Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

العلاج التوافقي المضاد للفيروسات القهقرية عن طريق الفم في الفئران المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/63696
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Hematology and Oncology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة جديدة لتوصيل الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية عن طريق الفم التي نجحت في قمع تكرار الحمض النووي الريبي لفيروس نقص المناعة البشرية -1 في الفئران المتوافقة مع البشر.

Abstract

تستمر جائحة فيروس نقص المناعة البشرية (HIV-1) في الانتشار بلا هوادة في جميع أنحاء العالم ، ولا يوجد حاليا لقاح متاح ضد فيروس نقص المناعة البشرية. على الرغم من أن العلاج التوليفي المضاد للفيروسات القهقرية (cART) قد نجح في قمع تكاثر الفيروس ، إلا أنه لا يمكن القضاء تماما على المستودع من الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية. ستتطلب استراتيجية العلاج الآمنة والفعالة لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية طرقا متعددة الجوانب ، وبالتالي فإن التقدم في النماذج الحيوانية لعدوى فيروس العوز المناعي البشري -1 أمر محوري لتطوير أبحاث علاج فيروس نقص المناعة البشرية. تلخص الفئران المتوافقة مع البشر السمات الرئيسية لعدوى فيروس العوز المناعي البشري -1. يمكن أن يصاب نموذج الفأر المتوافق مع البشر بفيروس نقص المناعة البشرية -1 ويمكن التحكم في تكاثر الفيروس باستخدام أنظمة cART. علاوة على ذلك ، يؤدي انقطاع cART إلى انتعاش فيروسي سريع في الفئران المتوافقة مع البشر. ومع ذلك ، يمكن أن يكون إعطاء cART للحيوان غير فعال أو صعب أو سام ، والعديد من أنظمة cART ذات الصلة سريريا لا يمكن استخدامها على النحو الأمثل. إلى جانب كونها غير آمنة للباحثين ، فإن إعطاء cART عن طريق إجراء حقن يومي مكثف شائع الاستخدام يؤدي إلى الإجهاد عن طريق التقييد البدني للحيوان. أدت طريقة cART الفموية الجديدة لعلاج الفئران البشرية المصابة بفيروس العوز المناعي البشري -1 الموصوفة في هذه المقالة إلى قمع viremia دون مستوى الكشف ، وزيادة معدل استعادة CD4 + ، وتحسين الصحة العامة في الفئران المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1.

Introduction

تحسن العمر المتوقع للأفراد المصابين بفيروس العوز المناعي البشري المزمن (HIV) تحسنا كبيرا مع العلاج التوليفي المضاد للفيروسات القهقرية (cART)1,2. نجح cART في تقليل تكاثر فيروس العوز المناعي البشري -1 وزيادة عدد الخلايا التائية CD4 + إلى وضعها الطبيعي في غالبية المشاركين المصابين بفيروس العوز المناعي البشري -1 المصابين بعدوى مزمنة3 ، مما يؤدي إلى تحسين الصحة العامة وتقليل تطور المرضبشكل كبير 4. ومع ذلك، يتم إنشاء المستودع الكامن لفيروس العوز المناعي البشري-1 حتى عندما يبدأ العلاج المضاد للفيروسات القهقرية أثناء العدوى الحادة 5,6,7. تستمر الخزانات على مدى سنوات خلال العلاج المضاد للفيروسات القهقرية والانتعاش الفيروسي السريع بعد انقطاع العلاج المضاد للفيروسات القهقريةموثق جيدا 8,9. الأشخاص المصابون بفيروس نقص المناعة البشرية على العلاج المضاد للفيروسات القهقرية معرضون أيضا لخطر أكبر للإصابة بأمراض مصاحبة مثل أمراض القلب والأوعية الدموية والسرطان والاضطرابات العصبية10،11،12. لذلك ، هناك حاجة إلى علاج وظيفي لفيروس نقص المناعة البشرية. تقدم النماذج الحيوانية لعدوى HIV-1 مزايا واضحة في تطوير والتحقق من صحة استراتيجيات علاج فيروس نقص المناعة البشرية الجديدة13،14،15. يمكن للفئران المتوافقة مع البشر ، كنموذج حيواني صغير ، أن توفر إعادة تكوين الخلايا المناعية البشرية متعددة السلالات في الأنسجة المختلفة ، مما يسمح بالدراسة الدقيقة لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية16،17،18،19. من بين النماذج المتوافقة مع البشر ، نجح نموذج نخاع العظم والكبد والغدة الصعترية (BLT) في تلخيص عدوى فيروس العوز المناعي البشري -1 المزمنة بالإضافة إلى الاستجابات المناعية البشرية الوظيفية لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية -120،21،22،23،24. لذلك ، تم استخدام نموذج الماوس BLT المتوافق مع البشر على نطاق واسع للتحقيق في جوانب مختلفة في مجال أبحاث فيروس نقص المناعة البشرية. فئران BLT المتوافقة مع البشر ليست فقط نماذج راسخة لتلخيص عدوى HIV-1 المستمرة والتسبب في المرض ، ولكنها أيضا أدوات تبعية لتقييم استراتيجيات التدخل القائمة على العلاج الخلوي. أظهر المؤلفون الحاليون وغيرهم أن نموذج الفئران BLT المتوافق مع البشر يلخص عدوى فيروس العوز المناعي البشري -1 المستمرة والتسببفي 25،26،27 ويوفر أدوات لتقييم استراتيجيات التدخل القائمة على العلاج الخلوي 28،29،30،31،32،33.

