Summary
Guldstandarden inden for kardiologi til cellulære og molekylære funktionelle eksperimenter er kardiomyocytter. Denne artikel beskriver tilpasninger til ikke-Langendorff-teknikken til isolering af musekardiomyocytter.
Abstract
Behovet for reproducerbare, men teknisk enkle metoder, der giver kardiomyocytter af høj kvalitet, er afgørende for forskning i hjertebiologi. Cellulære og molekylære funktionelle eksperimenter (fx sammentrækning, elektrofysiologi, calciumcyklus osv.) på kardiomyocytter er guldstandarden for etablering af sygdomsmekanisme(r). Musen er den valgte art til funktionelle eksperimenter, og den beskrevne teknik er specifikt til isolering af musekardiomyocytter. Tidligere metoder, der krævede et Langendorff-apparat, kræver et højt niveau af træning og præcision for aortakanylering, hvilket ofte resulterer i iskæmi. Feltet skifter mod Langendorff-fri isolationsmetoder, der er enkle, reproducerbare og giver levedygtige myocytter til fysiologisk dataindsamling og kultur. Disse metoder reducerer i høj grad iskæmitiden sammenlignet med aortakanylering og resulterer i pålideligt opnåede kardiomyocytter. Vores tilpasning til den Langendorff-fri metode inkluderer en indledende perfusion med iskold rydningsopløsning, brug af en stabiliserende platform, der sikrer en stabil nål under perfusion og yderligere fordøjelsestrin for at sikre pålideligt opnåede kardiomyocytter til brug i funktionelle målinger og kultur. Denne metode er enkel og hurtig at udføre og kræver lidt teknisk dygtighed.
Introduction
I årtier er en væsentlig idé i hjertebiologisk litteratur den molekylære virkningsmekanisme. Virkningsmekanismen skal etableres for at kunne offentliggøre pålidelige undersøgelser. En veletableret strategi til bestemmelse af molekylær mekanisme er isolerede kardiomyocytundersøgelser, som kræver kardiomyocytter af høj kvalitet for at opnå pålidelige data. Cellulære og molekylære eksperimenter udført på kardiomyocytter for at bestemme virkningsmekanismen er guldstandarden til undersøgelse af sammentrækning1, elektrofysiologi2, calcium (Ca 2+) cykling3, myofilament Ca2+ følsomhed4, cytoskelet5, metabolisme6, virkninger af hormoner7, signalmolekyler8, lægemiddelundersøgelser9 osv. Musen er blevet den valgte art til de fleste hjertebiologiske eksperimenter på grund af den lette genetiske manipulation, dens lille størrelse, dens relativt korte levetid, lave omkostninger osv.10. Den pålidelige isolering af højkvalitets musekardiomyocytter er imidlertid ikke triviel med nuværende teknikker.
Labs har isoleret kardiomyocytter i næsten 70 år11. Næsten alle teknikker til isolering af kardiomyocytter er afhængige af fordøjelsen af hjertet via forskellige enzymer (collagenase, protease, trypsin osv.). I de tidlige perioder (1950'erne-1960'erne) blev chunk-metoden anvendt, hvilket involverede fjernelse af hjertet, skæring i meget mindre stykker og inkubation i opløsning med collagenase / protease / trypsin12. I 1970'erne implementerede laboratorier den forbedrede "Langendorff" metode13, som isolerede kardiomyocytter ved hjælp af en koronararterieperfusionsbaseret isolationsteknik (retrograd perfusion med enzym via Langendorff-apparatet); Denne teknik forbliver den dominerende metode til myocytisolering i marken i dag, ~ 50 år senere14,15,16. Nyere arbejde er skiftet til kanylering af hjertet in vivo for at begrænse hypoxitid og iskæmisk skade, hvilket resulterer i overlegne kardiomyocytisolationer (bedre udbytte og højere kvalitet)17. For nylig har dette udviklet sig til at udføre in vivo, Langendorff-fri hjerteperfusioner 18,19,20,21,22. Vi har udviklet den Langendorff-fri kardiomyocytisoleringsteknik baseret på Ackers-Johnson et al.18-teknikken og tilpasset forskellige komponenter fra de mange tidligere isolationsteknikker. Disse vigtige tilpasninger omfatter injektion af en iskold clearingbuffer og inkorporering af en støtteplatform til stabilisering af nålen, hvilket muliggør nedsat manipulation af hjertet. Også detaljeret i denne teknik er temperaturkontrol af injicerede buffere (37 ° C), hvilket reducerede tiden mellem in vivo injektion og fordøjelse på grund af mindre EDTA-perfusion som tidligere offentliggjort18. Ved at mindske manipulation af hjertet og derfor minimere punkteringsstedets størrelse opnås grundig og konstant perfusion af koronararterierne. Vi raffinerede også teknikken med en sekundær klumpmetode fordøjelse, mængden af EDTA i den injicerede clearingbuffer og ændrede pH. Vores beskrevne teknik er mere pålidelig, mere effektiv og kræver ikke den omfattende træning/øvelse sammenlignet med brugen af Langendorff-apparatet (tabel 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer udført i denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Ohio State University i overensstemmelse med NIH-retningslinjer.
