Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Antiretroviral behandling i oral kombination hos HIV-1-infekterade humaniserade möss

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/63696
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Hematology and Oncology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

Detta protokoll beskriver en ny metod för att leverera orala kombinations-antiretrovirala läkemedel som framgångsrikt undertrycker HIV-1 RNA-replikation hos humaniserade möss.

Abstract

Pandemin med humant immunbristvirus (HIV-1) fortsätter att spridas med oförminskad styrka över hela världen, och för närvarande finns det inget vaccin tillgängligt mot HIV. Även om kombinationsantiretroviral terapi (cART) har lyckats undertrycka viral replikation, kan den inte helt utrota reservoaren från HIV-infekterade individer. En säker och effektiv botstrategi för HIV-infektion kommer att kräva mångsidiga metoder, och därför är framstegen med djurmodeller för HIV-1-infektion avgörande för utvecklingen av HIV-botemedelsforskning. Humaniserade möss rekapitulerar viktiga funktioner i HIV-1-infektion. Den humaniserade musmodellen kan infekteras av HIV-1 och viral replikation kan kontrolleras med cART-regimer. Dessutom resulterar cART-avbrott i en snabb viral rebound hos humaniserade möss. Administrering av cART till djuret kan dock vara ineffektivt, svårt eller giftigt, och många kliniskt relevanta cART-regimer kan inte utnyttjas optimalt. Tillsammans med att vara potentiellt osäkra för forskare, inducerar administrering av cART genom ett vanligt intensivt dagligt injektionsförfarande stress genom fysisk fasthållning av djuret. Den nya orala cART-metoden för att behandla HIV-1-infekterade humaniserade möss som beskrivs i denna artikel resulterade i undertryckande av viremi under detektionsnivån, ökad hastighet av CD4 + -restaurering och förbättrad allmän hälsa hos HIV-1-infekterade humaniserade möss.

Introduction

Den förväntade livslängden för patienter med kroniskt humant immunbristvirus (HIV)-infekterade individer har förbättrats avsevärt med antiretroviral kombinationsbehandling (cART)1,2. cART minskar framgångsrikt HIV-1-replikationen och ökar antalet CD4 + T-celler till normalitet hos majoriteten av HIV-1 kroniskt infekterade deltagare3, vilket resulterar i förbättrad allmän hälsa och dramatiskt minskad sjukdomsprogression4. Den latenta HIV-1-reservoaren etableras dock även när ART initieras under akut infektion 5,6,7. Reservoarer kvarstår under flera år under ART och snabb viral återhämtning efter ART-avbrott är väldokumenterad 8,9. Personer som lever med HIV på ART är också predisponerade för en högre risk för comorbiditeter som hjärt-kärlsjukdom, cancer och neurostörningar10,11,12. Därför behövs ett funktionellt botemedel mot hiv. Djurmodeller för HIV-1-infektion erbjuder uppenbara fördelar när det gäller att utveckla och validera nya HIV-botemedelsstrategier13,14,15. Humaniserade möss, som en liten djurmodell, kan ge multilineage mänsklig immuncellsrekonstitution i olika vävnader, vilket möjliggör en noggrann studie av HIV-infektion16,17,18,19. Bland humaniserade modeller rekapitulerar den humaniserade benmärgs-lever-tymus (BLT) -modellen framgångsrikt kronisk HIV-1-infektion samt funktionella mänskliga immunsvar mot HIV-1-infektion 20,21,22,23,24. Därför har den humaniserade BLT-musmodellen använts i stor utsträckning för att undersöka olika aspekter inom HIV-forskningsområdet. Humaniserade BLT-möss är inte bara väletablerade modeller för rekapitulation av ihållande HIV-1-infektion och patogenes, utan också följdverktyg för utvärdering av cellterapibaserade interventionsstrategier. De nuvarande författarna och andra har visat att den humaniserade BLT-mössmodellen rekapitulerar ihållande HIV-1-infektion och patogenes 25,26,27 och ger verktyg för att utvärdera cellterapibaserade interventionsstrategier 28,29,30,31,32,33.