تعمل أنظمة cART المكونة من مجموعات من الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية التي يتم تناولها يوميا على قمع تكاثر فيروس العوز المناعي البشري -1 لدرجة أن الحمل الفيروسي في الأفراد الذين عولجوا بنجاح لا يزال غير قابل للكشف على المدى الطويل34. تشبه نتائج علاج الفئران المصابة بفيروس العوز المناعي البشري المصابة بفيروس العوز المناعي البشري بنظم cART ذات الصلة سريريا تلك التي لوحظت في الأفراد المصابين بفيروس العوز المناعي البشري -1 الذين عولجوا بمضادات الفيروسات القهقرية22: يتم قمع مستويات فيروس العوز المناعي البشري -1 دون حدود الكشف وانقطاع نتائج cART في انتعاش تكاثر فيروس العوز المناعي البشري من الخزان الكامن35. الحقن تحت الجلد (SC) 27،36،37 أو داخل الصفاق (IP) 37،38،39 هو الطريق الذي يشيع استخدامه لعلاج cART في الفئران المتوافقة مع البشر. ومع ذلك ، فإن الحقن اليومي المكثف يؤدي إلى إجهاد الحيوانات عن طريق ضبط النفس البدني40. كما أنها كثيفة العمالة ويحتمل أن تكون غير آمنة للباحثين بسبب زيادة التعرض لفيروس نقص المناعة البشرية أثناء استخدام الأدوات الحادة. يعتبر الإعطاء عن طريق الفم مثاليا لتقليد امتصاص وتوزيع وإفراز أدوية cART التي يتناولها الأفراد المصابون بفيروس نقص المناعة البشرية -1. عادة ما يتضمن الإعطاء عن طريق الفم إجراءات مخصصة وغالبا ما تكون شاقة لوضع الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية في طعام معقم (ضروري بسبب نقص المناعة لدى الفئران)24،37،41 أو الماء42،43،44،45،46 ، والتي قد تكون أو لا تكون متوافقة كيميائيا مع العديد من الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية ، أو تؤدي إلى شيء لا تأكله الفئران أو تشربه بسهولة (مما قد يؤثر على مستويات الجرعة والدواء في الجسم). وتتجاوز الطريقة الجديدة لإدارة العلاج المضاد للفيروسات القهقرية المقترحة هنا محاولات التسليم السابقة بسبب توافقها مع أنواع مختلفة من الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية، والسلامة وسهولة التحضير والإدارة، والحد من إجهاد الحيوانات والقلق الناتج عن الحقن اليومي.

تينوفوفير ديسوبروكسيل فومارات (TDF) ، إلفيتيغرافير (ELV) ، ورالتيغرافير (RAL) هي أدوية ضعيفة الذوبان في الماء. ومن المثير للاهتمام ، لوحظ زيادة التوافر البيولوجي ل TDF مع الأطعمة الدهنية ، مما يشير إلى أن التثبيط التنافسي للليباز بواسطة الأطعمة الدهنية قد يوفر حماية معينة ل TDF47. لذلك ، تم اختيار أكواب DietGel Boost لتحل محل طعام القوارض العادي كطريقة للتسليم بناء على محتواها المتواضع من الدهون (20.3 جم لكل 100 جم) مقارنة بطعام القوارض العادي (10 جم لكل 100 جم) والنظام الغذائي النموذجي عالي الدهون للفأر (40-60 جم لكل 100 جم)48. الوزن الإجمالي لكوب واحد هو 75 غرام ؛ وبالتالي ، سيحتوي كل كوب على كمية الطعام ، وبالتالي الدواء ، بما يكفي لخمسة فئران على مدار 3 أيام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول على أنسجة الجنين البشري مجهولة المصدر تجاريا. تم إجراء البحوث على الحيوانات وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل جامعة كاليفورنيا ، لوس أنجلوس ، ولجنة أبحاث الحيوان (UCLA) (ARC) وفقا لجميع الإرشادات الفيدرالية والولائية والمحلية. على وجه التحديد ، تم إجراء جميع التجارب وفقا للتوصيات والمبادئ التوجيهية لإسكان ورعاية المختبر التابعة للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) وجمعية تقييم واعتماد رعاية المختبر (AALAC) الدولية بموجب بروتوكول UCLA ARC رقم 2010-038-02B. تم إجراء جميع العمليات الجراحية تحت الكيتامين (100 مجم / كجم) / زيلازين (5 مجم / كجم) وتخدير الأيزوفلوران (2-3 مجلد) وتم بذل كل الجهود لتقليل آلام الحيوانات وعدم الراحة.

1. الفئران المتوافقة مع البشر المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1

ملاحظة: تم بناء الفئران المتوافقة مع البشر كما هو موضح سابقا في30،31،49. يتم وصف البروتوكول بإيجاز أدناه.