1. Forberedelse af opløsning
BEMÆRK: Se tabel 2 for bufferkoncentrationer.
- Forisolering (op til 2 uger før myocytisolering)
- Perfusionsbufferbase: Forbered 1 liter perfusionsbufferbase (NaCl, KCl,NaH2PO4, HEPES, glucose og BDM) i 1 liter ultraren 18,2 MΩ · cm H2O. Juster til pH7,4 før 0,22 μm steril filtrering. Opbevares ved 4 °C indtil isolationsdagen.
- Rydningsbuffer: Forbered 1 liter clearingbuffer (NaCl, KCl,NaH2PO4, HEPES, glucose, EDTA og BDM) i 1 liter ultraren 18,2 MΩ·cm H2O. Juster til pH7,4 før 0,22 μm steril filtrering. Opbevares ved 4 °C indtil isolationsdagen.
- 100 mM CaCl2-stamopløsning: 1,11 gCaCl2 afvejes og opløses i 100 ml ultraren 18,2 MΩ·cmH2O. Opbevares ved stuetemperatur indtil isolationsdagen.
- Liberase-alikvoter: Opløs 5 mg fordøjelsesenzymer i 5 ml sterilt, RNasefrit vand. Forbered 0,8 ml alikvoter og opbevar ved -20 °C indtil isolationsdagen.
- Laminer opvasken: Påfør 100 μL 40 μg/ml muselaminin på sterile 30 ml petriskåle med glasbund. Lad det sidde i 30 minutter og fjern overskydende laminin. Sæt laminin på en petriskål med UV-inkubation ved stuetemperatur i 30 min. Opbevares ved 4 °C indtil isolationsdagen (laminerede petriskåle kan anvendes i op til 2 uger).
- DMEM-medier: I et biosikkerhedsskab tilsættes 2,5 ml FBS, 0,5 ml Penicillin-Streptomycin (50 U / ml-50 μg) og 1 ml 500 mM BDM til 46 ml DMEM. Opbevares ved 4 °C indtil isolationsdagen (medier kan anvendes i op til 2 uger).
- M199-medier: Forbered 1 L M199-medier (NaHCO3, HEPES, L-glutathion, M199, BDM og BSA) i 1 liter ultraren 18,2 MΩ·cm H2O. Juster til pH 7,4 før steril filtrering (0,22 μm filter). Opbevares ved 4 °C indtil isolationsdagen.
- 500 mM BDM-lager: Tilsæt 0,5 g BDM til 10 ml ultrarent 18,2 MΩ·cm H2O. Opbevares ved 4 °C indtil isolationsdagen.
- Stabiliserende platformoprettelse: Form legedej omkring bunden af nålen skruet ind i Luer-stophanen. Form til petriskålen, der indeholder hjertet, og sørg for, at nålen er i den rette højde til ventrikelinjektion (~ 5 mm over bunden af skålen).
- Isolationsdagen
- Perfusionsbuffer: På isolationsdagen tilsættes 9,5 mgMgCl2 til 100 ml perfusionsbufferbase. Lad det blande helt, før du fjerner 30 ml færdig perfusionsbuffer og læg det i en ren, bred mund, 100 ml glasflaske med et skruelåg (fordøjelsesbuffer).
BEMÆRK: Disse tilføjelser kan foretages på isolationsdagen uden yderligere pH-justeringer, da deres tilsætning ubetydeligt ændrer pH-værdien.- Fjern 12 ml perfusionsbuffer og sæt den til siden (stopbuffer). Hæld de resterende 58 ml perfusionsbuffer i en anden ren, bred mund, 100 ml glasflaske med et skruelåg. Den resterende perfusionsbuffer opbevares ved 37 °C under hele isolationen.
