Summary
Patientafledte organoider (PDO'er) er et kraftfuldt værktøj i translationel kræftforskning, der afspejler både sygdommens genetiske og fænotypiske heterogenitet og respons på personlige kræftbehandlinger. Her er en konsolideret protokol til generering af humane primære blærekræft-PSO'er som forberedelse til evaluering af fænotypiske analyser og lægemiddelresponser detaljeret.
Abstract
Nuværende in vitro-terapeutiske testplatforme mangler relevans for tumorpatofysiologi, der typisk anvender kræftcellelinjer etableret som todimensionelle (2D) kulturer på vævskulturplast. Der er et kritisk behov for mere repræsentative modeller af tumorkompleksitet, der præcist kan forudsige terapeutisk respons og følsomhed. Udviklingen af tredimensionel (3D) ex vivo-kultur af patientafledte organoider (PTO'er), der stammer fra frisk tumorvæv, har til formål at afhjælpe disse mangler. Organoidkulturer kan anvendes som tumorsurrogater parallelt med rutinemæssig klinisk styring for at informere terapeutiske beslutninger ved at identificere potentielle effektive interventioner og indikere terapier, der kan være forgæves. Her har denne procedure til formål at beskrive strategier og en detaljeret trin-for-trin protokol til etablering af blærekræft PPO'er fra frisk, levedygtigt klinisk væv. Vores veletablerede, optimerede protokoller er praktiske til at oprette 3D-kulturer til eksperimenter ved hjælp af begrænset og forskelligartet udgangsmateriale direkte fra patienter eller patientafledt xenograft (PDX) tumormateriale. Denne procedure kan også anvendes af de fleste laboratorier udstyret med standard vævskulturudstyr. De organoider, der genereres ved hjælp af denne protokol, kan bruges som ex vivo-surrogater til at forstå både de molekylære mekanismer, der understøtter urologisk kræftpatologi og til at evaluere behandlinger for at informere klinisk ledelse.
Introduction
Blærekræft er den mest udbredte urinvejskræft og den tiende mest almindelige menneskelige malignitet på verdensplan1. Det omfatter et genetisk forskelligartet og fænotypisk komplekst spektrum af sygdom2. Urothelial ikke-muskelinvasiv form for blærekræft (NMIBC) er de mest almindelige blærekræftdiagnoser (70% -80%), og disse kræftformer udviser betydelig biologisk heterogenitet og variable kliniske resultater 2,3,4. Patienter med NMIBC oplever typisk en høj risiko for tilbagefald af sygdommen (50-70 %), og en tredjedel af kræftformerne vil udvikle sig og udvikle sig til signifikant mere aggressiv muskelinvasiv blærekræft (MIBC)2. Selvom 5-års overlevelsesraten for NMIBC er høj (>90%), skal disse patienter gennemgå langsigtet klinisk behandling5. På den anden side betragtes lokalt avanceret (ikke-resekterbar) eller metastatisk MIBC generelt som uhelbredelig6. Derfor har blærekræft en af de højeste levetidsbehandlingsomkostninger inden for kræftbehandling og er en betydelig byrde for både den enkelte og sundhedssystemet 3,7. De underliggende genetiske afvigelser i fremskreden sygdom gør terapeutisk behandling af blærekræft til en klinisk udfordring, og terapeutiske muligheder for invasive urothelial tumorer er først for nylig forbedret siden godkendelsen af immunterapier til både avanceret og højrisiko NMIBC 8,9. I øjeblikket er klinisk beslutningstagning blevet styret af konventionelle kliniske og histopatologiske træk, på trods af individuelle blærekræfttumorer, der viser store forskelle i sygdomsaggressivitet og respons på terapi10. Der er et presserende behov for at fremskynde forskningen i klinisk nyttige modeller for at forbedre forudsigelsen af den enkelte patients prognose og identifikationen af effektive behandlinger.
Tredimensionelle (3D) organoider viser stort potentiale som tumormodeller på grund af deres evne til selvorganisering og rekapitulation af den oprindelige tumors iboende in vivo-arkitektur og farmakogenomiske profil og deres evne til at spejle den oprindelige cellulære funktionalitet i det oprindelige væv, hvorfra de blev afledt 11,12,13 . Selvom etablerede blærekræftcellelinjer er let tilgængelige, relativt omkostningseffektive, skalerbare og enkle at manipulere, undlader in vitro-cellelinjerne stort set ikke at efterligne spektret af forskellige genetiske og epigenetiske ændringer, der er observeret i klinisk blærekræft12,14 og blev alle etableret og vedligeholdt under 2D, klæbende kulturbetingelser. Derudover har cellelinjer afledt af primære og metastatiske blæretumorer betydelig genetisk divergens fra det oprindelige tumormateriale. 8,15.