  1. تنقية الخلايا السلفية المكونة للدم CD34 + من كبد الجنين البشري عن طريق الميكروبيدات المضادة ل CD34 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  2. تخدير الفئران الذكور والإناث البالغة من العمر 6-8 أسابيع NOD / SCID / IL2Rγ− / - (NSG) وتشعيع شبه مميت (2.7 غراي) قبل الجراحة.
  3. زرع الغدة الصعترية ، المشتقة من نفس المتبرع مثل كبد الجنين ، تحت كبسولة الكلى جنبا إلى جنب مع الكبد.
  4. بعد الزرع ، حقن الفئران ب 0.5 مليون إلى مليون خلية CD34 + ، عن طريق الوريد.
  5. بعد 8-10 أسابيع ، اجمع 100 ميكرولتر من دم الفأر عن طريق النزفالمداري الخلفي 50 في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على 5 ميكرولتر من EDTA وأجهزة الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 3 دقائق.
  6. قم بتخزين البلازما عند -80 درجة مئوية لمراقبة الحمل الفيروسي بعد إصابة الفأر بفيروس نقص المناعة البشرية -1. أضف 2 مل من محلول NH4C بنسبة 83٪ واحتضانه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتحليل خلايا الدم الحمراء.
  7. أضف 10 مل من RPMI مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) لوقف التحلل. تدور في 300 × غرام لمدة 5 دقائق.
  8. نضح طاف . صبغ الخلايا بلوحة الأجسام المضادة (انظر جدول المواد) وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي للتحقق من تطعيم الخلايا المناعية البشرية.
  9. تصيب الفئران التي تظهر أكثر من 50٪ من خلايا CD45 + المنتشرة عن طريق حقن الوريد خلف الحجاج51,52 مع ما لا يقل عن 200 نانوغرام من p24 من سلالة HIV-1 (أي NFNSXSL9 30,53,54) باستخدام حقنة الأنسولين. جمع الدم كل أسبوعين لتحليل قياس التدفق الخلوي وقياس الحمل الفيروسي.

2. إعداد عقاقير العلاج المضاد للفيروسات القهقرية

  1. وزن الأدوية الفردية. على سبيل المثال ، لصنع 10 أكواب طعام باستخدام cART ، استخدم كاشطات الخلايا المعقمة لوزن 250 مجم من FTC (Emtricitabine) ، و 375 مجم من TDF ، و 500 مجم من RAL أو ELV في أنابيب طرد مركزي معقمة فردية سعة 15 مل في خزانة السلامة البيولوجية.
  2. أضف 1 مل من DMSO إلى أنبوب FTC 250 مجم (التركيز النهائي 250 مجم / مل) ، أضف 1.5 مل من DMSO إلى أنبوب TDF 375 مجم (التركيز النهائي 250 مجم / مل) ، وأضف 1 مل من DMSO إلى أنبوب RAL أو ELV 500 مجم (التركيز النهائي 500 مجم / مل). حرك أو ماصة خليط الدواء حتى يذوب تماما ويتم الحصول على محلول واضح.
  3. استخدم مرشح غشاء PVDF محب للماء بحجم 0.22 ميكرومتر لتعقيم المحاليل باستخدام حقنة معقمة. يمكن تخزين المحاليل الدوائية الفردية في -20 درجة مئوية لمدة 12 أسبوعا.
  4. عندما تكون جاهزا للاستخدام، قم بإذابة حصة واحدة من كل محلول دوائي عند 37 درجة مئوية حتى يصبح المحلول صافيا. تخلط جيدا باستخدام ماصة.
  5. الجمع بين الأدوية وتخلط جيدا لتكوين مزيج رئيسي: 1 مل من FTC في DMSO ، 1.5 مل من TDF في DMSO ، و 1 مل من ELV أو RAL في DMSO.
    ملاحظة: هذا المبلغ سوف يصنع 10 أكواب طعام.
  6. أضف 350 ميكرولتر من محلول cART Master mix في كوب واحد لصنع كوب DietGel Boost cART واحد.
  7. أضف 0.75 مل من تريميثوبريم-سلفاميثوكسازول (0.48 ملغ/مل تركيز نهائي) إلى الكوب.
  8. يقلب جيدا باستخدام أطراف ماصة معقمة سعة 1 مل.
  9. قم بتوزيع كوب الطعام الذي يحتوي على cART من الكوب الأصلي باستخدام ملعقة صغيرة على طبق بتري 60 مم حسب الحاجة. قم بوزن الطعام على ميزان لحساب كمية كوب الطعام الذي يحتوي على cART لكل قفص وفقا لعدد الفئران.

3. إعطاء أدوية العلاج المضاد للفيروسات القهقرية للفئران المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1

  1. قم بإزالة تشاو العادي من القفص واستبدله بكوب طعام يحتوي على cART.
    ملاحظة: في المتوسط ، سوف يأكل الفأر ما يصل إلى 5 غرام من الطعام يوميا. يمكن إعطاء كوب طعام واحد تقريبا لخمسة فئران لمدة 2 أيام.
  2. قم بتحديث طعام cART ثلاث مرات في الأسبوع.
  3. وزن الأكواب المستخدمة لمراقبة المدخول. وزن الفئران أسبوعيا لتأكيد الاستهلاك.