cART-regimer som består av kombinationer av antiretrovirala läkemedel som dagligen undertrycker HIV-1-replikation till den grad att virusbelastningen hos framgångsrikt behandlade individer förblir omöjlig att upptäcka på lång sikt34. Resultaten av behandling av HIV-infekterade humaniserade möss med kliniskt relevanta cART-regimer liknar de som observerats hos HIV-1-infekterade ART-behandlade individer22: HIV-1-nivåer undertrycks under gränserna för detektion och avbrott av cART resulterar i en rebound av HIV-replikation från den latenta reservoaren35. Subkutan (SC)27,36,37 eller intraperitoneal (IP)37,38,39 injektion är den väg som vanligtvis används för cART-behandling hos humaniserade möss. Intensiv daglig injektion inducerar dock stress för djur genom fysisk fasthållning40. Det är också arbetskrävande och potentiellt osäkra för forskare på grund av ökad exponering för HIV när de använder vassa föremål. Oral administrering är idealisk för att efterlikna absorption, distribution och utsöndring av cART-läkemedel som tas av HIV-1-infekterade individer. Oral administrering innebär vanligtvis anpassade och ofta mödosamma procedurer för att sätta de antiretrovirala läkemedlen i steriliserad (nödvändig på grund av mössens immunbrist) mat 24,37,41 eller vatten 42,43,44,45,46 , som kan eller inte kan vara kemiskt kompatibla med många antiretrovirala läkemedel, eller resultera i något som mössen inte lätt skulle äta eller dricka (vilket skulle påverka dos- och läkemedelsnivåerna i kroppen). Den nya perorala cART-administreringsmetoden som föreslås här överträffar tidigare leveransförsök på grund av dess kompatibilitet med olika typer av antiretrovirala läkemedel, säkerhet och enkel beredning och administrering och minskning av djurstress och ångest till följd av den dagliga injektionen.

Tenofovirdisoproxilfumarat (TDF), Elvitegravir (ELV) och Raltegravir (RAL) är dåligt vattenlösliga läkemedel. Intressant nog observeras ökad biotillgänglighet av TDF med feta livsmedel, vilket tyder på att konkurrenskraftig hämning av lipaser av fet mat kan ge ett visst skydd för TDF47. Därför valdes DietGel Boost-koppar för att ersätta vanlig gnagare chow som leveransmetod baserat på deras blygsamma fettinnehåll (20,3 g per 100 g) jämfört med vanlig gnagare chow (10 g per 100 g) och en typisk musrik diet med hög fetthalt (40-60 g per 100 g)48. Den totala vikten av en kopp är 75 g; Således kommer varje kopp att innehålla mängden mat, och därför läkemedel, tillräckligt för fem möss över 3 dagar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Anonymiserad mänsklig fostervävnad förvärvades kommersiellt. Djurförsök utfördes enligt protokoll som godkänts av University of California, Los Angeles och (UCLA) Animal Research Committee (ARC) i enlighet med alla federala, statliga och lokala riktlinjer. Specifikt utfördes alla experiment i enlighet med rekommendationerna och riktlinjerna för boende och vård av laboratoriedjur från National Institutes of Health (NIH) och Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) International under UCLA ARC Protocol Number 2010-038-02B. Alla operationer utfördes under ketamin (100 mg/kg)/xylazin (5 mg/kg) och isoflurananestesi (2-3 vol%) och alla ansträngningar gjordes för att minimera djurens smärta och obehag.

1. Humaniserade möss infekterade med HIV-1

OBS: Humaniserade möss konstruerades som tidigare beskrivits i30,31,49. Protokollet beskrivs kortfattat nedan.

  1. Rena CD34 + hematopoetiska stamceller från den mänskliga fosterleveren via anti-CD34-mikrober enligt tillverkarens protokoll.
  2. Bedöva 6-8 veckor gamla NOD/SCID/IL2Rγ−/− (NSG) han- och honmöss och bestråla subletalt (2,7 Gy) före operationen.
  3. Implantattymus, härrörande från samma givare som fosterleveren, under njurkapseln tillsammans med levern.
  4. Efter implantation, injicera möss med 0,5 miljoner till en miljon CD34 + -celler, intravenöst.
  5. Efter 8-10 veckor, samla 100 μL musblod via retro-orbital blödning50 i mikrocentrifugrör som innehåller 5 μL EDTA och centrifugera vid 350 x g i 3 min.
  6. Förvara plasman vid -80 °C för att övervaka virusbelastningen efter att musen har infekterats med HIV-1. Tillsätt 2 ml 83% NH4C-lösning och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur för att lysera röda blodkroppar.
  7. Tillsätt 10 ml RPMI med 10% Fetal Bovine Serum (FBS) för att stoppa lysen. Snurra på 300 x g i 5 min.
  8. Aspirera supernatant. Färga celler med antikroppspanel (se materialförteckning) och analysera med flödescytometri för att kontrollera human immuncellsengraftment.
  9. Infektera möss som uppvisar mer än 50% av cirkulerande CD45 + -celler genom retro-orbital veninjektion51,52 med minst 200 ng p24 av en HIV-1-stam (dvs. NFNSXSL9 30,53,54) med hjälp av en insulinspruta. Samla blod varannan vecka för flödescytometrianalys och för att mäta virusbelastningen.

2. Beredning av ART-läkemedel

  1. Väg enskilda droger; till exempel, för att göra 10 matkoppar med cART, använd sterila cellskrapor för att väga ut 250 mg FTC (Emtricitabin), 375 mg TDF och 500 mg RAL eller ELV i enskilda sterila 15 ml centrifugrör i ett biosäkerhetsskåp.
  2. Tillsätt 1 ml DMSO i 250 mg FTC-rör (slutlig koncentration på 250 mg/ml), tillsätt 1,5 ml DMSO i 375 mg TDF-rör (slutlig koncentration på 250 mg/ml) och tillsätt 1 ml DMSO i 500 mg RAL- eller ELV-rör (slutlig koncentration på 500 mg/ml). Rör om eller pipett läkemedelsblandningen tills den är helt upplöst och en klar lösning erhålls.
  3. Använd ett hydrofilt PVDF-membranfilter med en porstorlek på 0,22 μM för att sterilisera lösningar med en steril spruta. Individuella läkemedelslösningar kan förvaras vid -20 °C i 12 veckor.
  4. När den är klar att användas, tina nyligen en alikvot av varje läkemedelslösning vid 37 °C tills lösningen blir klar. Blanda väl med en pipett.
  5. Kombinera läkemedel och blanda väl för att kompensera mastermix: 1 ml FTC i DMSO, 1,5 ml TDF i DMSO och 1 ml ELV eller RAL i DMSO.
    OBS: Detta belopp kommer att göra 10 matkoppar.
  6. Tillsätt 350 μL cART master mix-lösning i en kopp för att göra en DietGel Boost cART-kopp.
  7. Tillsätt 0,75 ml trimetoprim-sulfametoxazol (0,48 mg/ml slutlig koncentration) i koppen.
  8. Rör om noggrant med 1 ml sterila pipettspetsar.
  9. Alikvotera matkoppen som innehåller cART från originalkoppen med en mikrospatel på en 60 mm petriskål efter behov. Väg maten på en skala för att beräkna mängden matkopp som innehåller cART för varje bur enligt antalet möss.

3. Administrering av ART-läkemedel till HIV-1-infekterade möss

  1. Ta bort vanlig chow från buret och ersätt den med en matkopp som innehåller cART.
    OBS: I genomsnitt äter en mus upp till 5 g mat per dag. Cirka en matkopp kan administreras till fem möss i 2 dagar.
  2. Uppdatera cART mat tre gånger i veckan.
  3. Väg använda koppar för att övervaka intaget. Väg möss varje vecka för att bekräfta konsumtionen.

4. Övervaka viral belastning med PCR i realtid

  1. Bedöm humana immunceller (CD4- och CD8 T-cellnivåer) och HIV-1-replikation hos BLT-möss var 2: e vecka genom retro-orbital blödning. Skörda plasma genom att följa instruktionerna i steg 1.5-1.8.
  2. Övervaka plasmavirusbelastningar av möss infekterade med HIV-1 före och under oral cART-administrering i 8 veckor. Extrahera plasmaviralt RNA från plasma med hjälp av ett viralt RNA-extraktionssats och kvantifiera det med PCR i realtid med hjälp av primers och sonder (se materialtabell) som tidigare beskrivits 27,30,31. Använd följande cykelprotokoll: 48 °C (15 min), 95 °C (10 min), sedan cykling 95 °C (15 s), 60 °C (1 min) i 45 cykler.

5. Bedöm CD4 / CD8-förhållanden med flödescytometri

  1. Förbered encelliga suspensioner från perifert blod av blödningar varannan vecka enligt steg 1.5-1.8.
  2. Färga celler med ytmarkörer och analysera med flödescytometri. Använd följande ytmarkörantikroppar 27,30,43,49 i flödescytometri: CD45 (klon HI30), CD8 (klon SK1), CD3 (klon OKT3), CD4 (klon RPA-T4)27,30,42,49.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Förutsatt att en genomsnittlig mus som väger 25 g konsumerar 4 g mat per dag, motsvarar den dagliga läkemedelsdosen genom oralt intag 2,88 mg/kg TFV, 83 mg/kg FTC och 768 mg/kg RAL. För att testa om den optimerade matregimen är giftig och påverkar den allmänna hälsan jämfört med daglig injektion av cART övervakades mössens vikt varje vecka före och under cART genom oral eller subkutan injektion. Det fanns inga signifikanta viktskillnader före administrering av cART i varje grupp (figur 1). Musens vikt minskade dock kontinuerligt under den dagliga injektionen av cART SC. Däremot återställde FTC / TDF / ELV eller FTC / TDF / RAL i DietGel musvikter till pre-ART-initieringsnivåer efter 5 veckors oral cART-administrering. Dessutom observerades inga signifikanta viktförändringar mellan Raltegravir- eller Elvitegravirgrupperna.

För att testa om oral cART-administrering undertrycker virusbelastningen lika effektivt som en daglig injektion, bedömdes plasmavirusbelastningar varannan vecka med RT-PCR. Figur 2 visar att FTC / TDF / ELV ART matregim 100% effektivt undertryckte virusreplikationen till omätbara nivåer inom 4 veckor; FTC / TDF / RAL ART matregimen kan undertrycka 80% av mössen till omätbara nivåer inom 4 veckor, medan endast 70% av mössen som fick SC-injektion nådde omätbara nivåer efter 4 veckors behandling. Resultaten visade att oral administrering undertrycker viral replikation snabbare och mer effektivt än SC-injektion. Dessutom förhindrade cART-matregimen ytterligare nedgång av CD4 / CD8-förhållanden i perifert blod tidigare än SC: s dagliga injektion (figur 3). Dessa resultat föreslog att den föreslagna orala cART-regimen framgångsrikt kan undertrycka plasmaviremi under detektionsnivån, snabbt återställa CD4 T-cellnivåer och förbättra den allmänna hälsan hos djuren hos HIV-1-infekterade humaniserade möss.

Figure 1
Figur 1: Musens kroppsvikt förändras före och under cART-behandling efter HIV-1-infektion i olika grupper. Humaniserade möss infekterades med HIVNFNSXSL9 efter immunrekonstitution. Efter 4 veckors HIV-1-infektion behandlades möss antingen i ytterligare 7,5 veckor med FTC/TDF/RAL-behandling genom subkutan (SC) injektion, eller genom oral administrering av antingen FTC/TDF/RAL eller FTC/TDF/ELV. Musens kroppsvikt mättes från 1 vecka före HIV-infektion. Alla statistiska jämförelser utfördes med hjälp av Mann-Whitney-testet, rapporteringsgruppens medelvärde (± S.E.). Gröna asteriskstjärnor visar statistiska skillnader mellan FTC/TDF/ELV oral födoämnesgrupp och FTC/TDF/RAL SC-injektionsgrupp. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. n=6-7 i varje grupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Mat oral cART administrering visar snabbare viral dämpning. Som beskrivs i figur 1 var möss antingen obehandlade eller behandlade med FTC/TDF/RAL-behandling genom subkutan injektion och genom oral administrering av food cup mock, FTC/TDF/RAL eller FTC/TDF/ELV matregimer i ytterligare 7,5 veckor. (A) Plasmavirusbelastning över tid efter HIV-1-infektion i olika grupper. (B) Sammanfattning av virusbelastningen över tid efter HIV-1-infektion i olika grupper, rapportering av gruppens geometriska medelvärde med 95% konfidensintervall (CI). Svarta pilar anger tiden för cART-initiering för cART-behandlade grupper. (C) Överlevnadsanalys av tiden efter cART-behandling till omätbar virusbelastning för varje grupp. n= 6-7 i varje grupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: ART mat orala administreringar visar snabbare återställande av CD4 / CD8-förhållandet. CD4 / CD8-förhållande i perifert blod över tid efter HIV-1-infektion för varje grupp. Alla statistiska jämförelser gjordes med hjälp av Mann-Whitney-testet, rapporteringsgruppens medelvärde (± S.E.). Röda asteriskstjärnor visar statistiska skillnader mellan FTC/TDF/RAL oral födoämnesgrupp och FTC/TDF/RAL SC-injektionsgrupp. *P < 0,05. n=6-7 i varje grupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En oral cART-administreringsmetod utvecklas här för HIV-1-infekterade humaniserade möss genom att kombinera tre antiretrovirala läkemedel inom livsmedel med hög näringshalt. Jämfört med administrering genom dagliga injektioner är oral leverans lättare att använda, begränsar administreringsfrekvensen, minskar djurhanteringen, minimerar stress och förbättrar säkerheten55. Fram till denna punkt har endast ett fåtal studier på humaniserade möss 24,37,41 använt matpellets som innehåller krossade ART-läkemedel för att behandla möss. Denna metod är dock utmanande att tillämpa i stor utsträckning på grund av begränsad tillgång till tillverkning av speciella matpellets. Andra studier 42,43,44,45,46 har använt dricksvatten som ett cART-leveranssystem. Emellertid, sammansatta ett läkemedel i dricksvatten kan förändra stabiliteten, renheten, eller ens potens av de aktiva ingredienserna. Dessutom är många antiretrovirala läkemedel, inklusive TDF, RAL och ELV, dåligt vattenlösliga. Studier har visat att oral biotillgänglighet av TDF ökade 40% efter en fettrik måltid56, vilket tyder på att konkurrenskraftig hämning av lipaser från mat kan ge ett visst skydd för TDF57. DietGel Boost är ett kosttillskott som tillhandahåller hydrerings-, närings- och berikningsprodukter som förbättrar forskningsdjurens övergripande välbefinnande58. Den näringsberikade gelén består av 25%-30% rent vatten med tillsatta kolhydrater, proteiner, fetter, mineraler och elektrolyter och är certifierad fri från fytoöstrogener och nitrosaminer58. Det ger ett ekonomiskt, effektivt och arbetseffektivt alternativ till mosdieter58. Eftersom 20.3% av det totala fettet inkluderades i Boost-koppen föreslår vi att höga näringsnivåer kan lösa upp TDF bättre och därmed öka dess orala biotillgänglighet. Därför användes en hög näringsämnesmatsuspension för att leverera cART-läkemedlen för att efterlikna den perorala leveransen av cART-läkemedel som HIV-1-infekterade individer för närvarande använder.

Möss har en högre metabolism än människor, och därmed omvandlades dosen av de distinkta föreningarna och användes med en formel som beskrivs i referens59. Humana doser på 0,4 mg (total dos) av RAL, 0,1 mg (total dos) av FTC och 2,14 mg (total dos) av TDF omvandlades baserat på korrektionsfaktorn (Km, uppskattad genom att dividera den genomsnittliga kroppsvikten (kg) för arter med dess kroppsyta (m2)) för att uppskatta musens ekvivalentdosvärden på 37 (Km) och 3 (Km) för människor och möss59, respektive. Med tanke på den relativt låga lösligheten av TDF, RAL och ELV i vatten användes DMSO här som lösningsmedel för cART-läkemedel. Den slutliga koncentrationen av DMSO i den orala cART-maten är 0,0059% (v/v). DMSO-koncentrationen är mycket låg och relativt säker som ett läkemedelslösningsmedel60,61,62,63. Viktigt är att ingen pälsförlust eller några beteendeförändringar hos möss observerades i dessa studier.

Proceduren som beskrivs ovan är en mycket robust och repeterbar cART-leveransmetod för behandling av HIV-1-infekterade humaniserade möss. Detta protokoll kan enkelt följas. De kritiska stegen i protokollet är 1) att hålla hela processen steril för allt material som är involverat i protokollet relaterat till DietGel-maten med tanke på immunbrist hos de humaniserade mössen, och 2) för att undvika flera tina / frysa cART-stamlösningar och alikvotera cART-läkemedel på lämpligt sätt enligt musnummer och grupper. Data tyder på att oral administrering av tre-läkemedels cART (TDF, FTC och RAL eller ELV) förblandad i matkoppen effektivt undertrycker HIV-1-replikation och minskar virusbelastningen i plasma till omätbara nivåer inom 4 veckors behandling. Oral cART livsmedelsadministration förhindrade inte bara en ytterligare minskning av CD4 T-celler, utan resulterade också i en ökad CD4 T-cellprocent i perifert blod. Dessutom återställde den orala cART-administreringsmetoden musens vikt snabbare än den dagliga injektionen och förbättrade den allmänna hälsan.

Viktigt är att denna metod tog bort risken för forskarens exponering för vassa föremål under daglig injektion av cART-läkemedel i HIV-1-infekterade humaniserade möss. Den föreslagna metoden som framgångsrikt undertrycker HIV-1 RNA-replikation hos humaniserade möss kommer att vara mycket värdefull för prekliniska proof-of-concept-studier för att utveckla nya botemedelsbehandlingar som nära efterliknar läkemedelsleveransen hos cART-behandlade kroniska HIV-1-infekterade individer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

SK är en av grundarna av CDR3 Inc. De återstående författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kan tolkas som en potentiell intressekonflikt.

Acknowledgments

Vi vill tacka Drs. Romas Geleziunas och Jeff Murry och folket på Gilead för att tillhandahålla de antiretrovirala läkemedel som används i denna studie. Detta arbete finansierades av NCI 1R01CA239261-01 (till Kitchen), NIH Grants P30AI28697 (UCLA CFAR Virology Core, Gene and Cell Therapy Core och Humanized Mouse Core), U19AI149504 (PI: Kitchen & Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (till Zhen), NIAID R2120200174 (PI: Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (Carrillo). Detta arbete stöddes också av UCLA AIDS Institute, James B. Pendleton Charitable Trust och McCarthy Family Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm petri dish Thermo Scientific Nunc 150288 For aliquoting ART food
APC anti-human CD8 Antibody Biolegend 344722 For flow cytometry
BD LSRFortessa BD biosciences For flow data collection
CD34 microbeads Miltenyi Biotec 130-046-702 For NSG-BLT mice generation
Centrifuge tubes Falcon 14-432-22 For dissolving ART
DietGel Boost ClearH2O 72-04-5022 For making ART food
Elvitegravir Gilead Gifted from Gilead
Emtricitabine Gilead Gifted from Gilead
FITC anti-human CD3 Antibody Biolegend 317306 For flow cytometry
Flowjo software FlowJo For flow cytometry data analysis
HIV-1 forward primer: 5′-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 probe: 5′-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT
TAACTG [Tamra-Q]-3′;		 IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 reverse primer: 5′-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
Human fetal tissue Advanced Bioscience Resources, Inc
Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ The Jackson Laboratory 5557 For constructing the humanized mice
Pacific Blue anti-human CD45 Biolegend 304022 For flow cytometry
PerCP anti-human CD4 Antibody Biolegend 300528 For flow cytometry
QIAamp Viral RNA Kits Qiagen  52904 For measuring viral load
Raltegravir Merck Gifted from Merck
Sterile cell scrapers Thermo Scientific 179693 For aliquoting ART food
TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit Applied Biosystems 4392653 For plasma viral load detection
Tenofovir disoproxil fumarate Gilead Gifted from Gilead
Trimethoprim-Sulfamethoxazole Pharmaceutical Associates NDC 0121-0854-16 For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains
200 mg Sulfamethoxazole, USP
40 mg Trimethoprim, USP
NMT 0.5% Alcohol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Antiretroviral Therapy Cohort Collaboration. Life expectancy of individuals on combination antiretroviral therapy in high-income countries: a collaborative analysis of 14 cohort studies. Lancet. 372 (9635), 293-299 (2008).
  2. May, M. T., et al. Impact on life expectancy of HIV-1 positive individuals of CD4+ cell count and viral load response to antiretroviral therapy. AIDS. 28 (8), 1193-1202 (2014).
  3. Autran, B., et al. Positive effects of combined antiretroviral therapy on CD4+ T cell homeostasis and function in advanced HIV disease. Science. 277 (5322), 112-116 (1997).
  4. Palella, F. J., et al. Declining morbidity and mortality among patients with advanced human immunodeficiency virus infection. HIV outpatient study investigators. The New England Journal of Medicine. 338 (13), 853-860 (1998).
  5. Finzi, D., et al. Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy. Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).
  6. Ananworanich, J., Dube, K., Chomont, N. How does the timing of antiretroviral therapy initiation in acute infection affect HIV reservoirs. Current Opinion in HIV and AIDS. 10 (1), 18-28 (2015).
  7. Whitney, J. B., et al. Rapid seeding of the viral reservoir prior to SIV viraemia in rhesus monkeys. Nature. 512 (7512), 74-77 (2014).
  8. Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4 T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
  9. Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature Immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
  10. Brothers, T. D., et al. Frailty in people aging with human immunodeficiency virus (HIV) infection. Journal of Infectious Disease. 210 (8), 1170-1179 (2014).
  11. D. A. D. Study Group. Use of nucleoside reverse transcriptase inhibitors and risk of myocardial infarction in HIV-infected patients enrolled in the D:A:D study: a multi-cohort collaboration. Lancet. 371 (9622), 1417-1426 (2008).
  12. Schouten, J., et al. Cross-sectional comparison of the prevalence of age-associated comorbidities and their risk factors between HIV-infected and uninfected individuals: the AGEhIV cohort study. Clinical Infectious Diseases. 59 (12), 1787-1797 (2014).
  13. Policicchio, B. B., Pandrea, I., Apetrei, C. Animal models for HIV cure research. Frontiers in Immunology. 7, 12 (2016).
  14. Hessell, A. J., Haigwood, N. L. Animal models in HIV-1 protection and therapy. Current Opinion in HIV and AIDS. 10 (3), 170-176 (2015).
  15. Ambrose, Z., KewalRamani, V. N., Bieniasz, P. D., Hatziioannou, T. HIV/AIDS: in search of an animal model. Trends in Biotechnology. 25 (8), 333-337 (2007).
  16. Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature Medicine. 12 (11), 1316 (2006).
  17. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  18. Wege, A. K., Melkus, M. W., Denton, P. W., Estes, J. D., Garcia, J. V. Functional and phenotypic characterization of the humanized BLT mouse model. Current Topics in Microbiology and Immunology. 324, 149-165 (2008).
  19. Garcia, J. V. In vivo platforms for analysis of HIV persistence and eradication. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 424-431 (2016).
  20. Carrillo, M. A., Zhen, A., Kitchen, S. G. The use of the humanized mouse model in gene therapy and immunotherapy for HIV and cancer. Frontiers in Immunology. 9, 746 (2018).
  21. Abeynaike, S., Paust, S. Humanized mice for the evaluation of novel HIV-1 therapies. Frontiers in Immunology. 12, 636775 (2021).
  22. Marsden, M. D., Zack, J. A. Humanized mouse models for human immunodeficiency virus infection. Annual Review of Virology. 4 (1), 393-412 (2017).
  23. Brainard, D. M., et al. Induction of robust cellular and humoral virus-specific adaptive immune responses in human immunodeficiency virus-infected humanized BLT mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
  24. Nischang, M., et al. Humanized mice recapitulate key features of HIV-1 infection: a novel concept using long-acting anti-retroviral drugs for treating HIV-1. PLoS One. 7 (6), 38853 (2012).
  25. Garcia-Beltran, W. F., et al. Innate immune reconstitution in humanized bone marrow-liver-thymus (HuBLT) mice governs adaptive cellular immune function and responses to HIV-1 infection. Frontiers in Immunology. 12, 667393 (2021).
  26. Cheng, L., et al. Blocking type I interferon signaling enhances T cell recovery and reduces HIV-1 reservoirs. The Journal of Clinical Investigation. 127 (1), 269-279 (2017).
  27. Zhen, A., et al. Targeting type I interferon-mediated activation restores immune function in chronic HIV infection. The Journal of Clinical Investigation. 127 (1), 260-268 (2017).
  28. Khamaikawin, W., et al. Modeling anti-HIV-1 HSPC-based gene therapy in humanized mice previously infected with HIV-1. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 23-32 (2018).
  29. Kitchen, S. G., et al. Engineering antigen-specific T cells from genetically modified human hematopoietic stem cells in immunodeficient mice. PLoS One. 4 (12), 8208 (2009).
  30. Zhen, A., et al. Robust CAR-T memory formation and function via hematopoietic stem cell delivery. PLoS Pathogens. 17 (4), 1009404 (2021).
  31. Zhen, A., et al. HIV-specific immunity derived from chimeric antigen receptor-engineered stem cells. Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).
  32. Zhen, A., Kitchen, S. Stem-cell-based gene therapy for HIV infection. Viruses. 6 (1), 1-12 (2013).
  33. Mu, W., Carrillo, M. A., Kitchen, S. G. Engineering CAR T cells to target the hiv reservoir. Frontiers in Celluar and Infection Microbiology. 10, 410 (2020).
  34. Arts, E. J., Hazuda, D. J. HIV-1 antiretroviral drug therapy. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 2 (4), 007161 (2012).
  35. Denton, P. W., et al. Generation of HIV latency in humanized BLT mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
  36. Kovarova, M., et al. A long-acting formulation of the integrase inhibitor raltegravir protects humanized BLT mice from repeated high-dose vaginal HIV challenges. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (6), 1586-1596 (2016).
  37. Lavender, K. J., et al. An advanced BLT-humanized mouse model for extended HIV-1 cure studies. AIDS. 32 (1), 1-10 (2018).
  38. Denton, P. W., et al. Targeted cytotoxic therapy kills persisting HIV infected cells during ART. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003872 (2014).
  39. Marsden, M. D., et al. In vivo activation of latent HIV with a synthetic bryostatin analog effects both latent cell "kick" and "kill" in strategy for virus eradication. PLoS Pathogens. 13 (9), 1006575 (2017).
  40. Stuart, S. A., Robinson, E. S. Reducing the stress of drug administration: implications for the 3Rs. Science Report. 5, 14288 (2015).
  41. Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
  42. Daskou, M., et al. ApoA-I mimetics reduce systemic and gut inflammation in chronic treated HIV. PLoS Pathogens. 18 (1), 1010160 (2022).
  43. Mu, W., et al. Apolipoprotein A-I mimetics attenuate macrophage activation in chronic treated HIV. AIDS. 35 (4), 543-553 (2021).
  44. Daskou, M., et al. ApoA-I mimetics favorably impact cyclooxygenase 2 and bioactive lipids that may contribute to cardiometabolic syndrome in chronic treated HIV. Metabolism. 124, 154888 (2021).
  45. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational antiretroviral therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118 (2018).
  46. Llewellyn, G. N., et al. Humanized mouse model of HIV-1 latency with enrichment of latent virus in PD-1(+) and TIGIT(+) CD4 T cells. Journal of Virology. 93 (10), 02086 (2019).
  47. Kearney, B. P., Flaherty, J. F., Shah, J. Tenofovir disoproxil fumarate: clinical pharmacology and pharmacokinetics. Clinical Pharmacokinetics. 43 (9), 595-612 (2004).
  48. Speakman, J. R. Use of high-fat diets to study rodent obesity as a model of human obesity. International Journal of Obesity (Lond). 43 (8), 1491-1492 (2019).
  49. Zhen, A., et al. Stem-cell based engineered immunity against HIV infection in the humanized mouse model. Journal of Visualized Experiments. (113), e54048 (2016).
  50. Mopin, A., Driss, V., Brinster, C. A detailed protocol for characterizing the murine C1498 cell line and its associated leukemia mouse model. Journal of Visualized Experiments. (116), e54270 (2016).
  51. Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
  52. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  53. Shimizu, S., et al. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
  54. Ladinsky, M. S., et al. Mechanisms of virus dissemination in bone marrow of HIV-1-infected humanized BLT mice. Elife. 8, 46916 (2019).
  55. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
  56. Lamorde, M., et al. Effect of food on the steady-state pharmacokinetics of tenofovir and emtricitabine plus efavirenz in Ugandan adults. AIDS Research and Treatment. 2012, 105980 (2012).
  57. Watkins, M. E., et al. Development of a novel formulation that improves preclinical bioavailability of tenofovir disoproxil fumarate. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 906-919 (2017).
  58. Moccia, K. D., Olsen, C. H., Mitchell, J. M., Landauer, M. R. Evaluation of hydration and nutritional gels as supportive care after total-body irradiation in mice (Mus musculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (3), 323-328 (2010).
  59. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  60. Santos, N. C., Figueira-Coelho, J., Martins-Silva, J., Saldanha, C. Multidisciplinary utilization of dimethyl sulfoxide: pharmacological, cellular, and molecular aspects. Biochemical Pharmacology. 65 (7), 1035-1041 (2003).
  61. Kolb, K. H., Jaenicke, G., Kramer, M., Schulze, P. E. Absorption, distribution and elimination of labeled dimethyl sulfoxide in man and animals. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 85-95 (1967).
  62. Yellowlees, P., Greenfield, C., McIntyre, N. Dimethylsulphoxide-incuded toxicity. Lancet. 2 (8202), 1004-1006 (1980).
  63. Swanson, B. N. Medical use of dimethyl sulfoxide (DMSO). Reviews in Clinical & Basic Pharmacology. 5 (1-2), 1-33 (1985).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 188
Antiretroviral behandling i oral kombination hos HIV-1-infekterade humaniserade möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mu, W., Zhen, A., Carrillo, M. A.,… More

Mu, W., Zhen, A., Carrillo, M. A., Rezek, V., Martin, H., Lizarraga, M., Kitchen, S. Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice. J. Vis. Exp. (188), e63696, doi:10.3791/63696 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter