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Immunology and Infection

Tratamento Antirretroviral Combinacional Oral em Camundongos Humanizados Infectados pelo HIV-1

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/63696
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Hematology and Oncology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

Este protocolo descreve um novo método para administrar medicamentos antirretrovirais combinacionais orais que suprimem com sucesso a replicação do RNA do HIV-1 em camundongos humanizados.

Abstract

A pandemia do vírus da imunodeficiência humana (HIV-1) continua a se espalhar incessantemente em todo o mundo e, atualmente, não há vacina disponível contra o HIV. Embora a terapia antirretroviral combinacional (cTARV) tenha sido bem-sucedida na supressão da replicação viral, ela não pode erradicar completamente o reservatório de indivíduos infectados pelo HIV. Uma estratégia de cura segura e eficaz para a infecção pelo HIV exigirá métodos multifacetados e, portanto, os avanços dos modelos animais para a infecção pelo HIV-1 são fundamentais para o desenvolvimento da pesquisa de cura do HIV. Camundongos humanizados recapitulam as principais características da infecção pelo HIV-1. O modelo de camundongo humanizado pode ser infectado pelo HIV-1 e a replicação viral pode ser controlada com regimes de cTARV. Além disso, a interrupção da cART resulta em um rápido rebote viral em camundongos humanizados. No entanto, a administração de cART ao animal pode ser ineficaz, difícil ou tóxica, e muitos regimes de cART clinicamente relevantes não podem ser utilizados de forma ideal. Além de ser potencialmente insegura para os pesquisadores, a administração de cART por um procedimento de injeção diária intensiva comumente usado induz o estresse pela contenção física do animal. O novo método de cART oral para tratar camundongos humanizados infectados pelo HIV-1 descrito neste artigo resultou na supressão da viremia abaixo do nível de detecção, aumento da taxa de restauração CD4+ e melhoria da saúde geral em camundongos humanizados infectados pelo HIV-1.

Introduction

A expectativa de vida de indivíduos infectados pelo vírus da imunodeficiência humana crônica (HIV) melhorou significativamente com o tratamento antirretroviral combinatório (cTARV)1,2. A cTARV reduz com sucesso a replicação do HIV-1 e aumenta a contagem de células T CD4+ para a normalidade na maioria dos participantes cronicamente infectados pelo HIV-13, resultando em melhora da saúde geral e redução drástica da progressão da doença4. No entanto, o reservatório latente do HIV-1 é estabelecido mesmo quando a TARV é iniciada durante a infecção aguda 5,6,7. Os reservatórios persistem ao longo dos anos durante a TARV e o rápido rebote viral após a interrupção da TARV está bem documentado 8,9. Pessoas vivendo com HIV em TARV também estão predispostas a um maior risco de comorbidades como doenças cardiovasculares, câncer e distúrbios neurológicos10,11,12. Portanto, uma cura funcional para o HIV é necessária. Modelos animais para a infecção pelo HIV-1 oferecem vantagens óbvias no desenvolvimento e validação de novas estratégias de cura do HIV13,14,15. Camundongos humanizados, como modelo animal de pequeno porte, podem proporcionar reconstituição de células imunes humanas multilinhagem em diferentes tecidos, o que permite o estudo minucioso da infecção pelo HIV16,17,18,19. Dentre os modelos humanizados, o modelo humanizado de medula óssea-fígado-timo (BLT) recapitula com sucesso a infecção crônica pelo HIV-1, bem como as respostas imunes humanas funcionais à infecção pelo HIV-1 20,21,22,23,24. Portanto, o modelo humanizado de camundongo BLT tem sido amplamente utilizado para investigar diversos aspectos no campo da pesquisa sobre HIV. Camundongos BLT humanizados não são apenas modelos bem estabelecidos para a recapitulação da infecção persistente pelo HIV-1 e patogênese, mas também ferramentas consequentes para a avaliação de estratégias de intervenção baseadas em terapia celular. Os autores atuais e outros demonstraram que o modelo humanizado de camundongos BLT recapitula a infecção persistente pelo HIV-1 e a patogênese 25,26,27 e fornece ferramentas para avaliar estratégias de intervenção baseadas em terapia celular 28,29,30,31,32,33 .

Os esquemas de cTARV que consistem em combinações de medicamentos antirretrovirais que são tomados diariamente suprimem a replicação do HIV-1 a ponto de a carga viral em indivíduos tratados com sucesso permanecer indetectável a longo prazo34. Os resultados do tratamento de camundongos humanizados infectados pelo HIV com regimes de TARV clinicamente relevantes assemelham-se aos observados em indivíduos infectados pelo HIV-1 tratados com TARV22: os níveis de HIV-1 são suprimidos abaixo dos limites de detecção e interrupção dos resultados da cART em um rebote da replicação do HIV do reservatório latente35. A injeção subcutânea (SC)27,36,37 ou intraperitoneal (IP)37,38,39 é a via comumente utilizada para o tratamento da cART em camundongos humanizados. No entanto, a injeção diária intensiva induz estresse aos animais pela contenção física40. Também é trabalhoso e potencialmente inseguro para os pesquisadores devido ao aumento da exposição ao HIV durante o uso de objetos cortantes. A administração oral é ideal para imitar a absorção, distribuição e excreção de medicamentos cART que são tomados por indivíduos infectados pelo HIV-1. A administração oral geralmente envolve procedimentos personalizados e muitas vezes trabalhosos para colocar os medicamentos antirretrovirais em alimentos esterilizados (necessários devido à imunodeficiência dos camundongos) 24,37,41 ou água 42,43,44,45,46 , que pode ou não ser quimicamente compatível com muitos medicamentos antirretrovirais, ou resultar em algo que os ratos não comeriam ou beberiam prontamente (o que afetaria a dose e os níveis de drogas no corpo). O novo método de administração de cART peroral proposto aqui supera as tentativas de parto anteriores devido à sua compatibilidade com diferentes tipos de medicamentos antirretrovirais, segurança e facilidade de preparação e administração, e redução do estresse e ansiedade animal resultantes da injeção diária.

Tenofovir disoproxil fumarato (TDF), Elvitegravir (ELV) e Raltegravir (RAL) são drogas pouco solúveis em água. Curiosamente, o aumento da biodisponibilidade do TDF é observado com alimentos gordurosos, sugerindo que a inibição competitiva das lipases por alimentos gordurosos pode fornecer certa proteção para o TDF47. Portanto, os copos DietGel Boost foram selecionados para substituir a ração regular de roedores como método de entrega com base em seu modesto teor de gordura (20,3 g por 100 g) em comparação com a ração regular de roedores (10 g por 100 g) e uma dieta típica rica em gordura de camundongo (40-60 g por 100 g)48. O peso total de um copo é de 75 g; assim, cada xícara conterá a quantidade de alimento e, portanto, droga, suficiente para cinco ratos ao longo de 3 dias.

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Protocol

O tecido fetal humano anonimizado foi adquirido comercialmente. A pesquisa em animais foi realizada de acordo com protocolos aprovados pela Universidade da Califórnia, Los Angeles, e pelo Comitê de Pesquisa Animal (ARC) (UCLA), de acordo com todas as diretrizes federais, estaduais e locais. Especificamente, todos os experimentos foram realizados de acordo com as recomendações e diretrizes para alojamento e cuidado de animais de laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) e da Associação para a Avaliação e Acreditação de Cuidados com Animais de Laboratório (AALAC) Internacional sob o Número de Protocolo UCLA ARC 2010-038-02B. Todas as cirurgias foram realizadas sob anestesia com cetamina (100 mg/kg)/xilazina (5 mg/kg) e isoflurano (2-3 vol%) e todos os esforços foram feitos para minimizar a dor e o desconforto dos animais.

1. Camundongos humanizados infectados com HIV-1

NOTA: Camundongos humanizados foram construídos conforme descrito anteriormente em30,31,49. O protocolo é brevemente descrito abaixo.

  1. Purificar as células progenitoras hematopoiéticas CD34+ do fígado fetal humano através de microesferas anti-CD34 de acordo com o protocolo do fabricante.
  2. Anestesiar camundongos machos e fêmeas NOD/SCID/IL2Rγ−/− (NSG) de 6-8 semanas de idade e irradiar subletalmente (2,7 Gy) antes da cirurgia.
  3. Implante timo, derivado do mesmo doador que o fígado fetal, sob a cápsula renal junto com o fígado.
  4. Após a implantação, injete camundongos com 0,5 milhão a um milhão de células CD34+, por via intravenosa.
  5. Após 8-10 semanas, recolher 100 μL de sangue de rato através de sangria retro-orbital50 em tubos de microcentrífuga contendo 5 μL de EDTA e centrífuga a 350 x g durante 3 min.
  6. Armazenar o plasma a -80 °C para monitorizar a carga viral após o rato ter sido infectado com o VIH-1. Adicione 2 mL de solução de NH4C a 83% e incube por 5 minutos à temperatura ambiente para lisar os glóbulos vermelhos.
  7. Adicione 10 mL de RPMI com 10% de soro fetal bovino (FBS) para interromper a lise. Gire a 300 x g por 5 min.
  8. Aspirar sobrenadante. Células corantes com painel de anticorpos (ver Tabela de Materiais) e analisar por citometria de fluxo para verificar o enxerto de células imunes humanas.
  9. Infectar camundongos que exibem mais de 50% das células CD45+ circulantes por injeção de veia retroorbital51,52 com pelo menos 200 ng de p24 de uma cepa HIV-1 (ou seja, NFNSXSL9 30,53,54) usando uma seringa de insulina. Coletar sangue quinzenalmente para análise de citometria de fluxo e para medir a carga viral.

2. Preparação de medicamentos antirretrovirais

  1. Pesar drogas individuais; por exemplo, para fazer 10 copos de alimentos com cART, use raspadores de células estéreis para pesar 250 mg de FTC (Emtricitabina), 375 mg de TDF e 500 mg de RAL ou ELV em tubos de centrífuga estéril de 15 mL individuais em um gabinete de biossegurança.
  2. Adicionar 1 mL de DMSO em tubo FTC de 250 mg (concentração final de 250 mg/mL), adicionar 1,5 mL de DMSO em tubo de TDF de 375 mg (concentração final de 250 mg/mL) e adicionar 1mL de DMSO em tubo de 500 mg de RAL ou ELV (concentração final de 500 mg/mL). Mexa ou pipete a mistura de drogas até que esteja totalmente dissolvida e uma solução clara seja obtida.
  3. Use um filtro de membrana PVDF hidrofílico de tamanho de poro de 0,22 μM para esterilizar soluções com uma seringa estéril. Soluções medicamentosas individuais podem ser armazenadas a -20 °C por 12 semanas.
  4. Quando estiver pronto a utilizar, descongelar recentemente uma alíquota de cada solução medicamentosa a 37 °C até que a solução se torne límpida. Misture bem usando uma pipeta.
  5. Combine drogas e misture bem para compor a mistura mestre: 1 mL de FTC em DMSO, 1,5 mL de TDF em DMSO e 1 mL de ELV ou RAL em DMSO.
    NOTA: Esta quantidade fará 10 xícaras de comida.
  6. Adicione 350 μL de solução de mistura master cART em um copo para fazer um copo cART DietGel Boost.
  7. Adicionar 0,75 ml de Sulfametoxazol-Trimetoprima (concentração final de 0,48 mg/ml) ao copo.
  8. Mexa bem usando 1 mL de pontas de pipeta estéreis.
  9. Aliquote o copo de comida contendo cART do copo original com uma microespátula em uma placa de Petri de 60 mm, conforme necessário. Pese o alimento em uma balança para calcular a quantidade de copo de alimento contendo cART para cada gaiola de acordo com o número de camundongos.

3. Administração de medicamentos antirretrovirais em camundongos infectados pelo HIV-1

  1. Remova a ração regular da gaiola e substitua-a por um copo de comida contendo cART.
    NOTA: Em média, um rato vai comer até 5 g de comida por dia. Aproximadamente um copo de comida pode ser administrado a cinco ratos por 2 dias.
  2. Atualize a comida cART três vezes por semana.
  3. Pesar copos usados para monitorar a ingestão. Pese os ratos semanalmente para confirmar o consumo.

4. Monitore a carga viral por PCR em tempo real

  1. Avaliar as células imunes humanas (níveis de células T CD4 e CD8) e a replicação do HIV-1 em camundongos BLT a cada 2 semanas por sangramento retroorbital. Colha o plasma seguindo as instruções nas etapas 1.5-1.8.
  2. Monitore as cargas virais plasmáticas de camundongos infectados com HIV-1 antes e durante a administração oral de cART por 8 semanas. Extrair o RNA viral plasmático do plasma usando um kit de extração de RNA viral e quantificá-lo por PCR em tempo real usando os primers e sondas (ver Tabela de Materiais) conforme descrito anteriormente 27,30,31. Use o seguinte protocolo de ciclismo: 48 °C (15 min), 95 °C (10 min), depois pedale 95 °C (15 s), 60 °C (1 min) por 45 ciclos.

5. Avaliar as relações CD4/CD8 por citometria de fluxo

  1. Prepare suspensões unicelulares do sangue periférico de hemorragias quinzenais seguindo os passos 1.5-1.8.
  2. Células corantes com marcadores de superfície e analisadas por citometria de fluxo. Utilizar os seguintes anticorpos marcadores de superfície 27,30,43,49 na citometria de fluxo: CD45 (clone HI30), CD8 (clone SK1), CD3 (clone OKT3), CD4 (clone RPA-T4)27,30,42,49.

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Representative Results

Supondo que um rato médio pesando 25 g consuma 4 g de alimento por dia, a dose diária do medicamento através da ingestão oral corresponde a 2,88 mg/kg TFV, 83 mg/kg FTC e 768 mg/kg RAL. Para testar se o regime alimentar otimizado é tóxico e influencia a saúde geral em comparação com a injeção diária de cART, o peso dos ratos foi monitorado semanalmente antes e durante a cART através de injeção oral ou subcutânea. Não houve diferenças significativas de peso antes da administração da TARV em cada grupo (Figura 1). No entanto, o peso do rato diminuiu continuamente durante a injeção diária de cART SC. Em contraste, FTC/TDF/ELV ou FTC/TDF/RAL no DietGel restauraram os pesos dos ratos aos níveis de iniciação pré-TARV após 5 semanas de administração oral de TARV. Além disso, não foram observadas alterações significativas de peso entre os grupos Raltegravir ou Elvitegravir.

Para testar se a administração oral de cART suprime a carga viral de forma tão eficaz quanto uma injeção diária, as cargas virais plasmáticas quinzenais foram avaliadas usando RT-PCR. A Figura 2 mostra que o regime alimentar FTC/TDF/ELV ART suprimiu 100% eficientemente a replicação viral para níveis indetectáveis dentro de 4 semanas; O regime alimentar FTC/TDF/RAL ART pode suprimir 80% dos ratos a níveis indetectáveis dentro de 4 semanas, enquanto apenas 70% dos ratos que receberam injeção de SC atingiram níveis indetectáveis após 4 semanas de tratamento. Os resultados demonstraram que a administração oral suprime a replicação viral de forma mais rápida e eficiente do que a injeção de SC. Além disso, o regime alimentar de cART impediu o declínio adicional das relações CD4/CD8 no sangue periférico antes da injeção diária de SC (Figura 3). Esses resultados sugeriram que o regime de cART oral proposto pode suprimir com sucesso a viremia plasmática abaixo do nível de detecção, restaurar rapidamente os níveis de células T CD4 e melhorar a saúde geral dos animais em camundongos humanizados infectados pelo HIV-1.

Figure 1
Figura 1: O peso corporal do rato muda antes e durante o tratamento com cART após a infecção pelo HIV-1 em diferentes grupos. Camundongos humanizados foram infectados com HIVNFNSXSL9 após reconstituição imunológica. Após 4 semanas de infecção pelo HIV-1, os camundongos foram tratados por mais 7,5 semanas com o regime FTC/TDF/RAL através de injeção subcutânea (SC) ou pela administração oral de FTC/TDF/RAL ou FTC/TDF/ELV. Os pesos corporais dos ratos foram medidos a partir de 1 semana antes da infecção pelo HIV. Todas as comparações estatísticas foram realizadas utilizando-se o teste de Mann-Whitney, relatando a média dos grupos (± S.E.). As estrelas de asterisco verde mostram diferenças estatísticas entre o grupo oral alimentar FTC/TDF/ELV e o grupo de injeção FTC/TDF/RAL SC. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. n=6-7 em cada grupo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: A administração oral de cART alimentar mostra supressão viral mais rápida. Conforme descrito na Figura 1, os camundongos não foram tratados ou tratados com o regime FTC/TDF/RAL por meio de injeção subcutânea e pela administração oral de esquemas alimentares simulados, FTC/TDF/RAL ou FTC/TDF/ELV por mais 7,5 semanas. (A) Carga viral plasmática ao longo do tempo após a infecção pelo HIV-1 em diferentes grupos. (B) Resumo da carga viral ao longo do tempo após a infecção pelo HIV-1 em diferentes grupos, relatando média geométrica do grupo com intervalo de confiança (IC) de 95%. Setas pretas indicam o tempo de início da cART para os grupos tratados com cTARV. (C) Análise da sobrevida do tempo pós-tratamento da TARV à carga viral indetectável para cada grupo. n= 6-7 em cada grupo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: As administrações orais de alimentos ART mostram restauração mais rápida da relação CD4/CD8. Relação CD4/CD8 no sangue periférico ao longo do tempo após a infecção pelo HIV-1 para cada grupo. Todas as comparações estatísticas foram realizadas por meio do teste de Mann-Whitney, relatando a média dos grupos (± S.E.). As estrelas de asterisco vermelho mostram diferenças estatísticas entre o grupo oral de alimentos FTC/TDF/RAL e o grupo de injeção de FTC/TDF/RAL SC. *P < 0,05. n=6-7 em cada grupo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Um método de administração oral de cART é desenvolvido aqui para camundongos humanizados infectados pelo HIV-1, combinando três medicamentos antirretrovirais em alimentos ricos em nutrientes. Em comparação com a administração por injeções diárias, o parto oral é mais fácil de usar, limita a frequência de administração, reduz o manuseio dos animais, minimiza o estresse e melhora a segurança55. Até este ponto, apenas alguns estudos em camundongos humanizados 24,37,41 utilizaram pellets de alimentos contendo drogas antirretroviral esmagadas para o tratamento de camundongos. No entanto, este método é um desafio para aplicar amplamente devido ao acesso limitado à fabricação de pellets de alimentos especiais. Outros estudos 42,43,44,45,46 utilizaram água potável como sistema de entrega de TARV. No entanto, a composição de um medicamento em água potável pode alterar a estabilidade, pureza ou mesmo potência dos ingredientes ativos. Além disso, muitos medicamentos antirretrovirais, incluindo TDF, RAL e ELV, são pouco solúveis em água. Estudos têm demonstrado que a biodisponibilidade oral do TDF foi aumentada em 40% após uma refeição rica em gordura56, sugerindo que a inibição competitiva das lipases pelos alimentos pode fornecer certa proteção para o TDF57. DietGel Boost é um suplemento alimentar que fornece produtos de hidratação, nutrição e enriquecimento que melhoram o bem-estar geral dos animais de pesquisa58. O gel fortificado com nutrientes consiste em 25% a 30% de água pura com adição de carboidratos, proteínas, gorduras, minerais e eletrólitos, e é certificado livre de fitoestrógenos e nitrosaminas58. Ele fornece uma alternativa econômica, eficaz e eficiente em termos de trabalho para dietas de purê58. Uma vez que 20,3% da gordura total foi incluída no copo Boost, propomos que altos níveis de nutrientes podem dissolver melhor o TDF e, portanto, aumentar sua biodisponibilidade oral. Portanto, uma alta suspensão alimentar de nutrientes foi utilizada para administrar os medicamentos cART para imitar a entrega peroral de medicamentos cART que os indivíduos infectados pelo HIV-1 usam atualmente.

Os camundongos têm um metabolismo maior do que os humanos e, assim, a dose dos compostos distintos foi convertida e utilizada por uma fórmula descrita na referência59. Doses humanas de 0,4 mg (dose total) de RAL, 0,1 mg (dose total) de FTC e 2,14 mg (dose total) de TDF foram convertidas com base no fator de correção (Km, estimado dividindo o peso corporal médio (kg) da espécie pela sua área de superfície corporal (m2)) para estimar os valores de dose equivalente do rato de 37 (Km) e 3 (Km) para humanos e ratinhos59, respectivamente. Considerando a solubilidade relativamente baixa de TDF, RAL e ELV em água, o DMSO foi usado aqui como solvente para drogas cART. A concentração final de DMSO contida no alimento cART oral é de 0,0059% (v/v). A concentração de DMSO é muito baixa e relativamente segura como solvente de fármaco60,61,62,63. É importante ressaltar que nenhuma perda de pelo ou quaisquer mudanças de comportamento em camundongos foram observadas nesses estudos.

O procedimento descrito acima é um método de entrega de cART altamente robusto e repetível para o tratamento de camundongos humanizados infectados pelo HIV-1. Este protocolo pode ser seguido facilmente. As etapas críticas no protocolo são 1) manter estéril todo o processo de qualquer material envolvido no protocolo relacionado ao alimento DietGel considerando a imunodeficiência dos camundongos humanizados, e 2) evitar múltiplas soluções de estoque de cART de descongelamento / congelamento e alíquota de medicamentos cART adequadamente de acordo com o número e grupos de camundongos. Os dados sugerem que a administração oral de cART de três drogas (ETFD, FCT e RAL ou ELV) pré-misturadas dentro do copo de alimentos suprime eficientemente a replicação do HIV-1 e reduz a carga viral no plasma para níveis indetectáveis dentro de 4 semanas de tratamento. A administração oral de alimentos cART não só impediu um declínio adicional nas células T CD4, mas também resultou em um aumento da porcentagem de células T CD4 no sangue periférico. Além disso, o método de administração oral de cART restaurou o peso do rato mais rapidamente do que a injeção diária e melhorou a saúde geral.

É importante ressaltar que esse método removeu o risco de exposição do pesquisador a objetos perfurocortantes durante a injeção diária de drogas cART em camundongos humanizados infectados pelo HIV-1. O método proposto que suprime com sucesso a replicação do RNA do HIV-1 em camundongos humanizados será altamente valioso para estudos pré-clínicos de prova de conceito para o desenvolvimento de novos tratamentos de cura que imitam de perto a administração de medicamentos em indivíduos infectados crônicos pelo HIV-1 tratados com cART.

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Disclosures

A SK é fundadora da CDR3 Inc. Os demais autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer aos Drs. Romas Geleziunas e Jeff Murry e ao pessoal da Gilead por fornecerem os medicamentos antirretrovirais utilizados neste estudo. Este trabalho foi financiado pelo NCI 1R01CA239261-01 (to Kitchen), NIH Grants P30AI28697 (UCLA CFAR Virology Core, Gene and Cell Therapy Core e Humanized Mouse Core), U19AI149504 (PIs: Kitchen & Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (para Zhen), NIAID R2120200174 (PIs: Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (Carrillo). Este trabalho também foi apoiado pelo UCLA AIDS Institute, o James B. Pendleton Charitable Trust e a McCarthy Family Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm petri dish Thermo Scientific Nunc 150288 For aliquoting ART food
APC anti-human CD8 Antibody Biolegend 344722 For flow cytometry
BD LSRFortessa BD biosciences For flow data collection
CD34 microbeads Miltenyi Biotec 130-046-702 For NSG-BLT mice generation
Centrifuge tubes Falcon 14-432-22 For dissolving ART
DietGel Boost ClearH2O 72-04-5022 For making ART food
Elvitegravir Gilead Gifted from Gilead
Emtricitabine Gilead Gifted from Gilead
FITC anti-human CD3 Antibody Biolegend 317306 For flow cytometry
Flowjo software FlowJo For flow cytometry data analysis
HIV-1 forward primer: 5′-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 probe: 5′-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT
TAACTG [Tamra-Q]-3′;		 IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 reverse primer: 5′-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
Human fetal tissue Advanced Bioscience Resources, Inc
Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ The Jackson Laboratory 5557 For constructing the humanized mice
Pacific Blue anti-human CD45 Biolegend 304022 For flow cytometry
PerCP anti-human CD4 Antibody Biolegend 300528 For flow cytometry
QIAamp Viral RNA Kits Qiagen  52904 For measuring viral load
Raltegravir Merck Gifted from Merck
Sterile cell scrapers Thermo Scientific 179693 For aliquoting ART food
TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit Applied Biosystems 4392653 For plasma viral load detection
Tenofovir disoproxil fumarate Gilead Gifted from Gilead
Trimethoprim-Sulfamethoxazole Pharmaceutical Associates NDC 0121-0854-16 For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains
200 mg Sulfamethoxazole, USP
40 mg Trimethoprim, USP
NMT 0.5% Alcohol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Imunologia e Infecção Edição 188
Tratamento Antirretroviral Combinacional Oral em Camundongos Humanizados Infectados pelo HIV-1
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Mu, W., Zhen, A., Carrillo, M. A., Rezek, V., Martin, H., Lizarraga, M., Kitchen, S. Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice. J. Vis. Exp. (188), e63696, doi:10.3791/63696 (2022).

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