4. مراقبة الحمل الفيروسي عن طريق PCR في الوقت الحقيقي

  1. تقييم الخلايا المناعية البشرية (مستويات الخلايا التائية CD4 و CD8) وتكرار HIV-1 في الفئران BLT كل أسبوعين عن طريق النزيف خلف المدار. حصاد البلازما باتباع التعليمات الواردة في الخطوات 1.5-1.8.
  2. مراقبة الأحمال الفيروسية في البلازما للفئران المصابة بفيروس العوز المناعي البشري -1 قبل وأثناء إعطاء العلاج المضاد للفيروسات القهقرية عن طريق الفم لمدة 8 أسابيع. استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي في البلازما من البلازما باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي وتحديده عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي باستخدام البادئات والمجسات (انظر جدول المواد) كما هو موضح سابقا27،30،31. استخدم بروتوكول ركوب الدراجات التالي: 48 درجة مئوية (15 دقيقة) ، 95 درجة مئوية (10 دقائق) ، ثم ركوب الدراجات 95 درجة مئوية (15 ثانية) ، 60 درجة مئوية (1 دقيقة) لمدة 45 دورة.

5. تقييم نسب CD4 / CD8 عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. تحضير معلقات أحادية الخلية من الدم المحيطي للنزيف كل أسبوعين باتباع الخطوات 1.5-1.8.
  2. صبغ الخلايا بعلامات سطحية وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. استخدم الأجسام المضادة التالية لعلامة السطح 27،30،43،49 في قياس التدفق الخلوي: CD45 (استنساخ HI30) ، CD8 (استنساخ SK1) ، CD3 (استنساخ OKT3) ، CD4 (استنساخ RPA-T4)27،30،42،49.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بافتراض أن الفأر الذي يبلغ متوسط وزنه 25 جراما يستهلك 4 جم من الطعام يوميا ، فإن جرعة الدواء اليومية من خلال المدخول الفموي تتوافق مع 2.88 مجم / كجم TFV و 83 مجم / كجم FTC و 768 مجم / كجم من RAL. لاختبار ما إذا كان النظام الغذائي الأمثل ساما ويؤثر على الصحة العامة مقارنة بالحقن اليومي ل cART ، تمت مراقبة وزن الفئران أسبوعيا قبل وأثناء cART من خلال الحقن الفموي أو تحت الجلد. لم تكن هناك فروق كبيرة في الوزن قبل إعطاء cART في كل مجموعة (الشكل 1). ومع ذلك ، انخفض وزن الفأر باستمرار أثناء الحقن اليومي cART SC. في المقابل، أعاد FTC/TDF/ELV أو FTC/TDF/RAL في DietGel أوزان الفئران إلى مستويات بدء العلاج المضاد للفيروسات القهقرية بعد 5 أسابيع من إعطاء العلاج المضاد للفيروسات القهقرية عن طريق الفم. بالإضافة إلى ذلك ، لم تلاحظ أي تغييرات كبيرة في الوزن بين مجموعات Raltegravir أو Elvitegravir.

لاختبار ما إذا كان إعطاء cART عن طريق الفم يثبط الحمل الفيروسي بنفس فعالية الحقن اليومي ، تم تقييم الأحمال الفيروسية في البلازما كل أسبوعين باستخدام RT-PCR. يوضح الشكل 2 أن نظام الغذاء FTC / TDF / ELV ART 100٪ قمع بكفاءة تكاثر الفيروس إلى مستويات لا يمكن اكتشافها في غضون 4 أسابيع ؛ يمكن لنظام الغذاء FTC / TDF / RAL ART قمع 80٪ من الفئران إلى مستويات لا يمكن اكتشافها في غضون 4 أسابيع ، في حين أن 70٪ فقط من الفئران التي تتلقى حقن SC وصلت إلى مستويات لا يمكن اكتشافها بعد 4 أسابيع من العلاج. أظهرت النتائج أن الإعطاء عن طريق الفم يمنع تكاثر الفيروس بشكل أسرع وأكثر كفاءة من حقن SC. علاوة على ذلك ، منع النظام الغذائي cART المزيد من الانخفاض في نسب CD4 / CD8 في الدم المحيطي في وقت أبكر من الحقن اليومي SC (الشكل 3). أشارت هذه النتائج إلى أن نظام cART الفموي المقترح يمكن أن يثبط بنجاح viremia البلازما دون مستوى الكشف ، واستعادة مستويات الخلايا التائية CD4 بسرعة ، وتحسين الصحة العامة للحيوانات في الفئران المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1.

Figure 1
الشكل 1: يتغير وزن جسم الفأر قبل وأثناء العلاج بمضادات الفيروسات القهقرية بعد الإصابة بفيروس العوز المناعي البشري -1 في مجموعات مختلفة. أصيبت الفئران المتوافقة مع البشر بفيروس نقص المناعة البشريةNFNSXSL9 بعد إعادة تكوين المناعة. بعد 4 أسابيع من الإصابة بفيروس العوز المناعي البشري -1 ، عولجت الفئران إما لمدة 7.5 أسابيع أخرى بنظام FTC / TDF / RAL من خلال الحقن تحت الجلد (SC) ، أو عن طريق إعطاء إما FTC / TDF / RAL عن طريق الفم أو FTC / TDF / ELV. تم قياس أوزان جسم الفأر بدءا من 1 أسبوع قبل الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. أجريت جميع المقارنات الإحصائية باستخدام اختبار مان ويتني، متوسط مجموعة الإبلاغ (± S.E.). تظهر نجوم النجمة الخضراء اختلافات إحصائية بين مجموعة الحقن FTC / TDF / ELV الغذائية عن طريق الفم ومجموعة حقن FTC / TDF / RAL SC. * P < 0.05 ، ** P < 0.01 ، ***P < 0.001. ن = 6-7 في كل مجموعة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: يظهر إعطاء cART عن طريق الفم للطعام قمعا أسرع للفيروس. كما هو موضح في الشكل 1 ، لم يتم علاج الفئران أو علاجها بنظام FTC / TDF / RAL من خلال الحقن تحت الجلد ، ومن خلال الإدارة الفموية لأكواب الطعام الوهمية ، FTC / TDF / RAL ، أو FTC / TDF / ELV للأنظمة الغذائية لمدة 7.5 أسابيع أخرى. (أ) الحمل الفيروسي للبلازما بمرور الوقت بعد الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 في مجموعات مختلفة. (ب) ملخص الحمل الفيروسي بمرور الوقت بعد الإصابة بفيروس العوز المناعي البشري -1 في مجموعات مختلفة ، المتوسط الهندسي للمجموعة المبلغ عنها بفاصل ثقة 95٪ (CI). تشير الأسهم السوداء إلى وقت بدء cART للمجموعات المعالجة ب cART. (ج) تحليل البقاء على قيد الحياة للوقت بعد العلاج بمضادات الفيروسات القهقرية للحمل الفيروسي غير القابل للكشف لكل مجموعة. ن = 6-7 في كل مجموعة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: تظهر الإعطائات الفموية للأغذية ART استعادة أسرع لنسبة CD4 / CD8. نسبة CD4 / CD8 في الدم المحيطي بمرور الوقت بعد الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 لكل مجموعة. تم إجراء جميع المقارنات الإحصائية باستخدام اختبار مان ويتني ، متوسط مجموعة الإبلاغ (± S.E.). تظهر نجوم النجمة الحمراء اختلافات إحصائية بين مجموعة الحقن FTC / TDF / RAL الغذائية ومجموعة حقن FTC / TDF / RAL SC. *ف < 0.05. ن = 6-7 في كل مجموعة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم تطوير طريقة إعطاء cART عن طريق الفم هنا للفئران المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 من خلال الجمع بين ثلاثة أدوية مضادة للفيروسات القهقرية داخل أغذية عالية المغذيات. بالمقارنة مع الإعطاء عن طريق الحقن اليومية ، فإن التسليم عن طريق الفم أسهل في الاستخدام ، ويحد من تكرار الإدارة ، ويقلل من التعامل مع الحيوانات ، ويقلل من الإجهاد ، ويحسن السلامة55. حتى هذه اللحظة ، استخدمت دراسات قليلة فقط على الفئران المتوافقة مع البشر24،37،41 كريات الطعام التي تحتوي على أدوية ART المسحوقة لعلاج الفئران. ومع ذلك, هذه الطريقة صعبة التطبيق على نطاق واسع بسبب محدودية الوصول إلى تصنيع الكريات الغذائية الخاصة. استخدمت دراسات أخرى42،43،44،45،46 مياه الشرب كنظام توصيل cART. ومع ذلك ، فإن تركيب الدواء في مياه الشرب قد يغير استقرار المكونات النشطة أو نقائها أو حتى فعاليتها. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العديد من الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية ، بما في ذلك TDF و RAL و ELV ، ضعيفة الذوبان في الماء. أظهرت الدراسات أن التوافر البيولوجي الفموي ل TDF قد زاد بنسبة 40٪ بعد تناول وجبة دهنية عالية56 ، مما يشير إلى أن التثبيط التنافسي للليباز عن طريق الطعام قد يوفر حماية معينة ل TDF57. DietGel Boost هو مكمل غذائي يوفر منتجات الترطيب والتغذية والإثراء التي تعمل على تحسين الرفاهية العامة لحيوانات البحث58. يتكون الجل المدعم بالمغذيات من 25٪ -30٪ ماء نقي مع الكربوهيدرات المضافة والبروتينات والدهون والمعادن والكهارل ، وهو معتمد خال من فيتويستروغنز ونيتروزامين58. يوفر بديلا اقتصاديا وفعالا وفعالا في العمل للوجبات الغذائية المهروسة58. نظرا لأن 20.3٪ من إجمالي الدهون تم تضمينها في كوب Boost ، فإننا نقترح أن مستويات المغذيات العالية يمكن أن تذوب TDF بشكل أفضل ، وبالتالي تزيد من التوافر البيولوجي عن طريق الفم. لذلك ، تم استخدام معلق غذائي عالي المغذيات لتوصيل أدوية cART لتقليد التسليم الفموي لأدوية cART التي يستخدمها الأفراد المصابون بفيروس نقص المناعة البشرية -1 حاليا.

الفئران لديها أيض أعلى من البشر ، وبالتالي ، تم تحويل جرعة المركبات المميزة واستخدامها بواسطة صيغة كما هو موضح في المرجع59. تم تحويل الجرعات البشرية البالغة 0.4 مجم (الجرعة الإجمالية) من RAL ، و 0.1 مجم (الجرعة الإجمالية) من FTC ، و 2.14 مجم (الجرعة الإجمالية) من TDF بناء على عامل التصحيح (KM ، المقدر بقسمة متوسط وزن الجسم (كجم) للأنواع على مساحة سطح الجسم (م2)) لتقدير قيم الجرعة المكافئة للفأر البالغة 37 (كم) و 3 (كم) للبشر والفئران59 ، على التوالي. بالنظر إلى قابلية الذوبان المنخفضة نسبيا ل TDF و RAL و ELV في الماء ، تم استخدام DMSO هنا كمذيب لأدوية cART. التركيز النهائي ل DMSO الموجود في طعام cART الفموي هو 0.0059٪ (v / v). تركيز DMSO منخفض جدا وآمن نسبيا كمذيب للدواء60،61،62،63. الأهم من ذلك ، لم يلاحظ أي فقدان للفراء أو أي تغييرات في السلوك في الفئران في هذه الدراسات.