En alternativ tilgang er at anvende gensplejsede og kræftfremkaldende musemodeller. Mens disse modeller rekapitulerer nogle af de naturlige onkogene kaskader, der er involveret i human neoplasi (gennemgået i refs 16,17,18), mangler de tumorheterogenitet, er dyre, repræsenterer dårligt invasiv og metastatisk blærekræft og er ikke levedygtige til hurtig lægemiddeltest, da tumorer kan tage mange måneder at udvikle 14,19 . Patientafledte modeller af kræft (herunder organoider, betinget omprogrammeret primærcellekultur og xenografts) giver uvurderlige muligheder for at forstå virkningerne af lægemiddelbehandling før klinisk behandling20. På trods af dette bruger få grupper rutinemæssigt disse patient-proksimale modeller på grund af begrænset adgang til frisk primær patientvæv og den omfattende optimering, der kræves for reproducerbart at generere patientafledte organoide (BOB) dyrkningsbetingelser. I en in vivo-indstilling kan onkogene celler interagere og kommunikere med forskellige sammensætninger af de omgivende bestanddele, herunder stromalceller, væv, der infiltrerer immunceller, og matrix12. Tilsvarende for PPO'er, der dyrkes i et 3D-format, kan cellulær / matrixkompleksitet tilpasses til at omfatte andre relevante komponenter. PPO'er kan genereres hurtigt og er ofte i stand til at blive passeret i vid udstrækning eller kryokonserveret til senere brug, på trods af at de har en begrænset levetidpå 21,22,23. Farmakodynamik (dvs. respons på et lægemiddel) kan evalueres ved hjælp af flere udlæsninger, herunder organoid levedygtighed og morfologi, og karakterisering af immunhistokemiske mål eller transkriptionelle ændringer.
Her beskrives procedurerne for etablering af blærekræftorganoider fra patientmateriale indsamlet fra transuretral resektion af blæretumor (TURBT) eller kirurgisk fjernelse af blæren (radikal cystektomi). Metoden til at generere PPO'er er illustreret ved hjælp af let tilgængelige våde laboratoriematerialer og -værktøjer. Slutpunkter omfatter ændringer i cellemorfologiske egenskaber og levedygtighed. Disse blev målt ved hjælp af fluorescensmikroskopi, in vitro-levedygtighed (metabolisk og cellemembranintegritet) assays og histopatologisk analyse. Figur 1 viser arbejdsgangen for etablering af PPO'er for human blærekræft fra klinisk materiale opnået under elektiv kirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Patienterne har givet samtykke til denne undersøgelse efter deres indlæggelse under urologiteamet på Princess Alexandra Hospital, Brisbane, Australien. Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen og inden for etiske og institutionelle retningslinjer (etisk nummer HREC/05/QPAH/95, QUT 1000001165).
BEMÆRK: Som kriterier for støtteberettigelse var patienterne i alderen ≥ 18 år med kræft og i stand til at forstå og give samtykke. De, der ikke var i stand til at give informeret samtykke, blev udelukket. De, der havde et andet primært sprog end engelsk, blev udelukket, da det ikke var muligt at levere tolke på grund af logistiske og budgetmæssige overvejelser. Også udelukket var patienter, hvis tumorer ikke var tilgængelige for biopsi eller usandsynligt at være tilgængelige i tilstrækkelig mængde efter rutinemæssig patologi.
1. Organoid medium forberedelse
BEMÆRK: Humant blærekræftorganoidmedium kræver vækstfaktorer, der hjælper med overlevelse, vækst og kontinuerlig ekspansion af organoider afledt af dissocieret klinisk materiale (tabel 1). For fuldstændige oplysninger om hvert supplement, der anvendes i denne procedure, henvises til tabellen over materialer.
- Optø frosne ingredienser på is eller i køleskab ved 2-8 °C. Undgå gentagne fryse-/optøningscyklusser og arbejd fra frosne alikvoter (opbevares ved -20 °C).
- Basal medium: Forbered basal medium ved at supplere avanceret Dulbecco's Modified Eagle Medium / Ham's F-12 (adDMEM / F12) med HEPES (10 mM) og glutamin (2 mM). Dette bruges også som transportmedium og under organoidvasketrin.
BEMÆRK: Avanceret DMEM/F-12 anvendes som basalmedium til at hjælpe med at udvide organoider i nærvær af begrænset serum; Det kræver dog tilskud med HEPES og L-glutamin. - Kort centrifugefibroblastvækstfaktor 10 (FGF-10), fibroblastvækstfaktor 2 (FGF-2), epitelvækstfaktor (EGF), SB202190, prostaglandin E2 (PGE2) og A 83-01 inden åbning for at sikre, at komponenterne er i bunden af hætteglasset.
- Komplet organoidmedium: Suppler basalt medium med humane noggin- og R-spondin 1-konditionerede medier i en endelig koncentration på 5% v/v, human EGF (50 ng/ml), human fGF-2 (5 ng/ml), human FGF-10 (20 ng/ml), A 83-01 (500 nM), SB202190 (10 μM), B27 (1x), nicotinamid (10 mM), N-acetylcystein (1,25 mM), Y-27632 (10 μM), PGE2 (1 μM) og en bredspektret antibiotikadannelse ved den koncentration, der er angivet af producenten.
- Opbevar organoide medier ved 4 °C i mørke, og brug det inden for 2 uger (højst 1 måned). Frys ikke. Undgå udvidet eksponering for lyskilder.
BEMÆRK: Det organoide medium fremstilles serumfrit; Serum og penicillin/streptomycin kan dog suppleres fra bruger til bruger efter behov.
2. En dag før proceduren beskrevet i 3
- Optøningsvækstfaktor reduceret kældermembran (BME; se tabel over materialer) natten over i mindst 12 timer før brug i et 4 ° C køleskab eller kølerum. Om nødvendigt dispenseres BME i 1 ml alikvoter i et 1,5 ml polypropylen engangsrør for at undgå fryse-optøningscyklusser.
- Anbring filtrerede pipettespidser i et køleskab på 4 °C eller et kølerum.
BEMÆRK: Dette afsnit henviser til pipettespidser, der vil blive brugt ved håndtering af BME for at forhindre for tidlig polymerisation og reducere belægningen af BME på overfladen af spidserne. - Steriliser alt kirurgisk udstyr, der kræves til proceduren.
3. Generering af blæretumororganoider
BEMÆRK: Dette er et første skridt for BOB-etablering fra primære patienttumorer. Denne procedure er tilpasset blærekræftvæv fra metoder etableret af Gao et al.24.
- Brug en klasse II biohazard hætte til at forberede prøven. Hent tør og våd is og udskriv Patient Sample Processing Sheet (Supplerende fil).
- Ring til forskningspersonale til operationsstuen, når kirurgisk resektion er næsten afsluttet.
BEMÆRK: Bekræft, at patienten opfylder kriterierne for berettigelse og har underskrevet deltagerens samtykkeformular. Væv leveres kun til forskning, hvis der er overskud til krav om klinisk histopatologisk vurdering. - Saml en frisk makroskopisk levedygtig tumorprøve fra operationen. Sørg for, at prøven er nedsænket i transportmedium (enten 1x adDMEM/F12 eller 1x Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS)) i et sterilt 50 ml konisk rør eller urinprøvebeholder under transit.
BEMÆRK: På nogle kliniske centre kan det være nødvendigt at transportere væv til et patologilaboratorium for at blive tildelt til forskning. Under disse omstændigheder anbefales det, at antibiotika og antimykotika tilsættes til transportmediet. Væv kan opbevares ved 4 °C i basalmedium i op til 24 timer efter operationen og stadig generere levedygtige organoidkulturer. - Registrer prøvedetaljer, herunder vævsvægt (g eller mg), prøvebeskrivelse og detaljer vedrørende eventuelle blod- og urinprøver på patientprøvebehandlingsarket (supplerende fil).
- Fjern forsigtigt transportmediet og udskift det med 10 ml basalmedier. Lad tumorvævet slå sig ned ved tyngdekraften.
BEMÆRK: Transportmediet betragtes som klinisk affald og skal opsamles i en passende mærket affaldsbeholder i en passende mængde dekontamineringsopløsning. Når væsken er blevet kemisk dekontamineret, kan den bortskaffes i henhold til institutionelle retningslinjer for farligt affald. - Fjern tumorvævet med tang og læg det i en steril 90 mm petriskål (figur 2A). Vævets vægt registreres i mg eller g på det kliniske prøvebehandlingsark og dissektionsgitteret (figur 2B).
- Fjern ikke-kræftvæv (herunder fedtvæv) og makroskopisk synlige nekrotiske områder ved hjælp af sterile tang og engangsskalpelblad monteret på skalpelhåndtaget (figur 2C). Vask tumorstykker 1-2 gange med kold 1x DPBS. Saml tumorstykkerne og overfør dem til en ny steril 90 mm petriskål.
BEMÆRK: Da skalpelbladene er skarpe, skal du være forsigtig, når du skærer manuelt. Tumor-tilstødende fedtvæv kan identificeres ved tydeligt bløde, gelatinøse, blege områder umiddelbart ved siden af den visuelle tumoromkreds. Makroskopisk fedtvæv og fokale mørke områder, der repræsenterer områder med nekrose, vil kræve personlig vurdering, når de dissekeres fra en excisionel blæretumorbiopsi. - Tag et fotografi, tegn et diagram over væv, og planlæg vævsdissektion på et klinisk behandlingsgitter (figur 2B og figur 2C).
BEMÆRK: Det er vigtigt at føre en visuel optegnelse og grov skitse af de enkelte makroskopiske tumoregenskaber og dissektion for hvert enkelt tilfælde. - Dissekere tumorvævsstykker og allokere til histopatologiske (figur 2D) og molekylære analyser (figur 2E).
- Til histologiske analyser: Anbring ca. 50 mg tumorvæv i en mærket engangsplastisk histologikassette (figur 2D). Nedsænk histologikassetten i en beholder med 5x til 10x volumen af 10% neutral bufret formalin (NBF). Inkuber natten over på RT.
- Fjern 10 % NBF, og erstat med 70 % ethanol den næste dag til opbevaring ved 4 °C, indtil vævet kan behandles ved hjælp af rutinemæssig vævsbehandlingsprotokol
- Til molekylære analyser: Snap freeze mindst et 1-3 mm3 tumorstykke i et RNase/DNase-frit 1,5 ml kryovial ved hjælp af flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C (figur 2E).
- Dispenser 5 ml organoidmedium (tabel 1) i 90 mm petriskålen, der indeholder det eller de resterende tumorstykker.
- Mekanisk hakket væv så fint som muligt (0,5-1 mm3 stykker eller mindre) med et sterilt # 10 skalpelblad.
BEMÆRK: Større fragmenter eller hele stykker væv (>3 mm3) vil tage betydeligt længere tid at fordøje og vil mindske prøvens levedygtighed. Udelad ovenstående trin, hvis vævet er opdelt, og fragmenterne er små nok til at pipette med en 5 ml serologisk pipettespids. - Overfør fint hakket væv til et 50 ml konisk rør og tilsæt 4 ml organoidmedium, 1 ml 10x kollagenase / hyaluronidase og 0,1 mg / ml deoxyribonuklease 1 (DNase 1) for at undgå celleklumpning.
BEMÆRK: Enzymopløsning skal frisklaves hver gang. Forøg mediets volumen til at være ca. 10 gange den synlige mængde af tumorfragmenterne for store prøver. - Inkuber det hakkede tumorvæv og enzymopløsning i 1-2 timer på en orbital shaker eller rotator (150 o / min) i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) for at dissociere fragmenter i en cellesuspension og nedbryde kollagener. Dette kan kontrolleres med histologisk analyse (figur 3A).
BEMÆRK: Hvis mængden af væv er stor, eller der ikke observeres nogen åbenbar dissociation efter 1-1,5 timer, skal inkubationstiden øges og kontrollere dissociationsniveauet hvert 30. minut. Tidspunktet for dette trin afhænger af prøven og skal bestemmes empirisk hver gang. En mærkbart klarere løsning med vævsfragmenter, der ikke kan ses for øjet (eller meget få fragmenter), indikerer en vellykket fordøjelse. - Afslut fordøjelsen med tilsætning af 2x volumen (20 ml) basalmedium til prøven.
- Centrifugering af prøven ved 261 x g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT), aspirer og kassér supernatanten.
- For at lysere forurenende røde blodlegemer (RBC'er) skal pelleten opnået fra ovenstående trin suspenderes i 5 ml ammoniumchlorid-kaliumbuffer (ACK). Inkuber røret ved RT i 3 minutter, eller indtil rbc'ernes komplette lysis ses (suspension bliver klar).
BEMÆRK: Hvis RBC'er ikke overholdes som en lille rød klump i pillen, kan dette trin udelades. - Tilsæt 20 ml af basalmediet i røret. Centrifugering af røret ved 261 x g i 5 minutter ved RT og aspirer supernatanten.
- På dette trin skal du placere en 10 ml alikvote på 2x og 1x organoid medium i et 37 ° C vandbad for at varme.
- Prøven filtreres gennem en forfugtet reversibel 100 μm si i et nyt 50 ml rør for at fjerne stort uopløseligt materiale.
BEMÆRK: Stort ufordøjet materiale (>100 μm) opsamlet af filteret kan indeholde celler af interesse og kan dyrkes i 90 mm petriskål eller 6-brønds cellekulturplade i organoidmedium for at udlede 2D-kulturer (figur 1 (trin 5) og figur 3B). - Filtrer eluatet gennem en forvåd reversibel 37 μm sil for at indsamle enkeltceller og små klynger til enkeltcelle- og immuncelleisolering (Rør 37-1; Figur 1 (trin 6) og figur 3B).
BEMÆRK: Udbyttet af tumorceller under dette trin kan øges ved at føre den filtrerede cellesuspension gennem silen igen. - Vend 37 μm-silen og brug 10 ml basale medier til at samle små og moderate klynger (37-100 μm) (rør 70-1; Figur 3B).
- Påd hvert af de nye 50 ml rør (rør 70-1 og 37-1) med DPBS til 40 ml. Centrifugering af suspensionen ved 261 x g i 5 min ved RT. Aspirat og kassér supernatanten.
- Tilsæt 10 ml basalmedier til rør 37-1 og tæl cellerne ved hjælp af trypanblåt eksklusionsfarvestof og en automatiseret celletæller (i henhold til producentens specifikationer). Bestem cellenummeret og levedygtigheden af celler.
- Centrifugering af resten af prøven ved 261 x g i 5 minutter ved RT. Aspirere mediet og erstatte det med cellefrysningsopløsning eller basalmedier indeholdende 10% føtalt kvægserum (FBS), 1% penicillin/streptomycin og 10% dimethylsulfoxid (DMSO).
- Anbring prøver i 1,5 ml kryovialer og opbevar dem i en cellefrysningsbeholder. Overfør straks beholderen til en -80 °C fryser for optimal afkølingshastighed. Efter opbevaring af fryser natten over ved -80 °C overføres kryovialerne til kryogen væske eller luftfaseopbevaring (-196 °C) til langtidsopbevaring.
- Resuspend celler fra rør 70-1 med 500 μL forvarmet 2x organoid medium.
BEMÆRK: Såtætheden skal være høj for vellykket organoidformering. Volumenet af det organoide medium og efterfølgende BME bør ændres empirisk på antallet af celler isoleret fra filtreringstrinnet. Dette trin giver et relevant udgangspunkt baseret på undersøgelser i vores laboratorium. - Tilsæt BME til celler (i forholdet 1:1 med 2x organoidmedium) med iskolde P1000 sterile filterpipettespidser og bland forsigtigt for at suspendere cellerne. Hurtigt og forsigtigt pipetter 100 μL rekonstituerede celler / BME-blanding til brønde med en ultralav fastgørelse fladbundet 96-brønds plade. Anbring pladen med 96 brønde i en inkubator (37 °C, 5 % CO2) i 20-30 minutter for at størkne.
- Tilsæt 1:2-forholdet mellem 1x organoidmedium oven på BME-cellesuspensionen afhængigt af det empirisk vurderede volumen. I det relevante udgangspunkt tilsættes 50 μL 1x organoid medium media oven på 100 μL rekonstituerede celler/BME-blanding.
- Anbring pladen med 96 brønde i en inkubator (37 °C, 5 % CO2) i 20 minutter for at udligne.
- Tag cellekulturpladen ud af inkubatoren og saml den på en prøveholder på scenen af et mikroskop. Vurder organoider visuelt under fasekontrast eller lysfeltindstillinger.
BEMÆRK: Billeder erhverves bedst af et omvendt fasekontrastmikroskop udstyret med differentiel interferensoptik (DIC), digitalkamera og tilhørende software til at observere dannelsen af sfæriske PTO'er som forberedelse til slutpunktsanalyse.- Hvis forskellige klynger er synlige, skal cellekulturpladen placeres i et elektronisk opvarmet mikroskopkammer på scenen (37 °C, 5 % CO2) til levende cellebilleddannelse over de første 24-72 timer.
- Sørg for, at den fleksible opvarmede krave er fastgjort til linsen for at reducere termisk drift, og at luftfugteren er fyldt med dH2O.
- Udfør den indledende billeddannelse ved hjælp af et objektivobjektiv på 4x eller 10x (N.A. 0,30, W.D. 15,2 mm). Time-lapse hvert 5-10 min på fase-kontrastindstillingen.
- Kontroller for den vellykkede isolering som karakteriseret ved udseendet af >10 selvorganiserende organoider pr. Brønd efter en periode på 24-72 timer.
- Tillad kulturer at fortsætte i op til to uger, hvis organoidtallene er lave (figur 3C).
- Fyld mediet op hver 2-3 dage ved hjælp af 50 μL forvarmet organoidmedium for at genopbygge udtømte vækstfaktorer og det samlede volumen.
- Hent billeder (som beskrevet i trin 3.30) på dag 1, 2 og 3 (timelapse-serien) og på dag 5, 7 og 10 før aflevering (hvis relevant).
BEMÆRK: Organoider (observeret som generelt runde strukturer, hvor du ikke kan se kanterne på de enkelte celler) passeres typisk 7-10 dage efter opsætningen, afhængigt af isolationens succes. Før eller efter passaging kan organoider behandles med cytotoksiske stoffer eller terapeutiske midler i op til 6 dage, og lægemiddelrespons måles ved hjælp af cellelevedygtighed og cytotoksicitetsassays. Alternativt kan organoider hentes fra BME (ved anvendelse af 1 mg/ml dispase) og kryokonserverede (biobankede), fremstilles til molekylær testning eller indlejres og vurderes histologisk (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D-organoider blev med succes etableret fra human blærekræftpatient TURBT og cystektomivæv. Kort fortalt fremhæver denne teknik en hurtig dannelse af 3D-multicellulære strukturer, der både er levedygtige og egnede til andre endepunktsanalyser såsom histologisk evaluering, molekylær karakterisering (ved immunohistokemi eller kvantitativ PCR i realtid) og lægemiddelscreening. Under proceduren (figur 1) kunne de forskellige eluater under vores filtreringsfaser (figur 1, trin 1-6) udnyttes til at kryokonservere enkeltceller til isolering af tumorinfiltrerende immunceller (TIL'er) og generering af en enkeltcellebiobank. Proceduren gør det muligt at biobankere flere aspekter af en heterogen primær tumor på passende vis og på en måde, der kan spores på tværs af patienter (figur 2A, B), herunder histologi (figur 2C, D) og friske frosne prøver (figur 2E).
En 2 timers fordøjelse med kommercielt tilgængelig collagenase/hyaluronidase og DNase 1 giver mulighed for tilstrækkelig fordøjelse af 0,5-1 mm3 stykker af det mere komplekse cystektomi biopsivæv, herunder de neoplastiske celler i lamina propria og muskulære lag af blæren (figur 3A). Større fragmenter efter fordøjelsen (>100 mikron) har vist sig egnede til dyrkning i standardvævskulturplader af enhver størrelse til isolering af nye 2D-kulturer (figur 3B). Imidlertid kræves omfattende molekylær karakterisering for at validere kræftoprindelsen af sådanne cellelinjer. Organoider, der med succes genereres med denne protokol, gennemgår processer med dynamisk selvmontering, herunder faser af aggregering, komprimering og endelig dannelse, hvorved de dannes til stramme cellulære strukturer (figur 3C), der kan vurderes for respons på standard-of-care terapier. Figur 3C fremhæver organoidernes effektive selvmonteringsegenskaber. Histologisk rekapitulerer disse strukturer den oprindelige patienttumor (figur 4). Organoider genereret i denne procedure er egnede til en lang række formål, herunder yderligere karakterisering, biobanking og lægemiddeleffektivitetstest (figur 5).
Figur 1: Skematisk repræsentation af organoidvævskultur fra indsamling af tumorprøver fra kirurgi til endepunktsanalyser. URN, enhedsregistreringsnummer; TIL, Tumorinfiltrerende lymfocyt. (1) Vævet hakkes mekanisk i en 90 mm petriskål så fint som muligt med et sterilt skalpelblad (0,5-1 mm3 stk.). (2) Tumorstykker resuspenderet i et enzymatisk dissociationsmedium bestående af organoidmediet, kollagenase/hyaluronidase og DNase 1. (3) Hakket tumorvæv og enzymopløsning inkuberes i 1-2 timer på en rotatorinkubator (150 omdr./min., 37 °C, 5 % CO2) og pelleteres derefter (4) for at dissociere fragmenter i en finere cellesuspension. Prøven undergår filtrering gennem forvædede reversible (5) 100 μm og (6) 37 μm siler i nye 50 ml rør for at fjerne stort uopløseligt materiale og isolere 37-100 μm klynger. Efter (7) centrifugering af fraktionen isoleret fra bagsiden af 37 μm-silen suspenderes celleklyngerne i (8) BME- og organoidmedier før (9) levende cellebilleddannelse. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Steril tumorvævshåndtering til organoidetablering. (A) Ved udskæring og transport til laboratoriet anbringes prøven i en steril petriskål, vejes og dissekeres efterfølgende. (B) Et prøvedissektionsgitter anvendes til at markere prøven til forskellige processer. Et eksempel på dissektion er vist i (C), hvor prøver tages fra tumorperiferien så meget som muligt for at undgå områder med central nekrose og kommenteret (indsat) før (D) indtjening af vævet før vævsfiksering. Vægtstang: 6 mm. Indsætningsskalastang: 4 mm. (E) Små friske fragmenter tages til efterfølgende frysning og biobank. Vægtstang: 5 mm. Elementer af dette billede blev skabt med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Enzymatisk afledning og dynamisk samling af blæretumororganoider. (A) Repræsentative billeder af hæmatoxylin og eosin (H&E) farvet forældreblærekræftvæv (patologi gennemgået som T3bN0) ved øjeblikkelig fiksering (venstre) og 2 timer efter fordøjelsen med 1x kollagenase/hyaluronidase (højre). Vægtstang: 500 μm. Indsætningsskalabjælke: 50 μm. (B) Repræsentative billeder af >100 μm, 37-1 og 70-1 (dag 2) isolationer. Skalabjælker er angivet i billedet. (C) Repræsentative billeder vises for blærekræft organoid isolering over 48 timer og dag 7 organoid H & E farvning. Vægtstang: 50 μm. Skalabjælke for billedet i indlæget: 20 μm. DIC: differentiel interferenskontrast. Elementer af dette billede blev oprettet med BioRender.com Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Blærekræftafledte organoidkulturer opretholder den histologiske arkitektur af forældretumorer. Repræsentativt H&E-billede af lavkvalitets blærekræft (Ta) og tilsvarende lysfeltbillede af organoid på kulturdag 7. Panelet yderst til højre viser tilhørende H&E-farvning af dag 7-organoiden. Skalastænger er angivet i figuren. LG: lav kvalitet, BC: blærekræft, H & E: hæmatoxylin og eosin og DIC: differentiel interferenskontrast. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Downstream-applikationer med blærekræft patientafledte organoider. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Tilsætningsstof | Endelig conc. | Lager Conc. | Opløsningsmiddel | |
| Basale medier | Glutamax | 2 mM | 1 m | NaCl |
| HEPES | 10 mM | 1 m | NaCl/NaHPO4-bufferet opløsning | |
| Kosttilskud til komplette medier | R-spondin 1 konditionerede medier | 5% v/v | Konditionerede medier | Avanceret DMEM/F-12 |
| Noggin betingede medier | 5% v/v | Konditionerede medier | Avanceret DMEM/F-12 | |
| EGF | 50 ng/ml | 0,5 mg/ml | PBS/0,1% BSA | |
| FGF-10 | 20 ng/ml | 100 μg/ml | PBS/0,1% BSA | |
| FGF-2 | 5 ng/ml | 50 μg/ml | PBS/0,1% BSA | |
| Nicotinamid | 10 mM | 1 m | 1 g i 8,2 ml ddH20 | |
| N-acetyl-L-cystein | 1,25 mM | 500 mM | 40 ml ddH20 | |
| A 83-01 | 0,5 μM | 50 mM | DMSO | |
| SB202190 | 10 μM | 50 mM | DMSO | |
| Y27632 | 10 μM | 100 mM | ddH20 | |
| B-27 tilsætningsstof | 1X | 50x | ||
| Prostaglandin E2 | 1 μM | 10 mM | DMSO | |
| Primocin | 100 μg/ml | 50 mg/ml | ||
Tabel 1: Kosttilskud anvendt til basale og komplette organoidmedier
Supplerende fil: Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens 3D-organoidprotokoller afledt af blærekræftvæv stadig er i deres barndom, er de et område med aktiv forskning og klinisk undersøgelse. Her er en optimeret protokol til succesfuldt at etablere blærekræft PPO'er, der er egnede til både NMIBC- og MIBC-prøver, detaljeret. Denne arbejdsgang integreres parallelt i hospitalsbaserede kliniske forsøg og tager højde for periodisering af biobankprøver, herunder histologisk prøvebehandling og friskfrosset vævsbank, hvilket er en vigtig overvejelse for kliniske organoidrørledninger. Denne protokol bygger på eksisterende metoder og giver en konsolideret metode til opbygning af en organoid præcisionsmedicin pipeline.
Den nuværende succesrate for denne protokol - som andre - er ca. 70%25. Det forventes, at dette vil blive bedre, efterhånden som isolationsteknikker og karakterisering af blærekræfttumormikromiljø udvikler sig. Som forventet påvirker kvaliteten af den oprindelige prøve succesraten og er et vigtigt begrænsende skridt. Prøver opnået fra kemoterapi naive patienter giver den højeste succesrate, mens de fra patienter, der har modtaget neoadjuverende kemoterapi, kan have et reduceret antal levedygtige celler26,27. Typisk giver blærekræftprøver (fra både TURBT og cystektomier) en rigelig mængde prøver med høj tumorcellelighed. Dette muliggør robust generering af organoider på mellem 30-100 μm inden for en vækstperiode på 24-72 timer (givet nogle <40 μm klynger bevares i filtreringstrinnene). Det er vigtigt, at heterogeniteten observeret i organoidprøver (dvs. cystiske formationer og mere tætte strukturer) indikerer, at denne protokol giver betingelser, der er egnede til at udlede heterogene tumorcellepopulationer.
Vores optimerede protokol kan udføres på begrænset udgangsmateriale (som det er tilfældet fra nogle elektive operationer, herunder TURBT-procedurer eller prøver erhvervet fra patienter i et klinisk forsøg), hvilket gør det muligt at inkorporere flere analyser for at maksimere prøveværdien. Denne protokol indeholder metoder til at beskrive trin til dyrkning af 2D-kultur fra fremmede tumorceller af interesse, der kan opholde sig i store uopløselige væv, der behandles under det indledende filtreringstrin. Ligesom andre forskningsgrupper, der foreslår behandling af prøver inden for 24 timer efter operationen28,29, observeres det, at vævshypoxi, der forekommer inden for denne tidsramme, ikke udelukker generering af levedygtige organoider. Optimering er nødvendig for at bestemme tætheden af celle (native klynger) såning pr. Brønd. Efter vores erfaring kan et for stort antal klynger resultere i dårlig vækst af kulturerne, mens kulturer med lav visuel tæthed kan føre til celledød. Dette kan bestemmes af brugeren empirisk i forbindelse med deres volumener, som kan fortyndes inden for et interval efter behov. Derudover indeholder TURBT-prøver ofte brændte kanter på grund af resektionsprocessen, som er tydelige som fremtrædende nekrotiske regioner. Et kritisk trin er den omhyggelige isolering af makroskopisk tumorvæv og efterfølgende dissektion. Dette er altafgørende for at udlede levedygtige kulturer og skal kommunikeres med det kirurgiske team. I nogle tilfælde kan dette være en indledende begrænsning af proceduren.
En yderligere begrænsning af den nuværende teknik er fraværet af tumormikromiljø parallelt med organoiderne. En nødvendig udvikling vil være fremtidige co-kultursystemer for at øge cellulær kompleksitet og tilvejebringe andre komponenter i tumormikromiljøet (dvs. stroma og immunceller). Da organoider defineres som selvorganiserende strukturer med evnen til selv at opretholde deres vækst, vil der være behov for yderligere arbejde for at belyse de diskrete kræftstamceller (såsom CD44 og CD49), som kan muliggøre forbedrede in vitro-vækstegenskaber 31,32,33. Det er afgørende at fastslå med sikkerhed, at PPO'erne stammer fra tumorvæv, da bidraget fra normale urotelceller i funktionelle og molekylære analyser vil forvirre undersøgelser af lægemiddelresistens. Nogle gange er tumoroprindelsen af urotelcellerne i PDO'erne klar på grund af brugen af metastatisk væv eller papillære tumorer (som det er tilfældet her; se figur 4), men når kildevævet udskæres fra blæreslimhinden og dermed indeholder margener af det godartede urothelium, er det vigtigt at bekræfte, at de resulterende PDO'er består af tumorceller ved hjælp af molekylære teknikker. Således kræves immunohistokemiske og genomiske sammenligninger mellem de etablerede organoider og den primære tumor, hvorfra de blev afledt30.
Med hensyn til antallet og størrelsesfordelingen af organoiderne pr. Brønd er det vanskeligt at opretholde ensartet belægningstæthed af 3D-organoider til cytotoksicitetsanalyse. Dette afbødes lidt ved at isolere definerede områder ved hjælp af filtrene, men det er stadig en begrænsning, hvis små klynger og større organoider isoleres i samme brønd. Store partikelsorteringsanlæg kan afhjælpe dette problem, men er ikke bredt tilgængelige i medicinske forskningslaboratorier. Ikke desto mindre er teknikker, der måler levedygtighedssignaler før og efter behandling, blevet anvendt med succes i blærekræftorganoider34. Efterhånden som denne teknologi skrider frem, vil dette gøre det muligt for forskere at udvikle et bibliotek af blærekræft PPO'er med forskellige genomiske profiler og farmakodynamiske reaktioner, der kan udforskes for at undersøge nye terapier. Derudover tillader prøveindsamlingsproceduren og dissociationsmetoden, der er beskrevet heri, samtidige præparater til tumorrumprofilering, multiparametrisk flowcytometri og enkeltcellet RNA-sekventering. Samlet set giver dette mulighed for en bred vifte af kraftfulde endepunkter, som kan samles for at udforske en patients tumorheterogenitet og anvendelighed af lægemidler såsom immunterapier.
Sammenfattende beskriver vi en protokol til etablering og evaluering af kulturer af 3D-patientafledte blærekræftorganoider i fremkomsten af præcisionsmedicinske endepunkter. Det er vigtigt at bemærke, at de trin og noter, der er beskrevet her, er rutinemæssige tilgange, der bruges til at isolere blærekræft PPO'er i vores laboratorium. Det dyrkningsmedium, der blev anvendt i vores procedure, blev oprindeligt beskrevet for prostatakræftceller og har nu vist sig at være egnet til dyrkning af blærekræft. Det er vigtigt, at denne protokol er centraliseret, egnet til rutinemæssig brug i laboratorier og bredt anvendelig på tværs af urologiske kræfttyper. I kombination med molekylære fænotyping- og lægemiddelresponsendepunkter i høj fi vil denne teknik være et nyttigt værktøj til hurtigt at udforske den præcise terapeutiske håndtering af blærekræftpatienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi anerkender den tekniske bistand fra Translational Research Institute Histology core og Biological Resource Facility. Denne forskning blev støttet af finansiering fra en Princess Alexandra Research Foundation-pris (I.V., E.D.W.) og Medical Research Future Fund (MRFF) Rapid Applied Research Translation Program (Center for Personalized Analysis of Cancers (CPAC; E.D.W., I.V.). Translational Research Institute modtager støtte fra den australske regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
| 100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
| 100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
| 10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
| 37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
| 37°C incubator | |||
| 37°C water bath | |||
| 50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| 70% (w/w) ethanol | |||
| -80°C freezer | |||
| 96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
| A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
| ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
| adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
| Animal-free recombinant EGF | Sigma-Aldrich | 518179 | Growth factor |
| Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
| B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
| Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
| Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
| Computer system | |||
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
| Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
| DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| Dry and wet ice | |||
| Esky | |||
| Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
| Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
| Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
| Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
| Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
| NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
| Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
| Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
| Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
| Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
| Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
| R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
| SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
| Scale | |||
| Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
| Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
| Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
| Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
| Urine specimen jar | |||
| Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
References
- Saginala, K., et al.
- Lindskrog, S. V., et al. An integrated multi-omics analysis identifies prognostic molecular subtypes of non-muscle-invasive bladder cancer. Nature Communications. 12 (1), 2301 (2021).
- Isharwal, S., Konety, B. Non-muscle invasive bladder cancer risk stratification. Indian Journal of Urology. 31 (4), 289-296 (2015).
- Lozano, F., Raventos, C. X., Carrion, A., Trilla, E., Morote, J. Current status of genetic urinary biomarkers for surveillance of non-muscle invasive bladder cancer: a systematic review. BMC Urology. 20 (1), 99 (2020).
- Batista, R., et al. TERT promoter mutation as a potential predictive biomarker in bcg-treated bladder cancer patients. Internation Journal of Molecular Science. 21 (3), 947 (2020).
- Patel, V. G., Oh, W. K., Galsky, M. D. Treatment of muscle-invasive and advanced bladder cancer in 2020. Cancer Journal for Clinicians. 70 (5), 404-423 (2020).
- Williams, S. B., et al. Estimated costs and long-term outcomes of patients with high-risk non-muscle-invasive bladder cancer treated with bacillus calmette-guérin in the veterans affairs health system. JAMA Network Open. 4 (3), 213800 (2021).
- Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
- lvarez-Maestro, M., Guerrero-Ramos, F., Rodríguez-Faba, O., Domínguez-Escrig, J. L., Fernández-Gómez, J. M. Current treatments for BCG failure in non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). Actas Urológicas Españolas (English Edition). 45 (2), 93-102 (2021).
- Berry, D. L., et al. Treatment decision making in patients with bladder cancer. Bladder Cancer. 1 (2), 151-158 (2015).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Kato, M., Sasaki, T., Inoue, T. Current experimental human tissue-derived models for prostate cancer research. International Journal of Urology. 28 (2), 150-162 (2021).
- Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).
- Joshi, A., Roberts, M. J., Alinezhad, S., Williams, E. D., Vela, I. Challenges, applications and future directions of precision medicine in prostate cancer - the role of organoids and patient-derived xenografts. British Journal of Urology International. 126 (1), 65-72 (2020).
- Pan, C. X., et al. Development and characterization of bladder cancer patient-derived xenografts for molecularly guided targeted therapy. PLoS One. 10 (8), 0134346 (2015).
- Gopinathan, A., Tuveson, D. A. The use of GEM models for experimental cancer therapeutics. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 83-86 (2008).
- Kemp, C. J. Animal models of chemical carcinogenesis: driving breakthroughs in cancer research for 100 years. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (10), 865-874 (2015).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
- Liu, W., et al. Conditional reprogramming: Modeling urological cancer and translation to clinics. Clinical Translational Medicine. 10 (2), 95 (2020).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematological Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Kim, I. H., Lee, H. J. Perioperative immunotherapy for muscle-invasive bladder cancer. Translational Andrology and Urology. 9 (6), 2976-2985 (2020).
- Raphael, M. J., Booth, C. M. Neoadjuvant chemotherapy for muscle-invasive bladder cancer: Underused across the 49(th) parallel. Canadian Urological Association Journal. 13 (2), 29-31 (2019).
- Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models. Journal of Visualized Experiments. (155), e60364 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
- Fusco, P., et al. Patient-derived organoids (PDOs) as a novel in vitro model for neuroblastoma tumours. BMC Cancer. 19 (1), 970 (2019).
- Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (10), 4567-4574 (2019).
- Vasyutinv, I., Zerihun, L., Ivan, C., Atala, A. Bladder organoids and spheroids: potential tools for normal and diseased tissue modelling. Anticancer Research. 39 (3), 1105-1118 (2019).
- Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49fhigh mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communications. 10 (1), 4407 (2019).
- Whyard, T., Liu, J., Darras, F. S., Waltzer, W. C., Romanov, V. Organoid model of urothelial cancer: establishment and applications for bladder cancer research. Biotechniques. 69 (3), 193-199 (2020).