- Fordøjelsesbuffer: Der tilsættes 7,5 μL 100 mMCaCl2 til 30 ml perfusionsbuffer i en slutkoncentration på 25 μM. Umiddelbart før isoleringen tilsættes 770 μL Liberase til fordøjelsesbufferen i en slutkoncentration på 26 μg/ml.
- Stop buffer: Opløs 240 mg BSA i 12 ml perfusionsbuffer. Opbevares isoleret ved 37 °C.
- Rydningsbuffer: Forbered en 3 ml sprøjte med rydningsbuffer og ryd nålen for bobler. Opbevares på is indtil isolering.
- Perfusionsbuffer: På isolationsdagen tilsættes 9,5 mgMgCl2 til 100 ml perfusionsbufferbase. Lad det blande helt, før du fjerner 30 ml færdig perfusionsbuffer og læg det i en ren, bred mund, 100 ml glasflaske med et skruelåg (fordøjelsesbuffer).
2. Manifold forberedelse
- Ryd den temperaturstyrede manifold med frisklavet perfusionsbuffer, og vær omhyggelig med at sikre, at der ikke er bobler tilbage. Brug et Luer-låsestik til at skrue en 27 G-nål i, og fjern bobler. En ryddet manifold er afgørende for en vellykket isolering.
3. Tilberedning af dyr
- Intraperitonealt mus injiceres med 100 mg/kg ketamin og 20 mg/kg xylazin efter legemsvægt umiddelbart før isoleringen. Denne procedure brugte en mandlig, 4 måneder gammel C57Bl/6-mus.
- Hvis det er nødvendigt, skal du placere musen på en opvarmet kirurgisk pude for at tilskynde til sedation. Telt musens arme, og tape lemmerne og bunden af halen til en blå laboratorieble. Sørg for, at dyret bedøves fuldt ud ved tilbagetrækning af tåklemmerefleksen. Påfør et sterilt drapering omkring det kirurgiske område.
4. Procedure for isolering af kardiomyocytter
- Udsæt musens brystben, og skær sideværts til midterlinjen, skær proximalt gennem ribbenene og til axillen. Skær forsigtigt helt igennem mellemgulvet, og sørg for overfladiske snit for at undgå hjertet. Klem brystbenet med en hæmostat, og fold ribbenene bagud for at udsætte brysthulen.
- Fjern forsigtigt perikardiet fra hjertet og skær helt gennem den ringere vena cava, straks distal til hjertet. Brug en 3 ml sprøjte med en 27 G kanyle til hurtigt at injicere 3 ml iskold rydningsbuffer i hjertets højre ventrikel over 1 min.
- Hold forsigtigt hjertet ved hjælp af pincet og træk væk fra kroppen og udsæt så meget af aorta som muligt. Brug en hæmostat til at klemme den stigende aorta, pas på ikke at klemme atrierne og udskille hjertet fra brystet.
- Overfør hurtigt det fastspændte hjerte til låget på en petriskål af polypropylen med ca. 10 ml varm perfusionsbuffer. Anbring det fastspændte hjerte i støtteplatformen, og brug en stabiliseret 27 G nål fastgjort til manifolden til at injicere 10 ml temperaturstyret 37 °C perfusionsbuffer i venstre ventrikel over 5 min.
- Overfør det fastspændte hjerte og støtteplatformen til en petriskål med ca. 5 ml fordøjelsesbuffer. Udskift inputsprøjter med en 50 ml sprøjte med 25 ml fordøjelsesbuffer.
- Ryd manifolden for eventuelle bobler og resterende perfusionsbuffer før injektion. Sæt forsigtigt nålen i samme kanyleposition i venstre ventrikelspids.
- Brug en perfusionspumpe til at injicere temperaturstyret 37 °C fordøjelsesbuffer i venstre ventrikel i 15 minutter ved hjælp af en 50 ml sprøjte. Opløsningens temperatur kontrolleres med en vandkappe, der på forhånd er kalibreret til at skubbe 37 °C-opløsningen ud for enden af kanylen.
- Fjern ventriklerne fra atrierne og overfør til et 10 ml bægerglas. Tilsæt 3 ml fordøjelsesbuffer til bægerglasset, og skær ventriklerne i store stykker med en skarp saks. Bægerglasset dækkes med aluminiumsfolie og anbringes i et rystevandbad, der er forvarmet til 37 °C i 5 min.
- Supernatanten kasseres, og pas på ikke at fjerne vævsbidder. Resuspender vævsstykkerne i 3 ml fordøjelsesbuffer og triturer i ca. 4 minutter, eller indtil der opnås en homogen blanding.
- Filtrer cellerne gennem en 70 μm nyloncellesil til et 50 ml polypropylenrør.
- Sæt filtratet tilbage i et 14 ml rundbundet polypropylenrør og centrifuger i 1 minut ved 100 omdr./min. Supernatanten kasseres, og pelletpen resuspenderes i 3 ml stopbuffer.
- Der tilsættes 54 μL 100 mM CaCl2-materiale til de resuspenderede celler for en endeligCaCl2-koncentration på 1,8 mM. Dette trin kan også udføres trinvis for at øge celleudbyttet.
- Lad levende celler bundfælde sig ved tyngdekraften i 10 minutter, før supernatanten med døde celler fjernes. Pellet resuspenderes i opbevaringsopløsningen (perfusionsopløsning med 200 μMCaCl2). Disse celler kan nu bruges til funktionelle eksperimenter (dvs. calciumbilleddannelse/sammentrækning, plasterklemme osv.), kultur osv.
BEMÆRK: Cellerne kan også resuspenderes i laboratorie- eller eksperimentafhængige opløsninger.
5. Cellekultur
- Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer eller ved en feltvisningstælling ved hjælp af en gitterdæksel. Da myocytter er meget store, er det ikke altid korrekt at tælle ved hjælp af et hæmocytometer. Dette bruges til at få en idé om, hvor mange celler der blev opnået fra isoleringen.
- Fortynd cellerne til ~25.000 celler/ml med DMEM-medier. Tilsæt 1 ml celleopløsning til hvert hul.
- Der inkuberes ved 37 °C, 95 %O2, 5 % CO 2 i2 timer.
- Opsug forsigtigt DMEM-medier fra hvert hul, og tilsæt 2 ml M199-medier.
- Der inkuberes ved 37 °C, 95 %O2, 5 % CO2 i op til 24 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der er et par elementer, der skal undersøges, når man bestemmer succesen med en isolation. For det første skal kardiomyocytterne være stavformede uden membranpletter, såsom cellerne isoleret i figur 1. En typisk isolering vil give ~ 80% af myocytterne, der er stangformede. Hvis isolationen giver noget mindre end 50% stavformede celler, betragtes det som en mislykket isolation, og kardiomyocytter anvendes ikke. Endelig bør kardiomyocytterne være hvilende. Myocytter med spontan sammentrækning viser Ca2+ intolerance og vil producere upålidelige data. Af alle isolationer udført ved hjælp af ovenstående teknik betragtes næsten alle isolationer som vellykkede. Dyrkede kardiomyocytter betragtes som vellykkede, hvis de er stavformede uden membranpletter eller afrundede kanter med høje overlevelsesrater (figur 2).
Tabel 1. En tabel over bemærkede forskelle mellem vores metode, Langendorff-metoder, og tidligere offentliggjorte Langendorff-frie metoder til isolering af musekardiomyocytter. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Buffermediekoncentrationer. Klik her for at downloade denne tabel.
Figur 1. (A) 4 måneder gamle C57Bl/6-kardiomyocytter fra mus afbildet ved hjælp af lysfeltmikroskopi. Udbytte: ~ 80%; 20x forstørrelse. (B) Lyst feltbillede af en 4 måneder gammel C57Bl/6 kardiomyocyt hos mus. Kardiomyocytter er hvilende og udviser stangform uden membranpletter. Skalabjælken er 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. (A) De 4 måneder gamle C57Bl/6-kardiomyocytter til mus dyrket i 24 timer i M199-medier. Levedygtighed: ~ 80%; 20x forstørrelse. B) Myocytter dyrket i 24 timer. Ved 24 timer udviser kardiomyocytter stangform uden membranpletter. C) % overlevelseskurve for kardiomyocytter dyrket i 24 timer ved hjælp af den beskrevne metode. Skalabjælken er 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den største fordel ved vores Langendorff-fri kardiomyocytisoleringsteknik er, at den begrænser hypoxi og iskæmisk tid ved ikke at kræve kanylering til et Langendorff-apparat. Alternativt til klassiske Langendorff-teknikker, der tager flere minutter at fjerne, rense og hænge hjertet, hvilket ofte resulterer i iskæmisk skade på myocytten, inkluderer vores metode en in vivo-rensning af blod via en iskold clearingopløsning. Den iskolde clearingbuffer indeholder ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), chelaterer irreversibelt divalente kationer for effektivt at fjerne calcium, hvilket gør det til et fremragende antikoagulant og stopper derfor sammentrækning23. Brugen af iskolde opløsninger hæmmer sammentrækning ved at bremse ionbytning og cellulær metabolisk hastighed, hvilket forhindrer skader forårsaget af iskæmi24. Ved at fjerne behovet for aortakanylering producerer Langendorff-frie teknikker robuste myocytter, hvilket resulterer i et mere pålideligt præparat til at give pålidelige data, hvilket ikke altid er tilfældet for Langendorff-isolationsmetoder.
Dette er en variation af en tidligere offentliggjort Langendorff-fri isolationsteknik18 med tilpasninger som fremhævet i tabel 1. Vigtigst er det, at denne teknik introducerer en stabiliserende platform, der begrænser antallet af gange, nålen skal fjernes og udskiftes fra hjertet. Enhver unødvendig bevægelse, der indføres i nålen, mens den indsættes i ventriklen, udvider punkteringsstedet. Et bredere punkteringssted resulterer i tilbagestrømning ud af ventriklen fra punkteringsstedet, nedsat tryk i hjertet og nedsat strømning til koronarerne. Dette problem løses ved hjælp af stabiliseringsplatformen. Ved at begrænse nålens bevægelse og antallet af gange, nålen fjernes og udskiftes (en sammenlignet med tre gange som tidligere beskrevet18), opretholder vi ensartet flow til koronarerne og opnår konsekvent fordøjelse. En anden vigtig tilpasning var tilføjelsen af en temperaturstyret kappe for at opretholde enzymopløsninger ved 37 ° C, når de kom ind i hjertet (temperaturbad blev kalibreret til at skubbe ud ved 37 ° C fra nålen). Det anvendte fordøjelsesenzym har optimal reaktionsaktivitet ved 37 °C, og tilsætning af temperaturkontrol øger enzymaktiviteten og reducerer derfor fordøjelsestiden. Liberase har også minimal lot-to-lot variabilitet og har højere reproducerbarhed sammenlignet med andre enzymer. En anden tilpasning af tidligere teknikker er en nedsat mængde injiceret clearingopløsning. Reduktion af mængden af clearingbuffer for at komme ind i hjertet og tillade mere blod, der skal ryddes af perfusionsbuffer, reducerer inaktivering af fordøjelsesenzymet af EDTA. En anden grund til, at vores metode konsekvent opnår vellykkede myocytisoleringer, er ved brug af BDM. BDM er en myosinhæmmer, der forhindrer sarkomerens kraftslagmekanisme og derved hæmmer sammentrækning og begrænser reoxygeneringsskade under fordøjelsen. Ved at begrænse sammentrækning forhindrer vi calciumcyklus og produktion af iboende reaktive iltarter ved at indgå myocytter i kultur. Da kulturmediet indeholder calcium, er det muligt, at myocytterne kan indgå kontrakt og mindske efterfølgende udbytte efter kultur. Vi vælger at dyrke myocytterne i BDM for at forhindre sammentrækning og øge udbyttet25,26. BDM kan altid vaskes ud af myocytter til funktionelle målinger efter dyrkning med stor succes. Alternativt kan alle trin i denne procedure udføres uden tilsætning af BDM, men isolationer betragtes muligvis ikke som "vellykkede" på BDM-frie isolerede myocytter.
Udover iskæmisk tid er der mange andre faktorer, der bestemmer, om en isolering vil producere robuste myocytter. Da der er forskellige forhold i de enkelte laboratorier, kan de personer, der udfører isoleringen, være nødt til at ændre mængden af enzym og/eller calcium, perfusionstiden og/eller pumpehastigheden og gyngevandbadshastigheden og/eller -tiden. Disse parametre afhænger af den anvendte musemodel, såsom sund eller syg, aldring osv.
Selvom denne teknik ikke kræver den kirurgiske færdighed, der er nødvendig for de Langendorff-baserede teknikker, er der stadig kritiske trin for at gøre teknikken vellykket. Det mest almindelige problem, der giver dårlige myocytter med denne teknik, skyldes bobler, der kommer ind i perfusionssystemet og blokerer myokardievævet fra adgang til perfusionsbufferen. Løsningen på dette problem er omhyggelig praksis for at undgå bobler (via korrekt sprøjterydningsteknik, korrekt nålerydningsteknik, bøvsning af boblemanifolden, når du skifter sprøjter osv.) samt flere udgangspunkter fra perfusionssystemet, hvis en boble sidder fast i manifolden. Uden bobler får vi efter vores erfaring næsten 100% vellykkede myocytisolationer (defineret som over 50% stavformede myocytter; gennemsnittet er ~ 80%).
Mens metoden er blevet forenklet ved at fjerne den kirurgiske færdighed, der kræves til Langendorff-metoden, er denne tilpassede metode kun blevet prøvet på mus. En anden fordel ved den Langendorff-fri metode er, at den kan bruges til mange murinmodeller (dvs. fra nyfødte til ældning), som tidligere beskrevet19. Desværre vil større pattedyr (f.eks. Hunde, svin osv.) ikke være egnede til denne teknik på grund af størrelsen på deres hjerter. Det ville være umuligt at perfusere hjertet med tilstrækkelig opløsning til at erhverve pålidelige myocytter.
Vores tilpasning af den Langendorff-fri metode er en pålidelig metode til vellykket isolering af musekardiomyocytter. Sammenlignet med Langendorff-metoden kræver denne alternative tilgang lidt teknisk dygtighed for konsekvent at opnå kardiomyocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Grants R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) og T32 HL134616 (Sturgill og Salyer).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cc Bd Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-827-52 | |
| 10 mL Pyrex Low-Form Beaker | Cole-Palmer | UX-34502-01 | |
| 100 mL polypropylene cap glass media storage bottle | DWK Life Sciences | UX-34523-00 | |
| 14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher Sci | 14-959-11B | |
| 2,3-Butanedione Monoxime | Sigma | B0753 | >98% |
| 3 cc BD Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-823-435 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-20-C | |
| 50 mL BD Syringe without Needle | Fisher Sci | 13-689-8 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Cole-Palmer | EW-22999-84 | |
| 95% O2 5% CO2 | |||
| AIMS Space Gel Heating Pad | Fisher Sci | 14-370-223 | |
| BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles | Becton Dickinson | 305109 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3803 | Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98% |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C7902 | >99% |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | Suitable for cell culture, >99.5% |
| DMEM | Fisher Sci | 11965092 | |
| EDTA | Fisher Sci | AAA1071336 | |
| Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| FBS | R&D Systems (Bio-techne) | S11195 | |
| Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators | Fisher Sci | 13-874-432 | |
| Hartman Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 15921 | |
| Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set | Fisher Sci | 02-671-11 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | >99.5% |
| Labeling Tape | Fisher Sci | 15-901-10R | |
| Legato 100 Syringe Pump | kdScientific | 788100 | |
| L-glutathione | Fisher Sci | ICN19467980 | |
| Liberase TH Research Grade | Sigma | 5401135001 | High thermolysin concentration |
| M199 | Fisher Sci | MT10060CV | |
| Magnesium Chloride | Invitrogen | AM9530G | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | |
| Pen/Strep | Fisher Sci | ||
| Potassium Chloride | Sigma | P5405 | >99% |
| Precision Digital Reciprocating Water Bath | ThermoFisher Scientific | TSCIR19 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Suitable for cell culture |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | >99% |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | >99% |
| Sterile Cell Strainer 70 µm | Fisher Sci | 22-363-548 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| VWR Absorbent Underpads | Fisher Sci | NC9481815 |
References
- Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).
- Ziolo, M. T., et al. Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).
- Traynham, C. J., et al. Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling. PLoS One. 7 (12), 52005 (2012).
- Nixon, B. R., et al. Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).
- Swager, S. A., et al. Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1. Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).
- Pinckard, K. M., et al. A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function. Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).
- Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).
- Harris, J. E., et al. Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring. Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).
- Roof, S. R., et al. CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat. Frontiers in Physiology. 8, 894 (2017).
- Milani-Nejad, N. J. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies of single isolated beating heart cells. Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).
- Kono, T. Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues. Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).
- Baker, J. B. An improved apparatus for mammalian heart perfusion. The Journal of Physiology. 115 (1), 30-32 (1951).
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 72 (1), 327-333 (1976).
- Motayagheni, N. Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia. MethodsX. 4, 508-512 (2017).
- Zhang, Z., et al. An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).
- Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), 0160605 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
- Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart. AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140 (2019).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).
- Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice. Journal of Visualized Experiments. (171), e61866 (2021).
- Bers, D. M., Patton, C. W., Nuccitelli, R. A practical guide to the preparation of Ca2+ buffers. Methods in Cell Biology. 99, 126 (1994).
- Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart. Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).
- Thum, J. B. Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).