الإجراء الموصوف أعلاه هو طريقة توصيل cART قوية للغاية وقابلة للتكرار لعلاج الفئران المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1. يمكن اتباع هذا البروتوكول بسهولة. الخطوات الحاسمة في البروتوكول هي 1) الحفاظ على تعقيم العملية الكاملة لأي مادة متضمنة في البروتوكول المتعلق بأغذية DietGel مع مراعاة نقص المناعة لدى الفئران المتوافقة مع البشر ، و 2) لتجنب حلول مخزون cART متعددة الذوبان / التجميد ، و aliquot cART الأدوية بشكل مناسب وفقا لأرقام الفئران ومجموعاتها. تشير البيانات إلى أن الإعطاء الفموي لمضادات الفيروسات القهقرية ثلاثية الأدوية (TDF و FTC و RAL أو ELV) المخلوطة مسبقا داخل كوب الطعام يثبط بكفاءة تكاثر فيروس العوز المناعي البشري -1 ويقلل الحمل الفيروسي في البلازما إلى مستويات لا يمكن اكتشافها في غضون 4 أسابيع من العلاج. لم يمنع إعطاء الطعام cART عن طريق الفم المزيد من الانخفاض في الخلايا التائية CD4 فحسب ، بل أدى أيضا إلى زيادة نسبة الخلايا التائية CD4 في الدم المحيطي. بالإضافة إلى ذلك ، أعادت طريقة إعطاء cART عن طريق الفم وزن الفأر بشكل أسرع من الحقن اليومي وحسنت الصحة العامة.

الأهم من ذلك ، أن هذه الطريقة أزالت خطر تعرض الباحث للأدوات الحادة أثناء الحقن اليومي لعقاقير cART في الفئران المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1. ستكون الطريقة المقترحة التي نجحت في قمع تكرار الحمض النووي الريبي لفيروس العوز المناعي البشري -1 في الفئران المتوافقة مع البشر ذات قيمة عالية لدراسات إثبات المفهوم قبل السريرية لتطوير علاجات علاجية جديدة تحاكي عن كثب توصيل الدواء في الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية -1 المصابين بالعلاج المضاد للفيروسات القهقرية (cART).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

SK هو مؤسس شركة CDR3 Inc. يعلن المؤلفون الباقون أن البحث قد أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgments

نود أن نشكر الدكتور روماس غيليزيوناس وجيف موري والأشخاص في غيلياد على توفير الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية المستخدمة في هذه الدراسة. تم تمويل هذا العمل من قبل NCI 1R01CA239261-01 (إلى المطبخ) ، ومنح المعاهد الوطنية للصحة P30AI28697 (UCLA CFAR Virology Core ، و Gene and Cell Therapy Core ، و Humanized Mouse Core) ، U19AI149504 (PIs: Kitchen & Chen) ، CIRM DISC2-10748 ، NIDA R01DA-52841 (to Zhen) ، NIAID R2120200174 (PIs: Xie & Zhen) ، IRACDA K12 GM106996 (Carrillo). تم دعم هذا العمل أيضا من قبل معهد الإيدز بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس ، وصندوق جيمس ب. بندلتون الخيري ، ومؤسسة عائلة مكارثي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm petri dish Thermo Scientific Nunc 150288 For aliquoting ART food
APC anti-human CD8 Antibody Biolegend 344722 For flow cytometry
BD LSRFortessa BD biosciences For flow data collection
CD34 microbeads Miltenyi Biotec 130-046-702 For NSG-BLT mice generation
Centrifuge tubes Falcon 14-432-22 For dissolving ART
DietGel Boost ClearH2O 72-04-5022 For making ART food
Elvitegravir Gilead Gifted from Gilead
Emtricitabine Gilead Gifted from Gilead
FITC anti-human CD3 Antibody Biolegend 317306 For flow cytometry
Flowjo software FlowJo For flow cytometry data analysis
HIV-1 forward primer: 5′-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 probe: 5′-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT
TAACTG [Tamra-Q]-3′;		 IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 reverse primer: 5′-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
Human fetal tissue Advanced Bioscience Resources, Inc
Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ The Jackson Laboratory 5557 For constructing the humanized mice
Pacific Blue anti-human CD45 Biolegend 304022 For flow cytometry
PerCP anti-human CD4 Antibody Biolegend 300528 For flow cytometry
QIAamp Viral RNA Kits Qiagen  52904 For measuring viral load
Raltegravir Merck Gifted from Merck
Sterile cell scrapers Thermo Scientific 179693 For aliquoting ART food
TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit Applied Biosystems 4392653 For plasma viral load detection
Tenofovir disoproxil fumarate Gilead Gifted from Gilead
Trimethoprim-Sulfamethoxazole Pharmaceutical Associates NDC 0121-0854-16 For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains
200 mg Sulfamethoxazole, USP
40 mg Trimethoprim, USP
NMT 0.5% Alcohol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Antiretroviral Therapy Cohort Collaboration. Life expectancy of individuals on combination antiretroviral therapy in high-income countries: a collaborative analysis of 14 cohort studies. Lancet. 372 (9635), 293-299 (2008).
  2. May, M. T., et al. Impact on life expectancy of HIV-1 positive individuals of CD4+ cell count and viral load response to antiretroviral therapy. AIDS. 28 (8), 1193-1202 (2014).
  3. Autran, B., et al. Positive effects of combined antiretroviral therapy on CD4+ T cell homeostasis and function in advanced HIV disease. Science. 277 (5322), 112-116 (1997).
  4. Palella, F. J., et al. Declining morbidity and mortality among patients with advanced human immunodeficiency virus infection. HIV outpatient study investigators. The New England Journal of Medicine. 338 (13), 853-860 (1998).
  5. Finzi, D., et al. Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy. Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).
  6. Ananworanich, J., Dube, K., Chomont, N. How does the timing of antiretroviral therapy initiation in acute infection affect HIV reservoirs. Current Opinion in HIV and AIDS. 10 (1), 18-28 (2015).
  7. Whitney, J. B., et al. Rapid seeding of the viral reservoir prior to SIV viraemia in rhesus monkeys. Nature. 512 (7512), 74-77 (2014).
  8. Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4 T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
  9. Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature Immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
  10. Brothers, T. D., et al. Frailty in people aging with human immunodeficiency virus (HIV) infection. Journal of Infectious Disease. 210 (8), 1170-1179 (2014).
  11. D. A. D. Study Group. Use of nucleoside reverse transcriptase inhibitors and risk of myocardial infarction in HIV-infected patients enrolled in the D:A:D study: a multi-cohort collaboration. Lancet. 371 (9622), 1417-1426 (2008).
  12. Schouten, J., et al. Cross-sectional comparison of the prevalence of age-associated comorbidities and their risk factors between HIV-infected and uninfected individuals: the AGEhIV cohort study. Clinical Infectious Diseases. 59 (12), 1787-1797 (2014).
  13. Policicchio, B. B., Pandrea, I., Apetrei, C. Animal models for HIV cure research. Frontiers in Immunology. 7, 12 (2016).
  14. Hessell, A. J., Haigwood, N. L. Animal models in HIV-1 protection and therapy. Current Opinion in HIV and AIDS. 10 (3), 170-176 (2015).
  15. Ambrose, Z., KewalRamani, V. N., Bieniasz, P. D., Hatziioannou, T. HIV/AIDS: in search of an animal model. Trends in Biotechnology. 25 (8), 333-337 (2007).
  16. Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature Medicine. 12 (11), 1316 (2006).
  17. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  18. Wege, A. K., Melkus, M. W., Denton, P. W., Estes, J. D., Garcia, J. V. Functional and phenotypic characterization of the humanized BLT mouse model. Current Topics in Microbiology and Immunology. 324, 149-165 (2008).
  19. Garcia, J. V. In vivo platforms for analysis of HIV persistence and eradication. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 424-431 (2016).
  20. Carrillo, M. A., Zhen, A., Kitchen, S. G. The use of the humanized mouse model in gene therapy and immunotherapy for HIV and cancer. Frontiers in Immunology. 9, 746 (2018).
  21. Abeynaike, S., Paust, S. Humanized mice for the evaluation of novel HIV-1 therapies. Frontiers in Immunology. 12, 636775 (2021).
  22. Marsden, M. D., Zack, J. A. Humanized mouse models for human immunodeficiency virus infection. Annual Review of Virology. 4 (1), 393-412 (2017).
  23. Brainard, D. M., et al. Induction of robust cellular and humoral virus-specific adaptive immune responses in human immunodeficiency virus-infected humanized BLT mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
  24. Nischang, M., et al. Humanized mice recapitulate key features of HIV-1 infection: a novel concept using long-acting anti-retroviral drugs for treating HIV-1. PLoS One. 7 (6), 38853 (2012).
  25. Garcia-Beltran, W. F., et al. Innate immune reconstitution in humanized bone marrow-liver-thymus (HuBLT) mice governs adaptive cellular immune function and responses to HIV-1 infection. Frontiers in Immunology. 12, 667393 (2021).
  26. Cheng, L., et al. Blocking type I interferon signaling enhances T cell recovery and reduces HIV-1 reservoirs. The Journal of Clinical Investigation. 127 (1), 269-279 (2017).
  27. Zhen, A., et al. Targeting type I interferon-mediated activation restores immune function in chronic HIV infection. The Journal of Clinical Investigation. 127 (1), 260-268 (2017).
  28. Khamaikawin, W., et al. Modeling anti-HIV-1 HSPC-based gene therapy in humanized mice previously infected with HIV-1. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 23-32 (2018).
  29. Kitchen, S. G., et al. Engineering antigen-specific T cells from genetically modified human hematopoietic stem cells in immunodeficient mice. PLoS One. 4 (12), 8208 (2009).
  30. Zhen, A., et al. Robust CAR-T memory formation and function via hematopoietic stem cell delivery. PLoS Pathogens. 17 (4), 1009404 (2021).
  31. Zhen, A., et al. HIV-specific immunity derived from chimeric antigen receptor-engineered stem cells. Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).
  32. Zhen, A., Kitchen, S. Stem-cell-based gene therapy for HIV infection. Viruses. 6 (1), 1-12 (2013).
  33. Mu, W., Carrillo, M. A., Kitchen, S. G. Engineering CAR T cells to target the hiv reservoir. Frontiers in Celluar and Infection Microbiology. 10, 410 (2020).
  34. Arts, E. J., Hazuda, D. J. HIV-1 antiretroviral drug therapy. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 2 (4), 007161 (2012).
  35. Denton, P. W., et al. Generation of HIV latency in humanized BLT mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
  36. Kovarova, M., et al. A long-acting formulation of the integrase inhibitor raltegravir protects humanized BLT mice from repeated high-dose vaginal HIV challenges. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (6), 1586-1596 (2016).
  37. Lavender, K. J., et al. An advanced BLT-humanized mouse model for extended HIV-1 cure studies. AIDS. 32 (1), 1-10 (2018).
  38. Denton, P. W., et al. Targeted cytotoxic therapy kills persisting HIV infected cells during ART. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003872 (2014).
  39. Marsden, M. D., et al. In vivo activation of latent HIV with a synthetic bryostatin analog effects both latent cell "kick" and "kill" in strategy for virus eradication. PLoS Pathogens. 13 (9), 1006575 (2017).
  40. Stuart, S. A., Robinson, E. S. Reducing the stress of drug administration: implications for the 3Rs. Science Report. 5, 14288 (2015).
  41. Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
  42. Daskou, M., et al. ApoA-I mimetics reduce systemic and gut inflammation in chronic treated HIV. PLoS Pathogens. 18 (1), 1010160 (2022).
  43. Mu, W., et al. Apolipoprotein A-I mimetics attenuate macrophage activation in chronic treated HIV. AIDS. 35 (4), 543-553 (2021).
  44. Daskou, M., et al. ApoA-I mimetics favorably impact cyclooxygenase 2 and bioactive lipids that may contribute to cardiometabolic syndrome in chronic treated HIV. Metabolism. 124, 154888 (2021).
  45. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational antiretroviral therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118 (2018).
  46. Llewellyn, G. N., et al. Humanized mouse model of HIV-1 latency with enrichment of latent virus in PD-1(+) and TIGIT(+) CD4 T cells. Journal of Virology. 93 (10), 02086 (2019).
  47. Kearney, B. P., Flaherty, J. F., Shah, J. Tenofovir disoproxil fumarate: clinical pharmacology and pharmacokinetics. Clinical Pharmacokinetics. 43 (9), 595-612 (2004).
  48. Speakman, J. R. Use of high-fat diets to study rodent obesity as a model of human obesity. International Journal of Obesity (Lond). 43 (8), 1491-1492 (2019).
  49. Zhen, A., et al. Stem-cell based engineered immunity against HIV infection in the humanized mouse model. Journal of Visualized Experiments. (113), e54048 (2016).
  50. Mopin, A., Driss, V., Brinster, C. A detailed protocol for characterizing the murine C1498 cell line and its associated leukemia mouse model. Journal of Visualized Experiments. (116), e54270 (2016).
  51. Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
  52. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  53. Shimizu, S., et al. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
  54. Ladinsky, M. S., et al. Mechanisms of virus dissemination in bone marrow of HIV-1-infected humanized BLT mice. Elife. 8, 46916 (2019).
  55. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
  56. Lamorde, M., et al. Effect of food on the steady-state pharmacokinetics of tenofovir and emtricitabine plus efavirenz in Ugandan adults. AIDS Research and Treatment. 2012, 105980 (2012).
  57. Watkins, M. E., et al. Development of a novel formulation that improves preclinical bioavailability of tenofovir disoproxil fumarate. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 906-919 (2017).
  58. Moccia, K. D., Olsen, C. H., Mitchell, J. M., Landauer, M. R. Evaluation of hydration and nutritional gels as supportive care after total-body irradiation in mice (Mus musculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (3), 323-328 (2010).
  59. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  60. Santos, N. C., Figueira-Coelho, J., Martins-Silva, J., Saldanha, C. Multidisciplinary utilization of dimethyl sulfoxide: pharmacological, cellular, and molecular aspects. Biochemical Pharmacology. 65 (7), 1035-1041 (2003).
  61. Kolb, K. H., Jaenicke, G., Kramer, M., Schulze, P. E. Absorption, distribution and elimination of labeled dimethyl sulfoxide in man and animals. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 85-95 (1967).
  62. Yellowlees, P., Greenfield, C., McIntyre, N. Dimethylsulphoxide-incuded toxicity. Lancet. 2 (8202), 1004-1006 (1980).
  63. Swanson, B. N. Medical use of dimethyl sulfoxide (DMSO). Reviews in Clinical & Basic Pharmacology. 5 (1-2), 1-33 (1985).

Tags

علم المناعة والعدوى ، العدد 188 ،
العلاج التوافقي المضاد للفيروسات القهقرية عن طريق الفم في الفئران المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mu, W., Zhen, A., Carrillo, M. A.,… More

Mu, W., Zhen, A., Carrillo, M. A., Rezek, V., Martin, H., Lizarraga, M., Kitchen, S. Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice. J. Vis. Exp. (188), e63696, doi:10.3791/63696 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter