Summary
يمكن عزل الخلايا الجذعية الوسيطة تحت الرضفة (IFP-MSCs) بسهولة من وسادة الدهون تحت الرضفة في مفصل الركبة. تتكاثر بشكل جيد في المختبر ، وتشكل مستعمرات CFU-F ، وتتمايز إلى سلالات دهنية ، غضروفية ، وعظمية المنشأ. هنا ، يتم توفير منهجية عزل وتوسيع وتمييز IFP-MSCs عن مفصل خنق الماعز.
Abstract
يعمل IFP ، الموجود في مفصل الركبة ، كمصدر واعد ل MSCs. IFP هو نسيج يسهل الوصول إليه حيث يتم استئصاله والتخلص منه بشكل روتيني أثناء إجراءات تنظير المفاصل وجراحات استبدال الركبة. بالإضافة إلى ذلك ، ترتبط إزالته بالحد الأدنى من المراضة في موقع المانحين. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن IFP-MSCs لا تفقد قدرتها على الانتشار أثناء التوسع في المختبر ولديها إمكانية تمايز عظمي مستقل عن العمر. تمتلك IFP-MSCs إمكانات تمايز غضروفي فائقة مقارنة ب MSCs المشتقة من نخاع العظم (BMSCs) والخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ADSCs). على الرغم من أن هذه الخلايا يمكن الحصول عليها بسهولة من المرضى المسنين والمرضى ، إلا أن فعاليتها محدودة. ومن ثم ، فإن استخدام IFP-MSCs من متبرعين أصحاء أمر مهم لتحديد فعاليتها في التطبيقات الطبية الحيوية. نظرا لأن الوصول إلى متبرع بشري سليم يمثل تحديا ، يمكن أن تكون النماذج الحيوانية بديلا أفضل لتمكين الفهم الأساسي. تلعب الحيوانات الكبيرة مثل الكلاب والخيول والأغنام والماعز دورا مهما في البحث الانتقالي. من بين هؤلاء ، يمكن أن يكون الماعز نموذجا مفضلا لأن المفصل الخانق للماعز لديه أقرب تشريح لمفصل الركبة البشري. علاوة على ذلك ، يمكن ل goat-IFP تلبية أرقام MSC الأعلى اللازمة لتطبيقات تجديد الأنسجة. علاوة على ذلك ، فإن التكلفة المنخفضة والتوافر والامتثال لمبادئ 3R للبحوث الحيوانية تجعلها نموذجا جذابا. توضح هذه الدراسة بروتوكولا بسيطا لعزل IFP-MSCs عن المفصل الخانق للماعز وظروف الاستزراع في المختبر لتمددها وتمايزها. تم غسل IFP المعزول بشكل معقم من الماعز وفرمه وهضمه إنزيميا. بعد الترشيح والطرد المركزي ، تم استزراع الخلايا التي تم جمعها. كانت هذه الخلايا ملتصقة ، وكان لها مورفولوجيا تشبه MSCs ، وأظهرت قدرة استنساخ ملحوظة. علاوة على ذلك ، فقد تمايزوا إلى سلالات دهنية ، غضروفية ، وعظمية ، مما يدل على تعدد قدراتهم. في الختام ، توضح الدراسة عزل وتوسع MSCs ، والتي تظهر إمكانات في هندسة الأنسجة وتطبيقات الطب التجديدي.
Introduction
الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) هي مرشح جذاب للعلاجات القائمة على الخلايا في الطب التجديدي 1,2. يمكن حصادها من مجموعة متنوعة من مصادر الأنسجة مثل نخاع العظام والحبل السري والمشيمة ولب الأسنان والأنسجة الدهنية تحت الجلد3. ومع ذلك ، نظرا لأن توافر الخلايا الجذعية لدى البالغين محدود وغالبا ما يكون إجراء عزلها غازيا (مما يؤدي إلى الإصابة بأمراض موقع المانحين) ، فمن المستحسن أن يكون لديك مصدر بديل للخلايا الجذعية يمكنه التحايل على هذه التحديات.
مفصل الركبة عبارة عن مستودع لأنواع مختلفة من الخلايا ، مثل MSCs المشتقة من وسادة الدهون تحت الرضفة ، و MSCs المشتقة من الغشاء الزليلي ، و MSCs المشتقة من السائل الزليلي ، والخلايا الليفية في الرباط ، والخلايا الغضروفية المفصلية ، إلخ4،5،6. هذه الخلايا لديها القدرة على استكشافها على نطاق واسع في البحوث القائمة على هندسة الأنسجة العضلية الهيكلية. لذلك ، يمكن أن يكون مفصل الركبة مصدرا ممكنا وموثوقا لأنواع متعددة من MSCs. يعد مستودع الدهون الموجود في مفصل الركبة ، والمعروف باسم وسادة الدهون تحت الرضفة (IFP) أو وسادة الدهون في Hoffa ، خيارا واعدا وبديلا لمستودع MSC. يعد IFP مصدرا يسهل الوصول إليه نسبيا ويمكن الحصول عليه سريريا من MSCs ، حيث يتم استئصاله بشكل روتيني والتخلص منه كنفايات جراحية أثناء تنظير الركبة أو جراحة الركبة المفتوحة. ترتبط إزالة IFP بالحد الأدنى من المراضة في موقع المتبرع ، مما يجعله أيضا مصدرا جذابا للأنسجة. على الرغم من وجود نمط ظاهري مماثل، فإن MSCs من IFP-MSCs قد عززت إمكانات استنساخ عند مقارنتها بالخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظم (BM-MSCs)6 وقدرة تكاثرية أفضل مقارنة بالخلايا الجذعية المشتقة من الدهون تحت الجلد (ADSCs)7. ومن المثير للاهتمام ، بالمقارنة مع MSCs المشتقة من السائل الزليلي (SF-MSCs) ، لا تفقد IFP-MSCs قدرتها على التكاثر في الممرات المتأخرة ، ولا تزيد مضاعفة الوقت في الممرات المتأخرة. يشير هذا إلى أنه أثناء توسع الخلايا ، يمكن ل IFP-MSCs تحقيق عدد كبير بما فيه الكفاية من الخلايا لتطبيقات هندسة الأنسجة في المختبر دون المساس بمعدل انتشارها8. أشارت الدراسات الحديثة أيضا إلى أن IFP-MSCs تمتلك إمكانات تمايز غضروفي فائقة مقارنة ب MSCs المشتقة من نخاع العظم (BMSCs) و MSCs المشتقة من الدهون (ADSCs) ، ربما بسبب قربها التشريحي من الغضروف المفصلي ، مما يشير إلى ملاءمتها لهندسة أنسجة الغضاريف6،7،9،10. علاوة على ذلك ، لديهم أيضا إمكانية التمايز العظمي المستقل عن العمر11. ثبت أن الحقن داخل المفصل ل IFP-MSCs يقلل الألم ويحسن وظائف مفصل الركبة لدى مرضى هشاشة العظام (OA) 12,13. علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ أيضا عن استجابات قوية مثبطة للمناعة وخصائص مناعية محسنة ل IFP-MSCs في وجود السيتوكينات الالتهابية أثناء الحالات المرضية6.
وتشكل هذه الأفرقة مصدرا واعدا وبديلا للأفرقة المتنقلة؛ ومع ذلك ، فإن فائدتها العلاجية في هندسة الأنسجة والطب التجديدي أقل استكشافا نسبيا. استخدمت الدراسات الحالية على IFP-MSCs بشكل رئيسي خلايا من متبرعين بشريين. من بين هذه الدراسات ، قامت بعض الدراسات الحديثة بالتحقيق في IFP-MSCs من متبرعين بشريين أصحاء (مرضى غير مصابين بالتهاب المفاصل ، تتراوح أعمارهم بين 17-60 عاما) 6,14 ، في حين استخدمت معظم الدراسات IFP-MSCs من المرضى المسنين الذين يخضعون لجراحة استبدال الركبة بالكامل (المرضى المرضى ، الذين تتراوح أعمارهم بين 70-80 عاما). نظرا لأنه من المعروف أن كلا من العمر والمرض يغيران الأداء الطبيعي للخلايا الجذعية (انخفاض العدد وفقدان الإمكانات الوظيفية) ، فقد يؤدي ذلك إلى تناقضات في نتائج الدراسات المستندة إلى MSC7،15،16،17. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام IFP-MSCs من المرضى الذين يعانون من حالات فسيولوجية مرضية (مثل التهاب المفاصل والسمنة) يشكل أيضا صعوبة في فهم الخصائص الأساسية للخلايا السليمة في المختبر ، وبالتالي يعمل كعامل مقيد في تطوير العلاجات القائمة على MSCs. للتغلب على هذه المشكلات ، يعد استخدام IFP-MSCs من الجهات المانحة الصحية أمرا حيويا. نظرا لأن الوصول إلى متبرع بشري سليم يمثل تحديا ، يمكن أن تكون النماذج الحيوانية بديلا أفضل. في هذا الصدد ، هناك عدد قليل من الدراسات حيث تم عزل IFP من الفئران18. ومع ذلك ، نظرا لصغر حجم وسادة الدهون في الفئران العادية ، فقد تم دمج الأنسجة الدهنية من متعددة للحصول على أنسجة كافية لتنفيذ إجراءات تجريبية معقدة19. وبالتالي ، هناك حاجة إلى نموذج حيواني كبير ، والذي يمكن أن يفي بمتطلبات العدد الأكبر من الخلايا ويتوافق في نفس الوقت مع مبادئ 3R (التحسين والاستبدال والتقليل) في الأبحاث الحيوانية20. استخدام الحيوانات الكبيرة له آثار كبيرة في البحوث الانتقالية. على وجه التحديد ، في هندسة الأنسجة العضلية الهيكلية ، تم التحقيق في مجموعة من الحيوانات الكبيرة مثل الكلاب والخنازير والأغنام والماعز والخيول21. الماعز (Capra aegagrus hircus) هو اختيار ممتاز للحيوان الكبير لأن مفصله الخانق لديه أقرب تشريح لمفصل الركبة البشري22،23،24. يتشابه الهيكل التربيقي العظمي تحت الغضروفي وسمك عظم الماعز تحت الغضروف مع البشر ، كما تم الإبلاغ عن نسبة الغضروف إلى العظام لتكون قريبة من البشر21. بالإضافة إلى ذلك ، تم تدجين الماعز على نطاق واسع في جميع أنحاء العالم ، مما يجعلها متاحة بسهولة عندما تنضج هيكليا. علاوة على ذلك ، فإن تكاليف الصيانة المنخفضة وسهولة التعامل معها جعلتها نموذجا حيوانيا جذابا للبحث22.
في هذه الدراسة ، تم توضيح بروتوكول بسيط لعزل IFP-MSCs من المفصل الخانق ل Capra aegagrus hircus (الماعز) وظروف الاستزراع في المختبر لتمددها وتمايزها. الخلايا المعزولة ملتصقة ، ولها مورفولوجيا تشبه MSC ، وتشكل مستعمرات CFU-F (الخلايا الليفية المكونة للمستعمرة) ، وتمتلك إمكانات تمايز دهنية ، غضروفية ، وعظمية. لذلك ، تظهر IFP-MSCs إمكانات كمصدر بديل ل MSCs للتطبيقات الطبية الحيوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يعتمد البروتوكول على عزل IFP-MSCs عن الماعز. تم جمع الماعز IFP والدم من مسلخ محلي. نظرا لأن مجموعات الأنسجة هذه تقع خارج نطاق اختصاص لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية ، لم تكن الموافقة الأخلاقية مطلوبة.
1. عزل IFP-MSCs من المفصل الفخذي الظنبوبي لركبة الماعز
- جمع الماعز الفخذي الظنبوبي (عينة) تشمل ~ 15 سم كل من المناطق الفخذية والظنبوبية من الأطراف الخلفية. ضع العينة على الفور في صندوق معقم لجمع العينات وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لنقلها إلى المختبر لمزيد من المعالجة. معالجة العينات بشكل معقم في خزانة السلامة البيولوجية ، باستخدام أدوات جراحية معقمة طوال الإجراء (الشكل 1 ، الخطوة 1).
- ضع العينة على طبق بتري 150 مم واشطفها جيدا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مكمل بالمضادات الحيوية (5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين ب ، 200 وحدة / مل بنسلين-ستربتومايسين ، و 50 ميكروغرام / مل سيبروفلوكساسين) لتجنب التلوث. تأكد دائما من الحفاظ على رطوبة العينة باستخدام برنامج تلفزيوني.
- فحص بعناية المناطق التشريحية للعينة. لسهولة الوصول إلى كبسولة المفصل ، تأكد من إزالة الأنسجة الزائدة من كل من العظام الطويلة تماما (الشكل 1 ، الخطوة 2).
- لتحقيق ذلك ، أولا ، أمسك السطح النهائي لعظم الفخذ بيد واحدة ، وبمقص حاد ، اقطع طوليا نحو المفصل. قم بإزالة العضلات المحيطة والأنسجة الدهنية من العظام أثناء العملية. كن حذرا من أن الأنسجة المحيطة بكبسولة المفصل المباشر تظل دون إزعاج في البداية.
- وبالمثل ، قم بعمل شق آخر في نهاية الظنبوب للعينة وإزالة العضلات والأنسجة الدهنية من عظم الظنبوب. تأكد من أن كلا العظمتين الطويلتين مكشوفتان تماما وأن كبسولة المفصل مرئية بوضوح بعد هذه الخطوة (الشكل 1 ، الخطوة 3).
- بعد ذلك ، قم بعمل شق من جانبي الغشاء الزليلي لقطع المفصل المفصلي (الشكل 1 ، الخطوة 4). قم بقطع الرضفة من كل من الغشاء الزليلي والأربطة الرضفية باستخدام مجموعة جديدة من المقصات والملقط المعقمة. احتفظ على الفور بالرضفة المنفصلة في طبق بتري يحتوي على برنامج تلفزيوني (الشكل 1 ، الخطوة 5).
- قم بإزالة وسادة الدهون الموجودة بالكامل على السطح الداخلي للرضفة باستخدام المقص والملقط واجمع وسادة الدهون في طبق بتري طازج آخر (الشكل 1 ، الخطوة 6). فرم وسادة الدهون التي تم جمعها باستخدام مشرط. قم بتضمين أدوات جراحية أخرى (مثل المقص أو الشفرات الجراحية) كما هو مطلوب للحصول على أصغر قطع / شرائح دهنية ممكنة من ~ 2-3 مم.
ملاحظة: الفرم الجيد أمر بالغ الأهمية للحصول على عائد جيد من الخلايا. حافظ دائما على رطوبة الأنسجة ولا تدعها تجف في أي مرحلة من مراحل إجراء العزل. - انقل المنديل المفروم باستخدام ملعقة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل واغسله باستخدام برنامج تلفزيوني مكمل بالمضادات الحيوية في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 15 دقيقة في خلاط أنبوب اختبار. كرر خطوة الغسيل 3 مرات ، 15 دقيقة لكل منهما.
- للهضم الأنزيمي ، احتضن الأنسجة المفرومة (~ 5 جم) في وسائط النسر المعدلة من Dulbecco (DMEM Low glucose) التي تحتوي على 1.5 مجم / مل كولاجيناز من النوع الثاني (20 مل) وتستكمل ب 2٪ FBS عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
ملاحظة: قم بإجراء عملية الهضم في خلاط أنبوب الاختبار بمعدل ~ 15 دورة في الدقيقة (RPM). - قم بشفط الأنسجة المهضومة بعناية وقم بترشيحها من خلال مصفاة خلوية (70 ميكرومتر) لإزالة أي نسيج غير مهضوم. جهاز طرد مركزي للمرشح في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل عند 150 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية واغسل الحبيبات بجلوكوز منخفض DMEM على الأقل 2x.
ملاحظة: صب الأنسجة المهضومة ببطء في المصفاة لتجنب الانسكاب. استخدم أنبوب طرد مركزي منخفض الحجم (15 مل) للحصول على حبيبات جيدة. - أعد تعليق حبيبات الخلية التي تم الحصول عليها في وسائط DMEM كاملة (DMEM منخفض الجلوكوز المكمل بنسبة 10٪ FBS والمضادات الحيوية [2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين ، 100 وحدة / مل بنسلين-ستربتومايسين ، و 25 ميكروغرام / مل سيبروفلوكساسين]) ، يشار إليها باسم وسائط التمدد في البروتوكول في الخطوات اللاحقة.
- بذر الخلايا على أطباق بتري 150 مم واستزرعها في وسط التمدد المكمل بعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي 5 نانوغرام / مل (bFGF) و 50 ميكروغرام / مل 2-فوسفو-L-حمض الأسكوربيك ملح ثلاثي الصوديوم. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ للسماح للخلايا بالالتصاق والتكاثر. مراقبة ارتباط ونمو الخلايا على أساس يومي.
2. صيانة وتوسيع الخلايا المعزولة
- قم بتغيير الوسائط كل 3 أيام حتى تصبح الخلايا متقاربة. أضف 5 نانوغرام / مل bFGF طازج و 50 ميكروغرام / مل 2-فوسفو-L-حمض الأسكوربيك ملح ثلاثي الصوديوم مباشرة إلى طبق بتري في كل مرة يتم فيها تغيير الوسائط. بعد أن تصبح الخلايا 80٪ -90٪ متقاربة ، قم بزراعة الخلايا الفرعية.
ملاحظة: إزالة الكيانات غير المرتبطة أثناء كل تغيير في الوسائط. في حالة رؤية قطرات الزيت بعد 3 أيام من الحضانة ، اغسل الخلايا باستخدام PBS 1x ثم أضف وسائط جديدة إلى طبق بتري. استمر في غسل PBS قبل تغيير كل وسائط حتى تتم إزالة قطرات الزيت تماما. - الزراعة الفرعية للخلايا: قم بإزالة وسائط التمدد من طبق بتري واغسل الخلايا 1x باستخدام PBS. أضف 4 مل من 0.25٪ تربسين / EDTA إلى الطبق واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO2 لمدة 4 دقائق.
ملاحظة: يتم تحقيق التقاء (80٪ -90٪) في غضون 7 أيام. قم بتوزيع محلول التربسين / EDTA بشكل موحد على كامل سطح طبق بتري أثناء التربسين. - قم بإزاحة الخلايا عن طريق النقر على اللوحة الموجودة على الجانب والمراقبة تحت المجهر للتأكد من فصل جميع الخلايا. تحييد التربسين بعد إضافة حجم متساو (4 مل) من وسائط التمدد.
- اجمع الخلايا المنفصلة باستخدام ماصة في أنبوب بولي بروبيلين جديد سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي بسرعة 150 × جم لمدة 5 دقائق عند RT. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في الحجم المطلوب من وسائط التمدد.
- عد الخلايا باستخدام طريقة عد الخلايا القياسية والمزرعة الفرعية في أطباق بتري 150 مم بكثافة بذر 1 × 104 خلايا / سم2 لمزيد من التوسع. لجميع المقايسات ، استخدم طبقة أحادية متقاربة من خلايا رقم المرور P2-P5.
ملاحظة: الحفاظ على الخلايا الزائدة بالتبريد.
3. تقييم القدرة المستنسخة ل IFP-MSCs باستخدام مقايسة تشكيل المستعمرة (CFU-F)
- بالنسبة لفحص CFU-F ، قم بزرع الخلايا في وسط التمدد في صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار بكثافة بذر 50-100 خلية / سم2. أضف الوسائط للحصول على حجم نهائي يبلغ 3 مل.
ملاحظة: تحسين تركيز الخلية للمقايسات والعلاج. - استزراع الخلايا لمدة 12 يوما عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO2 في ظل ظروف الثقافة القياسية للسماح للخلايا بتكوين مستعمرات. قم بتغيير الوسائط كل 3 أيام. كن لطيفا أثناء تغيير الوسائط.
- بعد 12 يوما ، اشطف المستعمرات 1x باستخدام PBS وقم بإصلاحها باستخدام 20٪ ميثانول لمدة 20 دقيقة في RT. قم بتلطيخ المستعمرات بصبغة بنفسجية بلورية (0.5٪ [وزن / حجم] في 20٪ ميثانول) لمدة 20 دقيقة في RT. عد المستعمرات الفردية باستخدام مجهر مقلوب.
ملاحظة: يتم تعريف المستعمرة على أنها مجموعة من أكثر من 50 خلية.
4. إمكانات التمايز ل IFP-MSCs
- إحداث التمايز الدهني ل IFP-MSCs
- للحث على تكوين الدهون ، قم بزرع الخلايا بكثافة 25 × 103 خلايا / سم2 في لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا. أضف الوسائط للحصول على حجم نهائي قدره 500 ميكرولتر. استزرع الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.
- بعد يوم واحد من الالتقاء ، استبدل وسيط التمدد ب 500 ميكرولتر من وسائط التمايز الأديبوجينية. يتطلب ما يقرب من 2 أيام للخلايا للوصول إلى التقاء.
- تحضير وسائط التمايز الأدبوجينية عن طريق استكمال وسائط التمدد (DMEM + 10٪ FBS + 2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين ، 100 وحدة / مل بنسلين-ستربتومايسين ، و 25 ميكروغرام / مل سيبروفلوكساسين) مع 25 mM D (+) - جلوكوز ، 10 ميكروغرام / مل أنسولين ، 1 ميكرومتر ديكساميثازون ، و 100 ميكرومتر إندوميتاسين.
ملاحظة: وسائط التمايز غير مستقرة عند 4 °C بعد 1 شهر ؛ ومن ثم ، قم بإعداد وسائل الإعلام عند الاقتضاء. - ضع في اعتبارك الخلايا المستزرعة في وسائط التمدد المكملة ب 25 mM D (+) من الجلوكوز كعناصر تحكم غير مستحثة. قم بتغيير الوسائط كل 3 أيام لمدة 14 يوما. في نهاية ال 14 يوما ، اغسل الخلايا 1x باستخدام PBS. ثبت الخلايا باستخدام الفورمالين المحايد (NBF ؛ 4٪ فورمالديهايد في PBS) لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- بعد التثبيت ، اغسل الآبار 1x بالماء المقطر ثم احتضن الخلايا بنسبة 60٪ من الأيزوبروبانول لمدة 5 دقائق في RT. بعد إزالة الأيزوبروبانول ، قم بتلطيخ قطرات الدهون عن طريق احتضان الخلايا ب 500 ميكرولتر من محلول العمل لصبغة Oil Red O لمدة 5 دقائق في RT. اغسل الآبار 1x بالماء المقطر لإزالة الصبغة غير المنضمة وتصوير الخلايا باستخدام مجهر مقلوب.
ملاحظة: تحضير محلول مخزون الزيت الأحمر O (ORO) عن طريق إذابة 300 ملغ من ORO في 100 مل من 99٪ إيزوبروبانول. لتحضير محلول العمل ، امزج ثلاثة أجزاء من مخزون ORO وجزأين من الماء المقطر واتركه يختلط في RT لمدة 10 دقائق. قم بتصفية الخليط باستخدام ورق ترشيح 0.2 ميكرومتر. حل العمل جاهز للاستخدام. يمكن تحضير محلول المخزون وتخزينه في RT لمدة 1 شهر في الظلام ، في حين أن حل العمل يحتاج إلى إعداد طازج قبل كل استخدام / تلطيخ.
- إحداث التمايز الغضروفي ل IFP MSCs
- عزل بلازما الماعز:
- تحضير 3.4٪ (وزن / حجم) سترات الصوديوم في الماء المقطر. أضف 5 مل من محلول سترات الصوديوم المحضر إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
- اجمع 45 مل من دم الماعز المعزول حديثا في نفس الأنبوب. قم بإمالة الأنبوب على الفور لخلط الدم مع سترات الصوديوم جيدا لمنع التجلط ونقله إلى المختبر عند 4 درجات مئوية.
- جهاز طرد مركزي لدم الماعز الذي تم جمعه عند 1000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الطافية (البلازما) إلى أنبوب جديد داخل خزانة السلامة البيولوجية. قم بتصفية البلازما من خلال مرشحات 0.2 ميكرومتر ، والقسمة ، وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها مرة أخرى.
ملاحظة: الحفاظ على درجة حرارة 2-8 درجة مئوية أثناء التعامل مع العينات. من المهم تقليل دورات تجميد ذوبان البلازما.
- قم بزراعة الخلايا الموسعة إلى التقاء 80٪ -90٪ ، وافصل الخلايا باستخدام محلول التربسين / EDTA ، وقم بتقطيع الخلايا عند 150 × جم لمدة 5 دقائق في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. أعد تعليق الحبيبات في بلازما الماعز بكثافة 2 × 106 خلايا لكل 50 ميكرولتر من محلول البلازما.
- أضف قطرة من الخلايا المحتوية على البلازما (50 ميكرولتر) على طبق بتري معقم 90 مم ثم أضف كلوريد الكالسيوم بتركيز نهائي قدره 0.3٪ (وزن / حجم). تخلط جيدا لتصنيع هيدروجيل البلازما المتصالب.
- احتضان الهيدروجيل المصنع على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة. بعد الحضانة ، انقل الهلاميات المائية إلى ألواح زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا والتي تحتوي على وسائط غضروفية.
- تحضير وسائط غضروفية عن طريق استكمال DMEM منخفض الجلوكوز مع 10 mM 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازين إيثان سلفونيك حمض (HEPES) ، 1.25 ملغ / مل ألبومين مصل الأبقار (BSA) ، 1 مليمتر برولين ، 50 ميكروغرام / مل 2-فوسفو-L- حمض الأسكوربيك ملح ثلاثي الصوديوم ، 100 نانومتر ديكساميثازون ، 1x أنسولين ، ترانسفيرين ، سيلينيت الصوديوم + لينوليك-BSA (ITS + 1) ، مضادات حيوية (2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين ، 100 وحدة / مل بنسلين-ستربتومايسين و 25 ميكروغرام / مل سيبروفلوكساسين) ، و 10 نانوغرام / مل عامل نمو تحويل- β1 (TGF-β1).
- تعتبر الهلاميات المائية المستزرعة في وسائط DMEM كاملة (DMEM منخفض الجلوكوز مع 10٪ FBS والمضادات الحيوية [2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين ، 100 وحدة / مل بنسلين-ستربتومايسين ، و 25 ميكروغرام / مل سيبروفلوكساسين]) بدون TGF-β1 تعتبر عناصر تحكم غير مستحثة. قم بتغيير الوسائط كل 3 أيام لمدة 14 يوما.
- بعد 14 يوما من التمايز الغضروفي للخلايا في الهلاميات المائية في البلازما ، اغسل الهلاميات المائية باستخدام PBS 3x لمدة 5 دقائق لكل منها ثم ثبت العينات في NBF لمدة 3 ساعات.
تنبيه: الفورمالديهايد مادة مسرطنة محتملة ويمكن أن يسبب تهيجا للأنف والحلق والرئتين عند الاستنشاق. تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بالفورمالديهايد في غطاء الدخان. - قم بإزالة NBF ، واغسل الهلاميات المائية باستخدام PBS 3x لمدة 5 دقائق لكل منها ، ثم احتضن 35٪ (وزن / حجم) من السكروز في RT طوال الليل للسماح بامتصاص المحلول بالكامل في العينات. تأقلم الهلاميات المائية في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) لمدة 3 ساعات. قم بتضمين العينات في مركب OCT باستخدام قوالب السيليكون تحت النيتروجين السائل.
- قطع العينات بسمك 10-12 ميكرومتر على شرائح زجاجية مغلفة بالجيلاتين باستخدام cryotome وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. لفحص وجود أو ترسب المصفوفة خارج الخلية بعد التمايز الغضروفي ، قم بتلطيخ الأقسام بصبغة Alcian Blue و Safranin-O ، والتي ترتبط بالجليكوزامينوجليكان الكبريتي.
ملاحظة: لتحضير صبغة Alcian Blue ، قم بإذابة 1 جم من صبغة Alcian Blue في 100 مل من 0.1 N HCl واخلطها جيدا في خلاط أنبوب الاختبار طوال الليل. يمكن تخزين الحل في RT لمدة 1 شهر في الظلام. لتحضير صبغة Safranin-O ، قم بإذابة 0.1 جم من صبغة Safranin-O في 100 مل من الماء المقطر واخلطها جيدا في خلاط أنبوب الاختبار طوال الليل. - لتلطيخ Alcian Blue ، اغسل أقسام الهيدروجيل 1x بالماء المقطر لمدة 5 دقائق. لإصلاح الأقسام ، أضف 4٪ NBF إلى الشرائح واحتضانها لمدة 30 دقيقة.
- اغسل الأقسام 1x بالماء المقطر لمدة 5 دقائق ثم 2x مع 0.1 N HCl لمدة 30 ثانية لكل منهما. قم بإزالة حمض الهيدروكلوريك وجفف الشرائح برفق باستخدام المناديل الورقية. أضيفي صبغة Alcian Blue المحضرة إلى الأقسام واحتضنيها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في غرفة مرطبة.
- اغسل الصبغة غير المنضمة ب 0.1 نيوتن حمض الهيدروكلوريك ثم الماء المقطر لمدة 3 دقائق. قم بتجفيف الأقسام في الإيثانول المطلق ، وقم بإزالتها في الزيلين ، وأخيرا قم بتركيب المقاطع الملطخة في وسط راتنجي للتصوير.
- لتلطيخ Safranin-O ، اغسل أقسام الهيدروجيل بالماء المقطر 1x لمدة 5 دقائق. لإصلاح الأقسام ، أضف 4٪ NBF إلى الشرائح واحتضانها لمدة 30 دقيقة. اغسل المقاطع 1x بالماء المقطر لمدة 5 دقائق ، ثم اغمس الشرائح في حمض الخليك 1٪ لمدة 10-15 ثانية. جفف الشرائح برفق باستخدام المناديل الورقية.
- أضف صبغة Safranin-O المحضرة إلى الأقسام واحتضنها لمدة 10 دقائق في RT. اغسل الصبغة غير المنضمة بالإيثانول بنسبة 100٪. اغمس الشرائح في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق. قم بتجفيف الشرائح في الهواء ، وقم بمسحها في الزيلين ، وأخيرا قم بتركيب الأقسام الملطخة في وسط راتنجي للتصوير.
- عزل بلازما الماعز:
- إحداث التمايز العظمي ل IFP MSCs
- للحث على التمايز العظمي ، يقوم التربسين بالخلايا ، كما هو مذكور من قبل (الخطوة 2.2.). بذر الخلايا بكثافة 3 × 103 خلايا / سم2 في لوحة زراعة الأنسجة 24 بئر. أضف الوسائط للحصول على حجم نهائي قدره 500 ميكرولتر. استزرع الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪. 1 يوم بعد البذر ، استبدل وسائط التمدد ب 500 ميكرولتر وسائط تمايز عظمية.
- تحضير الوسائط العظمية عن طريق استكمال وسائط التمدد (DMEM + 10٪ FBS + 2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين ، 100 وحدة / مل بنسلين-ستربتومايسين ، و 25 ميكروغرام / مل سيبروفلوكساسين) مع 25 مللي متر D (+) - جلوكوز ، 10 نانومتر ديكساميثازون ، 10 مللي متر β جليسيروفوسفات ، 50 ميكروغرام / مل 2-فوسفو-L-ملح ثلاثي الصوديوم حمض الأسكوربيك ، و 10 نانومتر فيتامين D3.
ملاحظة: تعتبر الخلايا المستزرعة في وسط التمدد المكمل ب 25 mM D (+) من الجلوكوز عناصر تحكم غير مستحثة. - تغيير وسائط العظم كل 3 أيام لمدة 14 يوما أو 28 يوما. في نهاية 14 يوما ، قم بقياس مدى تكون العظم عن طريق تلطيخ الفوسفاتيز القلوي (ALP).
ملاحظة: لتحضير الركيزة لتلطيخ ALP ، قم بإذابة قرص واحد 5-برومو-4- كلورو-3-إندوليل فوسفات (BCIP) / نيتروبلو تيترازوليوم (NBT) في 10 مل من الماء المقطر في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. دع الجهاز اللوحي يذوب تماما. حل الركيزة جاهز للاستخدام. نظرا لأنه لا يمكن تخزين محلول الركيزة لفترة أطول ، بناء على الحاجة ، قم بتقسيم الجهاز اللوحي إلى نصفين وحله في 5 مل من الماء المقطر. لتحضير المخزن المؤقت للنفاذية ، أضف المخزن المؤقت Tris (100 mM) وكلوريد المغنيسيوم (5 mM) إلى الماء المقطر. أضف Triton X100 (0.1٪) إلى المحلول واتركه يذوب. اضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول على 9.25-9.75. - لتلطيخ ALP ، بعد 14 يوما من الحث ، قم بإزالة الوسائط وغسل الخلايا باستخدام PBS. إصلاح الخلايا باستخدام NBF (4٪) لمدة 1 دقيقة. اغسل الخلايا باستخدام PBS وتخلل باستخدام المخزن المؤقت للتحلل المحضر لمدة 2-3 دقائق.
- أضف 500 ميكرولتر من محلول الركيزة المحضر إلى الخلايا واتركه يحتضن لمدة 15 دقيقة إلى 1 ساعة ، اعتمادا على مستوى التعبير. تحقق من تطور اللون الأرجواني / الأزرق بينهما.
- إزالة محلول الركيزة ويغسل بالماء المقطر. صور الخلايا الملطخة باستخدام مجهر مقلوب.
- في نهاية 28 يوما ، قم بقياس مدى التكلس بعد تحريض العظم بواسطة تلطيخ Alizarin Red-S.
ملاحظة: لتحضير محلول تلطيخ Alizarin Red-S (40 mM) ، قم بإذابة 2 جم من Alizarin Red-S في 100 مل من الماء المقطر واضبط الرقم الهيدروجيني على 4.1-4.3 مع HCl أو NH4OH. قم بتصفية المحلول من خلال غشاء 0.22 ميكرومتر وخزنه عند 4 درجات مئوية في الظلام. الرقم الهيدروجيني للمحلول مهم ؛ ومن ثم فمن المستحسن إما لجعل حل جديد أو لإعادة قياس درجة الحموضة من الحل إذا كان عمره أكثر من 1 شهر. - لتلطيخ Alizarin Red-S ، بعد 28 يوما من الحث ، قم بإزالة الوسائط وغسل الخلايا 1x باستخدام PBS البارد. إصلاح الخلايا باستخدام 70٪ من الإيثانول لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- إزالة المثبت وغسل الخلايا 2x بالماء المقطر. قم بإزالة الماء تماما وأضف 1 مل من محلول Alizarin Red-S إلى كل بئر.
- احتضان الخلايا مع الحل لمدة 1 ساعة في RT وصورة الخلايا باستخدام المجهر المقلوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عزل IFP-MSCs من المفصل الفخذي الظنبوبي للماعز
يوضح الشكل 1 الخطوات التي ينطوي عليها عزل IFP-MSCs عن المفصل الخانق للماعز. تمت إزالة وسادة الدهون الموجودة في السطح الداخلي غير المفصلي للرضفة وفرمها وهضمها إنزيميا. تم عزل IFP-MSCs بنجاح واستزراعها في المختبر (الشكل 2 أ).
التوسع والقدرة المستنسخة من IFP-MSCs
تم استزراع الخلايا المعزولة في المختبر في وسط التوسع. بدأت الخلايا في الالتصاق بصفيحة زراعة الأنسجة في غضون 12 ساعة من البذر وكانت في الغالب مستديرة الشكل في اليوم 0. كانت ملتصقة بشكل متجانس بالصفيحة وحققت مورفولوجيا ممدودة في غضون 24 ساعة. تم الحفاظ على هذا التشكل طوال مدة الثقافة. تكاثرت الخلايا بكفاءة في المزرعة وأصبحت 80٪ -90٪ متقاربة في غضون 6 أيام من التوسع (الشكل 2 أ). بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت الخلايا المعزولة قدرة استنساخ ، تم تقييمها بواسطة مقايسة الخلايا الليفية المكونة للمستعمرة (CFU-F) (الشكل 2 ب). تشير هذه النتائج إلى أن الخلايا المعزولة لديها قدرات تكاثرية وتجديد ذاتي فعالة في المختبر.
إمكانات التمايز ل IFP-MSCs
لتوصيف ما إذا كانت الخلايا المعزولة متعددة القدرات وتمتلك سمات مميزة ل MSCs ، تم حثها على التمايز إلى سلالات متعددة. الخلايا المعزولة ، عندما يتم تحريضها نحو النسب الأديبوجيني ، أنتجت قطرات دهنية ، كما يمكن ملاحظته من صور برايتفيلد (الشكل 3 أ). تم تأكيد ذلك أيضا من خلال تلطيخ Oil Red O في اليوم 14 واليوم 21 ، مما يشير إلى قدرة هذه الخلايا على التمايز إلى خلايا دهنية. من ناحية أخرى ، لم تلاحظ أي قطرات زيت مرئية في الخلايا المستزرعة في غياب العوامل المحفزة للدهون (الشكل 3B ، C).
لتحديد الإمكانات الغضروفية للخلايا المعزولة ، تم تغليف الخلايا في هيدروجيل البلازما وسمح لها بالتمايز إلى سلالة غضروفية. كما هو موضح من الصور الإجمالية لهيدروجيل البلازما (الشكل 4 أ) ، ظهر النسيج الجديد المتشكل بعد 14 يوما في المجموعة المستحثة أبيض ولامع (على غرار الغضروف المفصلي) ، بينما في المجموعة غير المستحثة ، كان أبيض باهتا ، ولوحظ انخفاض اللمعان. بالإضافة إلى ذلك ، كانت الخلايا في المجموعة المستحثة قادرة على إفراز أحد المكونات الرئيسية لمصفوفة الغضروف (أي الجليكوزامينوجليكان الكبريتي) ، كما يتضح من التلوين النسيجي الإيجابي ل Alcian Blue (الشكل 4B) و Safranin O (الشكل 4C). في المقابل ، كانت أقسام الهيدروجيل من المجموعات غير المستحثة سلبية لتلطيخ Safranin O و Alcian Blue. تشير هذه النتائج مجتمعة إلى إمكانية التمايز الغضروفي ل MSCs في وجود محفزات غضروفية فقط.
أظهرت الخلايا المعزولة أيضا إمكانية التمايز العظمي. بعد 14 يوما و 21 يوما في الثقافة ، لم يلاحظ أي تمعدن تلقائي (مجموعة غير مستحثة). ومع ذلك ، عند تحريضه بوسائط عظمية ، كان التمعدن واضحا من خلال التلوين الإيجابي للفوسفاتيز القلوي (ALP) في نهاية 14 يوما (الشكل 5 أ). علاوة على ذلك ، بعد 28 يوما من الثقافة في الأوساط العظمية ، تم تصور الترسبات المتكلسة عن طريق تلطيخ Alizarin Red-S الإيجابي (الشكل 5 ب). توضح هذه النتائج أن الخلايا المعزولة من وسادة الدهون تحت الرضفة الماعز ، عند تحريضها ، لديها القدرة على التمايز إلى سلالات دهنية ، غضروفية ، وعظمية المنشأ.
الشكل 1: رسم تخطيطي لعزل IFP-MSC عن المفصل الخانق لركبة الماعز. الخطوة 1. جمع عينة ركبة الماعز من المسلخ والمضي قدما في تشريح في خزانة السلامة البيولوجية ؛ الخطوة 2. فحص بعناية تشريح الأنسجة وإزالة العضلات المحيطة والأنسجة الدهنية. الخطوه 3. دون إزعاج كبسولة المفصل ، قم بإزالة العضلات والأنسجة الدهنية لفضح كل من العظام الطويلة تماما (عظم الفخذ والساق) ؛ الخطوة 4. قم بعمل شق في الغشاء الزليلي وافتح المفصل المفصلي لفضح الرضفة والغضروف القوقعي ؛ الخطوة 5. إزالة الرضفة من المفصل المفصلي بعناية ، دون إزعاج وسادة الدهون تحت الرضفة (IFP) ، والاحتفاظ بها على طبق بتري يحتوي على PBS ؛ الخطوة 6. قم بإزالة وسادة الدهون بأكملها ببطء من الرضفة واحتفظ بها في طبق بتري طازج للفرم والهضم الأنزيمي. (أ. عظم الفخذ ، ب. الساق ، ج. الرضفة ، د. غضروف Trochlear ، ه. وسادة الدهون تحت الرضفة). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: التشكل والإمكانات المستنسخة ل IFP-MSCs . (أ) تم التقاط الصور المجهرية عند المقطع 3 باستخدام مجهر برايت فيلد مقلوب عند تكبير 10x. مباشرة بعد البذر (اليوم 0) ، ظلت الخلايا مستديرة الشكل ، في اليوم 3 حققت معظم الخلايا مورفولوجيا ممدودة ، وفي اليوم 6 أصبحت IFP-MSCs 80٪ -90٪ متقاربة (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). (ب) صور تمثيلية (ن = 3) لمستعمرات CFU-F ملطخة بصبغة بنفسجية بلورية بعد 12 يوما من البذر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: التمايز الأديبوجيني ل IFP-MSCs. تشير اللوحة العلوية إلى الصور المجهرية ل IFP-MSCs غير المستحثة ، وتمثل اللوحة السفلية IFP-MSCs المستحثة في السلالة الأديبوجينية. (أ) صور حقل ساطع تمثيلية توضح تكوين فجوات دهنية أثناء تكوين الدهون (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). صور تمثيلية لتلطيخ الزيت الأحمر O لقطرات الدهون في (B) اليوم 14 و (C) اليوم 21 من التمايز (شريط المقياس = 20 ميكرومتر). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: التمايز الغضروفي ل IFP-MSCs. تشير اللوحة العلوية إلى تركيبات / أقسام هيدروجيل من هيدروجيل غير مستحث ، وتمثل اللوحة السفلية هيدروجيل معرض لتكوين الغضروف. (أ) الصور الإجمالية لتركيبات هيدروجيل البلازما بعد 14 يوما في الثقافة في غياب (غير مستحث) أو وجود (مستحث) للوسائط الغضروفية المكملة ب TGF-β1. صور تمثيلية لأقسام 10 ميكرومتر من هيدروجيل ملطخة بصبغة ربط sGAG (B) Alcian Blue (أزرق) و (C) Safranin O (أحمر) (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: التمايز العظمي ل IFP-MSCs. تشير اللوحة العلوية إلى الخلايا غير المستحثة ، وتشير اللوحة السفلية إلى الخلايا المستحثة بالوسائط العظمية. الصور المجهرية والصور التمثيلية ل IFP-MSCs الملطخة ب (A) BCIP-NBT (الفوسفاتيز القلوي) بعد 14 يوما و (B) Alizarin Red-S (ترسب الكالسيوم) بعد 28 يوما من التمايز (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في البروتوكول الحالي ، تم توفير طريقة بسيطة وموثوقة وقابلة للتكرار لعزل MSCs من IFP الماعز. تم استخدام الخلايا المعزولة باستخدام هذه الطريقة بنجاح في دراساتنا السابقة لتجديد الأنسجة في المختبر. لوحظ أن الخلايا المعزولة كانت تكاثرية ، وكانت تستجيب لعوامل النمو المختلفة ، واحتفظت بنشاطها البيولوجي عند زرعها على ألياف وسقالات كهربائية25,26. علاوة على ذلك ، لوحظ أنه يمكن الحصول على عدد كبير من MSCs عالية الجودة وزراعتها مع الخلايا الغضروفية في الهلاميات المائية القابلة للحقن لهندسة الغضروف المفصلي في المختبر27،28،29. في حين أن إجراء تشريح الخلايا وعزلها بسيط ، إلا أن هناك بعض الخطوات التي يجب اتباعها بعناية من أجل عزل وتوسيع MSCs بنجاح من IFP. أولا ، نظرا لأنه لا يمكن الحفاظ على ظروف معقمة حقا أثناء إحضار العينة من المسلخ ، ينصح بمسح الأنسجة الخارجية بنسبة 70٪ من الإيثانول لتعقيم الأنسجة قبل البدء في إجراء العزل. الخطوة المهمة التالية هي تشريح وسادة الدهون من مفصل الركبة. يقع IFP أسفل الرضفة في مفصل الركبة. يتم إرفاق الطرف القريب من IFP بالنهاية البعيدة للرضفة30,31. وبالتالي ، يصبح من المهم جدا تحديد الموقع الصحيح للرضفة أثناء إجراء عملية العزل. بعد ذلك ، نظرا لأن IFP يتمفصل مع غضروف trochlear في عظم الفخذ ومغطى بغشاء الغشاء الزليلي30,31 ، فإن إجراء شق في الغشاء الزليلي ضروري لقطع مفصل الركبة. من الضروري أيضا مراقبة الصحة العامة لوسادة الدهون تحت الرضفة المجمعة. نظرا لأن IFP يتكون من الخلايا الشحمية (الخلايا) والنسيج الضام الدهني ، مثل الكولاجين والجليكوزامينوجليكان ، يتم فرم الأنسجة وهضمها باستخدام إنزيم كولاجيناز لإطلاق الخلايا 9,32. يتم فصل الخلايا الشحمية العائمة عن طريق الطرد المركزي بسرعة بطيئة للحصول على ثقافة متجانسة من MSCs. يجب إزالة الخلايا الشحمية المتبقية في جزء الأوعية الدموية اللحمية من لوحة زراعة الأنسجة عند كل تغيير في الوسائط عن طريق غسل الطبقة الأحادية للخلية باستخدام PBS قبل إضافة وسائط جديدة. يجب أن تستمر هذه الخطوة حتى تتم إزالة جميع الخلايا الشحمية المرئية. يقترح إعادة زرع الخلايا في صفيحة جديدة بعد أن تصل خلايا P0 إلى نقطة التقاء للتخلص من الخلايا الشحمية المتبقية ، والتي ربما تكون قد التصقت بجدار اللوحة ويصعب إزالتها. أخيرا ، نظرا لأن عينات الماعز يتم الحصول عليها في الغالب من المسلخ ، فمن الصعب تتبع العمر الدقيق للماعز ، وبالتالي ، أثناء عزل الخلايا ، يجب ملاحظة الاختلاف بين العينات وتوثيقه بعناية. يقترح توصيف الخلايا للتجديد الذاتي (CFU-F) ، والانتشار ، وإمكانية التمايز بعد كل عزل قبل استخدامها في مختلف التطبيقات والدراسات الميكانيكية. نظرا لمتطلبات وجود عدد كبير من الخلايا في تطبيقات هندسة الأنسجة القائمة على الخلايا ، فإن ظروف الثقافة التي تسهل الانتشار وتؤخر الشيخوخة وتحافظ على جذعية الخلايا تصبح ذات أهمية مركزية. لوحظ أن MSCs المستزرعة في ملح ثلاثي الصوديوم 2-Phospho-L-ascorbic acid (PAA) وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) أظهرت زيادة ~ 42 ضعفا في أعدادها مقارنة ب MSCs المستزرعة في bFGF وحدها. بالإضافة إلى ذلك ، أدت المعالجة المشتركة ل PAA و bFGF إلى تقليل إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (بسبب خصائصها المضادة للأكسدة) والشيخوخة في الخلايا الجذعية. لذلك ، فإن استخدام PAA أثناء التوسع في المختبر ل MSCs أمر مرغوب فيه33.
في حين أن الهضم الأنزيمي للأنسجة يستخدم عالميا وهو طريقة فعالة لعزل MSCs ، فإن استخدام الإنزيمات مثل الكولاجيناز يستغرق وقتا طويلا ومكلفا34. في الدراسة الحالية ، استغرق الهضم الكامل للأنسجة باستخدام كولاجيناز 12-16 ساعة (بين عشية وضحاها) ، مما قد يؤدي إلى انخفاض قابلية البقاء أو تغيير النمط الظاهري السطحي للخلايا35. وبالتالي ، يمكن تحسين الطريقة لتقليل مدة علاج كولاجيناز لهضم الأنسجة. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا استكشاف طريقة زراعة النباتات الخالية من الإنزيم والتي تستخدم لعزل MSCs المشتقة من الدهون من الشفط الشحمي أو منصات الدهون الأربية لعزل IFP-MSCs34،36،37.
تمتلك IFP-MSCs ، نظرا لقدرتها على التمايز إلى سلالات غضروفية ، ودهنية ، وعظمية المنشأ ، إمكانات علاجية واسعة. أظهرت التقارير السابقة أن IFP-MSCs تظهر إمكانات غضروفية أفضل من الخلايا الجذعية الأخرى6،7،9،10. ومن ثم ، اكتسبت IFP-MSCs اهتماما وتعتبر مرشحا أفضل للعلاج القائم على الخلايا لإصلاح عيوب الغضروف والتخفيف من تدهور الغضروف في هشاشة العظام. في دراسة ما قبل السريرية ، أدى التسليم المشترك ل IFP-MSCs مع مكونات مصفوفة الغضروف خارج الخلية من خلال الحقن داخل المفصل إلى تعزيز تجديد الغضروف في عيوب العظم الغضروفي38. وبالمثل ، أدى الحقن داخل المفصل ل IFP-MSCs في نموذج هشاشة العظام في الأرانب (OA) إلى انخفاض في معلمات المرض التالية: تدهور الغضروف ، وتشكيل هشاشة العظام ، وسماكة العظام تحت الغضروف ، والتهاب الغشاء المفصلي39. علاوة على ذلك ، أظهرت نتائج تجربة سريرية عشوائية تم الإبلاغ عنها سابقا13 وتجربة سريرية مفتوحة المستوى 140 نشرت مؤخرا أن الحقن داخل المفصل ل IFP-MSCs في المرضى الذين يعانون من هشاشة العظام في الركبة آمنة وتؤدي إلى تقليل الألم وتحسين وظيفة المفاصل ، مما يشير إلى إمكاناتها العلاجية الواعدة في تحسين المضاعفات المرتبطة بهشاشة العظام في الركبة. كما ثبت أن IFP-MSCs تطور خصائص مناعية معززة في وجود إشارات التهابية من خلال تسهيل تدهور منظم التهابي ، المادة P (SP) ، مما يؤدي إلى انخفاض في الجزيئات الالتهابية والهدمية ، ونتيجة لذلك ، تحسين علاج التهاب وتليف الغشاء الزليلي و IFP6 . والأهم من ذلك ، أظهرت IFP-MSCs التي تمت معالجتها في ظروف متوافقة مع اللوائح التنظيمية انتشارا أفضل ، وقدرة تمايز ، وخصائص مناعية أفضل مقارنة بظروف الثقافة القياسية في المختبر ، مما يدل على إمكاناتها للنجاح السريري عند استخدامها للعلاج القائم على الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC)41.
في الختام ، يصف البروتوكول الحالي عزل الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من ضمادة الدهون تحت الرضفة (IFP) من مفصل خنق الماعز عن طريق الهضم الأنزيمي والحفاظ عليها في الثقافة. تتمتع الخلايا المعزولة بإمكانية التكاثر والتجديد الذاتي ويمكن أن تتمايز إلى سلالات دهنية وعظمية وغضروفية. تعد IFP-MSCs مصدرا واعدا ل MSCs ولديها إمكانات متعدية لتطبيقات الطب التجديدي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تقر SH بالدعم المقدم من زمالة معهد ما بعد الدكتوراه في IIT Kanpur ومنحة SYST من DST (قسم SEED) (SP / YO / 618/2018). تعترف AM بالمعهد الهندي للتكنولوجيا - كانبور (IIT-Kanpur) للحصول على زمالة المعهد. تعترف DSK بأستاذ كرسي Gireesh Jankinath وقسم التكنولوجيا الحيوية ، الهند ، للتمويل (BT / PR22445 / MED / 32/571/2016). تشكر AM و SH و DSK مركز عائلة ميهتا للهندسة في الطب في IIT-Kanpur على دعمهم السخي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422-10G | 10 mM |
| 0.25% Trypsin- 0.02% EDTA | Hi-Media | TCL049 | |
| 15-mL centrifuge tube | Corning | ||
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | 50 µg/mL |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | HiMedia | TCL021-50ml | 10 mM |
| 50-mL centrifuge tube | Corning | ||
| Alcian Blue | Hi-Media | RM471 | For sufated gycosaminoglycans staining |
| Alizarin Red S | S D Fine-Chem Limited | 26048-25G | For calcium deposition |
| Amphotericin B | HiMedia | A011 | 2.5 µg/mL |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Sino Biologicals | 10014-HNAE | 5 ng/mL |
| BCIP/NBT ALP Substrate | Sigma | B5655-5TAB | For ALP staining |
| Biological safety cabinet | |||
| BSA | HiMedia | MB-083 | Long name: Bovine Serum Albumin (1.25 mg/mL ) |
| Cell strainer | HiMedia | TCP-182 | 70 µm |
| Centrifuge | REMI | ||
| Ciprofloxacin | RANBAXY LAB. Limited | B17407T1 | 2.5 µg/mL |
| Crystal Violet | S D Fine-Chem Limited | 42555 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.94925.0521 | 25 mM |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 µM |
| DMEM LG | SIGMA | D5523 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagle’s Media Low Glucose |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FBS | Gibco | 10270 | Long name: Fetal Bovine Serum |
| Formaldehyde solution 37%-41% | Merck | 61780805001730 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 µM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | 10 µg/mL |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse TS 100 | ||
| ITS + 1 | Sigma-Aldrich | I2521-5mL | Long name: insulin, transferrin, sodium selenite + linoleic-BSA |
| L-Proline | HiMedia | TO-109-25G | 1 mM |
| Magnesium chloride | Merck | 61751605001730 | For lysis buffer |
| Methanol | Meck | 1.07018.2521 | |
| Micropipettes and sterile tips (20 µL, 200 µL, 1000 µL) | Thermoscientific | ||
| MUSE Cell analyser | Merck Millipore | For cell counting | |
| OCT compound | Tissue-Tek | 4583 | Long name: Optimal Cutting Temperature |
| Oil Red O dye | S D Fine-Chem Limited | 54304 | For lipid vacuole staining |
| Penicillin-Streptomycin | HiMedia | A007 | 100 U/mL |
| Petri dishes (150 mm and 90 mm) | NEST | ||
| Safranin O | S D Fine-Chem Limited | 50240 | For sufated gycosaminoglycans staining |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C3434 | 3.4 % (w/v) |
| Sterile scissors, forceps and scalpels | For isolation of IFP-MSC | ||
| Sucrose | Merck | 1.94953.0521 | 35 % (w/v) |
| TGF-β1 | Sino Biologicals | Long name: Transforming growth factor- β1 (10 ng/mL) | |
| Tissue culture incubator 37 °C, 5% CO2 | Thermoscientific | ||
| Tris buffer | Merck | 61771405001730 | For lysis buffer |
| Triton X100 | S D Fine-Chem Limited | 40632 | For lysis buffer |
| Type II collagenase | Gibco | 17101015 | 1.5 mg/mL |
| Vitamin D3 | Sigma | C9756-1G | 10 nM |
| Well plates (6 -WP and 24-WP) | NEST |
References
- Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
- Pittenger, M. F., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. NPJ Regenerative Medicine. 4 (1), 22 (2019).
- Guo, Y., Yu, Y., Hu, S., Chen, Y., Shen, Z. The therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cardiovascular diseases. Cell Death & Disease. 11 (5), 349 (2020).
- Ge, Z., Goh, J. C. H., Lee, E. H. Selection of cell source for ligament tissue engineering. Cell Transplantation. 14 (8), 573-583 (2005).
- Harvanová, D., Tóthová, T., Sarissky, M., Amrichová, J., Rosocha, J. Isolation and characterization of synovial mesenchymal stem cells. Folia Biologica. 57 (3), 119-124 (2011).
- Kouroupis, D., et al. Infrapatellar fat pad-derived MSC response to inflammation and fibrosis induces an immunomodulatory phenotype involving CD10-mediated Substance P degradation. Scientific Reports. 9 (1), 10864 (2019).
- Lopa, S., et al. Donor-matched mesenchymal stem cells from knee infrapatellar and subcutaneous adipose tissue of osteoarthritic donors display differential chondrogenic and osteogenic commitment. European Cells & Materials. 27, 298-311 (2014).
- Garcia, J., et al. Characterisation of synovial fluid and infrapatellar fat pad derived mesenchymal stromal cells: The influence of tissue source and inflammatory stimulus. Scientific Reports. 6 (1), 24295 (2016).
- Tangchitphisut, P., et al. Infrapatellar fat pad: an alternative source of adipose-derived mesenchymal stem cells. Arthritis. 2016, 4019873 (2016).
- Ding, D. -C., et al. Human infrapatellar fat pad-derived stromal cells have more potent differentiation capacity than other mesenchymal cells and can be enhanced by hyaluronan. Cell Transplantation. 24 (7), 1221-1232 (2015).
- Khan, W., Adesida, A., Tew, S., Andrew, J., Hardingham, T. The epitope characterisation and the osteogenic differentiation potential of human fat pad-derived stem cells is maintained with ageing in later life. Injury. 40 (2), 150-157 (2009).
- Koh, Y. G., et al. Mesenchymal stem cell injections improve symptoms of knee osteoarthritis. Arthroscopy. 29 (4), 748-755 (2013).
- Koh, Y. G., Choi, Y. J. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cell therapy for knee osteoarthritis. Knee. 19 (6), 902-907 (2012).
- Kouroupis, D., Willman, M. A., Best, T. M., Kaplan, L. D., Correa, D. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cell-based spheroids enhance their therapeutic efficacy to reverse synovitis and fat pad fibrosis. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 44 (2021).
- Stocco, E., et al. Infrapatellar fat pad stem cells responsiveness to microenvironment in osteoarthritis: from morphology to function. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 323 (2019).
- Hindle, P., Khan, N., Biant, L., Péault, B. The infrapatellar fat pad as a source of perivascular stem cells with increased chondrogenic potential for regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 77-87 (2017).
- Stolzing, A., Jones, E., McGonagle, D., Scutt, A. Age-related changes in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: consequences for cell therapies. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (3), 163-173 (2008).
- Wu, C. L., Diekman, B. O., Jain, D., Guilak, F. Diet-induced obesity alters the differentiation potential of stem cells isolated from bone marrow, adipose tissue and infrapatellar fat pad: the effects of free fatty acids. International Journal of Obesity (2005). 37 (8), 1079-1087 (2013).
- Barboza, E., et al. Profibrotic infrapatellar fat pad remodeling without M1 macrophage polarization precedes knee osteoarthritis in mice with diet-induced obesity. Arthritis & Rheumatology. 69 (6), 1221-1232 (2017).
- Allen, M. J., Hankenson, K. D., Goodrich, L., Boivin, G. P., von Rechenberg, B. Ethical use of animal models in musculoskeletal research. Journal of Orthopaedic Research. 35 (4), 740-751 (2017).
- Moran, C. J., et al. The benefits and limitations of animal models for translational research in cartilage repair. Journal of Experimental Orthopaedics. 3 (1), (2016).
- Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: classification, update, and measurement of outcomes. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11 (1), 19 (2016).
- Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering Part B: Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
- Proffen, B. L., McElfresh, M., Fleming, B. C., Murray, M. M. A comparative anatomical study of the human knee and six animal species. The Knee. 19 (4), 493-499 (2012).
- Bhutada, S. S., Sriram, M., Katti, D. S. Sulfated carboxymethylcellulose conjugated electrospun fibers as a growth factor presenting system for tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 268, 118256 (2021).
- Waghmare, N. A., Arora, A., Bhattacharjee, A., Katti, D. S. Sulfated polysaccharide mediated TGF-β1 presentation in pre-formed injectable scaffolds for cartilage tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 193, 62-72 (2018).
- Arora, A., Mahajan, A., Katti, D. S. TGF-β1 presenting enzymatically cross-linked injectable hydrogels for improved chondrogenesis. Colloids & Surfaces B: Biointerfaces. 159, 838-848 (2017).
- Arora, A., Sriram, M., Kothari, A., Katti, D. S. Co-culture of infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stromal cells and articular chondrocytes in plasma clot for cartilage tissue engineering. Cytotherapy. 19 (7), 881-894 (2017).
- Mahajan, A., Singh, A., Datta, D., Katti, D. S. Bioinspired injectable hydrogels dynamically stiffen and contract to promote mechanosensing-mediated chondrogenic commitment of stem cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 14 (6), 7531-7550 (2022).
- Nakano, T., Wang, Y. W., Ozimek, L., Sim, J. S. Chemical composition of the infrapatellar fat pad of swine. Journal of Anatomy. 204 (4), 301-306 (2004).
- Sun, Y., Chen, S., Pei, M. Comparative advantages of infrapatellar fat pad: an emerging stem cell source for regenerative medicine. Rheumatology. 57 (12), 2072-2086 (2018).
- Han, W., et al. Infrapatellar fat pad in the knee: is local fat good or bad for knee osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. 16 (4), 1-8 (2014).
- Bae, S. H., et al. L-ascorbic acid 2-phosphate and fibroblast growth factor-2 treatment maintains differentiation potential in bone marrow-derived mesenchymal stem cells through expression of hepatocyte growth factor. Growth Factors. 33 (2), 71-78 (2015).
- Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Jing, W., et al. Explant culture: an efficient method to isolate adipose-derived stromal cells for tissue engineering. Artificial Organs. 35 (2), 105-112 (2011).
- Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
- Toghraie, F., et al. Treatment of osteoarthritis with infrapatellar fat pad derived mesenchymal stem cells in Rabbit. The Knee. 18 (2), 71-75 (2011).
- Chen, H. -H., et al. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stromal cell product for treatment of knee osteoarthritis: a first-in-human study with evaluation of the potency marker. Cytotherapy. 24 (1), 72-85 (2022).
- Kouroupis, D., Bowles, A. C., Best, T. M., Kaplan, L. D., Correa, D. CD10/Neprilysin enrichment in infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cells under regulatory-compliant conditions: implications for efficient synovitis and fat pad fibrosis reversal. The American Journal of Sports Medicine. 48 (8), 2013 (2020).
