Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Primer Fare Retinal Pigmentli Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Published: November 4, 2022 doi: 10.3791/63543
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2,3
1Eye Research Institute, Oakland University, 2Eye Research Center (OUWB)/ERC, William Beaumont School of Medicine, 3Oral Biology and Diagnostic Sciences, Dental College of Georgia, Augusta University

ERRATUM NOTICE

Summary

Bu yazıda retinal pigmente epitel (RPE) hücrelerinin fare gözlerinden kademeli olarak izole edilmesi için basitleştirilmiş bir protokol anlatılmaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonunu ve diseksiyonunu, ardından RPE hücrelerinin izolasyonunu, tohumlanmasını ve kültürlenmesini içerir.

Abstract

Retinal pigmentli epitel (RPE) tabakası, fotoreseptörlerin hemen arkasında yer alır ve fotoreseptörlerin işlevini sürdürmede birkaç kritik rol oynayan karmaşık bir metabolik sistemi barındırır. Bu nedenle, RPE yapısı ve işlevi normal görüşü sürdürmek için gereklidir. Bu yazıda primer fare RPE hücre izolasyonu için belirlenmiş bir protokol sunulmaktadır. RPE izolasyonu, oküler bozuklukların farklı fare modellerinde RPE patolojisinin altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için harika bir araçtır. Ayrıca, RPE izolasyonu, vahşi tip ve genetiği değiştirilmiş farelerden izole edilen birincil fare RPE hücrelerinin karşılaştırılmasında ve görme bozuklukları için tedavinin gelişimini hızlandırabilecek ilaçların test edilmesinde yardımcı olabilir. Makale adım adım RPE izolasyon protokolü sunmaktadır; enükleasyondan tohumlamaya kadar tüm prosedür yaklaşık 4 saat sürer. İzole hücrelerin bozulmadan büyümesine izin vermek için tohumlamadan sonra 5-7 gün boyunca ortam değiştirilmemelidir. Bu süreci, immünofloresan yoluyla hücrelerdeki morfoloji, pigmentasyon ve spesifik belirteçlerin karakterizasyonu izler. Hücreler en fazla üç veya dört kez geçirilebilir.

Introduction

Retinal pigmentli epitel (RPE) hücreleri, koroid ve nöral retina arasında bulunur ve fotoreseptör (PR) hücrelerinin arkasında yatan basit bir küboidal hücre tabakası oluşturur1. RPE, PR hücreleri için sağlıklı bir ortamın korunmasında, esas olarak reaktif oksijen türlerinin (ROS) aşırı birikimini ve bunun sonucunda oksidatif hasarı azaltarak kritik bir rol oynar1. RPE hücreleri, retinoidlerin dönüşümü ve depolanması, dağınık ışığın emilimi, sıvı ve iyon taşınması ve dökülen PR dış segment membranının fagositozu 2,3 gibi birçok işlevi denetler. RPE'deki değişiklikler (morfoloji/fonksiyon) retinopatiye yol açan fonksiyonlarını bozabilir ve bu birçok oküler bozukluk tarafından paylaşılan ortak bir özelliktir4. Birçok oküler hastalık, retinitis pigmentosa, Leber konjenital amauroz ve albinizm 4,5,6 gibi bazı genetik hastalıkların yanı sıra diyabetik retinopati (DR) ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) gibi yaşa bağlı oküler bozukluklar da dahil olmak üzere RPE hücrelerinin morfolojisi ve fonksiyonundaki değişikliklerle ilişkilidir7,8 . İnsan hücreleri en çok arzu edilenlerdir, bu nedenle RPE monokatmanları oluşturmak için birincil insan RPE hücrelerindeki RPE bozukluklarını incelemek ideal olacaktır. Bununla birlikte, etik konular ve bu bozuklukların çoğunun morbiditeye yol açması nedeniyle insan donörlerinin sınırlı mevcudiyeti9, ancak mutlaka mortalite10 değil, böylece birincil insan RPE hücrelerinin izolasyonunu engellemektedir. Bu, insan olmayan hayvan donörlerinden RPE hücrelerinin kültürlenmesini tercih edilen bir alternatif haline getirir. Kemirgenler, özellikle fareler, farklı oküler hastalıkları incelemek için harika bir model olarak kabul edilir, çünkü transgenik teknoloji bu türlerde daha yaygın olarak kurulmuştur11. Kültürlenmiş primer RPE hücrelerinin kullanımı birçok avantaj sunsa da, birçok pasaj için büyüyen hücreleri korumak veya hücreleri depolamak ve yeniden kullanmak zor olmuştur. Bu protokolün ana sınırlaması farelerin yaşıdır; RPE izolasyonu için kullanılan fareler çok genç yaşta olmalıdır (18-21 günlüklük en uygunudur), çünkü yetişkin farelerden RPE hücrelerini kültürlemek zor olmuştur11,12,13. RPE hücreleri her yaşta fare gözlerinden izole edilebilir, ancak dört hücreye kadar pasaj sadece genç farelerde (18-21 günlük) başarılı olmuştur. RPE hücrelerinde N-metil-D-aspartat reseptörlerinin (NMDAR'lar) silinmesiyle hem C57BL6 fareleri hem de transgenik fareler kullanılarak fare retinalarından RPE izolasyonu, yüksek amino asit homosisteinin AMD14'ün gelişimi ve ilerlemesi üzerindeki etkisini incelemek için gerçekleştirildi. Ek olarak, izole primer RPE hücreleri, RPE hücrelerinde NMDAR'ların inhibisyonu ile AMD için terapötik bir hedef önerilmesine yardımcı oldu14. Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından onaylanan ve şu anda AMD14 için potansiyel bir terapötik hedef olabilecek memantin16 gibi Alzheimer hastalığına (AD) bağlı orta ila şiddetli karışıklığı (demans) tedavi etmek için kullanılan bazı NMDAR blokerleri vardır. Ayrıca, izole primer fare RPE hücreleri, enflamatuar belirteçlerin tespiti ve yüksek düzeyde homosistein16,17 sunan genetiği değiştirilmiş bir fare (CBS) kullanılarak AMD ve AD'nin homosistein kaynaklı özellikleri için altta yatan bir mekanizma olarak inflamasyonun önerilen indüksiyonu için kullanılmıştır.

