Hitzeschockfraktion, lyophilisiertes Pulver, im Wesentlichen fettsäurefrei, >98%
Calciumchlorid-Dihydrat	Sigma	C7902>	99%
D-(+)-Glukose	Sigma	G7021	Geeignet für Zellkulturen, >99,5%
DMEM	Fisher Sci	11965092
EDTA	Fisher Sci	AAA1071336
Falcon 100 mm TC-behandelte Zellkulturschale	Corning	353003
FBS	R& D Systems (Bio-techne)	S11195
Fisherbrand Isotemp beheizte Tauchzirkulatoren	Fisher Sci	13-874-432
Hartman Mosquito Hämostatische Pinzette	World Precision Instruments	15921
Hausser Scientific Hy-Lite Zählkammer-Set	Fisher Sci	02-671-11
HEPES	Sigma	H4034	>99,5%
Beschriftungsband	Fisher Sci	15-901-10R
Legato 100 Spritzenpumpe	kdScientific	788100
L-Glutathion	Fisher Sci	ICN19467980
Liberase TH Research Grade	Sigma	5401135001	Hohe Thermolysinkonzentration
M199	Fisher Sci	MT10060CV
Magnesiumchlorid	Invitrogen	AM9530G
Maus Laminin	Corning	354232
Stift / Strep	Fisher Sci
Kaliumchlorid	Sigma	P5405	>99%
Präzisionsdigitales reziprokes Wasserbad	ThermoFisher Scientific	TSCIR19
Natriumbicarbonat	Sigma	S5761	Geeignet für Zelle Kultur
Natriumchlorid	Sigma	S5886>	99%
Natriumphosphat monobasisch	Sigma	S5011	>99%
Steriles Zellsieb 70 µ m	Fisher Sci	22-363-548
Student Feinschere	Fine Science Tools	91460-11
VWR Saugfähige Unterlage	Fisher Sci	NC9481815