Bu protokol, RPE hücrelerini hem vahşi tip C57BL / 6 farelerden hem de laboratuvarımızda geliştirilen transgenik farelerden, kolayca uygulanabilir ve güvenilir bir protokole ulaşmak için diğer yayınlanmış izolasyon protokollerinin 13,18,19'unun basitleştirilmiş bir uyarlaması olarak izole etmek için kullanılmıştır. Bu protokolde cinsiyet tercihi yoktur. Farelerin yaşları izolasyon süreci için kritik öneme sahipken, RPE izolasyonu için genç, yaşlı fareler (18-21 günlük) ve herhangi bir yaştaki (12 aya kadar) yaşlı fareler kullanılmıştır. Bununla birlikte, genç yaşlı farelerden izole edilen RPE hücrelerinin daha uzun yaşadığını ve dört pasajın gerçekleştirilebileceğini fark ettik. Yaşlı farelerden izole edilen RPE hücreleri bir veya iki kez geçirilebilir, daha sonra normal bir oranda büyümeyi durdurur ve şekillerini daha uzun olacak şekilde değiştirirler (fibroblast benzeri hücreler). Pigmentasyon kaybı ve doku kültürü plağına yapışmanın azalması ve ardından dekolmanı da gözlendi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvanlar, Oakland Üniversitesi IACUC hayvan protokolü numarası 21063 yönergelerine ve Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için ARVO Beyanı'nın kılavuzlarına göre kullanılmıştır.

1. Çözelti hazırlama

  1. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı / Besin Karışımı F-12'yi (DMEM / F12) % 25 Fetal Sığır Serumu (FBS),% 1.5 penisilin / streptomisin ve% 0.02 gentamisin ile destekleyerek RPE hücre kültürü ortamının tamamını hazırlayın.
  2. 741 μL Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisini (HBSS) 127 μL Kollajenaz stok çözeltisi ve 132 μL Hyaluronidaz stok çözeltisi ile destekleyerek Enzim A'yı hazırlayın. Bu, dört gözü tedavi edebilen 1 mL'lik son bir hacim yapar.
    1. Kollajenaz stok çözeltisini, 41 mL HBSS'de (19.5 ünite / mL) Clostridium histolyticum'dan 1 mg Kollajenaz çözerek hazırlayın.
    2. Hyaluronidaz stok çözeltisini, sığır testislerinden 1 mg Hyaluronidaz'ı 18.4 mL HBSS'de (38 ünite / mL) çözerek hazırlayın.
  3. Üç parça HBSS'ye iki parça% 0.25 Tripsin-EDTA ekleyerek B Enzimini hazırlayın. Toplam hacmin disseke edilen göz sayısına bağlı olduğunu unutmayın; Dört gözü tedavi etmek için 1 mL B Enzimi kullanılabilir.

2. Enükleasyon

  1. IACUC standartları21'e göre karbondioksit (CO2) inhalasyonunu kullanarak fareyi etik olarak ötenazi yapın.
    1. Kısaca, farelere en az sıkıntı vererek, 2 ila 3 dakika içinde bilinç kaybı sağlamak için CO 2 ile dakikada oda hacminin% 30-70'i doldurma oranıyla% 100 CO 2'yi tanıtmak için hayvanları CO 2 odasına yerleştirin.
    2. Ölümü onaylayın (solunum eksikliği ve soluk göz rengi), ardından fareyi kafesten sterilize edilmiş cerrahi ekipmanlarla donatılmış temiz bir sterilize cerrahi alana (alkolle temizlenmiş) taşıyın.
  2. Fareyi steril bir alt panelin üzerine yerleştirin.
  3. Proptozu indüklemek için orbital bölgeye 5/45 tarzı cımbız basarak gözleri enüklee edin, ardından cımbızları gözün arkasına hareket ettirin. Optik sinir bozulmadan gözleri orbital boşluktan yavaşça çekerek gözleri çıkarın.
  4. Forseps kullanarak, gözleri 1mL% 5 Povidon-İyot içeren 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne batırın. Gözleri oda sıcaklığında 2-3 dakika boyunca inkübe edin.
  5. Gözleri povidon-iyot çözeltisinden çıkarın ve bir Petri kabına yerleştirin. Steril bir transfer pipeti kullanarak, povidon-iyotun turuncu rengi gidene kadar gözleri HBSS ile yıkayın. Bu yaklaşık iki veya üç yıkama gerektirir.
  6. Gözleri yeni bir 60 mm'lik Petri kabına yerleştirin ve adım 1.1'de hazırlanan soğuk (2-8 °C) komple RPE hücre kültürü ortamına batırın.

3. Diseksiyon

  1. Cerrahi mikroskop altında, bağ dokusunu ve ekstraoküler kasları çıkarmak için M5S tarzı cımbız ve Vannas makası kullanın.
    NOT: Diseksiyon tamamen steril bir ortamda bir doku başlığı altında yapılır. Bununla birlikte, video amaçları için, diseksiyon mikroskobu, daha yüksek kalitede bir gösterim / film elde etmek için kaputun dışına yerleştirildi. Göz altına küçük bir parça tüy bırakmayan kağıt mendil yerleştirmek, diseksiyon sırasında stabiliteyi artırır. Gözler daha sonra soğuk RPE hücre kültürü ortamında geçici olarak (1 saatten fazla olmamak üzere) tutulabilir. Bununla birlikte, gözleri temizledikten hemen sonra doğrudan bir sonraki adıma geçmek tercih edilir.
  2. Gözleri, her dört göz için 1 mL Enzim A çözeltisi içeren 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ardından, gözleri 40 dakika boyunca 37 ° C'de bir inkübatörde inkübe edin.
  3. Gözleri inkübatörden ve mikrosantrifüj tüpünden çıkarın. Daha sonra, bunları her dört göz için 1 mL Enzim B çözeltisi içeren yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpü bir inkübatörde 50 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  4. Gözleri, 10 mL tam RPE hücre büyüme ortamı içeren yeni bir 60 mm süspansiyon kültürü kabına yerleştirin. Daha sonra gözleri 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  5. Çanağı cerrahi mikroskop altına yerleştirin ve diseksiyona başlayın.
  6. Gözün ön kısmını (kornea, iris ve lens) vizör adaptörünün arka kısmından (posterior retina) çıkarın.
    1. Gözü M5S tarzı forseps ile kavrayın ve ora serrata bölümünde (retinanın açık mavinin bittiği en ön kısmı) #11 bıçakla veya bir şırınganın iğnesiyle bir kesi yapın.
    2. Kesinin iç kısmını bir çift forseps ile kavrayın ve korneayı başka bir çift forseps ile kavrayın. Korneayı retinadan yavaşça çekmeye veya yırtmaya başlayın. RPE'nin çoğunlukla sağlam kalmasını ve daha temiz bir yırtılma ile sonuçlanmasını sağlamak için korneayı çıkarırken küçük artışlarla yırttığınızdan ve yırtığı aşağı doğru hareket ettirdiğinizden emin olun.
      NOT: Kornea tamamen ayrıldıktan sonra, iris ve lens görülebilir.
    3. Hem korneayı hem de irisi ayırın.
  7. Gözün arka yarısının hafifçe sıkıştırılmasıyla lensi vizör adaptöründen ayırın.
  8. Nöral retinayı RPE katmanından çıkarmak için, vizör adaptörünün dış tabakasını bir çift cımbızla kavrayın ve ikinci bir cımbız çiftinin kolunu hem RPE hem de nöral katmanlar arasında konumlandırın. Oradan, nöral retinayı RPE katmanından yavaşça çekin veya kepçeyle alın. Nöral retinayı atın.
    NOT: Videoda, nöral retina ve lens birlikte çıkarılmıştır. Ancak, yeni başlayanlar için, her birini ayrı ayrı kaldırmak daha kolay olacaktır. Geriye kalan RPE, koroid ve skleradır.
  9. Korneayı, irisi, lensi ve nöral retinayı atın. Kalan vizör adaptörünü tabakta döküntü içermeyen yeni bir alana taşıyın.
  10. RPE'yi koroid ve skleradan ayırmak için, RPE hücrelerinin ayrılmasını sağlamak için vizör adaptörünün içini 5/45 tarzı cımbızla hafifçe kazıyın. RPE hücreleri, RPE hücresi büyüme ortamının tamamında askıya alındığında bulutlu görünür.
  11. 3,2 mL'lik steril transfer pipeti kullanarak hücreleri aspire edin ve eksiksiz RPE hücre büyüme ortamı içeren yeni bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.

4. Santrifüjleme

  1. Birincil RPE hücrelerini içeren 15 mL santrifüj tüpünü bir santrifüjün içine yerleştirin ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.
  2. Süpernatantı aspire edin ve peleti 10 mL tam RPE büyüme ortamı ile yeniden askıya alın. Tam RPE büyüme ortamı, RPE büyümesi için Müller hücreleri veya koroidal endotel hücreleri gibi diğer kirletici hücrelerden daha spesifiktir. Müller hücreleri yüksek glukoz mediasına ihtiyaç duyarken, koroidal endotel hücreleri spesifik büyüme faktörleri gerektirir. Medyayı değiştirerek ve kültürü pasifleştirerek, sadece RPE hücreleri büyümeye devam edecektir.

5. Hücre kültürü

  1. Yeniden askıya alınmış birincil RPE hücrelerini steril bir 100 mm Petri kabına yerleştirin ve bir inkübatöre aktarın ( Şekil 1E-N'de belirtildiği gibi hücreleri spesifik RPE / Müller hücre belirteçleriyle boyayarak saflığı doğruladıktan sonra). Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
    NOT: Kullanılan işaretleyiciler Malzeme Tablosunda belirtilmiştir. Bu adım, kültür kurulduktan sonra gerçekleştirilir.
  2. Hücreleri büyümek için yaklaşık 5 gün boyunca inkübe edin. Bu süre zarfında, medyayı değiştirmeyin, hücreleri rahatsız etmeyin veya hücre kültürü plakasını hareket ettirmeyin (bu protokolde kritik bir adımdır; izolasyondan sonra, hücreler inkübe edilmeli ve 5 gün boyunca rahatsız edilmemelidir).
    NOT: Hücre sayısı, izolasyon için kullanılan göz sayısına bağlıdır. İzole edilen daha fazla sayıda göz, daha fazla sayıda hücre verecektir. İki gözden RPE izolasyonu ~ 440.000-880.000 hücre veya 8.8 milyon hücreyi tutabilen 100 mm Petri kabının% 5-10'unu verecektir.

6. Pasaj

  1. Ortamı aspire edin ve 2 mL PBS ile yıkayın. Sonra PBS'yi aspire edin.
  2. 4 mL% 0.25 Tripsin-EDTA (1x) veya kabın tabanını örtecek kadar ekleyin. Oda sıcaklığında 5-10 dakika kuluçkaya yatırın.
  3. 8 mL önceden ısıtılmış RPE ortamı veya adım 6.2'de ne kadar tripsin kullanıldığının hacminin iki katı ekleyin. Daha sonra hücreleri toplayın ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
  4. Oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve peleti 10 mL'lik tam RPE hücre kültürü ortamında yeniden askıya alın. Tüm süspansiyonu steril bir 100 mm Petri kabına yerleştirin.
    NOT: Hücreler dört veya beş kez18'e kadar geçirilebilir. Bununla birlikte, en tutarlı deney sonuçları iki veya üç pasajdan sonra bulunur. İki ila dört pasajdan sonra, hücreler şekillerini ( Şekil 1B'de gösterildiği gibi) daha uzun olacak şekilde değiştirdiler, plakanın ortasında birikti, büyümeyi durdurdu ve ayrıldı.
  5. RPE spesifikliğini boyamak ve doğrulamak için daha önceyayınlanan 8,14,15,16 yöntemlerine göre immünofloresan protokollerini kullanın.

7. İmmünofloresan

NOT: İmmünofloresan, RPE spesifikliğini boyamak ve doğrulamak için daha önceyayınlanan 8,14,15,16,17,18 yöntemlerine göre gerçekleştirilmiştir. Primer RPE hücrelerinin boyanması tipik olarak P1 ve P2 pasajlarında yapıldı. Burada, immünofloresan protokolüne kısa bir genel bakış sunulmaktadır.

  1. Hücreleri bir hücre kültürü odası kaydırağındaki tohumlayın (8 delikli oda slaydı için kuyu başına 30.000 hücre).
  2. Tam RPE hücre kültürü ortamındaki hücreleri 37 °C'de ve 24-48 saat boyunca% 5 CO 2'de kültürleyin.
  3. Hücreler% 80 -% 90 birleştiğinde, ortamı aspire edin ve oda kızağını 1x PBS ile yıkayın.
  4. Slaytı 10-15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.
  5. % 4'lük paraformaldehiti aspire edin ve daha sonra bloke edici çözelti ile bloke edin (bkz.
  6. Bloke edici çözeltiyi aspire edin ve birincil antikoru RPE65'i ekleyin ve 37 ° C'de üç saat boyunca inkübe edin (blokaj tamponunda 1:200-1:250 arasında değişen bir antikor konsantrasyonuyla, 150-200 μL / slayt hacminde). Ardından, PBS / TX-100 ile üç kez yıkayın (her yıkamada 5-10 dakika).
  7. Birincil antikoru aspire edin ve ikincil antikoru ekleyin (bloke edici tamponda 1: 1.000 antikor konsantrasyonu ile, 150-200 μL / slayt hacminde). 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.
  8. Sekonder antikoru aspire edin. PBS/Trtion X-100 ile üç kez yıkayın (her yıkamada 5-10 dakika).
  9. Çekirdekleri etiketlemek için bir damla DAPI montaj ortamı ekleyin ve kızağın üzerine bir kapak parçası yerleştirin. Kapak kapağının altında kabarcık olmadığından emin olun.
  10. Ardından, yüksek çözünürlüklü mikroskop (HRM) kamera ve görüntü işleme yazılımı eşliğinde floresan mikroskopla görüntüler çekin (bkz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İzole RPE hücrelerinin özgüllüğünün, saflığının ve bariyer fonksiyonunun/oluşumunun doğrulanması
İzole edilen hücreler, canlılıklarını, morfolojilerini ve pigmentasyonlarını doğrulamak için bir ışık mikroskobu altında incelendi. Hücrelerdeki değişiklikleri göstermek için P0 ve P1'den görüntüler (Şekil 1A,B) ve P0 ve P4'ten görüntüler (Şekil 1C,D) yakalandı; Pasajlar dördüncü pasaja ilerledikçe şekil, boyut ve pigmentasyon (siyah oklar P4'teki izole RPE hücrelerine işaret ediyor). İzole hücrelerin kimliğini doğrulamak için RPE65 proteini için bir antikor kullanıldı. İzole hücrelerin immünofloresan boyaması, RPE65'e karşı bir antikor ile gerçekleştirildi, ardından floresan mikroskop altında incelendi (Şekil 1E, F: düşük büyütme ve Şekil 1G, H: yüksek büyütme, pozitif boyanmış RPE hücrelerini yeşil ve nükleer belirteç DAPI, mavi renkte). RPE65, RPE'de eksprese edilen bir izomerrohidrolazdır. Çubuklar ve koni aracılı görme için gerekli görsel pigmentin yenilenmesi için gereklidir21 . İzole edilmiş bariyer fonksiyonunu doğrulamak için
izole hücreler için hem sitoiskelet proteini F-aktin hem de sıkı birleşim proteini ZO-1 immünofloresan boyama8 kullanıldı (Şekil 1I,J: yeşil ZO-1 ve mavi nükleer boyama). ve Şekil 1K, L: kırmızı F-aktin ve mavi nükleer boyama). Bununla birlikte, RPE'nin tipik parke taşı şekli, hücreler tamamen birleştiğinde çok belirgindir.

Sekonder antikorun birincil antikor eklenmeden RPE hücrelerine eklendiği deneylerde, antikorun özgüllüğünün ve ortaya çıkan rengin kullanılan antikorlara özgü olduğundan emin olmak için negatif kontrol kullanılmıştır (gösterilmemiştir).

İzole RPE'nin Müller hücreleri tarafından saflığını ve kontaminasyonunu doğrulamak için, izole hücrelerin Müller hücreleri için spesifik bir hücre belirteci olan vimentin ile immünofloresan boyaması, Müller hücreleri pozitif bir kontrol olarak kullanılarak ( Şekil 1M, N'de gösterildiği gibi nükleer boyama için yeşil ve mavi) kullanılmıştır. İzole RPE hücreleri vimentin için negatif boyanma gösterdi.

İzole edilen hücreler, canlılıklarını, morfolojilerini ve pigmentasyonlarını doğrulamak için bir ışık mikroskobu altında incelendi. P0 ve P1'den (Şekil 1K, L) görüntüler ve P0 ve P4'ten görüntüler (Şekil 1M, N), pasajlar dördüncü pasaja doğru ilerlerken hücrelerin şekli, boyutu ve pigmentasyonundaki değişiklikleri göstermek için yakalandı (siyah oklar P4'teki izole RPE hücrelerine işaret ediyor).

Figure 1
Şekil 1: RPE izolasyon doğrulaması. (A) RPE geçişi sıfır (P0) için ışık mikroskobu. (B) RPE geçişi için ışık mikroskobu bir (P1). (C) P0'da morfoloji karakterizasyonu. (D) P4'te morfoloji karakterizasyonu. (E) Düşük büyütmede RPE65 için immün boyama. (F) RPE65 için DAPI ile nükleer boyama ile immün boyama. (G) Yüksek büyütmede RPE65 için immün boyama. (H) Yüksek büyütmede DAPI ile nükleer boyama ile RPE65 için immün boyama. (I) RPE hücreleri için ZO-1 boyaması. (G) DAPI ile nükleer boyama ile RPE hücreleri için ZO-1 boyaması. (K) RPE hücreleri için F-aktin boyaması. (L) DAPI ile nükleer boyama ile RPE hücreleri için F-aktin boyama. (M) RPE hücreleri için Vimentin boyaması. (N) Müller hücreleri için pozitif kontrol (RMc-1) olarak Vimentin boyaması, DAPI ile nükleer boyama ile. Ölçek çubukları sırasıyla 300 μm, 20 μm, 300 μm, 300 μm, 50 μm, 10 μm, 50 μm, 50 μm ve 50 μm'ye eşittir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Geçerli protokol, fare gözlerinden RPE yalıtımı için raporlanmış, değiştirilmiş ve basitleştirilmiş ayrıntılı bir yordamdır. Protokol, fare gözlerinden izole edilen RPE hücrelerinin enükleasyonu, diseksiyonu, toplanması, tohumlanması, kültürü ve karakterizasyonunu içerir.

Başarılı RPE izolasyonu için farelerin yaşı, disseke edilen göz sayısı, doku kültürü tabağının veya kabının büyüklüğü ve tohumlama, depolama ve pasajdan sonra uyarılar gibi yerine getirilmesi gereken bazı sınırlamalar ve kritik adımlar vardır. İzole edilmiş hücreleri üç veya dört kata kadar geçirebilmek için, en iyi farelerin yaşları 18-21 gün arasındadır. Büyüyebilen ve çoğalabilen makul sayıda izole hücreye sahip olmak için, tek izolasyon için en az iki göze ihtiyaç vardır. İzolasyonla sonuçlanan hücrelerin sayısı, diseke edilen göz sayısıyla orantılıdır (~ 220.000 hücre / göz). Erken bir geçişte (P0) daha fazla sayıda hücre elde etmek için steril bir 100 mm Petri kabı / şişesi önerilir. Tohumlamadan sonra, doku kültürü plakasını inkübatörden hareket ettirerek veya ortamı en az 5 gün boyunca değiştirerek hücreler rahatsız edilmemelidir. Ayrıca, sınırlamalarından biriBu teknik, izole edilmiş hücrelerin depolanması ve geçirilmesidir. Hücreler depolanamaz (dondurulur ve çözülür) ve sadece üç veya dört kez geçirilebilir. 4. geçişten sonra, hücreler boyutlarını ve şekillerini, hücre pigmentasyonunda belirgin bir azalma ile uzamış (iğ şekli) olacak şekilde değiştirmeye başlarlar (Şekil 1D).

Bu protokol, birincil fare RPE yalıtımı 1 3,19,20 için yayınlanan diğer değerli ve güvenilir protokollerden farklıdır, çünkü takip edilmesi kolay birkaç adımla basitleştirilmiştir. RPE hücreleri morfolojileri, pigmentasyonları ve RPE65 4,5,21 gibi spesifik RPE belirteçleri ile tanımlanabilir. Müller hücrelerinin saflığının ve kontaminasyonunun doğrulanması, izole hücrelerin Müller hücreleri (vimentin) için spesifik bir hücre belirteci ile boyanmasıyla sağlanmıştır (vimentin)22. Kan-retina bariyerinin (BRB) bütünlüğünü in vitro olarak değerlendirmek için elektron mikroskobu (EM) muayenesi, sıkı bağlantı proteinlerinin (TJP'ler) değerlendirilmesi, FITIC dekstran kaçak testi ve RPE'nin fizyolojik fonksiyonunu tek katmanlı olarak değerlendiren transepitelyal elektrik direnci (TER) ölçümü gibi birçok teknik kullanılmıştır 8,23 . RPE hücreleri dış BRB'nin korunmasında önemli bir rol oynar ve bu işlevi doğrulamak için, daha önce yayınlandığı gibi Zona oklüdin-1 (ZO-1) gibi sıkı bağlantı proteinlerini (TJP'ler) ve F-aktin gibi sitoiskelet proteinlerini değerlendirdik8. TJP'lerin değerlendirilmesi, EM değerlendirmesi veya TER'nin aksine, tüm araştırma laboratuvarlarında bulunmayabilecek pahalı ekipman gerektirmeyen BRB bütünlüğünün ve bariyer fonksiyonunun değerlendirilmesi için daha uygun bir yöntemdir.

Primer RPE izolasyonu, altta yatan mekanizmaları ve patogenezi incelemek ve farklı göz hastalıkları için yeni terapötik uygulamalar önermek için önemli bir araç olabilecek bir tekniktir. Mevcut teknik, RPE hücre yapısı ve fonksiyonundaki değişikliklerin ve bunların yaşa bağlı makula dejenerasyonunda dış BRB üzerindeki etkilerinin incelenmesini sağlamıştır8. Ayrıca, vahşi tip C57BL6 farelerden ve farklı genetiği değiştirilmiş farelerden izole edilen RPE hücrelerindeki değişikliklerin incelenmesine ve AMD14,16 için terapötik bir hedef arayan farklı farmakolojik bileşiklerin test edilmesine yardımcı oldu.

Sonuç olarak, mevcut birçok yayınlanmış protokol birincil fare RPE izolasyonunu göstermiştir. Sunulan protokol, birincil RPE hücrelerini fare gözlerinden izole etmek için çoğu araştırma laboratuvarında bulunan materyal, yöntem ve ekipmanı kullanarak mevcut bazı protokollerin değiştirilmesinden kaynaklanan basitleştirilmiş bir prosedürdür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların, bu makalenin içeriğiyle ilgili olduğunu beyan etmek için çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Bu çalışma Ulusal Göz Enstitüsü (NEI), Ulusal Göz Enstitüsü (NEI) fonu R01 EY029751-04 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker : 100mL KIMAX 14000
Collagenase from Clostridium histolyticum  Sigma-Aldrich C7657-25MG For working enzyme, A
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile 13-711-20
DMEM/F12  gibco  11330 Media to grow RPE cells 
Fetal Bovine Serum (FBS) gibco 26140079 For complete RPE cell culture media
Gentamicin Reagent Solution gibco 15750-060 For complete RPE cell culture media
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Scientific 88284 For working enzymes (A&B) 
Heracell VISO 160i CO2 Incubator Thermo Scientific 50144906
Hyaluronidase from bovine testes Sigma-Aldrich H3506-500MG For working enzyme A
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL B-D 309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL Grainger 11L819
Mouse monoclonal anti-RPE65 antibody  Abcam, Cambridge, MA, USA ab78036 For IF staining 
Pen Strep gibco 15140-122 For complete RPE cell culture media
Positive Action Tweezers, Style 5/45 Dumont 72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm GARANA INDUSTRIES 2595
Sorvall St8 Centrifuge ThermoScientific 75007200
Stemi 305 Microscope Zeiss n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel Bard-Parker 371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style Corning 430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style Corning 353003
Tornado Tubes: 15mL Midsci C15B
Tornado Tubes: 50mL Midsci C50R
Trypsin EDTA (1x) 0.25% gibco 2186962 For working enzyme B
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips Dumont 501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL Electron Microscopy Sciences Dumont 50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36" McKesson 4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge FST 15000-08
Zeiss AxioImager Z2 Zeiss n/a
Zeiss Zen Blue 2.6 Zeiss n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Young, R. W., Droz, B. The renewal of protein in retinal rods and cones. The Journal of Cell Biology. 39 (1), 169-184 (1968).
  2. Sparrow, J. R., Hicks, D., Hamel, C. P. The retinal pigment epithelium in health and disease. Current Molecular Medicine. 10 (9), 802-823 (2010).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Marlhens, F., et al. Autosomal recessive retinal dystrophy associated with two novel mutations in the RPE65 gene. European Journal of Human Genetics. 6 (5), 527-531 (1998).
  5. Morimura, H., et al. Mutations in the RPE65 gene in patients with autosomal recessive retinitis pigmentosa or leber congenital amaurosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (6), 3088-3093 (1998).
  6. Weiter, J. J., Delori, F. C., Wing, G. L., Fitch, K. A. Retinal pigment epithelial lipofuscin and melanin and choroidal melanin in human eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (2), 145-152 (1986).
  7. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  8. Ibrahim, A. S., et al. Hyperhomocysteinemia disrupts retinal pigment epithelial structure and function with features of age-related macular degeneration. Oncotarget. 7 (8), 8532-8545 (2016).
  9. Zarbin, M. A. Age-related macular degeneration: review of pathogenesis. European Journal of Ophthalmology. 8 (4), 199-206 (1998).
  10. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-170 (1996).
  11. Flannery, J. G. Transgenic animal models for the study of inherited retinal dystrophies. ILAR Journal. 40 (2), 51-58 (1999).
  12. Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
  13. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture, and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  14. Samra, Y. A., et al. Implication of N-Methyl-d-Aspartate receptor in homocysteine-induced age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9356 (2021).
  15. van Marum, R. J. Update on the use of memantine in Alzheimer's disease. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 5, 237-247 (2009).
  16. Elsherbiny, N. M., et al. Homocysteine induces inflammation in retina and brain. Biomolecules. 10 (3), 393 (2020).
  17. Tawfik, A., Elsherbiny, N. M., Zaidi, Y., Rajpurohit, P. Homocysteine and age-related central nervous system diseases: role of inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6259 (2021).
  18. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler Jr, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. (133), e56997 (2018).
  19. Chen, M., et al. Characterization of a spontaneous mouse retinal pigment epithelial cell line B6-RPE07. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3699-3706 (2008).
  20. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2020).
  21. Cai, X., Conley, S. M., Naash, M. I. RPE65: role in the visual cycle, human retinal disease, and gene therapy. Ophthalmic Genetics. 30 (2), 57-62 (2009).
  22. Pérez-Álvarez, M. J., et al. Vimentin isoform expression in the human retina characterized with the monoclonal antibody 3CB2. Journal of Neuroscience Research. 86 (8), 1871-1883 (2008).
  23. Tawfik, A., Samra, Y. A., Elsherbiny, N. M., Al-Shabrawey, M. Implication of hyperhomocysteinemia in blood retinal barrier (BRB) dysfunction. Biomolecules. 10 (8), 1119 (2020).
  24. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, S. B., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B. S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5382-5393 (2014).

Tags

Biyoloji Sayı 189

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells
Posted by JoVE Editors on 12/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. The Discussion and References sections were updated.

The third paragraph of the Discussion section was updated from:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

to:

This protocol is different from other valuable and reliable published protocols for primary mouse RPE isolation13,19,20,24 in that it is simplified with a few steps that are easy to follow. RPE cells are able to be identified by their morphology, pigmentation, and specific RPE markers such as RPE654,5,21. Validation of the purity and contamination of Müller cells was achieved by staining isolated cells with a specific cell marker for Müller cells (vimentin)22. Many techniques have been used to evaluate the integrity of the blood-retinal barrier (BRB) in vitro, such as electron microscope (EM) examination, assessment of tight junction proteins (TJPs), FITIC dextran leakage assay, and transepithelial electrical resistance (TER) measurement that evaluates the physiological function of RPE as a monolayer8,23. RPE cells play an important role in maintaining the outer BRB, and to validate this function, we evaluated tight junction proteins (TJPs) such as Zona ocludin-1 (ZO-1) and cytoskeletal proteins like F-actin as previously published8. TJPs evaluation is a more convenient method for the evaluation of BRB integrity and barrier function which doesn't require expensive equipment that may not be available in all research labs, as opposed to EM evaluation or TER.

In the References section, a 24th reference was added:

  1. Promsote, W., Makala, L., Li, B., Smith, SB., Singh, N., Ganapathy, V., Pace, B.S., Martin, P. Monomethylfumarate induces γ-globin expression and fetal hemoglobin production in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) and erythroid cells, and in intact retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55(8):5382-93 (2014).
Primer Fare Retinal Pigmentli Epitel Hücrelerinin İzolasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tomaszewski, R., Rajpurohit, P.,… More

Tomaszewski, R., Rajpurohit, P., Cheng, M., Tawfik, A. Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells. J. Vis. Exp. (189), e63543, doi:10.3791/63543 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter